CN104147632A - 特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料及其制备方法,本发明将高相对分子质量(10万以上)的壳聚糖接枝具有细胞特异性粘附的多肽RGD(精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸序列),并在分子量调节剂的作用下通过γ射线辐照降解工艺制备得到一种特异性细胞粘附的低分子量壳聚糖护创液体敷料。本发明用于临床上伤口杀菌、止血止痛、止痒、促进愈合。本发明具有细胞特异性识别粘附,避免异体排斥反应、生物相容性良好,应用范围广泛,制备工艺简单可控,重复性好的特点。
Description
本发明属于医用液体敷料技术领域。
背景技术
壳聚糖是一种天然多糖,已经在医学临床上获得了大量的研究与应用。壳聚糖酶解后可以被人体组织吸收,对人体具有良好的生物相容性和良好的降解性,对人体无毒无积累。壳聚糖的性能与其相对分子质量的大小关系密切,例如对于革兰氏阴性菌,随着相对分子质量的减小,壳聚糖的抗菌性能逐渐增强,对于革兰氏阳性菌,随着相对分子质量的减小,壳聚糖的抗菌性能逐渐减弱。研究表明相对分子质量10万以上的壳聚糖具有良好的成膜性和止血、止疼、抗菌性能,相对分子质量低于1万的壳聚糖,具有很多高相对分子质量壳聚糖所不具有的功能,如保湿性、免疫调节、防癌、排除体内有毒害的物质、抗菌、防止伤口感染,促进肉芽生长和皮肤再生等许多作用。调节胃肠道微循环的功能等等。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽是一种重要的细胞识别位点与信号启动分子,存在于多种生物细胞外基质和血浆蛋白结构中,同时也是细胞间识别***的基本单位。RGD作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子,在许多生命活动中发挥着重要的调节功能,具有重要的医疗价值,包括在肿瘤诊治方面的作用、治疗急性肾衰抗炎、诱导组织再生、治疗骨质疏松以及皮肤再生、伤口愈合等。
壳聚糖是自然中唯一含有氨基的活性多糖,通过氨基、羧基的催化反应,将含RGD序列多肽小分子接枝于壳聚糖分子,能够有效提高壳聚糖与细胞、细胞外基质的粘附、相容性能,促进壳聚糖与机体的特异性结合,更好的发挥壳聚糖和RGD序列对创面愈合的积极作用。
然而天然壳聚糖粗产品中壳聚糖相对分子质量一般都在10万以上,水溶性差,应用上受到限制。因此选择适当的方法对壳聚糖进行降解,可以提高壳聚糖的性能应用。壳聚糖的降解方法主要有化学法、酶法、物理方法。其中化学法降解分子量分布宽,但是工艺条件差,降解过程难以控制,重复性差;酶降解反应条件温和,但是对壳聚糖的结构具有选择性;物理方法降解具有反应快,无污染,重复性好,但是反应机理比较复杂。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的在于提供一种特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料及其制备方法。本发明的一种特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料具有良好的成膜性和止血、止疼、抗菌、防止伤口感染、促进肉芽生长和皮肤再生等性能,减少形成瘢痕,对创面愈合有很好的治疗效果。本发明的一种特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料的制备方法,具有反应快,无污染,重复性好的特点。
为解决上述技术问题,本发明提供的技术方案是:
本发明一种特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料及其制备方法,其特征在于,用纯水配制接枝小分子多肽RGD的壳聚糖和分子量调节剂溶液,将混合水溶液通过γ射线辐照降解工艺制备得到。
本发明所述的壳聚糖接枝多肽RGD的特征在于,将壳聚糖溶解在2-吗啉乙磺酸(MES,pH 4.0-6.0缓冲溶液)中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC), N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥,得到产物RGD接枝的壳聚糖。其中壳聚糖(分子量10万及以上)浓度为0.1%-5%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10-1:1,壳聚糖与EDC摩尔比为1:10-10:1,EDC与NHS摩尔比为1:1-10:1。透析液成分选自乳酸、醋酸、富马酸和盐酸。上述所述组成、成分例子包括但不限于此。
本发明所述的含RGD多肽为含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的小分子多肽,具有细胞特意识别能力。
本发明所述的壳聚糖接枝RGD接枝率为10%-60%,分子量调节剂的水溶液中壳聚糖的质量浓度为0.2-3%,分子量调节剂的质量浓度为0.04-0.2%。
本发明所述的γ射线辐照降解工艺为无氧条件下辐照强度10-25kGy的钴-60γ射线辐照。
本发明所述的分子量调节剂为碘、氨基酸、多肽、蛋白质中的一种或多种。所述组成成分的非限制性例子包括但不限于碘、谷氨酸、天冬氨酸赖氨酸、组氨酸、抗菌肽D、α-乳清蛋白、卵清蛋白或血清清蛋白。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案,在分子量调节剂的作用下,抑制了壳聚糖的快速辐照降解,比常规辐照降解产物中含有更多地中高相对分子质量的壳聚糖,壳聚糖的脱乙酰度等结构特征未发生变化。本发明提供的技术方案使得壳聚糖具有特异性细胞、组织粘附作用,具有良好的生物相容性,降解产物具有很宽的分子量分布,兼具高相对分子质量壳聚糖、低相对分子质量壳聚糖和壳寡糖多种组分,具有良好的成膜性和止血、止疼、抗菌、防止伤口感染、促进肉芽生长和皮肤再生等性能。壳聚糖护创液体敷料喷涂于皮肤表面,黏附性好,形成具有呼吸性能的抗菌薄膜,具有广谱抗菌,减少瘢痕形成,促进创面愈合。
