CN116286557A - 一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法，属于微生物发酵领域。本发明所述所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63139，保藏日期为2023年02月28日。本发明公布的贝莱斯芽孢杆菌筛选自酱醪，其能在0~10%盐浓度下生长，在90℃水浴下处理10 min后依然能存活，并对模拟胃肠液和0.1~0.5%浓度的胆盐耐受性良好，本发明所述的耐盐贝莱斯芽孢杆菌经优化后其羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别343.45±5.23 U/mL和167.62±3.89 U/mL，具有较高的纤维素酶活，在降解纤维素领域具有一定的应用价值。
Description
技术领域
本发明具体涉及一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法，属于微生物发酵领域。
背景技术
贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种，得益于芽孢杆菌的芽孢结构，芽孢杆菌通常耐受性较强，即使在极端环境也能生存，因此其应用范围较广，现有专利中报道（公开号为CN109576179A的中国发明专利）贝莱斯芽孢杆菌能够耐受10 %盐浓度。目前关于贝莱斯芽孢杆菌的应用主要集中于促进植物生长和生物防治领域，较少关于降解工农业副产物纤维素方面的报道。纤维素的生物处理法是指通过微生物发酵产生的纤维素酶降纤维素，微生物发酵过程中还会产生有机酸和各种活性物质，可改善饲料营养价值，是目前纤维素降解的研究热点。
酱油渣是酱油酿造的副产物，新鲜酱油渣含水量高，极易腐败变质。酱油渣约含20%-30%的粗蛋白，5%-15%的粗脂肪和丰富的大豆异黄酮等营养物质，是较有潜力的蛋白饲料资源，具有一定的饲用价值。但因其较高的粗纤维含量（约20%-30%），直接用于饲料会使饲料适口性差，造成动物采食量和机体消化率偏低，另外，酱油渣的含盐量亦偏高，一般在8%以下，含盐量高抑制了部分微生物的生长，且经过饲料加工过程中的热处理后，大部分菌株无法存活，动物胃肠液中的低酸环境和胆盐等抗生长因素亦不利于菌株生存。
因此，筛选高产纤维素酶且能耐受一定的盐、高温、模拟胃肠液和胆盐的细菌，充分降解酱油渣中的粗纤维，进入动物机体内发挥益生特性，是酱油渣饲料化利用的关键。
发明内容
本发明从酱醪样品中筛选出一株芽孢杆菌，经16S rRNA比对分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。该菌株高产纤维素酶，对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐耐受性较强，说明其有具有较好的纤维素降解应用潜力，可作为酱油渣等以高盐物质为原料的发酵饲料候选菌株。
本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FHZJL-221，所述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63139，保藏日期为2023年02月28日。
所述的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221筛选自酱醪，对菌株进行菌株形态学和分子鉴定，所筛菌株与贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA序列相似性高达99%以上，将其命名为贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221。
所述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的菌株形态学特征为，菌落大致呈乳白色圆形，边缘不规则，中央微凸，表面较粗糙且有皱褶。在显微镜下观察菌体呈杆状，单个或成对排列。
在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221能在盐度为0~10%的LB培养基下生长。
在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221能在50℃~90℃水浴10 min的处理下存活。
在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221能在模拟肠和模拟胃液处理3 h下存活，能在0.1~0.5%浓度胆盐处理4 h下存活。
本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221，或含有其发酵液，或含有其冻干粉，或含有其裂解物。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的含量不少于：1×105CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明提供了一种产品，所述产品中含有上述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221或上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌的含量不少于：1×105CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述化学品包括但不限于纤维素降解剂、脱毛剂、饲料添加菌剂、益生菌剂。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221或上述微生物菌剂在制备降解纤维素中的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的含量不少于：1×105CFU/mL或1×106CFU/g。
本发明还提供了一种降解纤维素的方法，所述方法为，向含有纤维素的反应体系中添加上述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221，或上述微生物菌剂。
本发明还提供了一种发酵产纤维素酶的方法，所述方法为先将上述贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液后离心取上清即为粗酶液。
本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的产纤维素酶条件的响应面优化方法，步骤如下：
步骤一：进行单因素实验，包括菌株的培养时间、接种量、培养温度和起始pH；
步骤二：在单因素实验的基础上，应用Design Expert 12软件根据Box-Behnken实验设计原理，设计4因素3水平实验方案进行响应面实验分析；
步骤三：根据步骤二设计的实验方案完成实验，得到对应各组的纤维素酶活；
步骤四：根据实验结果建立模型回归方程并进行方差分析，输出响应面图并判断各参数对响应值的影响情况，最终根据优化结果得到关于菌株FHZJL-221最佳的产酶条件。
在本发明的一种实施方式中，步骤四所确定优化的最佳产酶条件组合为：培养时间58 h、接种量5.0%、培养温度37.0 ℃、起始pH为6.0。
在本发明的一种实施方式中，步骤1所述的产酶条件范围如下：培养时间为12、24、36、48、60、72、84 h，接种量为2%、4%、6%、8%、10%、12%，培养温度为27、32、37、42、47、52 ℃和起始pH为5、6、7、8、9、10。
有益效果
（1）本发明得到一株对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐耐受性较强的高产纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221，产纤维素酶活力较高，经产酶条件优化后羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别达343.45±5.23 U/mL和167.62±3.89 U/mL，是一株具有良好耐受性的高产纤维素酶贝莱斯芽孢杆菌，具有降解高盐度物质纤维素与作为饲料添加菌剂的潜力。
（2）本发明的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐均具有较好的耐受性，结果表明贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221能耐受最高10%的盐浓度，在90℃水浴下处理10 min后依然能存活，并对模拟胃肠液和0.1~0.5%浓度的胆盐耐受性良好，良好的耐受性说明该菌株在经过饲料热加工处理后可存活，并有望进入动物体内发挥其益生特性。
（3）本发明还提供了一种贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的产纤维素酶条件的响应面优化方法，确定了培养时间、接种量和起始pH和培养温度间的最佳组合和交互关系，优化后羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活分别提高7%和35%。
生物材料保藏：
一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FHZJL-221，分类命名为Bacillus velezensis，已于2023年02月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63139，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221在CMC-Na琼脂平板上形成的水解圈。
图2：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221涂布菌落形态图与革兰氏染色镜检图。
图3：基于贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221 16S rRNA序列构建的***发育树。
图4：培养时间对贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221产酶活性的影响。
图5：接种量对贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221产酶活性的影响。
图6：起始pH对贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221产酶活性的影响。
图7：培养温度对贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221产酶活性的影响。
图8A、图8B：各因素交互作用对羧甲基纤维素酶活影响的3D响应面图。
图8C、图8D：各因素交互作用对滤纸酶活影响的3D响应面图。
具体实施方式
下列实施例中涉及的培养基与试剂配制方法：
LB液体培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，酵母粉5 g，葡萄糖1 g，蒸馏水1 L。
CMC-Na筛选培养基：CMC-Na 10 g，KH2PO41 g，(NH4)2SO41 g，酵母粉1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L。
产酶发酵培养基：CMC-Na 10 g，蛋白胨 5 g，(NH4)2SO22g，KH2PO42 g，酵母粉1 g，MgSO40.5 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO40.02 g。
模拟胃液：用蒸馏水溶解1 g胃蛋白酶并用盐酸调节pH至3.0，定容至100 mL，过0.22 μm滤膜除菌备用。
模拟肠液：用500 mL蒸馏水溶解6.8 g磷酸二氢钾，再用0.4%氢氧化钠溶液调整pH为7.5，另取适量蒸馏水溶解10 g胰蛋白酶，将两种溶液混合后再加蒸馏水稀释至1000 mL，过0.22 μm滤膜除菌备用。
下述实施例中所涉及的检测方法：
羧甲基纤维素酶活测定方法
在试管中加1.5 mL含1 % CMC-Na的柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）作为底物，预热后加入0.5 mL粗酶液并震荡混匀，置于50 ℃水浴中反应30 min后立即加入2 mL DNS溶液终止反应，置于沸水浴10 min后迅速冷却并用蒸馏水定容至10 mL，在540 nm波长下测定吸光值。对照组的处理为先加2 mL DNS溶液后加粗酶液。
