CN116218789B - 一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116218789B CN116218789B CN202310016649.1A CN202310016649A CN116218789B CN 116218789 B CN116218789 B CN 116218789B CN 202310016649 A CN202310016649 A CN 202310016649A CN 116218789 B CN116218789 B CN 116218789B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- pdcov
- protein
- hybridoma cell
- cell strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 241001361508 Porcine deltacoronavirus Species 0.000 abstract description 9
- 241001461743 Deltacoronavirus Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000837158 Senecavirus A Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound CCS(O)(=O)=O.OCCN1CCNCC1 DBLXOVFQHHSKRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一株杂交瘤细胞株和由所述杂交瘤细胞株分泌产生的抗PDCoVNS6蛋白的单克隆抗体，所述抗PDCoVNS6蛋白的单克隆抗体一种具有高特异性、能够特异识别PDCoV的NS6蛋白，可用来检测猪δ冠状病毒。本发明还公开了所述杂交瘤细胞株在制备含抗PDCoVNS6蛋白的单克隆抗体的试剂、试剂盒或试纸条中的应用。本发明还公开了一种试剂、试剂盒或试纸条，含有所述杂交瘤细胞株和/或所述单克隆抗体。本发明还公开了所述杂交瘤细胞株和/或所述单克隆抗体和/或所述试剂、试剂盒或试纸条在猪δ冠状病毒的免疫检测中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)又称为猪丁型冠状病毒、猪三角洲冠状病毒，是具有囊膜的单股正链RNA病毒。猪感染该病毒后主要引起腹泻、发热、精神沉郁、食欲不振等症状，一般仔猪感染较为严重，常导致其脱水死亡。
PDCoV的基因组大小为21-25kb，包括ORF1a与ORF1b两个开放阅读框，四个结构蛋白纤突(S)蛋白、膜(M)蛋白、囊膜(E)蛋白、核衣壳(N)蛋白，以及3个辅助蛋白NS6、NS7与NS7a。NS6蛋白主要影响病毒滴度与致病力，在干扰素拮抗方面发挥重要作用。有研究表明，缺失NS6基因的病毒感染猪后，被感染猪无任何临床症状。由于PDCoV的发病机制不明确，现在市面上缺乏针对该病的治疗措施与特效药物等。疫苗开发是控制病毒传染病的最好方式，但目前还没有PDCoV的商品化疫苗。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。
抗原表位是具有一定组成和结构的特殊化学基团，因能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合，常应用于开发特异性诊断方法或试剂，为疫苗的研发和抗病毒免疫策略等提供新的见解。因此，将抗PDCoVNS6蛋白(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)的单克隆抗体与抗原表位发生特异性结合可为研究PDCoV提供有力的工具支持。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一株杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：C2022353，保藏日期为2022年11月29日。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种具有高特异性等特点、能够特异识别PDCoV的NS6蛋白、可以用来检测猪δ冠状病毒的抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述杂交瘤细胞株在制备含抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体的试剂、试剂盒或试纸条中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种试剂、试剂盒或试纸条，含有所述杂交瘤细胞株和/或所述单克隆抗体。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述杂交瘤细胞株和/或所述单克隆抗体和/或所述试剂、试剂盒或试纸条在猪δ冠状病毒的免疫检测中的应用。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一株杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：C2022353，保藏日期为2022年11月29日。
本发明还提供了一种抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
其中，所述单克隆抗体的重链、轻链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。
