CN116251224B - 一种乳铁蛋白凝胶敷料及其应用 - Google Patents

一种乳铁蛋白凝胶敷料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳铁蛋白凝胶敷料及其应用，所述敷料包括外层和里层，所述外层为聚氨酯薄膜，所述里层为甜菜碱改性透明质酸与乳铁蛋白的复合凝胶；所述聚氨酯外层具有良好的弹性和延展性，隔绝细菌同时能够进行水汽交换；所述凝胶里层不仅提供湿润的愈合环境、吸收渗出液、完全被吸收降解，且发挥了季铵与乳铁蛋白的协同抗菌作用，两层综合能够大大提高敷料的耐用性。

Description

一种乳铁蛋白凝胶敷料及其应用
技术领域
本发明属于合成生物医学材料技术领域，具体涉及一种乳铁蛋白凝胶敷料及其应用。
背景技术
乳铁蛋白(Lactoferrin ,LF)是一种具有多种生理功能的天然活性铁结合糖蛋白，主要来源于哺乳动物的乳汁中，它不仅参与生物体内铁的转运，促进骨细胞生长、分化，而且还具有抗微生物、抗病毒、抗氧化、抗癌等功能。在诸多生物学功能当中，其抗菌活性是最引人注目。大量研究表明，乳铁蛋白对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及一些真菌表现出良好的抑制能力，且对人体无毒副作用，被公认为是一种安全的食品防腐辅助剂，广泛地应用于食品领域。
目前乳铁蛋白应用于伤口敷料的报道较少，王琲报道了一种乳铁蛋白/硅酸镁锂通过离子键复合的可注射水凝胶伤口敷料，该水凝胶敷料的水分挥发后呈粉末状，在伤口上不能持久发挥作用，且难以清洗或清洗时容易发生二次感染（王琲. 乳铁蛋白/硅酸镁锂可注射水凝胶的制备及促进伤口愈合的研究[D].兰州大学, 2022）。中国专利CN107496971 B报道了一种细菌纤维素负载乳铁蛋白敷料，该敷料不具有粘性，在皮肤上容易掉落。
发明内容
针对现有技术中含有乳铁蛋白伤口敷料的不足，本发明提供一种乳铁蛋白凝胶敷料，该敷料包括外层和里层，外层为聚氨酯薄膜，里层为甜菜碱改性透明质酸与乳铁蛋白的复合凝胶。
所述外层提供弹性和延展性，可以抵抗外力破坏和防止水分过快的挥发；所述里层具有粘性可持久稳定的粘附的皮肤表面，且具有很强的保湿性，且可以吸收伤口分泌液，为创面提供湿润的环境促进愈。
所述聚氨酯薄膜厚度为0.8mm。
进一步的所述甜菜碱改性透明质酸制备方法如下：
透明质酸在碱性条件下与1,2-环氧-3-(二乙基氨基)丙烷加热搅拌反应得到胺基接枝透明质酸；胺基接枝透明质酸与1,3-丙烷磺内酯(PS)在四氢呋喃中加热反应，纯化干燥后得到甜菜碱改性透明质酸。
所述透明质酸分子量为10-80万。
所述透明质酸与1,2-环氧-3-(二乙基氨基)丙烷的投料质量比例为1:0.4。
所述胺基接枝透明质酸与1,3-丙烷磺内酯的投料质量比例为1:0.4。
进一步将甜菜碱改性透明质酸溶液与乳铁蛋白溶液混合，得到溶胶液，两者的混合比例为1：0.5~0.8。
所述甜菜碱改性透明质酸溶液为1g/mL，溶剂为Tris-HCl蛋白缓冲液；所述乳铁蛋白溶液为0.2g/mL，溶剂为Tris-HCl蛋白缓冲液。
进一步的采用涂抹法将凝胶附着于聚氨酯薄膜上，具体为：将溶胶液旋涂于聚氨酯薄膜上，在常温真空下干燥3~4h制备得到敷料。
控制凝胶层的厚度为0.5~1mm。
本发明提供的敷料包括聚氨酯外层和凝胶里层，所述聚氨酯外层具有良好的弹性和延展性，隔绝细菌同时能够进行水汽交换；所述凝胶里层能够提供湿润的愈合环境，且能够在皮肤表面完全降解并且被吸收，两者综合能够大大提高敷料的耐用性。