一个酶活单位： 1 mL粗酶液在1 min内水解CMC-Na产生1 μg还原糖所需酶量为一个酶活单位（U）。
滤纸酶活测定方法
在试管中加入一条滤纸（1 cm×6 cm，约50mg）和1.5 mL柠檬酸钠缓冲液（pH 4.8）作为底物，预热后加入0.5 mL粗酶液并震荡混匀，置于50 ℃水浴中反应60 min后立即加入2 mL DNS溶液终止反应，其余步骤和对照组处理与上述羧甲基纤维素酶活测定方法相同。
一个酶活单位：1 mL粗酶液在1 min内水解滤纸产生1 μg还原糖所需酶量为一个酶活单位（U）。
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例1：纤维素降解菌株的分离和筛选
1、菌株分离与初筛
取10 g酱醪样品加入到装有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分震荡混匀后静置30min后取0.1 mL上清液进行梯度稀释。分别取稀释度为10-3-10-6的稀释菌液0.1 mL涂布于CMC-Na筛选培养基上，以涂布无菌水为对照，每个稀释度菌液做3次重复。
涂布后置于37 ℃恒温培养箱倒置培养24 h，挑取生长较快的菌株进行三区划线纯化得到单菌落。
将上述操作得到的纯化菌株点接于CMC-Na琼脂平板上，37 ℃倒置培养48 h，将适量1 mg/mL刚果红染液倒入平板染色30 min后倾去染液，使用1 mol/L的NaCl溶液脱色30min，菌株FHZJL-221在CMC-Na琼脂平板上形成的水解圈如图1所示，测定相应菌株的透明圈直径（D）和菌落直径（d），选择D/d值较大的菌株进行复筛。
2、菌株纤维素酶活测定
将初筛后的菌株活化后接入LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h后作为种子液。将种子液以2%（v/v）的接种量接入50 mL产酶发酵培养基中，在37 ℃、180 r/min条件下发酵培养48 h，发酵液于4 ℃、8000 rpm下离心15 min后取上清液即为粗酶液。
测定上述粗酶液中羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活，各菌株的D/d值、羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活如表1所示。
表1：纤维素降解菌的D/d值与纤维素酶活
表中不同的字母表示各菌株间酶活差异显著（p<0.05）。
结果显示，共筛选出9株菌，分别命名为FHZJL-214，FHZJL-215，FHZJL-216，FHZJL-217，FHZJL-218，FHZJL-219，FHZJL-220，FHZJL-221，FHZJL-222。其中菌株FHZJL-221的D/d值为2.74，羧甲基纤维素酶活为321.08 U/mL，滤纸酶活为124.33 U/mL均为最高，故选定FHZJL-221进行下一步鉴定。
实施例2：纤维素降解菌的鉴定
1、菌株形态观察
将菌株FHZJL-221在 LB固体培养基均匀涂布，37 ℃倒置培养24 h，观察菌落表面形态。挑取少许单菌落经革兰氏染色后置于光学显微镜下观察。
单菌落和显微镜观察图如图2所示，菌落大致呈乳白色圆形，边缘不规则，中央微凸，表面较粗糙且有皱褶。菌株革兰氏染色呈阳性，在显微镜下观察，菌体呈杆状，单个或成对排列，初步判定为芽孢杆菌属。
2、菌株的分子鉴定
使用细菌DNA 提取试剂盒提取菌株 DNA。以鉴定菌株的DNA为模板，按以下反应体系及扩增条件进行PCR扩增反应：
16S rRNA PCR反应体系（50 μL）：2 μL Template，27F及1492R引物各1 μL（10 μM），5 μL 10X PCR Buffer，3 μL Mg2+（25 mM），1 μL dNTPs（10 mM），1 μL Easy Taq DNAPolymeras（5 U/μL），36 μL ddH2O。
反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保温5 s。
吸取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若目标产物片段长度在1500bp左右则表明扩增成功。将所得测序结果在 NCBI进行Blast比对，在 GenBank 数据库中获取相似性较高的 16S rRNA 序列，并进行同源性分析并构建菌株***发育树。
***发育树如图3所示，菌株FHZJL-221与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的16S rRNA序列相似性高达99%以上。综合菌株菌落形态和显微镜观察及分子鉴定结果，鉴定该菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），将其命名为贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221对盐、高温、模拟胃肠液和胆盐耐受能力的测定
1、种子液的制备
将保存于-80 ℃的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221甘油管梯度解冻后，取0.4 mL菌液接入至50 mL的LB液体培养基中，置于37 ℃、180 r/min活化24 h后，将活化后的菌液，按照2%（v/v）的接种量，继续接入LB液体培养基中，按照上述方法进行活化，活化至第三代后取处于生长对数期的贝莱斯芽孢杆菌菌液，调节OD600nm为0.6~0.8，即为贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221种子液。
2、对不同盐浓度的耐受性
取上述步骤1得到的种子液以2%（v/v）的接种量分别接种到盐质量浓度为 5%、10%、15%的LB液体培养基中，37 ℃培养24 h，测定OD600nm处的吸光值，以0%盐浓度的LB培养基作为对照组，以生长速率评价菌株对盐的耐受性。
生长速率（%）=（不同盐浓度培养的菌液OD600nm）/（对照组菌液OD600nm）×100。实验结果如表2所示。
表2：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221在不同盐浓度下的生长速率
