CN109187972A - 一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法，属于化学发光体外诊断技术领域。该试剂盒包括：链霉亲和素磁微粒悬浮液、化学发光物质标记的肾素单克隆抗体和生物素标记的肾素单克隆抗体。本发明还提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法。该试剂盒使用生物素‑亲和素体系，避免了抗体直接包被磁微粒导致的磁微粒凝集，解决了稳定性的问题，生物素‑亲和素体系是通过链霉亲和素‑生物素之间特异性相互作用，将生物素标记的抗体连接到磁微粒上。本发明使用化学发光法直接检测肾素，试剂性能稳定，灵敏度高，检测速度快，重复性好。

Description

一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制 备方法
技术领域
本发明属于化学发光体外诊断技术领域，涉及一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法。
背景技术
肾素(Renin)，作为肾素-血管紧张素***的重要组成部分，是肾小球旁器球旁细胞释放的一种蛋白水解酶。肾素经肾静脉进入血液，能催化血管紧张素原转变成AI。
肾素分子结构由同源性的两叶所组成，催化血管紧张素原的特殊部位即在此两叶交界的小脊处。血液除了肾素，还存在肾素前体，后者是肾素合成的前体蛋白。与肾素相比，肾素前体N端包含一个43氨基酸多肽(称为前段)，该多肽遮盖了肾素与血管紧张素原作用的脊部，因此肾素前体无酶活性。研究发现，血液中肾素前体常常5-10倍高于肾素。肾素前体可以通过水解掉前段部分而转变成有活性肾素。除了水解性活化，在低pH及低温(冷激活)环境下也会导致肾素前体的前段打开，发生分子结构变化而活化。因此在肾素检测时，冷激活是特别值得注意的问题。
此前，国内很多实验室是通过检测血浆肾素活性PRA(单位体积单位时间内受检测血浆血管紧张素原转变成AI的数量)来间接反映血浆中的活性肾素的水平。这是肾素检测的传统方法，在国内使用多年，但是由于PRA检测会受底物即血浆中血管紧张素原浓度影响。而不同病理生理条件下，血浆中血管紧张素原浓度会有差异。有报道在肝硬化、充血性心力衰竭和I型糖尿病患者中，因血管紧张素原水平下降而导致PRA降低，相反***和糖皮质激素可以增加血管紧张素原水平而使PRA升高，在这些状态下测定的PRA有可能导致继发性高血压筛查指标血浆醛固酮肾素比值ARR出现假阳性和假阴性。另外，PRA检测过程中，血浆标本的孵育时间、缓冲液pH值及血浆稀释的倍数，不同试剂盒和实验室并不一致。这些因素影响了PRA的重复性、稳定性，使得不同实验室结果无法对照，难以标准化。而PRA实验操作复杂、检测时间过长(常需过夜)也一直受检测人员诟病。这些方法学上的不足长期限制了肾素检测的临床推广及使用。随着单克隆抗体技术的发展，针对肾素分子不同表位的抗体检测使得直接定量检测这种关键酶成为可能。直接检测肾素浓度的试剂盒使用单克隆抗体识别肾素分子的特定表位，直接检测EDTA血浆中活性肾素含量。该方法不仅与PRA检测相关性良好，而与传统PRA检测相比，其还具有如下显著优点：
1)直接检测(传统血浆肾素活性检测是通过检测AI间接测得)，检测结果不受pH、时间以及血管紧张素原水平影响，结果更可靠；
2)全自动化，操作简便，一次测量，检测时间显著缩短(1小时内出结果)；
3)溯源至国际标准物质，方便实验室间比对。
已有的化学发光检测直接肾素的方法，使用抗体包被磁微粒，这种技术磁微粒稳定性差，容易凝集，导致检测结果重复性差。使用间接化学发光，通过检测样本中AI含量变化来间接反应肾素的活性，这种测试方法耗时长，重复性差，空白高，灵敏度低。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的检测肾素的方法耗时长，重复性差，灵敏度低的问题，而提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法。
本发明首先提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，该试剂盒包括：
链霉亲和素磁微粒悬浮液
化学发光物质标记的肾素单克隆抗体
生物素标记的肾素单克隆抗体
优选的是，所述的链霉亲和素磁微粒悬浮液浓度＞0.03％，生物素标记的肾素单克隆抗体浓度＞0.5μg/ml，化学发光物质标记的肾素单克隆抗体浓度＞0.05μg/ml。
优选的是，所述的链霉亲和素磁微粒悬浮液中，链霉亲和素磁微粒的粒径为1-3μm。
优选的是，所述的化学发光物质标记的肾素单克隆抗体中，化学发光物质与单克隆抗体的摩尔比为(1-10)：1。
优选的是，所述的化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物。
优选的是，所述的生物素标记的肾素单克隆抗体中，生物素与单克隆抗体的摩尔比为(1-10)：1。
优选的是，所述的试剂盒还包括校准品和质控品。
本发明还提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，该方法包括：
步骤一：链霉亲和素磁微粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁微粒溶液用固相试剂缓冲液稀释，配制成R1试剂；
步骤二：化学发光物质标记的肾素单克隆抗体的制备
取肾素单克隆抗体，进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，
然后加入化学发光物质溶液，混匀，25-40℃，标记1-10h，标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5-2h，封闭后进行超滤离心，得中间品，取中间品和试剂缓冲液，配制R2试剂；
步骤三：生物素标记的肾素单克隆抗体的制备
取肾素单克隆抗体，进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，
然后加入生物素原液，混匀，在25-40℃，标记1-10h，标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5-2h，封闭后进行超滤离心，得中间品，取中间品和试剂缓冲液，配制R3试剂。