经实验证实,本发明壳聚糖护创液体敷料对各种外伤性创面,体表溃疡创面等都具有显著的疗效。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,对本发明的权利要求做进一步的详细说明,但不构成对本发明的任何限制,任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改,仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为1%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10,壳聚糖与EDC摩尔比为1:10,EDC与NHS摩尔比为10:1。透析液成分为稀盐酸。RGD接枝率为58%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量40万以上)1%;
卵清蛋白(重量百分比)0.2%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,10kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例2
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为4%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10,壳聚糖与EDC摩尔比为1:5,EDC与NHS摩尔比为5:1。透析液成分为乳酸。RGD接枝率为32%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量10万以上)3%;
碘(重量百分比)0.05%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,15kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例3
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC,NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为5%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10,壳聚糖与EDC摩尔比为1:10,EDC与NHS摩尔比为5:1。透析液成分为富马酸。RGD接枝率为40%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量40万以上)2%;
α-乳清蛋白(重量百分比)0.08%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,25kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例4
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC,NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为0.5%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:5,壳聚糖与EDC摩尔比为5:1,EDC与NHS摩尔比为10:1。透析液成分为柠檬酸。RGD接枝率为26%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量60万以上)0.8%;
组氨酸(重量百分比)0.05%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,50kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例5
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC,NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为2.5%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10,壳聚糖与EDC摩尔比为1:10,EDC与NHS摩尔比为10:1。透析液成分为醋酸。RGD接枝率为60%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量10万以上)1%;
天冬氨酸(重量百分比)0.04%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,10kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例6
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为0.1%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10,壳聚糖与EDC摩尔比为1:5,EDC与NHS摩尔比为5:1。透析液成分为苹果酸。RGD接枝率为37%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量40万以上)0.3%;
抗菌肽D(重量百分比)0.1%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,15kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例7
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为1%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:5,壳聚糖与EDC摩尔比为10:1,EDC与NHS摩尔比为10:1。透析液成分为酒石酸。RGD接枝率为28%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量40万以上)0.5%;
组氨酸(重量百分比)0.2%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,25kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例8
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为1%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:5,壳聚糖与EDC摩尔比为1:5,EDC与NHS摩尔比为10:1。透析液成分为盐酸。RGD接枝率为34%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量60万以上)1.2%;
碘(重量百分比)0.06%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,15kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例9
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为1%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:1,壳聚糖与EDC摩尔比为1:1,EDC与NHS摩尔比为10:1。透析液成分为稀盐酸。RGD接枝率为10%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量40万以上)1.5%;
血清清蛋白(重量百分比)0.3%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,25kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
实施例10
壳聚糖溶解在MES中,加入EDC, NHS和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,冷冻干燥。其中壳聚糖浓度为0.1%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10,壳聚糖与EDC摩尔比为1:5,EDC与NHS摩尔比为1:1。透析液成分为稀盐酸。RGD接枝率为35%。
室温下,按照以下配方制备溶液:
RGD-壳聚糖(重量百分比,相对分子质量40万以上)0.2%;
赖氨酸(重量百分比)0.5%;
余量为纯化水。
将配置好的溶液静置24小时,过滤去除不溶物,在无氧条件下,15kGy钴-60γ射线辐照20分钟,制得淡黄色澄清透明液体,即为产品。
体外抑菌实验及临床效果
将实施例1-10所得到的壳聚糖护创液体敷料采用悬液法进行抑菌效力检查试验,试验菌为白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,取其3-14代普通营养琼脂新鲜培养物,用含10g/L蛋白胨的PBS缓冲液制成含菌量为1×106-2×106cfu/mL的菌悬液。当菌悬液和壳聚糖护创液体敷料为2:1时,作用10分钟,白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均达到99.99%,当菌悬液和壳聚糖护创液体敷料为4:1时,作用10分钟,白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均达到98.00%。当菌悬液和壳聚糖护创液体敷料为8:1时,作用10分钟,白色念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均达到95.00%。(见表1)
表1
*:对照组采用相同条件下的已上市产品壳聚糖护创生物敷料(未接枝RGD)进行对比。
将实施例1-10所得到的壳聚糖护创液体敷料应用到皮肤挫擦伤临床护理。随机将120例皮肤挫擦伤患者随机分为三组:壳聚糖护创液体敷料治疗组,碘伏对照组,莫匹罗星软膏对照组,比较临床疗效。临床观察结果为碘伏对照组优于莫匹罗星软膏对照组,壳聚糖护创液体敷料治疗组喷涂于创面,创面干燥,水肿轻,疼痛感明显减轻,有舒适感,一般2-4天创面愈合,均无瘢痕形成,无色素沉着。
Claims (10)
1.一种特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料,其特征在于,用纯水配制分子量调节剂和接枝有含RGD序列的多肽的壳聚糖的溶液,其中所述壳聚糖的分子量为10万以上,通过γ射线辐照降解工艺得到的壳聚糖护创液体敷料。
2.权利要求1的特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料,其特征在于,所述壳聚糖接枝有含RGD序列的多肽,接枝产物的RGD接枝率为10%-60%。
3.权利要求1的特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料,其特征在于,在接枝的壳聚糖和分子量调节剂的水溶液中所述的壳聚糖的质量浓度为0.2-3%,所述分子量调节剂的质量浓度为0.04-0.2%。
4.权利要求1的特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料,其特征在于,所述γ射线辐照降解工艺为无氧条件下辐照强度10-25kGy的钴-60γ射线辐照。
5.权利要求1和2的特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料,其特征在于,所述的分子量调节剂为碘,氨基酸或蛋白质中的一种或多种。
6.权利要求1-6中任一项的特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料的制备方法:其特征在于,用纯水配制接枝小分子多肽RGD的壳聚糖和分子量调节剂的混合溶液,将混合水溶液通过γ射线辐照降解工艺制备得到所述特异性细胞粘附的壳聚糖护创液体敷料。
7.权利要求6的方法,其特征在于,将壳聚糖溶解在2-吗啉乙磺酸中,加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC), N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和 RGD, 室温搅拌12小时,透析3天,透析液为乳酸、醋酸、富马酸、盐酸的稀水溶液,冷冻干燥,得到产物接枝有含RGD序列多肽的壳聚糖。
8.权利要求7的方法,其中壳聚糖浓度为0.1%-5%,壳聚糖与RGD摩尔比为1:10-1:1,壳聚糖与EDC摩尔比为1:10-10:1,优选1:5-5:1,EDC与NHS摩尔比为1:1-10:1。
9.权利要求7的方法,其中2-吗啉乙磺酸为pH 4.0-6.0缓冲溶液的形式。
10.权利要求7的方法,其中透析液成分选自乳酸、醋酸、富马酸和盐酸。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |