CN112899239A - 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用 - Google Patents

一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及杂交瘤细胞株及其分泌的抗体，特别是指一株抗猪δ冠状病毒（PDCoV）N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。所述抗原表位的氨基酸序列为326‑QDWEWDDA‑333，杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV‑N‑6B7，保藏编号：CCTCC NO：C202178，保藏日：2021.3.26，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。6B7单克隆抗体针对的抗原表位保守性强，是线性表位，属于免疫显性表位，有利于待检血清中的抗体结合，因此利用针对该表位的单克隆抗体建立阻断ELISA试剂盒会更加灵敏。

Description

一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细 胞株及其分泌的抗体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及杂交瘤细胞株及其分泌的抗体，特别是指一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(PDCoV)属于冠状病毒科δ冠状病毒属成员，是近年来新出现的一种肠道冠状病毒，能够引起哺乳仔猪急性腹泻，呕吐，脱水，肠道绒毛萎缩，甚至导致死亡，严重影响猪的生长，对养猪业造成严重危害。DCoV引起仔猪的死亡率高达30％-50％，目前尚无有效的疫苗或治疗药物。2012年PDCoV由Woo等人最先鉴定、报道，随后PDCoV快速蔓延至多个国家，具有全球流行的潜在趋势，引起世界各国的极大关注。2014年我国相继从多个省份的病料中检测到了PDCoV的感染。
PDCoV病毒是单股正链RNA病毒，基因组全长25.4kb，是目前已知的最小冠状病毒。PDCoV的基因组包括：5’端非翻译区、ORF、ORF1a、ORF1b、棘突(S)蛋白、N蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、辅助蛋白NS6、辅助蛋白NS7、NS7a和3’端非翻译区等。PDCoV感染的靶器官是猪小肠，尤其是空肠和回肠，肠壁变薄、充满黄色液体。组织学观察发现肠绒毛萎缩、脱落，肠上皮细胞大量死亡且严重空泡化，固有层有大量炎性细胞浸润。PDCoV感染的临床症状与PEDV和TGEV引起的临床症状难以区分。本实验室之前的报道显示，在腹泻猪中，PDCoV和PEDV的混合感染率高达60.4％；但在收集的临床样品中，TGEV与PDCoV混合感染的比例相对较低，约为5.94％。目前没有针对PDCoV的商业疫苗。为了控制PDCoV的传播，有效地进行抗病毒治疗，需要一种快速、准确的诊断方法在疾病早期发现PDCoV的感染。
目前实验室检测是诊断PDCoV感染的主要手段。检测方法可分为抗原检测和抗体检测。目前，其中病原学检测有常规逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时RT-PCR、巢式RT-PCR以及高通量测序。这些方法在检测病毒遗传物质方面具有较高的灵敏度和可靠性，但都需要依靠昂贵的仪器，成本较高。血清学检测方法主要有有间接ELISA法、FMIA、免疫组化、免疫荧光以及病毒中和试验等。虽然这些方法都可以检测血清抗体，但ELISA方法更方便和快速。间接ELISA方法容易受到血清中补体或各种细胞因子的影响，从而增加非特异性结合，影响检测结果。
PDCoV N蛋白是PDCoV中最保守和丰富的结构蛋白之一，在细胞中大量表达，病毒感染后引起早期免疫，具有作为PDCoV诊断靶点的潜力。目前针对PDCoV N蛋白抗体检测的ELISA方法均为间接法，而目前研究发现不同冠状病毒的N蛋白之间存在一定的交叉，其血清可能会与其他冠状病毒存在交叉反应，为解决现有PDCoV N蛋白抗体检测中的问题，迫切需要建立一个基于N蛋白抗原表位及其配对单克隆抗体的检测方法确，以实现快速的检测PDCoV。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述抗原表位的氨基酸序列为-QDWEWDDA-，杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7，保藏编号：CCTCC NO：C202178，保藏日：2021.3.26，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
所述单克隆抗体命名为单抗6B7。
基于N蛋白抗原表位和权利要求2所述的单克隆抗体的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括抗原包被板、样本稀释液PBST 20mL、25×浓缩洗涤液PBST 20mL、阴阳对照血清、酶标抗体、TMB单组分显色液25mL和ELISA终止液15mL。
