CN112921005B - 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 - Google Patents

一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和应用，属于单克隆抗体制备技术领域，本发明提供的杂交瘤细胞株5A92B12能够稳定传代，可以持续、稳定地分泌抗犬细小病毒VP2蛋白的单克隆抗体；培养到10代后，所述杂交瘤细胞株5A92B12仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1×106以上；所述交瘤细胞株产生的单克隆抗体与犬细小病毒VP2蛋白能特异性识别，具有高特异性、高敏感性的优点，同时具有抑制犬细小病毒复制的特性，能够应用于犬细小病毒病的检测和治疗，具有良好的应用前景。

Description

一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗 体和应用
技术领域
本发明属于单克隆抗体制备技术领域，尤其涉及一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和应用。
背景技术
犬细小病毒病(Canine Parvovirus Disease)是由犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)感染引起的以出血性肠炎和非化脓性心肌炎为主要特征的传染病，主要感染幼犬，由于发病快，死亡率很高，已成为养犬行业最严重的传染病之一。
犬细小病毒属于单股负链DNA病毒，基因组大小约5kb，包括两个开放阅读框(openreading frame，ORF)，3′端的ORF编码非结构蛋白NS1和NS2，5′端的ORF编码结构蛋白VP1和VP2；在基因组的两端各有一个发卡结构，其中3′端折叠形成“Y”型结构，而5′端形成“U”型结构，对病毒的复制和转录具有重要作用。VP2基因长1755bp，编码的584个氨基酸，是构成病毒衣壳的主要蛋白。VP2蛋白也是细小病毒的主要免疫蛋白，能够刺激机体产生保护性中和抗体，是制备基因工程疫苗的首选基因；另外VP2基因在受体识别、组织嗜性过程起关键性作用，同时与病毒的致病性、血凝特性有密切关系。
由于犬细小病毒没有囊膜，衣壳蛋白结构紧密，对外界环境的抵抗力很强，一旦感染很难彻底清除。由于幼犬免疫器官尚未发育成熟，通过疫苗免疫进行幼犬的预防效果不太理想。因此，一旦幼犬感染犬细小病毒，如何治疗就显得非常重要。目前，在犬细小病毒病治疗方面主要是通过抗病毒药物和犬细小病毒的高免血清联合使用，但多数病例还是以死亡为最终归属。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和应用；所述交瘤细胞株产生的单克隆抗体与犬细小病毒VP2蛋白能特异性识别，具有高特异性、高敏感性的优点，同时具有抑制犬细小病毒复制的特性，能够应用于犬细小病毒病的检测和治疗，具有良好的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一株杂交瘤细胞株5A92B12，保藏编号为CCTCC NO：C202110。
本发明提供了所述的杂交瘤细胞株5A92B12在制备犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体中的应用。
本发明提供了一种犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株5A92B12产生。
优选的，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备犬细小病毒病检测试剂盒中的应用。
本发明提供了一种犬细小病毒病检测试剂盒，包括所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和检测试剂。
优选的，所述犬细小病毒病检测试剂盒为ELISA检测试剂盒、Western-blot检测试剂盒或免疫荧光检测试剂盒。
优选的，所述检测试剂包括犬细小病毒VP2蛋白，所述犬细小病毒VP2蛋白作为包被抗原，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体作为检测竞争抗体。
本发明提供了所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备治疗犬细小病毒病的药物中的应用。
优选的，所述药物中犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的浓度为0.5～1μg。
本发明提供了一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和应用；所述交瘤细胞株产生的单克隆抗体与犬细小病毒VP2蛋白能特异性识别，具有高特异性、高敏感性的优点，同时具有抑制犬细小病毒复制的特性，能够应用于犬细小病毒病的检测和治疗，具有良好的应用前景。
本发明提供的杂交瘤细胞株5A92B12能够稳定传代，可以持续、稳定地分泌抗犬细小病毒VP2蛋白的单克隆抗体；培养到10代后，所述杂交瘤细胞株5A92B12仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1×106以上。
本发明提供的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体可以准确检测犬细小病毒病疫苗样品中有效抗原成分或感染组织样品中VP2蛋白的含量，在疫苗和临床检测中能够得到广泛应用；所述单克隆抗体具有抑制病毒复制的能力，能够用于犬细小病毒病的治疗。
附图说明