其中，所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
其中，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.7～9所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10～12所示。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备含抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体的试剂、试剂盒或试纸条中的应用。
本发明还提供了一种试剂、试剂盒或试纸条，含有所述杂交瘤细胞株和/或所述单克隆抗体。
本发明还提供了所述杂交瘤细胞株和/或所述单克隆抗体和/或所述试剂、试剂盒或试纸条在猪δ冠状病毒的免疫检测中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、本发明将NS6蛋白与GST结合形成融合蛋白，该融合蛋白有利于NS6蛋白在大肠杆菌中正确折叠并能够提高NS6蛋白的免疫原性；
2、本发明获得的一株分泌抗PDCoV NS6蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，可分泌具有高特异性等特点的单克隆抗体；
3、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体能够特异识别PDCoV的NS6蛋白；
4、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体可以用来检测猪δ冠状病毒，对研究PDCoV具有重要意义，也为其提供了有力的工具支持。
附图说明
图1A为pGEX-6P-1-NS6重组蛋白的表达，图1B为pGEX-6P-1-NS6重组蛋白的纯化；
图2为pCAGGS-3flag-NS6转染HEK-293A细胞后用PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体进行IFA检测，图2A为阴性对照(转染pCAGGS-3flag)，图2B为试验组(pCAGGS-3flag-NS6转染HEK-293A，出现特异性荧光)；
图3为pCAGGS-3flag-NS6转染HEK-293A细胞后用PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体进行Western blot试验。M为相对分子质量标准，单位kDa，泳道1阴性对照(转染pCAGGS-3flag的细胞裂解液)，泳道2试验组(转染pCAGGS-3flag-NS6的细胞裂解液，有特异性条带，大小为15kDa左右)；
图4为PDCoV感染LLC-PKI细胞后，PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体的IFA检测图；图4A阴性对照组(LLC-PKI未感染PDCoV)，图4B试验组(LLC-PKI感染PDCoV，出现特异性荧光)；
图5为PDCoV感染LLC-PKI细胞后，PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体的Westernblot图，M为相对分子质量标准，单位kDa，泳道1阴性对照(未感染PDCoV的LLC-PKI细胞裂解液)，泳道2试验组(感染PDCoV的LLC-PKI细胞裂解液)；
图6为PDCoV感染LLC-PKI细胞后，用稀释度分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000的PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体作为一抗的IFA检测图；
图7为PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体的抗原表位鉴定Western blot试验；图7A为NS6基因逐步截短示意图，图7B为Western blot检测结果图；
图8为抗原表位区域70EYGSIYGKDFI80与Genbank上181株PDCoVNS6基因的氨基酸序列的比对结果(11株PDCoV在此抗原表位区域发生了个别氨基酸突变)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
溶液：
磷酸盐缓冲液(PBS)：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.42g和磷酸二氢钾0.27g，溶于800mL蒸馏水中，调PH至7.4，定容至1L。
4％多聚甲醛溶液：称取4g多聚甲醛粉末溶于100ml PBS中。
0.1％Triton X-100溶液：吸取10μl Triton X-100稀释于10ml PBS中。
2％BSA溶液：称取2g BSA粉末溶于100ml PBS中。
试剂：50％PEG1500(上海希格玛高技术有限公司，简称Sigma公司)。
培养基：
LB培养基：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母膏(Yeast Extract)5g和NaCl 10g，溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。
HAT培养基：2％的50×HAT(北京博奥龙免疫技术有限公司)、12％的胎牛血清(Sigma公司)、1％的100×青链霉素(北京索莱宝科技有限公司)和85％的DMEM(GrandIsland Biological Company)。
HT培养基：2％的50×HT(北京博奥龙免疫技术有限公司)、12％的胎牛血清、1％的100×青链霉素和85％的DMEM。