所述抗原包被板包括N蛋白、0.2M PB磷酸盐缓冲液和封闭液，其中酶标抗体为单抗6B7经过过碘酸钠法标记得到。
上述的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：
(1)包被：以0.2M PB磷酸盐缓冲液为包被液稀释N蛋白，加入酶标板中，每孔100μL，于37℃中放置3小时，弃去包被液，后经PBST洗涤2次，拍干；
(2)封闭：每孔加入150μL 1％BSA+5％蔗糖+0.01M PBS的封闭液，于37℃中放置2小时。弃去封闭液，拍干后37℃烘干，放入含有干燥剂的自封袋中密封；
(3)样品：分别加入使用0.01M PBST按照1/8倍稀释的阴阳性血清和临床样品，每孔50μL，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30分钟；
(4)酶标抗体：加入使用抗体保护剂稀释的酶标单抗，每孔50μL，轻微振板混匀，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30分钟；
(5)显色：经洗板4次拍干后，加入底物索莱宝TMB单组分显色液进行显色，每孔100μL，贴上封板贴，于37℃温箱中避光反应10分钟；
(6)终止：加入索莱宝ELISA终止液终止显色反应，每孔50μL，轻微振板混匀，使用酶标仪读值；
(7)结果判定：根据各孔的值计算其S/N值，其中S为样品的值，N为阴性对照的值，阴阳性对照各做一组重复，N取其平均值；S/N值≤0.559判定为阳性，S/N值≥0.804判定为阴性，0.559<S/N值<0.804判定为可疑，可疑样品进行复检，复检结果S/N值>0.804判定为阴性，S/N值≤0.804判定为阳性。
所述步骤(1)中N蛋白的包被浓度为1μg/ml。
所述步骤(4)中酶标单抗被抗体保护剂稀释的倍数为2000倍。
所述步骤(6)中酶标仪读值时是在OD450nm。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请发明人对N蛋白的抗原表位优势区进行分时，发现N蛋白大部分区域都有较好的亲水性，大部分区域都具有较好的抗原性，根据抗原表位区域分布情况设计出5对交叉重叠的N基因短截引物，对五段截短N蛋白分别设计引物。根据设计的引物表达出5个交叉重叠且包含全长的N短截蛋白，使用WB方法鉴定发现，单抗6B7与N-5短截蛋白反应，为进一步鉴定单抗6B7的识别区域，本申请将N-5蛋白分段为两部分交叉的蛋白设计引物，构建重组质粒，进行表达并进行WB鉴定，可以看到6B7单抗与N-5-2截短蛋白反应而不与N-5-1短截蛋白反应，这些结果说明单抗6B7识别的抗原表位位于氨基酸312-342之间，再进一步分析发现当C端缺失第333位氨基酸时，单抗不能够识别短截蛋白，当N端缺失326位氨基酸时，单抗不再识别短截蛋白，说明第326位氨基端和333位氨基酸是单抗6B7所识别的两端关键氨基酸，单抗6B7针对的抗原表位为氨基酸326-QDWEWDDA-333(326-333AA)。6B7单克隆抗体针对的抗原表位保守性强是线性表位，为一个免疫显性表位，有利于待检血清中的抗体结合，因此利用针对该表位的单克隆抗体建立阻断ELISA试剂盒会更加灵敏。
2、该试剂盒的使用时间在1.5h以内，操作方便快捷，省时省力，并且该阻断ELISA抗体检测试剂盒与抗体检测的金标准中和试验进行对比，符合率可以达到93％，且本申请的试剂盒不依赖显微镜，允许更大规模的检测，可以用于畜群的大规模筛选。
3、该试剂盒对兔抗PDCoV N蛋白的阴阳性血清和鼠抗PDCoV N蛋白的阴阳性血清进行检测，结果显示，可以准确检测不同种属血清中针对PDCoV N蛋白的抗体，该试剂盒适用范围较广，将会有更好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为WB鉴定单抗与PDCoV N蛋白的反应性。
图2为免疫荧光鉴定单抗与PDCoV N蛋白的反应性。
图3为最佳包被液的确定。
图4为最佳包被条件的确定。
图5为最佳封闭液的确定。
图6为样品稀释液的确定。
图7为血清反应时间的确定。
图8为辣根过氧化物酶标记单克隆抗体反应时间的确定。
图9为显色时间的确定。
图10为临界值的确定。
图11为阻断ELISA抗体检测方法的特异性。
图12为兔抗N蛋白血清阻断ELISA方法的检测。
图13为鼠抗N蛋白血清阻断ELISA方法的检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、材料
1、细胞株的制备
含重组质粒PET-28a-PDCoV-N的表达菌种；杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7由本实验室制备并保藏，杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7，保藏编号：CCTCCNO：C202178，保藏日：2021.3.26，保藏地址：中国，武汉，武汉大学；BALB/c小鼠购自河南实验动物中心。
1.1关于杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7产生的单抗
本申请保藏的杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7产生的单抗与与表达纯化的N蛋白发生了特异性反应，出现一条明显的条带，而SP2/0细胞上清与N蛋白并未出现条带，如图1所示，表明我们制备的单抗特异性良好，可以很好的识别N蛋白。
单抗6B7识别的抗原表位通过WB方法鉴定，发现位于氨基酸312-342之间，在对单抗6B7所识别的区域312-342位氨基端进行多次分段表达，可以看到当C端缺失第333位氨基酸时，单抗不能够识别短截蛋白，当N端缺失326位氨基酸时，单抗不再识别短截蛋白，说明第326位氨基端和333位氨基酸是单抗6B7所识别的两端关键氨基酸，单抗6B7针对的抗原表位为氨基酸326-QDWEWDDA-333(326-333AA)。
为了确定这个表位在不同PDCoV毒株以及与其他猪冠状病毒的保守性，本申请比较了GenBank中其他PDCoV毒株和冠状病毒的N蛋白序列。结果表明，这个表位在PDCoV毒株中高度保守，PDCoV与亚洲豹猫冠状病毒、喜鹊-知更鸟冠状病毒、鹅口疮冠状病毒、雀三角洲冠状病毒、白眼冠状病毒和文鸟冠状病毒在表位326～333AA的序列相似性为62.25％～100％。其他Deltacoronvirus与PDCoV的326-333AA表位序列相似性为12.5％～50％。此外，对已知的冠状病毒亚科成员序列比对发现，表位326-333AA在PDCoV中仍具有较高的特异性，而与其他冠状病毒的序列同源性较低。
为了探究该抗原表位在N蛋白上的位置，本申请对N蛋白进行三维结构预测，该表位位于N蛋白表面的一个顶点，是一个免疫显性表位。
进行免疫荧光结果如图2所示，单抗6B7能够与感染PDCoV后的ST细胞发生反应，在细胞中出现荧光而未感染PDCoV的ST细胞均未出现荧光。
对单克隆抗体的亚型进行鉴定的结果表明，本申请的单抗6B7为IgG2b，轻链类型为Kappa型。
2、溶液配制
(1)0.06M醋酸缓冲液：配制A液(0.18M醋酸钠)，2.45g醋酸钠溶解于去离子水中，定容至100mL；B液(0.18M醋酸)，冰醋酸2mL加去离子水定容至70mL。按A:B＝5.9:4.1比例混匀，混合液中加入两倍体积的去离子水后即为0.06M，PH 4.8的醋酸缓冲液。
(2)饱和硫酸钠溶液：在室温下向1L去离子水中加入过量的硫酸铵颗粒，搅拌溶解，至底部固体颗粒不再溶解为止。
(3)0.1M NaIO4溶液：称取241mg高碘酸钠溶于高压的去离子水10mL中，待完全溶解，保存于4℃，现配现用。
(4)1mM醋酸钠缓冲溶液：使用去离子水将上述(2)中A液稀释180倍稀释即成。
(5)0.2M碳酸盐缓冲溶液(CB)：称取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g溶解于250mL去离子水中，待完全溶解，保存于4℃备用。用去离子水稀释4倍，即成0.05M的碳酸盐缓冲液(PH 9.6)。
(6)4mg/mL的NaBH4溶液：称取4mg NaBH4溶于1mL去离子水，待完全溶解，保存于4℃，现配现用。
(7)0.2M磷酸盐缓冲溶液(PB，PH 7.5)：称取十二水合磷酸氢二钠20.43g，二水合磷酸二氢钠22.27g溶解至去离子水中，定容至1L，保存于4℃备用。
(8)0.1M Tirs盐酸缓冲溶液(TB，PH 7.5)：称取12.1g Tris加入到1L去离子水中，滴加浓盐酸至pH为7.5。
(9)1％BSA：称取1g牛血清白蛋白(BSA)、5g蔗糖溶解于80mL的0.01M PBS中，加入100μL PC-300，待完全溶解混匀后，定容至100mL，4℃保存备用。
(10)1％酪蛋白：称取1g酪蛋白、5g蔗糖溶解于8 0mL的0.01MPBS中，加入100μLPC-300，待完全溶解混匀后，定容至100mL，4℃保存备用。
(11)1％明胶：称取1g明胶、5g蔗糖溶解于80mL的0.01MPBS中，加入100μL PC-300，待完全溶解混匀后，定容至100mL，4℃保存备用。
二、方法
2.1、PDCoV阳性血清的制备
采用25kg左右健康非免疫猪(PDCoV病原学检测阴性，PDCoV抗体中和试验阴性),以猪δ冠状病毒HNZK-04株灭活抗原加佐剂乳化为免疫原，每头猪颈背部肌肉多点注射乳化的抗原2ml(共免疫3次，每次免疫间隔14天，首次免疫采用抗原加弗氏完全佐剂1：1混合乳化后免疫，二次免疫采用抗原加弗氏不完全佐剂1：1混合乳化后免疫，三次免疫与二次免疫方法相同但抗原剂量加倍)。三次免疫后14天小样无菌采血分离血清，检测血清抗体病毒中和效价，待达到要求后，正式采血，分离的血清加入0.1％Procline300，-20℃以下保存备用。
2.2、PDCoV阴性血清的制备
阴性质控样品包括已知未感染样本、猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体阳性样本、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体阳性样本、猪萨佩罗病毒(PSV)抗体阳性样本。
采用25kg左右健康非免疫猪(PDCoV病原学检测阴性，PDCoV抗体中和试验阴性)，无菌采血分离血清。加入0.1％Procline300，-20℃以下保存备用。
采用3只25kg左右健康非免疫猪，分别以猪流行性腹泻病毒油乳剂灭活疫苗(CV777株)、猪传染性胃肠炎病毒油乳剂灭活疫苗(华毒株)、猪萨佩罗病毒油乳剂灭活疫苗(CHN-HNHB-01株)为免疫原，按照疫苗免疫程序进行免疫。小样静脉无菌采血分离血清，进行抗体效价检测，若免疫血清效价达到要求，则正式采血分离血清，分离的血清加入0.1％Procline300，-20℃以下保存备用。
2.3、重组PDCoV N蛋白的表达及纯化
取冻存的pET-28a-PDCoV-N表达菌种，接种于液体LB培养基中，加入IPTG诱导表达，通过蛋白纯化试剂盒进行纯化。将纯化后的蛋白液装入孔径为8000D的透析袋中，于PBS中4℃透析过夜，测定蛋白浓度，分装于-80℃保存。
2.4、单克隆抗体的制备及标记
2.4.1、阳性杂交瘤细胞株的筛选
用纯化过的PDCoV N蛋白，免疫BALB/c小鼠，待血清效价较高时，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，利用N蛋白包被酶标板进行间接ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞株经有限稀释法亚克隆，经多次亚克隆至单细胞后，扩大培养，再经免疫荧光试验验证抗体的特异性。用PDCoV免疫的猪阳性对照血清和未免疫过PDCoV的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体。
2.4.2、杂交瘤细胞的培养
从液氮罐中取出一只PDCoV-N-6B7杂交瘤细胞在37℃水浴下快速融化，使用无血清DMEM清洗细胞，用含10％血清的DMEM培养基于T75培养瓶中培养，待细胞长至饱满透亮状态后，为最佳的状态，维持好细胞状态。
2.4.3、单克隆抗体腹水的制备及纯化
挑选健康的BALB/c小鼠，在注射细胞前一周于腹腔注射500μL液体石蜡。将杂交瘤细胞经无血清DMEM清晰后，使用500μL无血清DMEM重悬1×106个杂交瘤细胞，待小鼠腹部开始胀起时，抽取腹水。腹水采用辛酸铵硫酸铵沉淀法进行纯化，具体如下。
(1)按照1:2的比例在1倍体积腹水中缓慢加入2倍体积0.06M醋酸缓冲液，搅拌混匀。
(2)按照每毫升腹水加入33μL正辛酸的比例边搅拌边缓慢加入正辛酸，于4℃静置2h，12000r/min离心30min，取上清，并通过细胞筛除去溶液中的粘稠状油脂。
(3)加入1/10体积的0.01M的PBS，并用1M的NaOH将PH调至7.4，边搅拌边缓慢加入饱和硫酸钠(PH 7.4)使硫酸铵终浓度为45％，4℃静置12-16h。
(4)于4℃离心机中，12000r/min，离心30min，弃上清，0.01M PBS重悬沉淀。
(5)将重悬液加入透析袋(透析分子量8000-14000D)中，置于0.01M PBS，4℃透析12-16h除盐，将纯化的抗体分装冻存于-80℃。
2.4.4、单克隆抗体的标记
单克隆抗体的标记采用最常用的过碘酸钠法进行标记，使用NaIO4将HRP表面的糖分子氧化为醛基，然后与IgG上面的氨基相结合。步骤如下。
(1)称取5mg的辣根过氧化物酶(HRP)，溶于1mL蒸馏水中。
(2)于上液中加入200μL新配制0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20-30min。
(3)将上述溶液装入到透析袋(透析分子量8000-14000D)中，于1mM PH 4.4的醋酸钠缓冲溶液中进行透析，4℃下12h。
(4)在透析后的溶液中加入0.2M(PH 9.6)的CB溶液200μL，使用1M的NaOH将醛化HRP的PH调至9.5左右，然后迅速加入纯化后抗体10mg(浓度为4mg/mL，溶剂为0.01M PBS)，4℃避光轻轻搅拌12-16h。
(5)在上述溶液中加入235μL新配制的4mg/mL的NaBH4溶液(每1mg HRP加47μLNaBH4)，混匀后静置于4℃2h。
(6)将上述溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，于4℃沉淀30min，经4℃，12000r/min离心30min。
(7)弃上清，沉淀用0.01M PBS重悬，于4℃下，在0.01M PBS溶液中透析12-16h。
(8)将透析后溶液12000r/min离心10min，上清即为标记后的抗体溶液，分装保存于-80℃。
2.5、PDCoV阻断ELISA反应条件的优化
通过抗原的包被量、酶标抗体的工作浓度、各阶段反应的缓冲体系和各阶段的反应时间的优化，以此确定一套最佳的反应条件，完成阻断ELISA抗体检测方法的建立。在最优的选择过程中要优先保证阴性OD值大于1，阳性OD值小于0.3的原则，其次P/N值最小。具体流程如下。
(1)抗原包被浓度及酶标抗体浓度的选择：采用方阵法将N蛋白使用0.05M CB(pH9.6)进行连续倍比稀释，按照2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0.25μg/mL的浓度进行包被，每孔包被100μL，于37℃静置3h。弃去包被液，经PBST洗涤2次，拍干。每孔加入150μL 1％的BSA封闭液，于4℃中放置20-24h。弃去封闭液，拍干。分别加入使用1％的BSA按照1/8倍稀释的阴阳性血清，每孔50μL，贴上封板贴，于37℃温箱中反应1h。加入使用抗体保护剂按照1/500、1/1000、1/2000和1/4000倍进行稀释的酶标单克隆抗体，每孔50μL，轻微振板混匀，贴上封板贴，于37℃温箱中反应1h。加入单组分TMB显色液进行显色，每孔100μL，贴上封板贴，于37℃温箱中避光反应10min。加入ELISA终止液终止显色，每孔50μL，使用酶标仪读值(OD450nm)。根据各孔的值计算其P/N值，其中P为阳性对照值，N为阴性对照值。以阴性血清测得OD值大于1，阳性血清测得OD值小于0.3，且P/N值最小时的抗原包被浓度和酶标抗体的稀释浓度为最佳包被浓度和最佳抗体稀释浓度。
(2)最佳包被液的选择：以测得的最佳抗原包被浓度包被抗原，包被液依次选择最常用的三种包被液0.05M CB(PH 9.6)、0.2M PB(PH 7.5)和0.1M TB(PH 7.5)稀释抗原。按照最佳抗体稀释浓度进行后续阻断ELISA试验，选择P/N值最小时的包被液为最佳的包被液。
(3)最佳包被条件的选择：以最佳的包被浓度和包被抗原，将加入包被液的酶标板于4℃放置20-24h和37℃放置3h，使用最佳的抗体稀释浓度进行后续的阻断ELISA试验，以此分析抗原的热稳定性，选择P/N值最小时的包被条件为最佳的包被条件。
(4)最佳封闭液的选择：以上述筛选的最佳包被方式包被抗原，封闭液选择1％BSA、1％酪蛋白和1％明胶于37℃恒温箱中封闭2h，按照最佳抗体稀释浓度进行后续阻断ELISA试验，选择P/N值最小时的封闭液液为最佳的封闭液。
(5)最佳样品稀释液的选择：样品稀释液我们选择PBS和PBST两种进行测试，以上述确定的各个最佳反应条件进行阻断ELISA试验，选择P/N值最小时的样品稀释液为最佳的样品稀释液。
(6)血清样品最佳反应时间的选择：以上述确定的最佳条件包被抗原，封闭酶标板，稀释血清后每孔加入50μL，分别放置于37℃温箱30min、45min、1h和1.5h，每孔加入50μL稀释后的酶标抗体完成后续阻断ELISA试验，根据P/N值选择最佳的血清反应时间。
(7)酶标抗体最佳反应时间的选择：以上述确定的最佳条件包被抗原，封闭酶标板，每孔加入稀释后的血清50μL，放置于37℃温箱孵育最佳的反应时间，每孔加入稀释的酶标抗体50μL，于37℃中反应30min、45min以及60min，完成后续阻断ELISA试验，根据P/N值选择最佳的酶标抗体反应时间。
(8)最佳显色时间的选择：按照各项最佳反应条件进行包被，封闭酶标板，加入稀释好的血清于37℃反应，加入稀释后的酶标抗体于37℃反应，经4次洗板后，拍干，加入TMB单组分显色液，分别反应5min、10min以及15min，终止显色，进行读值。根据P/N值选择最佳的显色时间。
2.6、PDCoV阻断ELISA抗体检测方法判定标准的确定
取实验室经病毒中和试验和间接ELISA鉴定为PDCoV阴性的血清50份，按照上述各项最佳反应条件进行阻断ELISA试验，计算样品的S/N值，按照统计学方法，使用公式对检测结果进行分析，
Figure BDA0003011239660000091
Figure BDA0003011239660000092
可疑样品进行复检，复检结果
Figure BDA0003011239660000093
Figure BDA0003011239660000094
其中
Figure BDA0003011239660000095
为所测得所有阴性血清S/N值的平均值，SD(Standard Deviation)为所测得阴性血清S/N值的标准偏差。
2.7、PDCoV阻断ELISA抗体检测方法的评估
(1)特异性试验：以建立的PDCoV阻断ELISA抗体检测方法进行交叉试验，检测PEDV阳性血清，TGEV阳性血清，PSV阳性血清，同时用PDCoV阳性和阴性血清作为对照，测得所有样品的OD值，计算S/N值，以此判断PDCoV阻断ELISA抗体检测方法的特异性。
(2)敏感性试验：使用建立的PDCoV阻断ELISA抗体检测方法，检测中和试验鉴定为PDCoV阳性的50份临床血清，其中中和效价为1/4的血清15份、1/16的血清15份、1/64的血清15份以及1/256的血清5份。测得各组分的阳性率，分析该方法的敏感性。
(3)批内重复试验：以最佳包被条件包被，封闭酶标板，取同一批次包被的酶标板3块，临床血清8份，其中PDCoV阳性血清4份，阴性血清4份，按照建立的PDCoV阻断ELISA抗体检测方法进行后续试验，记录OD值，计算S/N值以及3块酶标板之间的变异系数。
(4)批间重复试验：分别在不同时间以最佳包被，封闭条件制备3批酶标板，检测8份临床血清，其中PDCoV阳性血清4份，阴性血清4份，按照建立的阻断ELISA方法进行后续试验，记录OD值，计算S/N值以及3批酶标板之间的变异系数。
(5)符合率试验：用我们建立的阻断ELISA方法对病毒中和试验鉴定过的100份临床血清进行检测，计算S/N值，分析该阻断ELISA抗体检测方法与病毒中和试验的符合率。
2.8、PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的稳定性验证
通过加速稳定性试验验证该试剂盒的稳定性。以最佳包被条件包被酶标板，使用最佳封闭液进行封闭，封闭结束后，排干，于干燥37℃温箱中烘干，及时取出并装入含有干燥剂的自封袋中密封；制备样本稀释液、洗涤液、使用抗体保护剂稀释的阴阳性对照血清、使用抗体保护剂稀释的酶标抗体，并在超净台中过滤除菌；购买索莱宝TMB单组分显色液和ELISA终止液组装出成品的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒。将该试剂盒于2～8℃保存7天，以及在37℃中保存7天，而后分别检测阴阳性血清，评价该试剂盒的稳定性。
2.9、PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同种属血清间的应用
利用制备的PDCoV阻断ELISA试剂盒对兔抗PDCoV N蛋白的阳性血清和鼠抗PDCoVN蛋白的阳性血清进行检测，两种阳性血清从1/4倍倍比稀释至1/512，同时设兔和鼠阴性血清对照，计算S/N值并分析结果。
3、结果
3.1、制备PDCoV阳性血清的结果
对制备的PDCoV阳性抗体用病毒中和试验进行检验中和效价达到1：1024以上则说明PDCoV阳性抗体制备成功。
3.2、制备PDCoV阴性血清的结果
对健康免疫猪采血，通过PDCoV中和试验测得血清为PDCoV阴性血清。
对制备的猪流行性腹泻病毒阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒阳性血清、猪萨佩罗病毒阳性血清进行效价检测效价均达到1：1024以上，通过PDCoV中和试验检测，为PDCoV阴性血清。
3.3、单克隆抗体的制备
经过免疫N蛋白小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合筛选后最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为PDCoV-N-6B7，(杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7，保藏编号为：CCTCC NO.C202178)。
3.4、阻断ELISA检测方法中各个条件的确定
(1)抗原包被浓度及抗体工作浓度的确定：根据阴性OD值大于1，阳性OD值小于0.3，且P/N值最低的原则，确定最佳的包被浓度和最佳的酶标抗体工作浓度，N蛋白的最佳包被浓度为1μg/mL，酶标单克隆抗体的最佳稀释倍数为2000倍。
表3-2方阵法测定抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度
Figure BDA0003011239660000111
(2)包被液的确定：使用不同的包被液包被抗原，封闭后检测标准阴阳性血清，如图3所示结果显示0.2M PB的包被效果最佳，P/N值最低，说明其对应的阻断效果最佳，选择0.2M PB作为最佳的包被液。
(3)包被条件的确定：按照最佳的包被浓度进行包被抗原，经不同的包被条件包被后完成试验，计算P/N值，如图4所示，37℃包被的酶标板P/N值为0.072，4℃包被的酶标板P/N值为0.263，说明抗原的热稳定性比较好，在37℃下包被更佳。
(4)封闭液的确定：将抗原包被至酶标板后，使用不同的封闭液进行封闭酶标板，检测标准阴阳性血清，如图5所示，封闭液1％BSA所对应的P/N值最小，说明其所对应阻断效果最佳，所以确定含1％BSA的磷酸盐缓冲液为最佳封闭液。
(5)样品稀释液的确定：我们使用PBS与PBST稀释阴阳性血清进行试验，如图6所示，对比发现PBST相对于PBS测得的P/N值更小，因此选择PBST作为样品稀释液。
(6)血清反应时间的确定：在阻断ELISA试验中，我们设血清的反应时间为30min、45min、1h和1.5h，比较P/N值，由图7可以看到，虽然1h和1.5h反应时间的P/N值均小于30min和45min，但其阻断率均能达到90％以上，且小于93％，差异不大。为降低试剂盒的反应时间可以选择30min进行血清的孵育，因此选择30min为血清的最佳反应时间。
(7)酶标抗体反应时间的确定：在阻断ELISA试验中，血清反应1h结束后直接加入稀释好的酶标单克隆抗体，反应30min、45min和60min，分析实验结果由图8发现，酶标单克隆抗体反应30min以上，阻断率均能够达到90％以上，因此选择酶标单克隆抗体的最佳反应时间为30min。
(8)显色时间的确定：在阻断ELISA试验中，加入TMB单组分显色液后，放置于37℃温箱5min、10min和15min进行反应，分析实验结果由图9可以发现，显色时间为10min时，P/N值最小，确定显色液的最佳作用时间为10min。
3.5、临界值的确定
通过阻断ELISA方法检测50份PDCoV阴性血清，计算其S/N值如图10所示，我们算得
Figure BDA0003011239660000121
为1.290，SD为0.239，确定
Figure BDA0003011239660000122
所以当检测结果S/N值≤0.574判定为阳性；S/N值≥0.813判定为阴性；0.574<S/N值<0.813判定为可疑。可疑样品进行复检，复检结果S/N值>0.813判定为阴性，S/N值≤0.813判定为阳性。
3.6、PDCoV阻断ELISA抗体检测方法流程总结
(1)包被：以0.2M PB为包被液稀释抗原，加入酶标板中，每孔100μL，于37℃中放置3h，弃去包被液，后经PBST洗涤2次，拍干。
(2)封闭：每孔加入150μL 1％BSA封闭液，于4℃中放置20-24h。弃去封闭液，拍干后37℃烘干，及时取出放入含有干燥剂的自封袋中密封。
(3)样品：分别加入使用0.01M PBST稀释8倍的临床样品，两个重复孔的阴阳性血清，每孔50μL，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30min。
(4)酶标抗体：加入使用抗体保护剂稀释2000倍的酶标抗体，每孔50μL，轻微振板混匀，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30min。
(5)显色：经洗板4次拍干后，加入TMB单组分显色液进行显色，每孔100μL，贴上封板贴，于37℃温箱中避光反应10min。
(6)终止：加入ELISA终止液终止显色，每孔50μL，使用酶标仪读值(OD450nm)。
(7)结果判定：根据各孔的值计算其S/N值，其中S为样品的值，N为阴性对照的值，阴阳性对照各有一个重复孔，N取其平均值。S/N值≤0.559判定为阳性，S/N值≥0.804判定为阴性，0.559<S/N值<0.804判定为可疑，可疑样品进行复检，复检结果S/N值>0.804判定为阴性，S/N值≤0.804判定为阳性(阴性值大于1，阳性值小于0.3时试验成立)。
3.7、PDCoV阻断ELISA抗体检测方法的评估
特异性试验：通过阻断ELISA方法对PEDV阳性血清、TGEV阳性血清、PSV阳性血清和PDCoV阴阳性血清进行检测，计算各个样本的S/N值如图11所示，可以看到PEDV阳性血清、TGEV阳性血清和PSV阳性血清判定均为阴性，说明该试剂盒特异性良好，不与其他病毒抗体存在交叉反应。
敏感性试验：通过分析50份不同PDCoV中和效价的阳性样本，计算S/N值，分析不同中和效价各组分样本的阳性率发现，中和效价为1/64，1/256的样本均判定为阳性，阳性率为100％(20/20)，中和效价为1/4的样本有3份判定为阴性，阳性率为80％，中和效价为1/16的样本有一份判定为阴性，阳性率为93.3％(14/15)。总体看来病毒中和效价在1/4以上的血清阳性符合率高达97.14％，病毒中和效价在1/16以上的血清阳性符合率为100％，说明抗体检测方法敏感性良好。
表3-3敏感性试验检测结果
Figure BDA0003011239660000131
批内重复性试验：使用同批次的不同酶标板对4份阳性样品和4份阴性样品进行检测，计算S/N值以及变异系数，均小于10％，且并没有影响实验结果，说明该检测方法批内重复性较好。
表3-4阻断ELISA方法的批内重复性试验结果(S/N值)
Figure BDA0003011239660000132
批间重复性试验：使用不同批次的酶标板对4份阳性样品和4份阴性样品进行检测，计算S/N值以及变异系数，变异系数最高为9.61％，且并没有影响实验判定结果，说明该检测方法批间重复性较好。
表3-5阻断ELISA方法的批间重复性试验结果(S/N值)
Figure BDA0003011239660000141
符合率试验：通过阻断ELISA抗体检测方法和病毒中和抗体检测方法对100份临床样品检测，经中和试验检测其中阳性血清80份，阴性血清20份。使用阻断ELISA检测，中和试验80份阳性血清中检测到74份阳性，6份阴性；中和试验20份阴性血清中检测到19份阴性，1份阳性。总符合率为93％，符合率较高。
表3-6阻断ELISA与病毒中和试验符合率
Figure BDA0003011239660000142
总符合率＝(74+19)/(74+6+1+19)＝93％
3.8、PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的稳定性
通过加速稳定性试验将我们制备的试剂盒于37℃放置7天和4℃放置7天，检测阴阳性血清进行比较，计算S/N值，结果显示在37℃放置7天的试剂盒与4℃放置7天试剂盒相比，阴性值仍大于1，阳性值小于0.3；阴阳性血清同程度降幅20％左右；但其P/N值并没有发生明显改变，说明试剂盒较为稳定。
表3-7 PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的降幅
Figure BDA0003011239660000151
3.9、PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同种属血清间的应用
用制备的阻断ELISA抗体检测方法对兔和鼠抗PDCoV N蛋白阳性血清进行检测，结果如图12和13所示显示兔和鼠抗PDCoV N蛋白阳性血清具有明显的阻断作用并且随着阳性血清的稀释，抗体含量的降低，阻断效率也在降低，说明该检测方法能够检测不同种属血清中针对PDCoV N蛋白的抗体。
四、讨论
PDCoV N蛋白是PDCoV中最保守和丰富的结构蛋白之一，在细胞中大量表达，病毒感染后引起早期免疫，具有作为PDCoV诊断靶点的潜力。N蛋白的特性决定了它是最佳的检测靶蛋白，目前针对PDCoV N蛋白抗体检测的ELISA方法均为间接法，而目前研究发现冠状病毒的N蛋白存在一定的交叉，其血清可能会与其他冠状病毒存在交叉反应，而阻断ELISA是待检血清中的抗体与单克隆抗体竞争同一抗原表位，抗原表位的保守性越好，建立的方法特异性将越强，因此建立一个基于N蛋白抗原表位及其配对单克隆抗体的检测方法将会更加准确，快速的检测PDCoV。
在本研究中，基于上一实验中对抗体抗原表位的研究，其中6B7单克隆抗体针对的抗原表位保守性强是线性表位，为一个免疫显性表位，有利于待检血清中的抗体结合，因此利用针对该表位的单克隆抗体建立阻断ELISA试剂盒会更加灵敏。该试剂盒的使用时间在1.5h以内，操作方便快捷，省时省力，并且该阻断ELISA抗体检测试剂盒与抗体检测的金标准中和试验进行对比，符合率可以达到93％。病毒的中和试验，免疫荧光试验，阻断ELISA都可以应用与PDCoV抗体的检测，并且准确度较高，但阻断ELISA方法比其他检测方法更有优势，因为它更快、更简单、更便宜，而且不依赖显微镜，允许更大规模的检测，因此可以用于畜群的大规模筛选。
阻断ELISA方法的原理是待检血清中的抗体封闭抗原的抗原表位，阻断单克隆抗体与抗原的进一步结合。理论上无论什么种属的血清，都可以进行检测是否含有PDCoV的抗体。本研究建立的检测方法成功检测出本实验室保存的高免兔和鼠PDCoV N蛋白阳性血清中的抗体。PDCoV的起源目前尚不清楚，大部分δ属冠状病毒在野生鸟类中检测到，PDCoV是唯一能够感染哺乳动物的δ属冠状病毒。而PDCoV与部分禽类δ属病毒具有高度的基因组相似性，因此PDCoV可能来源于禽类DCoV。目前的研究证实了PDCoV具有感染其他动物的潜力，包括牛和鸡，最近又有报道PDCoV更是可以感染人，对于种属血清的PDCoV抗体检测即可以用该阻断ELISA试剂盒。
综上，本研究通过对各个反应条件及缓冲液的优化，以及临界值的确定，研发出一个基于N蛋白和单克隆抗体6B7的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒。该PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒特异性好，敏感性高，重复性好，与病毒中和试验符合率高，并且能够检测不同种属血清中针对PDCoV的抗体，适用范围广；另外，该试剂盒质量稳定，降幅程度小，保存期长，可满足一线生产应用的需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述抗原表位的氨基酸序列为-QDWEWDDA-，杂交瘤细胞株的分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV-N-6B7，保藏编号：CCTCC NO：C202178，保藏日：2021.3.26，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体命名为单抗6B7。
3.基于N蛋白抗原表位和权利要求2所述的单克隆抗体的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：抗原包被板、样本稀释液PBST 20mL、25×浓缩洗涤液PBST 20mL、阴阳对照血清、酶标抗体、TMB单组分显色液25mL和ELISA终止液15mL。
4.根据权利要求3所述的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗原包被板包括N蛋白、0.2M PB磷酸盐缓冲液和封闭液，其中酶标抗体为单抗6B7经过过碘酸钠法标记得到。
5.权利要求3或4所述的PDCoV阻断ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：
（1）包被：以 0.2M PB磷酸盐缓冲液为包被液稀释N蛋白，加入酶标板中，每孔100μL，于37℃中放置3小时，弃去包被液，后经PBST洗涤2次，拍干；
（2）封闭：每孔加入150μL 1%BSA+5%蔗糖+0.01M PBS的封闭液，于37℃中放置2小时；
弃去封闭液，拍干后37℃烘干，放入含有干燥剂的自封袋中密封；
（3）样品：分别加入使用0.01M PBST按照1/8倍稀释的阴阳性血清和临床样品，每孔50μL，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30分钟；
（4）酶标抗体：加入酶标单抗，每孔50μL，轻微振板混匀，贴上封板贴，于37℃温箱中反应30分钟；
（5）显色：经洗板4次拍干后，加入底物索莱宝TMB单组分显色液进行显色，每孔100μL，贴上封板贴，于37℃温箱中避光反应10分钟；
（6）终止：加入ELISA终止液终止显色反应，每孔50μL，使用酶标仪读值；
（7）结果判定：根据各孔的值计算其S/N值，其中S为样品的值，N为阴性对照的值，阴阳性对照各做一组重复，N取其平均值；
S/N值≤0.559判定为阳性，S/N值≥0.804判定为阴性，0.559<S/N值<0.804判定为可疑，可疑样品进行复检，复检结果S/N值>0.804判定为阴性，S/N值≤0.804判定为阳性。
6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（1）中N蛋白的包被浓度为1μg/ml。
7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（4）中酶标单抗被抗体保护剂稀释的倍数为2000倍。
8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述步骤（6）中酶标仪读值时是在OD450nm。
CN202110376120.1A 2021-04-08 2021-04-08 一株抗猪δ冠状病毒N蛋白抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体和应用 Active CN112899239B (zh)

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