所述甜菜碱改性透明质酸溶液与乳铁蛋白溶液混合后的凝胶原理如下：乳铁蛋白带正点，而甜菜碱含有磺酸基（SO3 -）和季铵（N+），两者混合后，乳铁蛋白与磺酸基静电吸引，从而乳铁蛋白成为了改性透明质酸的交联剂，形成网状交联物；由于两者都有较高的水溶性，当混合物在水中的浓度较低时为溶胶状态，随着含水量越低，从而形成凝胶。进一步的，甜菜碱中自由的季铵由于带负电，因此也具有良好的抑菌性，由此可见，乳铁蛋白与季铵具有协同的抗菌作用。乳铁蛋白具有强大的铁结合能力，可与细菌繁殖所需铁离子竞争性螯合，减少了细菌与铁离子的结合，降低了细菌生长过程中所需的营养吸收，抑制其生长；而季铵带正电，能够破坏细菌细胞膜表面的负电，从而使得细胞膜破裂，从而起到杀菌的作用。
有益效果
本发明提供的敷料的内层起到保湿、吸收渗出液、抑菌、消炎的作用，同时能够完全降解并被皮肤吸收，具有良好的安全性。
本发明提供的敷料外层具有良好的弹性和延展性，里层具有协同抑菌因子，大大延长了敷料的耐久性。
附图说明
图1为生物毒性实验结果-细胞的形态图。
图2为乳铁蛋白、甜菜碱改性透明质酸、凝胶样品4的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
将10g透明质酸溶于100mL异丙醇溶液中，并加入5mL质量浓度为20%的NaOH溶液，然后放入室温的水浴锅中磁力搅拌2h，加入4g 1,2-环氧-3-(二乙基氨基)丙烷搅拌均匀，调节pH=8，60℃下继续搅拌10h，反应结束后将得到的溶液倒入HCl质量浓度为20%的甲醇溶液中沉淀析出，抽滤得到沉淀物，用乙醇洗涤沉淀物并过滤，减压下干燥得到胺基接枝透明质酸。
将胺基接枝透明质酸和1,3-丙烷磺内酯(PS)用四氢呋喃溶解后装入圆底烧瓶中，于50℃水浴中加热搅拌12h后，挥发溶剂，得到的粗产物用水溶解后，在10000Da透析袋在水里透析3天，干燥得到甜菜碱改性透明质酸。胺基接枝透明质酸与1,3-丙烷磺内酯的投料质量比例为1:0.4。
透明质酸的分子量分别为10~20万、20~40万、40~80万，得到的甜菜碱改性透明质酸分别命名为HA-1、HA-2、HA-3。透明质酸购于上海麦克林生化科技股份有限公司。
实施例2
制备水凝胶。
配制Tris-HCl蛋白缓冲液：将50mL 0.1M Tris溶液与42mL 0.1M HCl溶液混合，定容至100mL(pH 7.4)，然后在0 .08～0 .1MPa压力下蒸汽灭菌30min，经冷藏得到蛋白缓冲液。
分别配制1g/mL的甜菜碱改性透明质酸溶液和0.2g/mL的乳铁蛋白溶液。
所述乳铁蛋白购于百川生物科技有限公司。
不同的甜菜碱改性透明质酸及不同的混合比列制备得到的凝胶列于表1。
表1
实施例3
将聚氨酯薄膜剪裁成3×3cm的样片，用毛刷蘸取实施例2得到的溶胶液涂抹在样片的一面，在常温真空下干燥3~4h，重复涂抹和干燥，直至凝胶层厚度为0.5~1mm之间。
聚氨酯薄膜购于上海鑫亘环保科技有限公司，厚度为0.8mm。
实施例4
对敷料的粘性进行测试。
通过测试敷料与光滑玻璃片（硫酸表面处理）间粘结后的剥离力来表征薄膜的粘性。将薄膜裁成10mm×60mm的长条状样条，将样条一面贴在光滑玻璃片上，施加一定压力让敷料与玻璃片紧密贴合后放入37℃烘箱中静置2h。样条取出后用拉力机测试180°剥离样条所需的力，剥离速率为50mm/min。
实施例5
测试凝胶的体外抗菌性。
抑菌活性测试：以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为测试菌种，菌液为用PBS缓冲溶液分别稀释到1.4×104CFU/mL（大肠杆菌）和1×106CFU/mL（金黄色葡萄球菌）。敷料灭菌后加入到75mL细菌溶液中，于恒温振荡器中振荡接触12h，然后取出适量菌液涂板培养，根据生长的菌落个数计算菌液浓度并计算抑菌率，抑菌率计算公式如下：
其中Wt是空白对照组菌液的浓度；Qt是样品与菌液接触之后菌液的浓度。
实施例4和实施例5的测试结果列于表2。
表2
从结果可以看出，本发明提供的敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较高的抑菌性，甜菜碱改性透明质酸溶液与乳铁蛋白交联凝胶后，由于甜菜碱中自由的季铵的存在，凝胶的负电性没有因为两者的静电吸引结合没有过多的减少，从而凝胶的抑菌性能保持较高水平。另一方面，该凝胶发挥了季铵与乳铁乳铁蛋白的协同抗菌作用，因此由较高的抑菌活性。从测试结果中观察到，凝胶具有较好的粘性，其粘性与透明质酸的分子量及两溶液的混合比例有关系。
实施例6
对敷料进行生物毒性实验。
将小鼠上皮成纤维细胞 L929（2mL）悬浮液加入到容器中，并在 37℃、CO2浓度为5%的CO2培养箱中培养。每个容器加入新鲜的 RPMI 1640 培养基。将灭菌的敷料（样品4）轻轻放置在每个容器中心的细胞层上，再继续培养24h利用光学显微镜观察细胞形态。以LDPE 膜为阴性对照和含有机锡稳定剂的PVC膜作为阳性对照。对照组膜材均购于山东德旭达土工材料有限公司。细胞形态图参阅附图1。
实施例7
对凝胶（样品4）、HA-1及乳铁蛋白进行红外广谱分析，谱图参阅附图2。
从图中可以看出，混合后的凝胶相对于甜菜碱改性透明质酸，季铵（N+）以及磺酸基（SO3 -）的特征峰发生了不同程度的位移，这是由于键的极性发生改变造成的。其中两个磺酸基的特征峰分别为1190cm-1（S=O的伸缩振动）和1040cm-1（S-O-反对称伸缩振动）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种乳铁蛋白凝胶敷料，其特征在于，所述敷料包括外层和里层，所述外层为聚氨酯薄膜，所述里层为甜菜碱改性透明质酸与乳铁蛋白的复合凝胶；
所述甜菜碱改性透明质酸制备方法如下：
透明质酸在碱性条件下与1,2-环氧-3-(二乙基氨基)丙烷加热搅拌反应得到胺基接枝透明质酸；胺基接枝透明质酸与1,3-丙烷磺内酯(PS)在四氢呋喃中加热反应，纯化干燥后得到甜菜碱改性透明质酸；
所述透明质酸的分子量为10-80万；
所述复合凝胶由甜菜碱改性透明质酸溶液和乳铁蛋白溶液混合制备得到，溶剂为Tris-HCl蛋白缓冲液，所述甜菜碱改性透明质酸溶液的浓度为1g/mL，乳铁蛋白溶液的浓度为0.2g/mL，两者的混合体积比例为1：0.5~0.8。
2.根据权利要求1所述的一种乳铁蛋白凝胶敷料，其特征在于，所述透明质酸与1,2-环氧-3-(二乙基氨基)丙烷的投料质量比例为1:0.4。
3.根据权利要求1所述的一种乳铁蛋白凝胶敷料，其特征在于，所述胺基接枝透明质酸与1,3-丙烷磺内酯的投料质量比例为1:0.4。
4.根据权利要求1所述的一种乳铁蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别配制甜菜碱改性透明质酸溶液和乳铁蛋白溶液，溶剂为Tris-HCl蛋白缓冲液；
两者按比例混合得到溶胶液；
将溶胶液旋涂于聚氨酯薄膜上，在常温真空下干燥3~4h制备得到敷料。
5.根据权利要求4所述的一种乳铁蛋白凝胶敷料的制备方法，其特征在于，所述聚氨酯薄膜厚度为0.8mm，凝胶层的厚度为0.5~1mm。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种乳铁蛋白凝胶敷料的应用，其特征在于，所述敷料应用于人皮肤创口。
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