LLC-PKI培养基：10％的胎牛血清、1％的1M HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)溶液与100×青链霉素、88％的MEM。
冠状病毒培养基：10％的胰蛋白胨磷酸盐肉汤(TPB)、0.0002％的胰酶、1％的100×青链霉素和89％的DMEM。
实施例1 pGEX-6P-1-NS6重组蛋白的获取与制备
根据GenBank中猪δ冠状病毒毒株CHN-GD16-05全基因组查找NS6基因序列，设计-对特异性引物PDCoV-NS6-F与PDCoV-NS6-R，并在其上下游分别***酶切位点Bam HI与SalI(下划线为酶切位点)。
表1
进一步的进行RT-PCR扩增，将CHN-GD16-05株病毒RNA基因组反转录为cDNA，用设计的引物扩增NS6基因，PCR反应体系总体积为50μl：
表2
反应条件：98℃预变性3min；98℃变性15s、55℃退火10s、72℃延伸30s，此步骤进行30个循环；72℃延伸10min。然后，通过PCR纯化试剂盒(Omega Therapeutics，Inc.)进行PCR纯化，进一步的进行核酸电泳并使用核酸胶回收试剂盒(OmegaTherapeutics，Inc.)回收胶进行酶切处理。
扩增出的NS6基因用Bam HI(Code No.1010S)与Sal I(Code No.1080S)限制性内切酶(宝日医生物技术(北京)有限公司)，进行酶切处理，酶切体系为50μl：
表3
反应体系配好后置于37℃恒温箱放置4h，将酶切后的基因连接到带有对应酶切位点的pGEX-6P-1质粒载体(本实验室保存)中构建原核表达载体pGEX-6P-1-NS6，经PCR鉴定或酶切鉴定。构建成功后，即得重组质粒；将重组质粒转入BL21大肠杆菌菌种中，挑取单个克隆菌群接种于LB培养基(带氨苄青霉素)中，待细菌增殖OD值达到0.5左右，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，并置于16℃恒温箱持续培养12h。5000r/min离心10min收集细菌进行超声破碎，破碎后收集上清进行SDS-PAGE分析，该蛋白在目标大小位置30kDa左右出现特异性条带且在细菌沉淀中表达。如图1A所示，泳道1为PGEX-6P-1-NS6破碎后的全菌、泳道2为PGEX-6P-1-NS6破碎后的上清液、泳道3为PGEX-6P-1-NS6破碎后的沉淀、泳道4为PGEX-6P-1破碎后的全菌(对照)。由此可见，通过SDS-PAGE切胶纯化得到大量相对较纯的目的蛋白。如图1B所示，泳道5为纯化后的PGEX-6P-1-NS6蛋白、泳道6为PGEX-6P-1-NS6破碎后的全菌(对照)。
实施例2小鼠免疫
将实施例1获得的PDCoV NS6重组蛋白与弗氏完全佐剂(Sigma公司)1∶1等体积混合，放入两颗研磨珠于震荡研磨机中震荡研磨使其变为白色粘稠液体，200μl/80μg蛋白的剂量皮下多点注射6-8周龄Balb/c小鼠(购自扬州大学动物实验中心)，间隔14d，进行第二次免疫，重组蛋白1∶1等体积与弗氏不完全佐剂混合，200μl/80μg蛋白的剂量皮下多点注射；间隔14d，进行第三次免疫，免疫策略同第二次相同；7-10d，小鼠眼眶静脉丛采血，抗体效价达到1∶1000，间隔3周进行冲击免疫，直接腹腔注射200μl/80μg重组蛋白，三天后进行细胞融合。
实施例3细胞融合
饲养细胞的准备：取一只未免疫的小鼠，将其脱颈致死，浸泡于75％的酒精中5min，于生物安全柜中剪开腹部皮肤(腹膜不能剪破)，暴露其腹腔，用灭菌注射器吸取8mlHAT培养基，注入小鼠腹腔，轻柔按摩其腹部几下，将液体回抽，重新与HAT培养基混合均匀总体积为36ml，铺于3块24孔板，每孔500ul。
脾细胞的准备：将实施例2中的小鼠脱颈处死，无菌操作取小鼠的脾脏于2ml DMEM培养基中，用注射器针头多次穿刺脾脏，直至脾脏的细胞全部释放出来，收集液体于50ml离心管中补加DMEM到20ml，离心收集脾细胞。
骨髓瘤细胞(sp2/0)的准备：将本实验室保存的骨髓瘤细胞(sp2/0)通过移液器吹打下来收集到50ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，再用DMEM重悬。
细胞融合开始前所用到的培养基与试剂等均放到37℃温箱中预热。
细胞融合：将骨髓瘤细胞(sp2/0)与脾细胞个数按1∶5充分混合于50ml离心管中，离心弃掉上清只保留细胞，轻轻拍打管壁底部，使其均匀的分散到管壁底部四周，将离心管置于37℃烧杯中，缓慢旋转管壁并逐滴加入1ml 50％PEG1500，1min内加完；继续旋转管壁20s；逐滴加入2ml DMEM，2min内加完；补加DMEM至20ml，1000r/min离心10min，弃掉上清，用HAT培养基轻轻重悬底部细胞并补加至36ml，铺于事先加好饲养细胞的3块24孔板，每孔500μl。置于37℃、含有5％CO2的细胞培养箱中培养。
实施例4 IFA初筛与亚克隆
第5天、第7天用HAT培养基进行半量换液，第8天、第9天待细胞长满孔底2/3进行IFA检测阳性孔。确定阳性孔后，改用HT培养基将该孔细胞扩大培养并进行亚克隆。亚克隆步骤为细胞计数并取约500个细胞稀释到20ml预先加入饲养细胞的HT培养基中混合均匀，每孔100μl铺于2块96孔板。待细胞生长到孔底面积的50％时，吸取50μl单个克隆孔的上清进行IFA检测。阳性孔再进行一轮亚克隆，方法同上，即得到阳性单克隆杂交瘤细胞株PDCoV-NS6-5-A11。将该杂交瘤细胞株PDCoV-NS6-5-A11保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：C2022353，保藏日期为2022年11月29日。