图1是犬细小病毒VP2蛋白重组表达的SDS-PAGE电泳图，Marker是蛋白分子量标准(kDa)；
图2为犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的SDS-PAGE结果图，Marker是蛋白分子量标准(kDa)；
图3为犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的Westernblot结果图；
图4为间接ELISA检测犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的效价；
图5为抗犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的病毒抑制实验结果，其中1为犬细小病毒经10-3稀释接种F81细胞96h的情况，2为犬细小病毒10-3稀释接种F81细胞，同时加入0.5μg的5A92B12单克隆抗体抑制病毒生长情况，3为犬细小病毒10-4稀释接种F81细胞96h的情况，4为犬细小病毒10-4稀释接种F81细胞，同时加入0.5μg的5A92B12单克隆抗体抑制病毒生长情况；图中标尺为400nm。
生物保藏说明
本发明提供的杂交瘤细胞株5A92B12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202110，保藏日期为2021年3月25日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。
具体实施方式
本发明提供了一株杂交瘤细胞株5A92B12，保藏编号为CCTCC NO：C202110。在本发明中，所述杂交瘤细胞株5A92B12优选的通过以VP2抗原免疫小鼠获得的脾细胞和SP2/0细胞融合、筛选获得。
在本发明中，以VP2抗原免疫小鼠优选的包括第一次免疫、第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫和加强免疫。在本发明中，所述第一次免疫优选的将所述VP2抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后注射小鼠；在本发明中，所述VP2抗原与弗氏完全佐剂混合的体积比例优选为1:1；所述注射的部位优选为背部，所述注射优选为皮下多点注射；所述注射的剂量优选为50μg。在本发明中，所述第二次免疫优选的在第一次免疫2周后进行，所述第三次免疫优选的在所述第二次免疫2周后进行，所述第四次免疫优选的在所述第三次免疫2周后进行。在本发明中，所述第二次免疫、第三次免疫、第四次免疫的方法和剂量与第一次免疫的方法和剂量一致。在本发明中，所述加强免疫优选的在细胞融合的3天前进行；所述加强免疫优选的注射含50μgVP2抗原的磷酸盐缓冲液；所述注射优选为腹腔注射。
本发明在所述加强免疫后，收集小鼠的脾细胞。本发明对所述脾细胞的收集方法没有特殊限定，采用本领域常规的脾细胞的收集方法即可。在本发明中，将收集到的脾细胞和SP2/0细胞融合、筛选获得杂交瘤细胞。在本发明中，所述SP2/0细胞优选的采用市售产品，在本发明具体实施过程中，购自武汉金凯瑞公司。在本发明中，所述脾细胞和SP2/0细胞的个数比例优选为5:1；所述融合优选的采用PEG4000进行；所述PEG4000的用量优选为1ml45％的PEG4000。本发明在所述细胞融合后进行培养，筛选识别犬细小病毒VP2蛋白的细胞株即为杂交瘤细胞株。在本发明中，所述培养用培养基为HAT培养基，所述培养的温度优选为37℃，所述培养的时间又选为2周；所述培养优选的在96孔板中进行。在本发明中，所述识别犬细小病毒VP2蛋白的细胞株优选的通过间接ELISA方法检测细胞培养上清进行筛选。在本发明中，优选的对筛选获得的识别犬细小病毒VP2蛋白的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆。
本发明提供了所述的杂交瘤细胞株5A92B12在制备犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体中的应用。在本发明中，将所述杂交瘤细胞株5A92B12腹腔接种小鼠后获得。在本发明中，所述小鼠优选为6～8周龄Balb/c小鼠；所述小鼠在腹腔接种前一周，优选的腹腔注射液体石蜡，所述液体石蜡的注射量为0.5mL/只。在本发明中，每只小鼠接种细胞数优选为1×105～1×106个；本发明在所述接种后，优选的间隔5天采集腹水。本发明在获得腹水后，将所述腹水进行离心，收集上清液；纯化所述上清液获得犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体。本发明中，所述离心的转速优选为12000～14000rpm，更优选为13000rpm；所述离心的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明在获得所述上清液后，进行纯化；所述纯化优选的采用Protein-SepharoseCL-4B进行：上柱液优选为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液优选为甘氨酸缓冲液，所述甘氨酸缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为2.7。
本发明提供了一种犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
DIQMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKN。
其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
