CN116334152A - 一种可以高效将2,5-dkg转化为2-klg的2,5-dkg还原酶 - Google Patents

一种可以高效将2,5-dkg转化为2-klg的2,5-dkg还原酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可以高效将2,5‑DKG转化为2‑KLG的2,5‑DKG还原酶，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌BL21(DE3)中表达不同来源的2,5‑DKG还原酶和醛酮还原酶并对比其催化2,5‑DKG的能力，发现了一种新来源的催化能力更强的2,5‑DKG还原酶，并它的一些酶学性质进行了研究。所述2,5‑DKG还原酶可以用于构建葡萄糖至2‑KLG的一步反应，因而所述2,5‑DKG还原酶在化妆品、纺织品、食品领域具有重要作用。

Description

一种可以高效将2,5-DKG转化为2-KLG的2,5-DKG还原酶
技术领域
本发明涉及一种可以高效将2,5-DKG转化为2-KLG的2,5-DKG还原酶，属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
维生素C又称L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，具有很强的还原性,是人体必须的维生素之一。近年来，关于维生素C的应用案例不断被发掘，其在食品、药品、化妆品、饲料及医疗健康方面都有着非常重要的作用。随着维生素C其他功能不断被发掘，其后期需求量势必会进一步增加，因此作为国民大宗需求品，其产能的进一步增加对相关行业的经济促进有着重要作用。
维生素C的主要合成方法有莱氏法和二步发酵法。莱氏法是最早应用于维生素C生产的方式，其优点是工艺成熟，产品收率较高，但缺陷是生产程序复杂、劳动强度高以及生产过程大量使用有机溶剂对环境污染较为严重。二步发酵法是20世纪70年代由我国科学家尹光琳提出，用微生物发酵的方法代替了莱氏法中的化学合成步骤。首先通过高压加氢的方式将葡萄糖转化为山梨醇，然后通过氧化葡萄糖酸杆菌发酵将山梨醇转化为山梨糖，再通过混菌发酵将山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，最后内酯化反应生成维生素C。另外，还有新二步发酵法与一步发酵法等工艺。葡萄糖可通过欧文氏菌、拉恩氏菌、沙雷氏菌、塔特姆氏菌及泛菌等多个菌属微生物转化成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸，随后2,5-二酮基-D-葡萄糖酸通过棒状杆菌来源的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶转化成2-酮基-L-古龙酸，该方法为新二步发酵法。1982年，日本盐野义制药的Sonoyama将一株可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的欧文氏菌与棒状杆菌串联发酵，实现了由葡萄糖不经高压加氢的新二步发酵法生成2-酮基-L-古龙酸。1985年，美国的Anderson实验室首次将棒状杆菌来源的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸还原酶导入可产2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的欧文氏菌，构建出一株工程菌实现了由葡萄糖一步发酵直接生成2-酮基-L-古龙酸。1988年瑞士Hardy同样构建了类似的工程菌，但葡萄糖到2-酮基-L-古龙酸的转化率均较低。
为解决上述问题，本申请旨在挖掘新型来源，拥有更高催化活性的2,5-DKG还原酶，促使其对合成生物学的发展和维生素产业的进步具有潜在的指导价值和指导意义。
发明内容
本发明提供了一种新型2,5-DKG还原酶，其来源于氧化葡萄糖酸杆菌，所述2,5-DKG还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述2,5-DKG还原酶从氧化葡萄糖酸杆菌的基因组中克隆而出。
在本发明的一种实施方式中，编码所述2,5-DKG还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供所述2,5-DKG还原酶的酶活检测方式。
在本发明的一种实施方式中，所述2,5-DKG还原酶的底物为2,5-DKG。
在本发明的一种实施方式中，所述2,5-DKG还原酶的辅因子为NADPH。
在本发明的一种实施方式中，通过在340nm处降低NADPH的吸光度来测量2,5-DKG还原酶的活性。
在本发明的一种实施方式中，通过高效液相(HPLC)来检测最终产物2-KLG的生成。
本发明提供了一种制备2-酮基-L-古龙酸的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶的重组菌添加至含有2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的反应体系中，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
在本发明的一种实施方式中，编码所述2,5-DKG还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为：25-30，常压，pH 5.0～7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为：常温，常压，pH 7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的添加量为：2mM；所述2,5-DKG还原酶的添加量为：50μL，所述反应体系中NADPH的添加量为2mM。
在本发明的一种实施方式中，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶的重组菌是以细菌或真菌为表达宿主。