实施例5 PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体(腹水)的制备
单克隆阳性杂交瘤细胞株PDCoV-NS6-5-A11扩大培养后，大概收集2.5×106个细胞，用500μl DMEM重悬细胞，注射于事先打过500μl液体石蜡小鼠的腹腔。7d后，小鼠腹部明显膨大，针头穿刺收集腹水于10ml离心管中，1500r/min离心10min，吸取上清，即得PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体(腹水)，分装后于-80℃超低温冰箱中保存。
实施例6 PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体的特异性鉴定
根据NS6基因设计-对酶切位点分别为Kpn I与Xho I的特异性引物，将NS6基因***到对应酶切位点的pCAGGS-3flag真核表达质粒(Identification of a B-Cell Epitopein the VP3 Protein of Senecavirus A，Mi Chen)当中，构建程序同实施例1。
表4
构建好的PCAGGS-3flag-NS6真核表达质粒，转染HEK-293A细胞24h后，用PDCoV-NS6-5-A11单克隆抗体作为一抗，分别进行IFA与Western blot检测。IFA检测结果如图2所示，只转染pCAGGS-3flag的细胞无荧光显示(图2A)，而转染pCAGGS-3flag-NS6的细胞出现特异性荧光(图2B)。Western blot检测结果如图3所示，转染pCAGGS-3flag的细胞裂解液没有条带出现(泳道1)，而转染pCAGGS-3flag-NS6的细胞裂解液出现特异性条带(泳道2，大小15kDa左右)。IFA与Western blot结果证明，PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体特异性识别PDCoV NS6蛋白。
实施例7 PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体与天然的PDCoV NS6蛋白反应
PDCoV感染LLC-PKI细胞后分别进行IFA与Western blot检测，PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体为一抗。IFA结果显示(图4)，感染PDCoV的LLC-PKI细胞出现特异性荧光(图4B)，没有感染PDCoV的LLC-PKI细胞无荧光显示(图4A)。Western blot结果显示(图5)，感染PDCoV的LLC-PKI细胞裂解液中出现特异性条带(泳道2，大小11kDa左右)，而没有感染PDCoV的LLC-PKI细胞裂解液无任何条带显示。IFA与Western blot试验结果均证明，PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体与天然的PDCoV NS6蛋白反应。
实施例8 PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体的反应敏感性检测
用PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体从1∶1000开始倍比稀释，使稀释度分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000作为一抗分别与正常的LLC-PKI细胞和感染PDCoV的LLC-PKI细胞反应，之后用DyLight 488，GoatAnti-Mouse IgG(488标记的山羊抗鼠IgG，Abbkine，Inc公司)作为二抗，于倒置荧光显微镜下观察结果，并通过计算机荧光采集***拍摄结果并保存。结果显示(图6)，该抗体在1：4000倍内稀释荧光效果最好(图6A、C、E、G)，最高稀释倍数可达到1∶16000倍(图6I)，阴性对照组无荧光显示(正常的LLC-PKI细胞，如图6B、D、F、H、J)，证明该抗体效价高且结果成立。
实施例9 PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体的表位鉴定
根据NS6基因，分步设计不同片段的特异性引物，以实施例1中相同程序分别将NS6基因截短的不同片段构建至真核表达质粒pEGFP-C3中，转染HEK-293A细胞，24h收集细胞，制备细胞样品进行Western blot试验(以PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体为一抗，HRPGoat Anti-Mouse IgG(武汉爱博泰克生物科技有限公司)为二抗)。先将NS6基因分成4个片段，每两个片段之间重叠10-20个氨基酸(图7A，NS6-A、NS6-B、NS6-C、NS6-D)，结果表明抗原表位定位于NS6-D(图7B1，泳道NS6-D出现特异性条带)；进一步将NS6-D分别从N端与C端缩减13与14位氨基酸(图7A，NS6-D-1、NS6-D-2)，抗原表位定位于NS6-D-1(图7B2，泳道NS6-D-1出现特异性条带)；进一步将NS6-D-1从C端缩减1位氨基酸(图7A，NS6-D-1-C79)后不能检测出特异性条带(图7B3，泳道NS6-D-1-C79)，说明PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体识别的抗原表位C端位置截止到第80位；将NS6-D-1的N端缩减2位氨基酸后仍能够检测出特异性条带(图7B4，泳道NS6-D-1-N63)；进一步将NS6-D-1-N63从C端分别缩减6位氨基酸与7位氨基酸(图7A，NS6-D-1-N70、NS6-D-1-N71)，NS6-D-1-N70能够检测出特异性条带而NS6-D-1-N71不能(图7B5)，说明PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体识别的抗原表位N端位置截止到第70位。以上结果证明，PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体最终确定识别的抗原表位为NS6基因的第70至80位氨基酸70EYGSIYGKDFI80。