结果显示，5%盐浓度对贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的生长速率几乎不受影响，10%盐浓度的生长速率降低至59.13%，15%盐浓度下菌株已不生长，说明FHZJL-221最高能耐受10%盐浓度。
3、对高温的耐受性
高温组：将上述步骤1得到的种子液分别置于温度为50℃、70 ℃、90 ℃的水浴10min后迅速冷却；对照组以37 ℃水浴处理10 min；
分别将高温组和对照组梯度稀释，选择稀释度为107的稀释液进行平板涂布，涂布后将平板置于37 ℃恒温培养箱倒置培养24 h后进行平板菌落计数。
存活率（%）=（lg Nn/ lg Nm）×100，式中Nm对照组的活菌数（CFU/mL），Nn为经过不同温度水浴处理后的活菌数（CFU/mL），结果如表3所示。
表3：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221在不同温度处理下的存活率
结果显示，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的存活率随着温度的增加而降低，50 ℃时FHZJL-221的存活率达97%，但温度升至70 ℃和90 ℃时存活率降低明显，分别为34.21%和32.65%。芽孢杆菌的营养体不耐热，温度达70℃时已菌株贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221营养体大部分已死亡，导致存活率大幅降低，但贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221芽孢耐热能力较强，能耐受90 ℃高温。
4、对模拟胃肠液和不同浓度胆盐的耐受性
将上述步骤1得到的种子液以10%（v/v）的接种量，分别接种至模拟胃液和模拟肠液中，37 ℃水浴静置3 h，取样液稀释至107后涂布平板，置于37 ℃培养箱培养24 h后进行平板菌落计数。
另取上述步骤1得到的种子液按10%（v/v）的接种量，分别接种至猪胆盐浓度为0.1%、0.3%和0.5%的 LB 培养基中，置于37 ℃水浴静置 4 h后涂布平板计数，菌株存活率公式同步骤3。
结果如表4所示。
表4：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221经模拟胃肠液和不同浓度胆盐处理后的存活率
结果显示，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221经模拟胃肠液处理3 h存活率分别为85.68%和95.79%，对模拟肠胃液的耐受性良好，并能耐受0.1~0.5%浓度的胆盐。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的产纤维素酶条件的响应面优化方法
具体步骤如下：
1、采用单因素实验探究产酶条件对菌株羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活的影响，包括菌株的培养时间、接种量、培养温度和起始pH。
2、在单因素实验的基础上，选择影响显著的因素范围，以羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活为响应值，使用Design Expert 12软件根据Box-Behnken实验设计原理，设计4因素3水平实验方案（表5）进行响应面实验分析。
表5：Box-Behnke响应面设计
（1）菌株FHZJL-221的活化方法具体为，将保存于-20 ℃冰箱的冷冻菌液接入LB培养基，活化3代以上后再接入LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h后作为种子液。
（2）保持培养温度37℃、起始pH 7和接种量2%不变，所述产酶条件中培养时间分别为调节为12、24、36、48、60、72 h，测定粗酶液的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。
（3）保持培养温度37℃、起始pH 7和培养时间24 h不变，所述产酶条件中种子液的接种量调节为2%、4%、6%、8%、10%、12%，测定粗酶液的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。
（4）保持起始pH 7、接种量2%和培养时间24 h不变，所述产酶条件中培养温度调节为27、32、37、42、47、52 ℃，测定粗酶液的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。
（5）保持培养温度37℃、培养时间24 h和接种量2%不变，所述产酶条件中培养基的起始pH调节为5、6、7、8、9、10，测定粗酶液的羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活。
单因素实验结果如图4、图5、图6和图7所示。
3、所述的建立响应面模型，分析实验结果，确定优化参数是指，将响应值输入Design Expert软件，根据软件来分析结果，输出响应面图并判断各参数对响应值的影响情况，最终根据优化结果得到关于贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221最佳的产酶条件。按照表6的产酶条件组合一共进行29次实验，实验结果如表6所示。
表6：Box-Behnke响应面设计结果
4、利用软件Design-Expert 12.0 对实验结果进行多元拟合分析，得到羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活关于自变量的二次多项回归方程：
Y (羧甲基纤维素酶活) = 333.86 – 30.58A + 8.32B – 4.23C – 2.54D +3.64AB + 10.08AC + 1.62AD – 0.65BC – 5.26BD – 26.00CD – 43.69A² – 15.64B² –39.32C² – 36.70D²。
Y (滤纸酶活) = 167.18 – 7.6A + 9.14B – 10.26C – 8.45D – 10.85AB –1.38AC + 5.47AD – 4.33BC + 5.35BD + 1.42CD – 72.98A² – 17.57B² – 37.2C² –50.24D²。
表7：羧甲基纤维素酶活回归模型方差分析
表8：滤纸酶活回归模型方差分析
两个响应面模型的方差分析如表7和表8所示，羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活响应面模型F值分别为13.38和14.39，两个模型都达到极显著水平（p<0.01）。羧甲基纤维素酶活模型决定系数R2=0.9304，滤纸酶活模型决定系数R2=0.9350，表明两个响应面模型均能拟合超过93.0%响应值。羧甲基纤维素酶活模型和滤纸酶活模型信噪比为11.61和11.77，均大于4，且两个模型失拟项均不显著（p>0.05），证明两个模型可信度和拟合度较好。
羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活响应面模型符合以上检验原则，说明两个模型的模拟性以及适应性较好，可将模型应用于对贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221 产羧甲基纤维素酶和滤纸酶的分析预测及条件优化。
5、响应面图分析：图8A~图8D是由响应面模型拟合两两不同因素间交互作用对羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活影响的3D响应面图。由图8A~图8D可知，两个模型所有两两交互因素的响应面图曲面均呈凸面陡峭，说明均存在极值。
在羧甲基纤维素酶活回归模型中，CD交互因素响应面图表现为陡峭程度高，等高线呈椭圆，结合方差分析，说明其对响应值影响显著（p<0.05），即培养温度和起始pH的交互作用对羧甲基纤维素酶活的影响最大。AB、AC、AD、BC、BD交互因素对响应值有一定的交互作用但其对响应值的影响均不显著（p>0.05）。在滤纸酶活回归模型中，所有交互因素对响应值的影响均不显著（p>0.05），但结合响应面图陡峭程度、等高线及方差分析可知，AB交互因素对响应值的交互作用较强，即培养时间和接种量的交互作用对滤纸酶活的影响较强。
6、综合两个响应面模型的实验结果，得到关于贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221 羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活的最佳产酶条件：
将贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221保存于-20 ℃冰箱的冷冻菌液接入LB液体培养基，活化3代以上后再接入LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h后作为种子液，OD600nm为0.6~0.8；
将制备得到的种子液按照5.0%(v/v)接种量接种至产酶发酵培养基中，在温度37.0℃、起始pH为6.0的条件下发酵培养时间为58 h；
在该产酶条件下重复实验3次以验证回归模型的准确性，测得羧甲基纤维素和滤纸酶活为343.45±5.23 U/mL和167.62±3.89 U/mL，与模型预测值相差较小。
与未优化产酶条件前（条件为：将贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221保存于-20 ℃冰箱的冷冻菌液接入LB培养基，活化3代以上后再接入LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养24 h后作为种子液，OD600nm为0.6~0.8；将制备得到的种子液按照2.0%(v/v)接种量接种至产酶发酵培养基中，在温度37.0℃、起始pH为7.0的条件下发酵，培养时间为24 h）相比，优化后羧甲基纤维素酶活（酶活为：343.45 U/mL）和滤纸酶活（酶活为：167.62 U/mL）分别提高7%和35%，说明回归模型可较好的应用于菌株FHZJL-221 产羧甲基纤维素和滤纸酶的条件优化实验中。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FHZJL-221，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63139，保藏日期为2023年02月28日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221，或含有其发酵液，或含有其冻干粉，或含有其裂解物。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的含量不少于：1×105 CFU/mL或1×106 CFU/g。
4.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221或权利要求2或3所述的微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的含量不少于：1×105 CFU/mL或1×106 CFU/g。
6.如权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品为化学品。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述化学品包括纤维素降解剂、脱毛剂。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221或权利要求2或3所述的微生物菌剂在制备降解纤维素中的产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品中，贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221的含量不少于：1×105 CFU/mL或1×106 CFU/g。
10.一种降解纤维素的方法，其特征在于，向含有纤维素的反应体系中添加权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌FHZJL-221，或权利要求2或3所述的微生物菌剂。
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