QVQLKESGAELVRPGASVTLSCKASVYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGAIDPETGGTAYNQNFKDKATLTADRSSSTAYMELR。
在本发明中，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体优选由上述杂交瘤细胞株5A92B12产生，具体方法参见上述记载。
本发明还提供了所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备犬细小病毒病检测试剂盒中的应用。在本发明中，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体可以准确检测犬细小病毒病疫苗样品中有效抗原成分或感染组织样品中VP2蛋白的含量。在本发明中，所述检测优选的通过ELISA检测、Western-blot检测或免疫荧光检测实现。在本发明中，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体优选的经过生物标记或化学标记；所述生物标记包括酶标记，所述酶标记优选为辣根过氧化物酶标记。
本发明提供了一种犬细小病毒病检测试剂盒，包括所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和检测试剂。在本发明中，所述犬细小病毒病检测试剂盒优选为ELISA检测试剂盒、Western-blot检测试剂盒或免疫荧光检测试剂盒。本发明对所述检测试剂的种类和规格没有特殊限定，采用本领域常规的ELISA检测、Western-blot检测或免疫荧光检测所需要的检测试剂即可。在本发明中，所述ELISA检测试剂盒中的检测试剂优选的包括犬细小病毒VP2蛋白，所述犬细小病毒VP2蛋白作为包被抗原，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体经酶标记后作为检测竞争抗体。
本发明还提供了所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备治疗犬细小病毒病的药物中的应用。在本发明中，所述药物中犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的浓度优选为0.5～1μg。本发明中，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体能够抑制犬细小病毒的复制，具有治疗犬细小病毒病的作用。本发明对所述药物的剂型和辅料组成没有特殊限定，采用所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体能够接受的剂型和辅料即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
犬细小病毒分离
一、病料预处理：采集甘肃省兰州市某宠物医院疑似感染犬细小病毒的患犬肠内容物样品，按照体积比为1:10的比例加PBS溶液制成的悬液，7000rpm离心15min，取上清液500μL加入等量的氯仿，进行充分混匀，然后4000rpm离心15min，弃掉沉淀，上清经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置于-20℃冰箱保存备。
二、病毒分离：将上述处理过的病料样品，采用同步接毒的方式接种F81细胞(购自长春海光生物技术有限公司，货号：HG-ATCCF81)，于37℃5％的CO2培养箱内培养，并逐日观察细胞病变(CPE)情况；连续盲传培养，在传至第4代时可观察到CPE，命名为CPV-LZ-1分离株，初步证明病料中有犬细小病毒存在。
三、血凝特性鉴定：采用新鲜的1％猪红细胞悬液，购自，北京安众锐森科技有限公司，货号：F7705-05，检测CPV-LZ-1分离株5～9代F81细胞培养物的血凝特性，结果在培养的5～9代细胞培养物中，其血凝价在28～29之间，说明该分离株病毒血凝特性比较稳定。
四、分子生物学鉴定：根据GenBank中CPV序列，设计扩增VP2基因的特异性引物，将PCR扩增产物连接克隆载体进行序列测定。采用DNA STAR软件包的MegAlign软件将分离株与Genbank登录的CPVVP2基因进行比对，结果表明，本试验中分离株与其它参考株的相似性在98.8％～99.9％，具有很高的同源性。进一步对氨基酸序列进行分析，该毒株VP2基因的426位氨基酸为Asn，而不是Asp，因此该分离株为CPV-2a型。
犬细小病毒VP2蛋白的表达与纯化
一、基因克隆与表达载体构建
实施例1中分离获得的犬细小病毒CPV-LZ-1分离毒株由本实验室保存(可由市售犬细小病毒CPV-2a型分离株代替)，如下所示设计引物扩增目的片段：上游引物CPV-VP2F：CGCGGATCCATGAGTGATGGAGCAGTT(SEQ ID No.3)，下游引物CPV-VP2R：CCCAAGCTTTTAATATAATTTTCTAGGTGC(SEQ ID No.4)；引物两端分别添加BamHI和HindⅢ酶切位点；目的片段大小为1755bp；通过病毒DNA提取和目的基因的克隆，将VP2基因克隆至pMD18-T，挑选出阳性克隆并测序。将序列正确的阳性克隆双酶切，克隆到pET-30a表达载体，转化到Rosetta(DE3)感受态。
二、表达与纯化重组蛋白
将菌液以1:100的体积比扩大培养至OD为0.6～1，加入终浓度为1mM的IPTG诱导蛋白，收集菌体按重量体积比1：10加入含有8mol/L尿素的磷酸盐缓冲液重悬菌体并超声破碎；离心上清与菌体破碎沉淀，目的蛋白为不可溶性蛋白；用HiTrapTALONcrude(GE)纯化目的蛋白并用SDS-PAGE检测(图1)。
实施例2
杂交瘤细胞系的建立