实施例10 PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体抗原表位序列比对
将70EYGSIYGKDFI80与NCBI中已公布的181株PDCoV全基因组序列利用Jalview软件进行序列比对，比对结果如图8所示，仅发现其中11株毒株在该抗原表位区域个别氨基酸发生突变，说明PDCoV-NS6-5-A11分泌的单克隆抗体能识别绝大多数PDCoV毒株。
以上所有实施例中所述的间接免疫荧光试验(IFA)应用具体如下：
抗原制备：将LLC-PKI细胞铺于96孔板，置于37℃含5％CO2的温箱中培养24h，细胞长满孔底。将96孔板中原培养基上清弃掉，每孔100μl用高压灭菌后的PBS清洗两遍，每孔接入50μl病毒液(含200TCID50)，置于37℃含5％CO2的温箱中培养15h，约四分之一细胞病变死亡后弃掉病毒液；用4％的多聚甲醛溶液固定15min，每孔50μl；0.1％TritonX-100溶液通透30min，每孔50μl；2％BSA封闭30min，每孔50μl；
一抗孵育：每孔加入待测样品(小鼠血清、细胞培养上清或单克隆抗体)，4℃过夜；
二抗孵育：每孔加入50μl的1：2000稀释的DyLight 488，Goat Anti-Mouse IgG，室温孵育2h；
以上每步结束后均需PBS洗2遍，每次2min，最后1遍拍干即可，于倒置荧光显微镜下拍照观察结果。
以上所有实施例中所述的Western blot试验应用具体如下：
细胞样品制备：收集细胞加入适量RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司)置于冰上，摇床孵育20min，12000r/min离心10min收集细胞裂解液上清，加入Loading Buffer，100℃煮沸5min。
转膜：制备好的细胞样品在电压80V的条件下进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将凝胶上的条带在电流200mA条件下转移至PVDF膜上(PVDF膜在使用时，预先用甲醇浸泡激活)。
封闭：转膜结束后，用5％的脱脂奶粉溶液摇床孵育2h；
一抗孵育：用制备的单克隆抗体1∶1000稀释，4℃摇床过夜封闭；
二抗孵育：用HRP Goat Anti-Mouse IgG(武汉爱博泰克生物科技有限公司)1∶10000稀释作为二抗，室温摇床孵育1h；
显色：发光液A与B(苏州新赛美生物科技有限公司)等体积混合，滴加于PVDF膜上，在计算机成像***下拍照保存。
实施例11单克隆抗体的轻重链可变区序列测定
通过RNA提取试剂盒(天根科技生化有限公司)提取分泌抗PDCoV NS6蛋白的杂交瘤细胞株PDCoV-NS6-5-A11的总RNA，进一步通过反转录试剂盒将其反转录为cDNA。
设计轻链可变区引物序列：
表5
设计重链可变区引物序列：
表6
表7
PCR反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸30s，此步骤33个循环；72℃延伸5min。
进一步的将PCR产物通过试剂盒纯化后与pMD19-T载体(宝日医生物技术(北京)有限公司，Takara公司)进行连接，挑取对应的阳性克隆质粒送至擎科生物科技有限公司(南京)进行测序。测定单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。重链可变区、轻链可变区核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。重链可变区的CDR1、CDR2与CDR3氨基酸序列分别为SEQ IDNO.7～9所示(SEQ IDNO.7：GYAFTNFL；SEQ ID NO.8：INPGNGAT；SEQ ID NO.9：VR)，轻链可变区的CDR1、CDR2、与CDR3氨基酸序列分别为SEQ ID NO.10～12所示(SEQ ID NO.10：KSVGTSGYSY；SEQ IDNO.11：LAS；SEQ ID NO.12：QHNREMP)。
Claims (7)
1.一株杂交瘤细胞株，命名为 PDCoV-NS6-5-A11，保藏编号为 CCTCC NO：C2022353。
2.一种抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。
3.根据权利要求2所述的抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区、轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求2或3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
5.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7~9所示；轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10~12所示。
6.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备含抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体的试剂、试剂盒或试纸条中的应用。
7.一种试剂、试剂盒或试纸条，其特征在于，含有权利要求1所述杂交瘤细胞株和/或权利要求2~4任一项所述单克隆抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310016649.1A CN116218789B (zh) | 2023-01-06 | 2023-01-06 | 一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310016649.1A CN116218789B (zh) | 2023-01-06 | 2023-01-06 | 一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116218789A CN116218789A (zh) | 2023-06-06 |
| CN116218789B true CN116218789B (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=86583699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310016649.1A Active CN116218789B (zh) | 2023-01-06 | 2023-01-06 | 一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116218789B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109112111A (zh) * | 2017-09-12 | 2019-01-01 | 华中农业大学 | 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用 |
| CN109796531A (zh) * | 2017-11-15 | 2019-05-24 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用 |
| CN110361542A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-10-22 | 扬州大学 | 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
| CN112899239A (zh) * | 2021-04-08 | 2021-06-04 | 河南农业大学 | 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用 |
| CN113150134A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-07-23 | 江苏省农业科学院 | 抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒 |
| WO2022132904A1 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114057868B (zh) * | 2020-07-31 | 2023-08-15 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 猪δ冠状病毒抗体、含有猪δ冠状病毒抗体的试剂盒及应用 |
| CN113698475B (zh) * | 2021-07-05 | 2022-10-11 | 国药集团动物保健股份有限公司 | 抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条 |
-
2023
- 2023-01-06 CN CN202310016649.1A patent/CN116218789B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109112111A (zh) * | 2017-09-12 | 2019-01-01 | 华中农业大学 | 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用 |
| CN109796531A (zh) * | 2017-11-15 | 2019-05-24 | 中国农业科学院上海兽医研究所 | 猪Delta冠状病毒N蛋白单克隆抗体及其抗原表位和应用 |
| CN110361542A (zh) * | 2019-07-25 | 2019-10-22 | 扬州大学 | 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
| WO2022132904A1 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2 |
| CN113150134A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-07-23 | 江苏省农业科学院 | 抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒 |
| CN112899239A (zh) * | 2021-04-08 | 2021-06-04 | 河南农业大学 | 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 1株猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备与鉴定;付嘉钰;陈汭;黄小波;曹三杰;文心田;文翼平;赵勤;伍锐;;微生物学通报(第06期);第1847-1856页 * |