优选的是，所述步骤二和步骤三的标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0。
优选的是，所述步骤二和步骤三的封闭缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
本发明的有益效果
本发明首先提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，该试剂盒包括：链霉亲和素磁微粒悬浮液、化学发光物质标记的肾素单克隆抗体、生物素标记的肾素单克隆抗体；该试剂盒使用生物素-亲和素体系，避免了抗体直接包被磁微粒导致的磁微粒凝集，解决了稳定性的问题，生物素-亲和素体系是通过链霉亲和素-生物素之间特异性相互作用，将生物素标记的抗体连接到磁微粒上。这一结合过程是在检测样本时发生的，试剂盒在使用之前，链霉亲和素包被的磁微粒和生物素标记的抗体是分开存放的，因此可以避免抗体直接包被磁微粒导致的磁微粒凝集。同时，该试剂盒采用吖啶酯直接发光，降低了本底空白，提高了灵敏度。和现有技术相对比，本发明使用化学发光法直接检测肾素，试剂性能稳定，灵敏度高，检测速度快，重复性好。
附图说明
图1为实施例4用国际标准物质绘制的标准曲线；
图2为实施例4用本发明的校准品绘制标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明首先提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，该试剂盒包括：
链霉亲和素磁微粒悬浮液
化学发光物质标记的肾素单克隆抗体
生物素标记的肾素单克隆抗体
按照本发明，所述的链霉亲和素磁微粒悬浮液浓度＞0.03％，生物素标记的肾素单克隆抗体浓度＞0.5μg/ml，化学发光物质标记的肾素单克隆抗体浓度＞0.05μg/ml。
按照本发明，所述的链霉亲和素磁微粒悬浮液中链霉亲和素磁微粒的粒径优选为1-3μm。当链霉亲和素磁微粒的粒径低于1μm时，抗原或者抗体与磁微粒结合率低，可能导致整体光量子数偏低；当链霉亲和素磁颗粒的粒径高于3μm时，非特异性结合效果明显，可能导致试剂盒灵敏度差等。
按照本发明，所述的化学发光物质标记的肾素单克隆抗体中，化学发光物质与单克隆抗体的摩尔比优选为(1-10)：1。
按照本发明，所述的化学发光物质优选为吖啶酯或吖啶酯衍生物。
按照本发明，所述的生物素标记的肾素单克隆抗体中，生物素与单克隆抗体的摩尔比优选为(1-10)：1。
按照本发明，所述的试剂盒还包括校准品和质控品。肾素校准品浓度为25μIU/mL(低值)和200μIU/mL(高值)，体积均为1ml。肾素质控品浓度为15μIU/mL(低值)和90μIU/mL(高值)，体积均为1ml。
所述的肾素校准品、质控品的制备包括：
取0.1IU/mL的肾素原液1ml，加入到99ml校准品基质缓冲液中，稀释成1000μIU/mL的校准品母液。再将校准品母液依次稀释成浓度为500μIU/mL、100μIU/mL、50μIU/mL、20μIU/mL、10μIU/mL、5μIU/mL的各浓度点，将校准品基质缓冲液作为0μIU/mL浓度的点。
将校准品母液8ml，加入到32ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为200μIU/mL高浓度产品校准品。
将校准品母液1ml，加入到39ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为25μIU/mL低浓度产品校准品。
将校准品母液3.6ml，加入到36.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为90μIU/mL高浓度质控品。
将校准品母液0.6ml，加入到39.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为15μIU/mL低浓度质控品。
本发明还提供一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，该方法包括：
步骤一：链霉亲和素磁微粒微粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁微粒微粒溶液用固相试剂缓冲液稀释，配制成R1试剂；所述的链霉亲和素磁微粒微粒溶液的浓度优选为1％，R1试剂的浓度优选为0.03％；固相试剂缓冲液包括20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH7.2；
步骤二：化学发光物质标记的肾素单克隆抗体的制备
取肾素单克隆抗体，优选用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，然后按照化学发光物质：肾素单克隆抗体摩尔比为1-10：1加入化学发光物质溶液，混匀，25-40℃，标记1-10h，标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5-2h，封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存，取中间品和试剂缓冲液，配制R2试剂；
所述的离心转速优选为8000-12000rpm，更优选为9000rpm，离心时间优选为15-60min，更优选为30min；标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0；封闭缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0；试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
步骤三：生物素标记的肾素单克隆抗体的制备
取肾素单克隆抗体，优选用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，
然后按照生物素：肾素单克隆抗体摩尔比为1-10：1加入生物素原液，混匀，在25-40℃标记1-10h，标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5-2h，封闭后进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子，测定蛋白浓度，作为中间品保存，取中间品和试剂缓冲液，配制R3试剂；
所述的离心转速为8000-12000rpm，更优选为9000rpm，离心时间优选为15-60min，更优选为30min；；标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0；封闭缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0；试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
本发明的肾素化学发光免疫检测试剂盒用于肾素检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对肾素主校准品进行检测，绘制主校准曲线，内置于射频卡；接着测试两点校准，对主校准曲线进行校准；接着测试质控品，质控品测试结果落在靶值范围内认为校准合格。测试实际样本(EDTA血浆)，根据样本发光值计算样本浓度；最后对肾素全自动化学发光免疫分析***进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。
这种肾素化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成肾素的检测。这种肾素化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到0.5μIU/mL这种肾素化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例1肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备
(1)链霉亲和素磁微粒的制备
取浓度为1％的链霉亲和素磁微粒溶液(商购，选自Thermol)，用固相试剂缓冲液稀释，配制成浓度为0.03％的磁微粒混悬液，作为R1试剂。
(2)化学发光物质标记的肾素单克隆抗体的制备
取500μg肾素单克隆抗体(商购，选自Fitzgerald)，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min，标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0；
按照吖啶酯：单克隆抗体摩尔比为10：1加入吖啶酯原液，混匀，37℃，标记4h；
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h，封闭缓冲液为20mmol/LPB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制；
取中间品和试剂缓冲液，配制成抗体浓度为0.5μg/ml的R2试剂，试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
(3)生物素标记的肾素单克隆抗体的制备
取500μg肾素单克隆抗体，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为9000rpm，离心时间为30min，标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0。
按照生物素：单克隆抗体摩尔比为10：1加入生物素原液，混匀，37℃，标记4h；
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为1h，封闭缓冲液为20mmol/LPB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0；
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制；
取中间品和试剂缓冲液，配制成抗体浓度为0.5μg/ml的R3试剂，试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
(4)肾素校准品、质控品的制备
取0.1IU/mL的肾素原液1ml，加入到99ml校准品基质缓冲液中，稀释成1000μIU/mL的校准品母液。再将校准品母液依次稀释成浓度为500μIU/mL、100μIU/mL、50μIU/mL、20μIU/mL、10μIU/mL、5μIU/mL的各浓度点，将校准品基质缓冲液作为0μIU/mL浓度的点。
将校准品母液8ml，加入到32ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为200μIU/mL高浓度产品校准品。
将校准品母液1ml，加入到39ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为25μIU/mL低浓度产品校准品。
将校准品母液3.6ml，加入到36.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为90μIU/mL高浓度质控品。
将校准品母液0.6ml，加入到39.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为15μIU/mL低浓度质控品。
实施例2肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备
(1)链霉亲和素磁微粒的制备
取浓度为1％的链霉亲和素磁微粒微粒溶液(商购，选自Thermol)，用固相试剂缓冲液稀释，配制成浓度为0.05％的磁微粒混悬液，作为R1试剂。
(2)化学发光物质标记的肾素单克隆抗体的制备
取500μg肾素单克隆抗体(商购，选自Fitzgerald)，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为8000rpm，离心时间为60min。标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0；
按照吖啶酯：单克隆抗体摩尔比为5：1加入吖啶酯原液，混匀，25℃，标记10h；
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5h，封闭缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制；
取中间品和试剂缓冲液，配制成抗体浓度为1.0μg/ml的R2试剂，试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
(3)生物素标记的肾素单克隆抗体的制备
取500μg肾素单克隆抗体，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为8000rpm，离心时间为60min，标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0。
按照生物素：单克隆抗体摩尔比为5：1加入生物素原液，混匀，25℃，标记10h；
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5h，封闭缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0；
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制；
取中间品和试剂缓冲液，配制成抗体浓度为1μg/ml的R3试剂，试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
(4)肾素校准品、质控品的制备
取0.1IU/mL的肾素原液1ml，加入到99ml校准品基质缓冲液中，稀释成1000μIU/mL的校准品母液。再将校准品母液依次稀释成浓度为500μIU/mL、100μIU/mL、50μIU/mL、20μIU/mL、10μIU/mL、5μIU/mL的各浓度点，将校准品基质缓冲液作为0μIU/mL浓度的点。
将校准品母液8ml，加入到32ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为200μIU/mL高浓度产品校准品。
将校准品母液1ml，加入到39ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为25μIU/mL低浓度产品校准品。
将校准品母液3.6ml，加入到36.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为90μIU/mL高浓度质控品。
将校准品母液0.6ml，加入到39.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为15μIU/mL低浓度质控品。
实施例3肾素化学发光免疫检测试剂盒的制备
(1)链霉亲和素磁微粒的制备
取浓度为1％的链霉亲和素磁微粒微粒溶液(商购，选自Thermol)，用固相试剂缓冲液稀释，配制成浓度为0.03％的磁微粒混悬液，作为R1试剂。
(2)化学发光物质标记的肾素单克隆抗体的制备
取500μg肾素单克隆抗体(商购，选自Fitzgerald)，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为12000rpm，离心时间为15min。标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0；
按照吖啶酯：单克隆抗体摩尔比为1：1加入吖啶酯原液，混匀，40℃，标记1h；
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为2h，封闭缓冲液为20mmol/LPB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的吖啶酯分子，超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制；
取中间品和试剂缓冲液，配制成抗体浓度为2.0μg/ml的R2试剂，试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
(3)生物素标记的肾素单克隆抗体的制备
取500μg肾素单克隆抗体，用30KDa超滤离心管进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，离心机转速为12000rpm，离心时间为15min，标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0。
按照生物素：单克隆抗体摩尔比为1：1加入生物素原液，混匀，40℃，标记1h；
标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为2h，封闭缓冲液为20mmol/LPB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0；
封闭后用30KDa超滤离心管进行超滤离心，除去未偶联的生物素分子。超滤结束后，测定蛋白浓度，作为中间品保存。用于试剂配制；
取中间品和试剂缓冲液，配制成抗体浓度为2μg/ml的R3试剂，试剂缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20，1％BSA，pH6.0。
(4)肾素校准品、质控品的制备
取0.1IU/mL的肾素原液1ml，加入到99ml校准品基质缓冲液中，稀释成1000μIU/mL的校准品母液。再将校准品母液依次稀释成浓度为500μIU/mL、100μIU/mL、50μIU/mL、20μIU/mL、10μIU/mL、5μIU/mL的各浓度点，将校准品基质缓冲液作为0μIU/mL浓度的点。
将校准品母液8ml，加入到32ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为200μIU/mL高浓度产品校准品。
将校准品母液1ml，加入到39ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为25μIU/mL低浓度产品校准品。
将校准品母液3.6ml，加入到36.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为90μIU/mL高浓度质控品。
将校准品母液0.6ml，加入到39.4ml校准品基质缓冲液中，配制成40ml浓度为15μIU/mL低浓度质控品。
实施例4肾素化学发光免疫检测方法
以全自动化学发光免疫分析仪(CM-180)为检测工具，方法学模式为双抗体夹心法，即仪器依次加入150μl的样品、50μl的生物素标记的肾素单克隆抗体、50μl的化学发光物质标记的肾素单克隆抗体，反应10min后，再加40μl链霉亲和素磁微粒，反应10min后，进行磁分离，加入清洗液清洗5次，仪器将反应复合物送入检测器，依次加入预激发液和激发液进行发光反应，采集光信号，记录发光值。
实施例5肾素化学发光免疫检测试剂盒性能评价
采用实施例4中的方法对肾素主校准品进行溯源，将主校准品各点光量值带入国际标准物质发光标准曲线(图1，具体数据如表1所示)，计算主校准品各点浓度值。
表1
国际标准物质理论浓度 迪瑞试剂测试光量
μIU/mL RLU
0 195
5 647
10 1128
20 2204
50 7721
100 14522
500 51474
采用实施例4中的方法对肾素主校准品进行检测，将主校准品各点浓度值和发光值做主校准曲线，如图2所示，具体数据如表2所示。
接着测试两点校准，对主校准曲线进行校准，接着测试2点质控品，质控品在靶值范围内，接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
表2
1、灵敏度的检测
参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算肾素化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度＜0.5μIU/mL。
2、线性的检测
对浓度为0μIU/mL、5μIU/mL、10μIU/mL、20μIU/mL、50μIU/mL、100μIU/mL、500μIU/mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.998，另外，该试剂盒对肾素样品检测的线性范围为0.52-500μIU/mL。
3、精密度测定
取浓度为25μIU/mL的低浓度肾素样品和200μIU/mL高浓度肾素样品，每个样本每个浓度各做3次平行测试，用3批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均＜5％。
4、干扰性实验
取混合血清分别添加干扰物，包括：胆红素、血红蛋白、甘油三酯、人白蛋白，其中胆红素浓度为30mg/dL，血红蛋白浓度为500mg/dL，甘油三酯浓度为3000mg/dL，人白蛋白浓度为12g/L，分别测定添加干扰物质的血清和未添加干扰物质的血清，计算测试偏差，偏差＜±15％。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标准，可用于临床实验室肾素状况的准确评估。
实施例6肾素化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
分别用化学发光检测方法和传统的ELISA法对浓度0μIU/mL、5μIU/mL、10μIU/mL、20μIU/mL、50μIU/mL、100μIU/mL、500μIU/mL的肾素样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，本发明的试剂盒灵敏度更高，数据如下表3所示：
表3

Claims (10)

1.一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
链霉亲和素磁微粒悬浮液
化学发光物质标记的肾素单克隆抗体
生物素标记的肾素单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素磁微粒悬浮液浓度＞0.03％，生物素标记的肾素单克隆抗体浓度＞0.5μg/ml，化学发光物质标记的肾素单克隆抗体浓度＞0.05μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述的链霉亲和素磁微粒悬浮液中，链霉亲和素磁微粒的粒径为1-3μm。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述的化学发光物质标记的肾素单克隆抗体中，化学发光物质与单克隆抗体的摩尔比为(1-10)：1。
5.根据权利要求1或4所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述的化学发光物质为吖啶酯或吖啶酯衍生物。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述的生物素标记的肾素单克隆抗体中，生物素与单克隆抗体的摩尔比为(1-10)：1。
7.根据权利要求1所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括校准品和质控品。
8.根据权利要求1所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一：链霉亲和素磁微粒悬浮液的制备
将链霉亲和素磁微粒溶液用固相试剂缓冲液稀释，配制成R1试剂；
步骤二：化学发光物质标记的肾素单克隆抗体的制备
取肾素单克隆抗体，进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，
然后加入化学发光物质溶液，混匀，25-40℃，标记1-10h，标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5-2h，封闭后进行超滤离心，得中间品，取中间品和试剂缓冲液，配制R2试剂；
步骤三：生物素标记的肾素单克隆抗体的制备
取肾素单克隆抗体，进行超滤离心，将缓冲液置换为标记缓冲液，
然后加入生物素原液，混匀，在25-40℃，标记1-10h，标记反应结束后，加入封闭缓冲液，封闭时间为0.5-2h，封闭后进行超滤离心，得中间品，取中间品和试剂缓冲液，配制R3试剂。
9.根据权利要求8所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤二和步骤三的标记缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH8.0。
10.根据权利要求8所述的一种定量检测血浆肾素含量的磁微粒化学发光试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤二和步骤三的封闭缓冲液为20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，10％赖氨酸，pH8.0。
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