一、实验材料
1、抗原：以上述实施例1中原核表达***表达犬细小病毒VP2蛋白作为抗原；
2、培养基：Hyclone DMEM培养基购于Thermo公司；HAT购于SIGMA公司；HT购于SIGMA公司；
3、实验动物：雌性Balb/c小鼠，8～12周龄，在SPF级条件饲养；
4、其他实验材料：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于SIGMA公司；PEG4000购于MERCK公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于abcam公司；其余试剂均为国产分析纯产品。
二、方法步骤
1、动物免疫
(1)一免：将VP2抗原与弗氏完全佐剂等体积混合并手握式均质机按3000转/分钟，乳化5min使其充分乳化，小鼠背部皮下多点注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为50μg(抗原)；
(2)二免：首次免疫后2周，将VP2抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，小鼠背部皮下多点注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为50μg；
(3)三免：在第二次免疫后2周，再用VP2抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，背部皮下多点注射免疫小鼠，每只Balb/c小鼠每次注射量为50μg；
(4)四免：在第三次免疫后2周，再用VP2抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，背部皮下多点注射免疫小鼠，每只Balb/c小鼠每次注射量为50μg；
(5)加强免疫：在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含50μgVP2抗原的磷酸盐缓冲液。
2、杂交瘤细胞的制备
按照常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞(购自武汉金凯瑞公司)。细胞计数后，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞个数比以5:1的比例混合，离心后细胞沉淀用1ml 45％PEG4000进行融合。融合细胞用HAT培养基悬浮后，铺96孔板，于37℃条件培养。融合后两周，采用间接ELISA检测细胞培养上清，筛选识别犬细小病毒VP2蛋白的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
3、杂交瘤细胞系的建立
经过3次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株针对犬细小病毒重组VP2蛋白的稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系；其中效果最好的1株杂交瘤细胞命名为5A92B12。
4、应用上述杂交瘤细胞系注射小鼠腹腔，收集纯化腹水后，然后进行SDS-PAGE，如图2所示，将所得的腹水进行效价检测，结果如表1和图4所示，结果表明，将5A92B12单克隆抗体稀释到3.906ng/ml浓度时，仍可与包被的抗原发生反应，其OD值可达0.9718，表明所制备的单克隆抗体具有很好的特异性和敏感性。
表1 5A92B12抗体效价测定结果
Figure BDA0003019714270000091
5、杂交瘤细胞系的传代培养
将上述稳定分泌5A9B12的杂交瘤细胞系在含有20％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM高糖培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1×106以上。
以上结果表明，本发明所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定地分泌抗犬细小病毒VP2蛋白的单克隆抗体。
实施例3
抗犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的大量制备及鉴定
一、抗体制备
选择6～8周龄Balb/c小鼠，腹腔注射0.5mL液体石蜡，每只小鼠0.5mL。一周后腹腔接种杂交瘤细胞细胞，每只小鼠接种细胞数为1×105～1×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
将腹水离心(13000rpm，30min)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein-SepharoseCL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为pH值2.7，20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗犬细小病毒VP2蛋白的单克隆抗体，经SDS-PAGE抗体纯度达到95％以上，如图2所示。
二、抗体的鉴定
1、单克隆抗体的Western验证
犬细小病毒灭活抗原在12％的SDS-PAGE分离，160mA处理90min后将蛋白醋酸纤维膜(NC膜)上。NC膜用5％脱脂奶室温封闭1h。PBST洗3次之后，加入单克隆抗体作为一抗，室温孵育1h。PBST洗三次之后，用标记HRP的羊抗鼠IgGFc二抗(1:5000)室温孵育1h，最后用Easy See Western BlotKit(TRAN)检测免疫反应(图3，其中5A9为本发明的5A92B12单抗，多抗为小鼠血清)，结果发现在约70kDa处有目的条带，表明本发明所用的5A92B12单克隆抗体能够与犬细小病毒灭活抗原发生特异性免疫反应。
2、单克隆抗体的病毒抑制试验
将犬细小病毒经倍比稀释，在12孔细胞培养板中，选取10-1～10-6稀释的病毒，每个滴度同步接种2孔F81细胞，感染2h后，一组细胞中加入终浓度为0.5μg单克隆抗体，一组细胞不加抗体，在37℃5％CO2培养箱中培养，逐日观察细胞病变，结果如图5所示，发现本发明制备的单克隆抗体具有抑制病毒复制的能力。
3、识别犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体可变区序列测定
将5A92B12杂交瘤细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物，重链可变区上游引物为：5′-TTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAG-3′(SEQ ID No.5)，重链可变区下游引物为：5′-CCAGGTCACTGTCACTGGCTC-3′(SEQ ID No.6)；轻链可变区VL上游引物为:5′ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3′(SEQ ID No.7)，轻链可变区下游引物为:5′GATACAGTTGGTGCAGCATCAGCC-3′(SEQ ID No.8)。用高保真酶进行PCR扩增，将PCR产物片段***到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。识别VP2蛋白的5A92B12的抗体的可变区氨基酸序列：轻链如SEQ ID No.1所示，重链如SEQ ID No.2所示。
由上述实施例可知，本发明提供的杂交瘤细胞株5A92B12能够稳定传代，可以持续、稳定地分泌抗犬细小病毒VP2蛋白的单克隆抗体；其产生的单克隆抗体与犬细小病毒VP2蛋白能特异性识别，具有高特异性、高敏感性的优点，同时具有抑制犬细小病毒复制的特性，能够应用于犬细小病毒病的检测和治疗，具有良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Asn
100 105
<210> 2
<211> 84
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Val Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgcggatcca tgagtgatgg agcagtt 27
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cccaagcttt taatataatt ttctaggtgc 30
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ttaaaaggtg tccagtgtga ag 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ccaggtcact gtcactggct c 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atgaagttgc ctgttaggct gttg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gatacagttg gtgcagcatc agcc 24

Claims (9)

1.一株杂交瘤细胞株5A92B12，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO：C202110。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株5A92B12在制备犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体中的应用。
3.一种犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株5A92B12产生。
4.权利要求3所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备犬细小病毒病检测试剂盒中的应用。
5.一种犬细小病毒病检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体和检测试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述犬细小病毒病检测试剂盒为ELISA检测试剂盒、Western-blot检测试剂盒或免疫荧光检测试剂盒。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括犬细小病毒VP2蛋白，所述犬细小病毒VP2蛋白作为包被抗原，所述犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体作为检测竞争抗体。
8.权利要求3所述的犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备治疗犬细小病毒病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物中犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的浓度为0.5～1μg。
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