本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码所述2,5-DKG还原酶的基因或携带核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码所述2,5-DKG还原酶的基因的重组载体在制备2-酮基-L-古龙酸或含有2-酮基-L-古龙酸的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET28a或pCDFDUET为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
本发明还提供了一种提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶的重组菌添加至含有2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的反应体系中，进行反应，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
在本发明的一种实施方式中，编码所述2,5-DKG还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明提供了一种新型2,5-DKG还原酶，其来源于氧化葡萄糖酸杆菌，所述2,5-DKG还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述2,5-DKG还原酶从氧化葡萄糖酸杆菌的基因组中克隆而出。
在本发明的一种实施方式中，编码所述2,5-DKG还原酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
有益效果
(1)本发明提供了一种新的2,5-DKG还原酶，该酶催化能力高于已报道的谷氨酸棒状杆菌来源的2,5-DKG还原酶。基于资料中报导的2,5-DKG还原酶的酶活检测方式对该酶的相关酶学性质进行了检测，证明该酶在常规pH和温度下具有较好的稳定性。
(2)本发明所发现的2,5-DKG还原酶具有更高效的催化活性，对构建葡萄糖至2-KLG单菌一步发酵途径的构建提供了更多的酶原件。
附图说明
图1为葡萄糖一步合成2-酮基-L-古龙酸代谢途径图。
图2为不同来源2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶SDS-PAGE图。
图3为不同来源2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶以2,5-DKG为底物时的比酶活对比图。
图4为氧化葡萄糖酸杆菌来源的2,5-DKG还原酶在不同pH下的酶活变化。
图5为氧化葡萄糖酸杆菌来源的2,5-DKG还原酶在不同温度下的酶活变化。
图6为不同金属离子对氧化葡萄糖酸杆菌来源的2,5-DKG还原酶的酶活影响。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
山梨醇培养基：D-山梨醇50g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。
下述实施例中所涉及的反应体系：
250μL的Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中含有2mM 2,5-DKG、2mM NADPH和50μL2,5-DKG还原酶或醛酮还原酶。
A液：25mM Tris，150mM NaCl，25mM咪唑，pH＝8.0。
B液：25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，pH＝8.0。
C液：25mM Tris，150mM NaCl，pH＝8.0。
下述实施例中所涉及的不同来源醛酮还原酶与2,5-DKG还原酶基因的克隆
将Gluconobacter oxydans ATCC9937接种于山梨醇培养基培养。收集菌体，并利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组，利用PCR扩增2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶，扩增引物包含连接质粒时所需要的同源臂序列。PCR均使用2×Phanta Max Master Mix(购自南京诺唯赞公司)。PCR产物回收使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
将Corynebacterium glutamicum ATCC 13032接种于LB培养基培养。收集菌体，并利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组，利用PCR扩增2,5-DKG还原酶，扩增引物包含连接质粒时所需要的同源臂序列。PCR均使用2×Phanta Max Master Mix(购自南京诺唯赞公司)。PCR产物回收使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
将Tatumella citrea CICC10802接种于LB培养基培养。收集菌体，并利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组，利用PCR扩增2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶，扩增引物包含连接质粒时所需要的同源臂序列。PCR均使用2×Phanta Max Master Mix(购自南京诺唯赞公司)。PCR产物回收使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。
下述实施例中所涉及的2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶质粒构建与基因的表达
1)利用pcr扩增载体，使载体线性化，并使之带有可以与扩增后的2,5-DKG还原酶或醛酮还原酶基因互补的同源臂序列。
2)利用Infusion-Cloning试剂盒(购自南京诺唯赞公司)将线性化载体载体和不同来源的2,5-DKG还原酶或者醛酮还原酶进行无缝连接，构建完整的质粒。
3)将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，并涂布至含有相应抗生素的平板上，挑选阳性克隆子进行测序。
下述实施例中所涉及的2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶的表达与纯化
1)将测序正确的菌株接种至添加有相应抗性的种子培养基制备种子液。待种子液制备完成，将其接种于表达培养基中，通过诱导进行2,5-DKG还原酶或者醛酮还原酶的表达。
2)离心样品后收集菌体，利用A液重悬菌体。
3)利用均质机对样品进行破碎。12000×g离心60min，去除杂质，收集上清，并将上清通过0.22μm滤膜，将样品放置冰上备用。
4)利用AKTA pure仪器(美国通用电气公司)将样品经过由A液平衡后的镍柱，并用A液再次平衡镍柱。用B液进行样品洗脱，收集目标并利用蛋白浓缩管(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)浓缩样品。最后将浓缩后样品经过由C液平衡后的凝胶柱(superdex200pg26/600)，并收集目标峰。
下述实施例中所涉及的2,5-DKG还原酶的酶活测定方法
反应在含有2mM 2,5-DKG、2mM NADPH和50μL 2,5-DKG还原酶或醛酮还原酶纯酶液(浓度约为0.7mg/mL)的Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中进行。用Tris-HCl(pH 7.0)将反应溶液的体积调节至250μL，并在室温下使用96孔板检测样品在30min内340nm处的吸光度变化。
一个单位的2,5-DKG还原酶活性被定义为，每分钟还原1μmol NADPH所需的酶量。为了避免2,5-DKG褐变对检测的干扰，本发明将底物浓度控制在3mM以下；
酶活/蛋白浓度即为比酶活。
实施例1：不同来源的2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶的基因克隆、质粒的构建及表达
(1)不同来源2,5-DKG还原酶
将Gluconobacter oxydans ATCC9937活化后接种于山梨醇培养基中，30℃，220rpm培养48h，4000rpm离心，并收集菌体，提取Gluconobacter oxydans ATCC9937基因组(NCBI上的编号为CP102494-CP102499)，利用引物对dkgA-G-F/dkgA-G-R1进行氧化葡萄糖酸杆菌来源的2,5-DKG还原酶的扩增。分别利用表1中的引物对yhdN-G-F/yhdN-G-R、yeaE-G-F\yeaE-G-R、psakr-G-F\psakr-G-R、pakr-G-F\pakr-G-R对氧化葡萄糖酸杆菌来源的不同醛酮还原酶进行扩增。并回收PCR产物。得到来源于Gluconobacter oxydans ATCC9937的2,5-DKG还原酶DKGRA-G，醛酮还原酶YhdN-G、醛酮还原酶YeaE-G、醛酮还原酶Psakr-G和醛酮还原酶Pakr-G。
将Corynebacterium glutamicum ATCC 13032活化后接种于LB培养基中，30℃，220rpm培养24h，4000rpm离心，并收集菌体，提取Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组(NCBI上的编号为CP025533.1)，利用引物对dkgA-C-F/dkgA-C-R1进行谷氨酸棒状杆菌来源的2,5-DKG还原酶的扩增。并回收PCR产物。得到来源于Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032的2,5-DKG还原酶DKGRA-C。
将Tatumella citrea CICC10802活化后接种于LB培养基中，30℃，220rpm培养24h，4000rpm离心，并收集菌体，提取Tatumella citrea CICC10802基因组(NCBI上的编号为CP015579.1)，分别利用引物对dkgA-T-F/dkgA-T-R1和dkgB-T-F\dkgB-T-R进行柠檬塔特姆氏菌来源的2,5-DKG还原酶的扩增。分别利用引物对akr1-T-F\akr2-T-R、akr2-T-F\akr2-T-R、akr3-T-F\akr3-T-R对柠檬塔特姆氏菌来源的不同醛酮还原酶进行扩增。并回收PCR产物。得到来源于Tatumella citrea CICC10802的2,5-DKG还原酶DKGRA-T、2,5-DKG还原酶DKGRB-T，醛酮还原酶AKR1-T、醛酮还原酶AKR2-T和醛酮还原酶AKR3-T。
所涉及的引物序列如表1所示。
表1所用引物
Figure BDA0004119414140000061
Figure BDA0004119414140000071
(2)表达载体的构建
使用引物对F/R对pET28a(+)载体进行扩增，并回收PCR产物。
PCR反应体系均为：25μL 2×Phanta Max Master Mix，1μL正向引物(10μmol·L-1)，1μL反向引物(10μmol·L-1)，1μL模板DNA，加入蒸馏水至50μL。L-山梨酮脱氢酶PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入30个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，4℃保温。pET28a(+)质粒线性化PCR扩增程序设定为：首先，95℃预变性3min；然后进入25个循环：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
将所克隆的不同2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶的pcr产物分别和20ng pET28a(+)线性化载体混合，利用Infusion-Cloning试剂盒进行连接，构建质粒pET28a(+)-DKGR\AKR。将10μLpET28a(+)-DKGR\AKR连接产物转入BL21(DE3)感受态中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入1ml LB培养基，37℃，220rpm培养45min，3000rpm离心3min，去掉上清，将菌体重悬于100μl LB培养基中，涂布在含有50mg/L硫酸卡那霉素的LB平板中，培养过夜。挑选阳性克隆进行测序，验证质粒的是否正确。
分别制备得到重组菌株：E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-DKGRA-G，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-DKGRA-C，E.coli BL21(DE3)/PET28a(+)-DKGRA-T，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-DKGRB-T，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-yhdN-G，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-yeaE-G，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-psakr-G，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-pakr-G，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-akr1-T，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-akr2-T，E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-akr3-T。
(3)不同来源2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶的表达
分别将测序正确的重组菌株转移至含有50mg/L硫酸卡那霉素的10ml LB中培养，在37℃，220rpm条件下，培养12h，制备种子液。
将培养好的种子液以2％(v/v)转接至含有50mg/L硫酸卡那霉素的50ml TB培养基中，待菌体浓度达到OD600＝0.8时降温至20℃，并添加IPTG至终浓度0.5mM诱导，以表达目的酶；分别制备得到不同来源2,5-DKG还原酶、醛酮还原酶的发酵液。
实施例2：不同来源2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶的纯酶的制备
(1)粗酶液的制备
实施例中所用的2,5-DKG还原酶及醛酮还原酶的纯化过程均在4℃下进行。
首先将实施例2得到的发酵液离心，弃上清收集菌体细胞，使用PBS溶液反复清洗三次，随后使用高压匀浆仪进行破碎，压力范围800-1000bar，反复破碎3次；12000g，30min离心破碎液去除未破碎细胞，并将上清液通过0.45μm的滤膜，得到粗酶液(图2)。
(2)纯酶液的制备
粗酶液使用Ni-NAT亲和层析柱过滤得到纯酶液。首先用A液平衡Ni-NAT层析柱。粗酶液以3ml/min流速上样。待粗酶液上样完毕后，再次用A液平衡层析柱。之后利用B液进行梯度洗脱(0-100％ B液；30min)。收集洗脱峰并验证，获得纯酶液。
实施例3：不同来源2,5-DKG还原酶催化能力对比
具体步骤如下：
(1)分别检测不同来源2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶纯酶液的比酶活，结果如表2及图3所示。
表2：不同来源2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶纯酶液的比酶活
酶 比酶活(U/mg)
WT 0
AKRr1-T 0
AKR2-T 0
AKR3-T 0
YhdN-G 0
YeaE-G 0
psAKR-G 0
pAKR-G 0
DKGRA-T 234.66667
DKGRB-T 255.33333
DKGRA-C 575.33333
DKGRA-G 1676.66667
结果显示，在三种不同微生物来源的2,5-DKG还原酶与醛酮还原酶中，G.oxydansATCC9937来源的2,5-DKG还原酶(DKGRA-G)比酶活远高于其他2,5-DKG还原酶，为1677U/mg。这是文献中报道的C.glutamicum来源的2,5-DKG还原酶DKGRA-C(533U/mg)的2.5倍。T.citrea来源的2,5-DKG还原酶的比酶活最低，分别为235U/mg(DKGRA-T)和255U/mg(DKGRB-T)。其它的醛酮还原酶并未表现出催化2,5-DKG的能力。这表明本发明所发现的新型2,5-DKG还原酶对2,5-DKG有着更强的催化活性。
实施例4：G.oxydans ATCC9937来源2,5-DKG还原酶pH稳定性
具体步骤如下：
使用以下20mM缓冲液在pH 3.5-10.0范围内测定pH对2,5-DKG还原酶活性的影响：醋酸钠缓冲液(pH 3.5-6.0)、Tris-HCl缓冲液(pH 6.0-8.0)、甘氨酸缓冲液(8.0-10.0)，检测方式参照具体酶活的检测。使用微孔板读取器进行三次测量。
结果显示，由图4可看出，G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶最适pH在pH5.5-8.5之间，其酶活几乎不受不同缓冲液的影响，pH偏碱性时其催化能力要强于酸性，但当pH高于8.5时催化能力开始显著降低。当反应pH低于5.5时，其催化活性也会快速降低。这表明本发明所发现的新型2,5-DKG还原酶在常规pH中比较稳定。
实施例5：温度对G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶催化活性影响
具体步骤如下：
将2,5-DKG还原酶溶液分为5份，在20℃～40℃(10℃间隔)下加热80分钟，每隔20分钟取样检测酶活性。以初始酶活性为100％，计算在不同温度下加热不同时间后酶活性的剩余量。酶活检测方式参照具体酶活的检测。
结果显示(图5)，在20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中当温度低于40℃时放置80min对酶活几乎未造成影响，80min后本发明所发现的2,5-DKGhuan原酶仍能保持90％以上的酶活。在4℃保存下放置72h后DKGA-G仍能保持80％以上的催化活性。
当温度升高至50℃时，放置20min酶活降低至初始酶活的80％，继续放置至80min酶活未再出现明显降低。
当温度高于60℃时，随着保存时间的增加酶活出现快速降低，20min后酶活剩余约70％，40min后酶活剩余约30％，直至80min酶活完全丧失。其最适催化温度再20-30℃之间，在该温度区间内G.oxydans来源的2,5-DKG还原酶在检测时间内始终能保持95％以上的催化活性。
实施例6：常见金属离子对G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶催化能力影响具体步骤如下：
在各种盐的存在下测定酶的催化活性。酶活性检测方法参照上述方法。分别取氯化钠、氯化钙、氯化镁和氯化镁配置成浓度为1mol/L的母液。使用时稀释，各金属离子浓度梯度设置为0、10mM、25mM、50mM、100mM、200mM、250mM。通过对比2,5-DKG还原酶在不同金属离子存在下催化活性的变化来判断常见金属离子对2,5-DKG还原酶的催化活性的影响。结果如表3所示。
表3：不同金属离子对酶活的影响
Figure BDA0004119414140000101
结果显示(图6)，当体系中添加不同浓度钠离子时，随着钠离子浓度的增加，其催化能力逐渐增加，当添加量为250mM时，催化能力大幅度提升。
而钙离子的添加明显对G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶催化能力由一定抑制作用。当钙离子浓度大于100mM时，G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶几乎完全丧失催化能力。
钾离子对G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶催化能力促进作用较为明显，随着添加浓度的增加，其消耗底物的速度也加快。
而镁离子浓度在低于200mM时对G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶催化能力有促进作用，浓度为200mM时促进作用最为明显，当浓度高于200mM时其开始抑制G.oxydans ATCC9937来源的2,5-DKG还原酶的催化能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶的重组菌添加至含有2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的反应体系中，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述2,5-DKG还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中的反应条件为：25-30，常压，pH 5.0～7.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应体系中2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的添加量为：2mM；所述2,5-DKG还原酶的添加量为：50μL，所述反应体系中NADPH的添加量为2mM。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶的重组菌是以细菌或真菌为表达宿主。
6.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码所述2,5-DKG还原酶的基因或携带核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码所述2,5-DKG还原酶的基因的重组载体在制备2-酮基-L-古龙酸或含有2-酮基-L-古龙酸的产品中的应用。
7.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述重组载体是以pET28a或pCDFDUET为表达载体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主。
9.一种提高2-酮基-L-古龙酸产量的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2,5-DKG还原酶的重组菌添加至含有2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的反应体系中，进行反应，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，编码所述2,5-DKG还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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