| Identification and subcellular localization of porcine deltacoronavirus accessory protein NS6;Fang P等;《Virology》;第499卷;第170-177页 * |
| 猪δ冠状病毒辅助蛋白研究进展;张蕙畅等;《中国动物传染病学报》;第31卷(第01期);第213-221页 * |
| 猪德尔塔冠状病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定;范前进等;《中国动物传染病学报》;第29卷(第03期);第64-70页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116218789A (zh) | 2023-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111153991A (zh) | 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| Wang et al. | Prevalence, isolation, and partial sequence analysis of hepatitis E virus from domestic animals in China | |
| CN109970851B (zh) | Ccv病毒m蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法 | |
| CN110551212A (zh) | 抗gii.4型诺如病毒衣壳蛋白vp1和病毒样颗粒vlp单克隆抗体的制备方法和应用 | |
| CN112921005B (zh) | 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 | |
| CN114874995B (zh) | 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用 | |
| CN109082412B (zh) | 一种弓形虫棒状体蛋白rop18的单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及其用途 | |
| CN113527475B (zh) | 一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σC蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用 | |
| CN111944044A (zh) | 一种抗ASFV-p30蛋白的纳米抗体及其制备方法和应用 | |
| CN107586322A (zh) | 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用 | |
| CN108752471B (zh) | 抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用 | |
| CN115991765B (zh) | 抗猪δ冠状病毒M蛋白单克隆抗体及其识别的抗原表位肽和应用 | |
| CN107253979B (zh) | 单克隆抗体10b10识别的***病毒血清型共享性抗原表位及其应用 | |
| CN116218789B (zh) | 一株杂交瘤细胞株、抗PDCoV NS6蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN111413499A (zh) | 一种检测禽腺病毒i群的间接免疫荧光试剂盒 | |
| CN114163521B (zh) | 一种鉴别猪瘟病毒2.1亚型强毒株及其抗体的单克隆抗体 | |
| CN108017714B (zh) | 一株ⅱ型鲤疱疹病毒orf92蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN113583141B (zh) | 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN112980802B (zh) | 一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用 | |
| CN108642017B (zh) | 一株能稳定分泌抗芋螺毒素的单克隆抗体细胞株及应用 | |
| CN116769040B (zh) | 鼠抗gdh杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 | |
| CN117904072A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶的抗原表位、抗体的制备及应用 | |
| CN116042531B (zh) | 抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用 | |
| CN116769019B (zh) | 一种ASFVp30蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| CN117903262A (zh) | 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7单克隆抗体的制备、表位鉴定及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |