CN109970851B

CN109970851B - Ccv病毒m蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法

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Publication number: CN109970851B
Application number: CN201910257290.0A
Authority: CN
Inventors: 甘军纪; 田晓彦; 吕海峰; 刘秀梵
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2039-04-01
Also published as: CN109970851A

Abstract

本发明涉及一种CCV病毒M蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法，具体涉及CCV病毒M蛋白的单抗，包括CCV M蛋白特异单克隆抗体2H11、2G3。其制备方法；以分离纯化的CCV灭活病毒为免疫抗原，用单克隆抗体技术制备出CCV单抗；经western‑blot试验鉴定单抗针对M蛋白，再用重组酶ExnaseTM II技术对CCV病毒M蛋白的基因克隆进线性化的pCDNA3.1载体，转染293T细胞进行M蛋白表达，IFA试验验证，获得2株CCV病毒M蛋白特异单抗2H11、2G3。本发明还公开了犬冠状病毒胶体金检测试纸条的制备方法。本发明特异性强、敏感性高、操作简单、成本低，适用于临床及田间检测，用于CCV病原学诊断、流行病学调查和动物医院快速诊断。

Description

CCV病毒M蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法

技术领域

本发明涉及一种CCV病毒M蛋白的单抗及其制备方法、犬冠状病毒胶体金检测试纸条的制备方法，属于生物技术和动物疾病检疫检测领域。

背景技术

犬冠状病毒(CCV)属冠状病毒科冠状病毒属，该病毒形态特征，具有类似冠状的纤突，有囊膜，呈圆形或椭圆形，大小80-120nm。犬冠状病毒主要有4种结构蛋白分别为纤突蛋白(S，Spike Protein，180-220kD)是受体结合位点；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein，9–12kD)，此蛋白较小与包膜结合；跨膜蛋白M蛋白(M，Transmembrane Protein，29-32kD)负责营养物质的跨膜运输和新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成；核蛋白N蛋白(N，Nucleocapsid Protein，50–60kD)与病毒的RNA紧密结合成病毒的核心壳。

犬冠状病毒是一种由CCV引起的临床上以呕吐、腹泻、脱水及易复发为特性的高度接触性传染病，一年四季均可发生。该病对幼犬危害尤其严重，病死率较高。病犬和带毒犬是主要传染源，病毒通过直接接触和间接接触，经呼吸道和消化道传染给健康犬及其他易感动物。感染犬可通过粪便排毒2周或更长时间，传染性粪便污染的环境是传染的主要原因。

目前CCV无有效疫苗用于预防，也无特效疗法，因此早期诊断非常重要。CCV的常见临床症状，不易于与其他的肠道病原，如CPV-2，犬轮状病毒和犬腺病毒区分。因此CCV的诊断需要实验室确诊。用于粪便样品中CCV的检测的诊断技术包括电镜(EM)，细胞培养分离病毒(VI)和病毒基因检测(RT-PCR)。但这些方法需要特殊设备和熟练的专业技术人员，不便于兽医人员在临床或田间使用。

胶体金免疫层析技术因操作简单，检测灵敏，能稳定保存，成本较低等优点，近年来被临床和基层单位广泛使用。目前国内使用的CCV胶体金试纸条主要依赖进口(韩国)。本发明通过单克隆抗体技术制备了针对CCV病毒M蛋白的单克隆抗体，M蛋白是犬冠状病毒比较保守的蛋白，不同毒株间同源性非常高，用M蛋白作单抗诊断犬冠状病毒感染，可避免因纤突蛋白的变异而造成对犬冠状病毒感染诊断的假阴性，从而更准确地诊断犬冠状病毒感染。CCV M蛋白单抗与胶体金颗粒结合稳定性提高可以特异性的检测出临床及田间的CCV发病动物，能同时检测CCV 1型和2型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CCV病毒M蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法，建立特异性强、敏感性高、操作简单、成本低的适用于检测临床及田间的CCV胶体金免疫层析试纸条，用于CCV病原学诊断、流行病学调查和动物医院快速诊断。

本发明的技术方案包括：一种CCV病毒M蛋白的单克隆抗体，其特征是：包括针对CCV病毒M蛋白的一对杂交瘤细胞株，其中第一个杂交瘤细胞株命名为2H11的保藏编号为CGMCC NO.17287，第二个杂交瘤细胞株命名为2G3的保藏编号为CGMCC NO.17288，2个杂交瘤细胞株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址均为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；CCV病毒M蛋白的单克隆抗体，由所述的2个杂交瘤细胞株2H11和2G3分别产生。

CCV病毒M蛋白的单克隆抗体的制备方法，所述制备方法：以分离纯化的CCV灭活病毒为免疫抗原，用单克隆抗体技术制备出CCV单抗；经western-blot(蛋白免疫印迹)试验鉴定单抗针对M蛋白，再用重组酶ExnaseTM II技术对CCV病毒M蛋白的基因克隆进线性化的pCDNA3.1载体，转染293T细胞进行M蛋白表达，用单抗与表达的M蛋白做IFA鉴定进一步验证；获得2株CCV病毒M蛋白特异单抗2H11、2G3。

所述CCV单抗的制备方法具体为：

(1)CCV病毒的分离与纯化：取临床上发病的犬的新鲜粪便样品，经0.2μm针头滤器过滤后，接种到A-72细胞，进行盲传，出现典型细胞病变后，进行病毒纯化和鉴定；CCV病毒用A-72细胞进行大量培养，用超离法纯化病毒抗原；

(2)针对M蛋白单抗制备：用0.1％(v/v)甲醛灭活的纯化CCV病毒与弗氏佐剂混合乳化，分4次免疫8周龄的BALB/c小鼠；取效价高的小鼠脾脏细胞与瘤细胞SP2/0进行细胞融合；融合后先用感染CCV的细胞板做IFA大量筛选，筛选后的阳性单抗隆抗体细胞上清进行western-blot和转染表达人工重组的M蛋白细胞IFA检测，鉴定、获得针对CCV M蛋白的单克隆抗体。

所述经western-blot(蛋白免疫印迹)试验鉴定单抗针对M蛋白，再用重组酶ExnaseTM II技术对CCV病毒M蛋白的基因克隆进线性化的pCDNA3.1载体，转染293T细胞进行M蛋白表达，具体为：

(1)利用下述引物，以提取犬冠状病毒感染细胞上清的RNA为模板进行M基因的扩增，PCR引物

上游引物：AGCTTGGTACCGAatgaagattttgtta

下游引物：ATATCTGCAGAATTttataccatatgtaat

(2)利用下述引物，以PCDNA3.1+质粒做模板进行线性化载体的扩增；

上游引物：GAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTG

下游引物：GCTCGGTACCAAGCTTAAGTTTAAACG

(3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆经转染293T表达细胞进行M基因的表达。

一种免疫胶体金试纸条的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)胶体金抗体标记：在胶体金上标记权利要求1所述的单克隆抗体2H11；

(2)喷金：将步骤(1)标记好的胶体金喷到玻璃纤维上，制成金标垫；

(3)制作硝酸纤维素膜：将兔抗鼠IgG和权利要求1所述的单克隆抗体2G3共同喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线：

(4)将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸自下至上组装在PVC板上，然后切割制成试纸条；所述样品垫为空白的玻璃纤维素膜)。

所述胶体金抗体标记：用柠檬三钠还原法制备粒径约为20nm的胶体金，用0.2mol/L K₂CO₃调到pH的浓度8.0，在磁力搅拌下逐滴加入纯化单抗100μg/ml 2H11，室温搅拌30min，加入10％(w/v)BSA溶液，使其终浓度为1％，室温继续搅拌均匀，然后依次缓慢滴入终浓度0.2％(w/v)PEG-20000，继续搅拌30min后，置于4℃静置2h；100rpm 4℃离心15min弃去底部未结合的杂质成分，取上清10000rpm 4℃离心30min，弃去上清；沉淀用原体积1/20含5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA、0.2％(w/v)PEG20000以及0.02％(w/v)叠氮钠的0.01mol/LpH9.2硼酸盐缓冲液悬浮；置于4℃保存备用。

所述兔抗鼠IgG的制备方法是：将小鼠IgG与弗氏完全佐剂混合乳化，背部皮下、皮内多点注射免疫健康家兔，经3次免疫后，检测血清效价，当琼脂凝胶沉淀试验AGP效价≥1:16时，采血，分离血清，加入饱和硫酸铵沉淀，透析后获得兔抗鼠IgG。

通过本发明，CCV病毒的分离与纯化，针对M蛋白的单抗的制备，兔抗鼠血清的制备、胶体金免疫层析试纸条制备及其对直肠棉试、病料悬液、细胞培养等材料样本中的病毒抗原样本灵敏度和特异性测定。

CCV M蛋白的单克隆抗体的制备方法：

1.CCV病毒的分离与纯化：取临床上发病的犬的新鲜粪便样品，经0.2μm针头滤器过滤后，接种到A-72细胞，进行盲传，出现典型细胞病变后，进行病毒纯化和鉴定。CCV病毒用A-72细胞进行大量培养，用超离法纯化病毒抗原。

2.针对M蛋白单抗制备：用0.1％(v/v)甲醛灭活的纯化CCV病毒与弗氏佐剂混合，分4次免疫8周龄的BALB/c小鼠。取效价高的小鼠脾脏细胞与瘤细胞SP2/0进行细胞融合。融合后先用感染CCV的细胞板做IFA大量筛选，筛选后的阳性单抗隆抗体(细胞上清)进行western-blot和转染表达人工重组的M蛋白细胞IFA检测，鉴定、获得针对CCV M蛋白的单克隆抗体。

单抗的特异性鉴定：分别用犬冠状病毒(CCVJS1706，JS1712)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，犬瘟热病毒(CDV)，犬腺病毒(CAV-2)，犬细小病毒(CPV-2a)感染A-72、Vero、MDCK、FK81细胞，冷甲醇固定，间接免疫荧光法(IFA)检测细胞特异荧光反应。

兔抗鼠血清的制备：将小鼠IgG:与弗氏完全佐剂混合乳化，背部皮下、皮内多点注射免疫健康家兔，经3次免疫后，检测血清效价，当琼脂凝胶沉淀试验(AGP)效价≥1:16时，采血，分离血清，加入饱和硫酸铵沉淀，透析后获得兔抗鼠IgG。

试纸条制备方法：

(1)在胶体金上标记针对M-蛋白的抗犬冠状病毒抗原特异性单克隆抗体2H11；

(2)将胶体金标记的抗体喷金到玻璃纤维上，制成胶体金垫；

(3)将兔抗鼠IgG和抗犬冠状病毒的单克隆抗体2G3分别喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；

(4)组装样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸在PVC底板上，然后切割条制成试纸条。

本发明的试纸条能用于检测直肠粪样悬液、细胞培养等材料样本中的CCV病毒抗原。该方法简单、快速，可以用肉眼直接观察，3-10分钟即出结果，本产品特异性强，敏感性高，适用于基层兽医部门，动物医院进行疾病诊断，也可用于冠状病毒病的流行病学调查，实验室犬病毒快速筛选检测等，应用前景广阔。

附图说明

图1.CCV感染A-72细胞与单克隆抗体的IFA图。CCV单抗隆抗体2H11，2G3均与表达CCV感染的A-72细胞反应。

图2.重组CCV M蛋白表达细胞与单抗隆抗体的IFA鉴定。CCV单抗隆抗体2H11，2G3均与表达CCV M蛋白的293T细胞反应。

图3.单抗隆抗体与CCV M蛋白的western-blot反应性。CCV单抗隆抗体2H11，2G3均特异识别CCV M蛋白(30kD左右)。

图4.胶体金电镜图。胶体金颗粒大小20nm左右。

图5.试纸条与韩国进口试纸条比较检测。符合率100％。

具体实施方式

生物材料来源：

犬冠状病毒(JS1706，JS1712株)，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、鉴定。

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，犬瘟热病毒(CDV)，犬腺病毒(CAV-2)，犬细小病毒(CPV-2a)毒种，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存、提供。

PCDNA3.1(+)、大肠杆菌DH5α，由扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室保存、提供。胶体金试纸条制备材料购自上海金标生物科技有限公司。

具体操作步骤如下：

1.CCV病毒的分离与纯化

(1)CCV病毒的分离

取CCV新鲜的病料，用细胞生长液1:1稀释，经0.2μm针头滤器过滤后，接种到A-72细胞，37℃吸附1h后，换1％(v/v)FBS的DMEM维持液培养3-5d，进行盲传3代，出现典型细胞病变后，进行病毒纯化和鉴定。CCV病毒用A-72细胞进行大量培养，用超离法纯化病毒抗原。

(2)CCV病毒的纯化

取CCV病毒的细胞培养物，10000rpm离心20min，取上清液加入10％(w/v)PEG6000，搅拌溶解后，4℃放置过夜，然后溶液经过10000rpm，4℃离心30min。弃掉上清，沉淀物加入NTE缓冲液重新悬浮至原体积1/10，再加入到含30％(w/v)蔗糖-TNE缓冲液上，140000g离心1.5h，沉淀物加TNE缓冲液到原体积的1/50。测定纯化病毒的蛋白浓度，分装，-20℃保存备用。

2.抗CCV单克隆抗体的制备

纯化的CCV抗原(1.6mg/ml)，0.1％(v/v)甲醛灭活24h，作为免疫抗原。第1次免疫，抗原+弗氏完全佐剂1:1混合乳化，皮下多点接种免疫8周龄BALB/c小鼠，0.2ml/只。间隔2周分别进行相同抗原第2、3次接种，使用弗氏不完全佐剂。第4次免疫，不使用佐剂，皮下注射抗原0.1ml，3-4d取脾细胞与SP2/0进行细胞融合，融合剂PEG1500(Roche,USA)。融合后8-10d，用CCV感染细胞进行IFA试验筛选阳性杂交瘤。阳性杂交瘤经有限稀释法进行3次克隆化，建立稳定分泌高特异抗犬冠状病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选的阳性杂交瘤细胞上清经western-blot鉴定病毒蛋白特异性，进一步与表达重组犬冠状病毒M蛋白(步骤1)的细胞用IFA方法鉴定，得到针对于CCV病毒M蛋白的2株杂交瘤细胞株2H11，2G3。杂交瘤细胞腹腔接种BALB/c小鼠制备单克隆抗体腹水，饱和硫酸铵沉淀，用HiTrap Protein G柱(GE)进行纯化。以纯化的、高特异性单克隆抗体为基础，保证了试纸条的敏感性与特异性。

3.单抗的特异性鉴定：分别用犬冠状病毒(CCVJS1706，JS1712)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，犬瘟热病毒(CDV)，犬腺病毒(CAV-2)，犬细小病毒(CPV-2a)感染A-72、Vero、MDCK、FK81细胞，冷甲醇固定，间接免疫荧光法(IFA)检测细胞特异荧光反应，CCV单抗2H11，2G3仅与冠状病毒反应。

4.真核表达M蛋白的载体构建、细胞表达

(1)引物的设计

设计扩增含犬冠状病毒M蛋白序列的pcdna3.1+线性化表达载体和M蛋白基因片段引物：扩增pcdna3.1+new线性化载体上游引物位于pcdna3.1+质粒952-977位，扩增pcdna3.1+new线性化载体下游引物位于pcdna3.1+质粒900-926位。扩增M基因序列的上游引物包括基因起始密码ATG及其后15个碱基，且在5’端带有16个与pcdna3.1+线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增M基因序列的下游引物包括M全部基因，1383-1399位16个碱基，且在5’端带有15个与pcdna3.1+线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列见附表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

(2)M基因和线性化真核表达载体的扩增

由表1所述引物为引物进行PCR扩增。反应体系为：18μl水，25μl 2倍缓冲液，1μl10mM dNTP，2μl 10μM上游引物，2μl 10μM下游引物,1μl商品化的Phanta Super-FidelityDNA聚合酶。模板分别用1μl10ng/μl的pcdna3.1+用来制备线性化PCDNA3.1+载体，M基因目的片段的扩增用细胞上清提取的基因。PCR扩增反应循环参数为：94℃预变性3分钟,随后进行30个循环(94℃变性30秒,55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟),最后72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。

(3)M基因的重组质粒构建及表达

将以上纯化的线性化载体pcdna3.1以及CCV病毒M基因片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。具体重组反应体系如下：纯化的CCV病毒M基因片段片段产物50-100ng，纯化的pcdna3.1线性化表达载体50ng，2μl商品化的ExnaseTM II酶，4μl 5倍的缓冲液，其它补加水至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。

将阳性克隆质粒转染到293T细胞中，换5％(v/v)FBS的DMEM细胞培养基，37℃，5％(v/v)CO₂培养细胞48h后，将细胞用甲醇4℃固定过夜，用CCV单抗2H11、2G3检测，产生特异免疫荧光反应。

5.Western blot对单抗的分析及鉴定

用纯化的犬细小病毒蛋白裂解过后进行SDS-PAGE，然后电转印到硝酸纤维膜(NC)上，5％(w/v)脱脂乳封闭过后，用一抗单克隆抗体(杂交瘤培养上清)，二抗HRP-羊抗鼠稀释液依次进行孵育，最后将NC膜用吸水纸吸干，把增强型ECLPlus化学发光试剂(Solarbio)均匀涂抹在NC膜上，避光曝光，成像***(Tanon 5200)扫描，M蛋白大小29-32kD。

6.兔抗鼠IgG的制备

将小鼠IgG(4.85mg/ml)与弗氏完全佐剂1:1(v/v)混合乳化，背部皮下、皮内多点注射免疫健康家兔(2kg左右)，2ml/只。间隔3周分别进行第2、3次接种，第2次接种用弗氏不完全佐剂，接种方式同第1次。第3次接种，耳静脉注射2ml/只，接种后3周，采血制备血清，当琼脂凝胶沉淀试验(AGP)效价≥1:16时，采血，分离血清，加入饱和硫酸铵沉淀，透析后获得兔抗鼠IgG，测定蛋白浓度，分装，-20℃冻存备用。

7.胶体金试纸条的制备

(1)胶体金制备及标记用柠檬三钠还原法制备粒径约为20nm的胶体金，用0.2mol/L K₂CO₃调到pH的浓度8.0，在磁力搅拌下逐滴加入纯化单抗2H11(100μg/ml)，室温搅拌30min，加入10％(w/v)BSA溶液，使其终浓度为1％(w/v)，室温继续搅拌均匀，然后依次缓慢滴入终浓度0.2％(w/v)PEG-20000，继续搅拌30min后，置于4℃静置2h。100rpm 4℃离心15min弃去底部未结合的杂质成分，取上清10000rpm 4℃离心30min，弃去上清。沉淀用原体积1/20含5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA、0.2％(w/v)PEG20000以及0.02％(w/v)叠氮钠的0.01mol/L pH9.2硼酸盐缓冲液悬浮。置于4℃保存备用。

(2)胶体金标垫的制备用Biodot XYZ3060三维喷点***将胶体金标记抗体2ul/cm的喷量喷在玻璃纤维棉上(公司)制成金标垫。自然干燥，抽真空备用。

(3)NC膜的制备用Biodot XYZ3060三维喷点***以1ul/cm的喷量，分别把单克隆抗体2G3(1mg/ml)和兔抗鼠IgG(1mg/ml)两种抗体条状喷在NC(硝酸纤维素膜)膜上，分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，两者线之间隔5mm。

(4)试纸条的组装：按照从下到上的顺序依次放置：底盖PVC板→NC膜→金标垫(重叠NC膜T线左端0.25cm处压平放置)→聚酯膜(重叠金标垫左端0.2cm处压平放置)→吸水纸(NC膜C线右端0.2cm处压平)。调整组装好的试纸条长度，用BIO-DOT机切割试纸条宽约3到5mm，最后对应安装与底盖嵌合的面盖(面盖上观察窗对应的T线、C线、加样孔位置分别于试纸条组装顺序一致)

8.试纸条检测

(1)试纸条结果的判定

取待检样品200ul直接加到样品孔里，等待3到10min后，肉眼可见NC膜上出现红色条带，若C、T线同时出现，说明样品中含有待检抗原，判定为阳性；若C线出现而T线未出现，说明样品中不含待检抗原，判定为阴性；若C、T线均未出现或T线出现C线未出现，检测无效。

(2)特异性的检测

分别用试纸条检测犬冠状病毒(CCVJS1706，JS1712)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，犬瘟热病毒(CDV)，犬腺病毒(CAV-2)，犬细小病毒(CPV-2a)，同时用PBS缓冲液做阴性对照。结果表明试纸条只与CCV抗原有反应，证明试纸条就有良好的特异性。

分别用试纸条检测犬冠状病毒2型(CCVJS1706，JS1712)细胞培养物，犬冠状病毒1型(YZ1601)临床样品，能同时检出CCV 1和CCV2。

(3)灵敏性的检测

把培养的CCV病毒进行1:10稀释，用本发明试纸条(见图5下方检测条)进行检测，同时用韩国进口试纸条(见图5上方检测条)检测，样本检测的敏感性相同，符合率100％，见表2。

CCV(JS1706)M基因核苷酸序列

ATGAAGATTT TGTTAATGCT TGCGTGCGTC TTTGCATGCG TTTATGGAGA GCGATATTGT60

GCTATGCAAG CTGATAGCGG CATTACACAA TGTCGTAATG GCACTAATTC TGAGTGTGAA120

TCTTGCTTCA ATGGTGGCGA TCTTATTTGG CATCTCGCTA ACTGGAACTT CAGCTGGTCT180

ATAATATTGA TTGTATTTAT AACTGTGTTA CAATATGGTA GACCTCAATT TAGCTGGTTC240

GTGTATGGCA TTAAAATGCT TATTATGTGG CTACTATGGC CCATTGTGTT AGCTCTTACG300

ATATTTAATG CATACTCGGA ATACGAAGTT TCCAGATATG TAATGTTCGG CTTTAGTGTT360

GCATGTGCAA TTGTTACTTT CATACTTTGG ATTATGTATT TTGTTAGATC CATTCAGTTA420

TACAGAAGGA CTAAGTCTTG GTGGTCTTTC AACCCTGAAA CTAACGCAAT TCTTTGCGTT480

AGTGCTTTAG GAAGAAGCTA CGTGCTTCCT CTTGAAGGTG TACCAACTGG TGTCACTTTA540

ACATTGCTTT CAGGGAATTT GTATGCTGAA GGATTCAAAA TTGCTGGTGG TATGAACATC600

GACAATTTAC CAAAATACGT AATGGTTGCA TTACCTAGCA GGACCATCGT CTACACACTT660

GTTGGCAAGA AATTGAAAGC AAGTAGCGCA ACTGGATGGG CTTACTATGT AAAATCTAAA720

GCCGGTGATT ACTCAACAGA CGCAAGAACT GACAATTTGA GTGAGCAAGA AAAATTATTA780

CATATGGTAT AA792

CCV(JS1706)M基因氨基酸序列

CCV(JS1712)M基因核苷酸序列

ATGAAGATTT TGTTAATGCT TGCGTGCGTC TTTGCATGCG TTTATGGAGA GCGATATTGT60

GCTATGCAAG CTGATAGCGG CATTACACAA TGTCGTAATG GCACTAATTC TGAGTGTGAA120

TCTTGCTTCA ATGGTGGCGA TCTTATTTGG CATCTCGCTA ACTGGAACTT CAGCTGGTCT180

ATAATATTGA TTGTATTTAT AACTGTGTTA CAATATGGTA GACCTCAATT TAGCTGGTTC240

GTGTATGGCA TTAAAATGCT TATTATGTGG CTACTATGGC CCATTGTGTT AGCTCTTACG300

ATATTTAATG CATACTCGGA ATACGAAGTT TCCAGATATG TAATGGTCGG CTTTAGTGTT360

GCATGTGCAA TTGTTACTTT CATACTTTGG ATTATGTATT TTGTTAGATC CATTCAGTTA420

TACAGAAGGA CTAAGTCTTG GTGGTCTTTC AACCCTGAAA CTAACGCAAT TCTTTGCGTT480

AGTGCTTTAG GAAGAAGCTA CGTGCTTCCT CTTGAAGGTG TACCAACTGG TGTCACTTTA540

ACATTGCTTT CAGGGAATTT GTATGCTGAA GGATTCAAAA TTGCTGGTGG TATGAACATC600

GACAATTTAC CAAAATACGT AATGGTTGCA TTACCTAGCA GGACCATCGT CTACACACTT660

GTTGGCAAGA AATTGAAAGC AAGTAGCGTA ACTGGATGGG CTTACTATGT AAAATCTAAA720

GCCGGTGATT ACTCAACAGA CGCAAGAACT GACAATTTGA GTGAGCAAGA AAAATTATTA780

CATATGGTAT AA792

CCV(JS1712)M基因氨基酸序列

表1 CCoV-M真核表达载体构建引物序列

表2胶体金试纸条特异性

表2中：+：阳性反应；-：阴性反应。

序列表

<110> 扬州大学

<120> CCV病毒M蛋白的单抗及其制备方法、免疫胶体金试纸条的制备方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagattt tgttaatgct tgcgtgcgtc tttgcatgcg tttatggaga gcgatattgt 60

gctatgcaag ctgatagcgg cattacacaa tgtcgtaatg gcactaattc tgagtgtgaa 120

tcttgcttca atggtggcga tcttatttgg catctcgcta actggaactt cagctggtct 180

ataatattga ttgtatttat aactgtgtta caatatggta gacctcaatt tagctggttc 240

gtgtatggca ttaaaatgct tattatgtgg ctactatggc ccattgtgtt agctcttacg 300

atatttaatg catactcgga atacgaagtt tccagatatg taatgttcgg ctttagtgtt 360

gcatgtgcaa ttgttacttt catactttgg attatgtatt ttgttagatc cattcagtta 420

tacagaagga ctaagtcttg gtggtctttc aaccctgaaa ctaacgcaat tctttgcgtt 480

agtgctttag gaagaagcta cgtgcttcct cttgaaggtg taccaactgg tgtcacttta 540

acattgcttt cagggaattt gtatgctgaa ggattcaaaa ttgctggtgg tatgaacatc 600

gacaatttac caaaatacgt aatggttgca ttacctagca ggaccatcgt ctacacactt 660

gttggcaaga aattgaaagc aagtagcgca actggatggg cttactatgt aaaatctaaa 720

gccggtgatt actcaacaga cgcaagaact gacaatttga gtgagcaaga aaaattatta 780

catatggtat aa 792

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Ile Leu Leu Met Leu Ala Cys Val Phe Ala Cys Val Tyr Gly

1 5 10 15

Glu Arg Tyr Cys Ala Met Gln Ala Asp Ser Gly Ile Thr Gln Cys Arg

20 25 30

Asn Gly Thr Asn Ser Glu Cys Glu Ser Cys Phe Asn Gly Gly Asp Leu

35 40 45

Ile Trp His Leu Ala Asn Trp Asn Phe Ser Trp Ser Ile Ile Leu Ile

50 55 60

Val Phe Ile Thr Val Leu Gln Tyr Gly Arg Pro Gln Phe Ser Trp Phe

65 70 75 80

Val Tyr Gly Ile Lys Met Leu Ile Met Trp Leu Leu Trp Pro Ile Val

85 90 95

Leu Ala Leu Thr Ile Phe Asn Ala Tyr Ser Glu Tyr Glu Val Ser Arg

100 105 110

Tyr Val Met Phe Gly Phe Ser Val Ala Cys Ala Ile Val Thr Phe Ile

115 120 125

Leu Trp Ile Met Tyr Phe Val Arg Ser Ile Gln Leu Tyr Arg Arg Thr

130 135 140

Lys Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ala Ile Leu Cys Val

145 150 155 160

Ser Ala Leu Gly Arg Ser Tyr Val Leu Pro Leu Glu Gly Val Pro Thr

165 170 175

Gly Val Thr Leu Thr Leu Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Ala Glu Gly Phe

180 185 190

Lys Ile Ala Gly Gly Met Asn Ile Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Val Met

195 200 205

Val Ala Leu Pro Ser Arg Thr Ile Val Tyr Thr Leu Val Gly Lys Lys

210 215 220

Leu Lys Ala Ser Ser Ala Thr Gly Trp Ala Tyr Tyr Val Lys Ser Lys

225 230 235 240

Ala Gly Asp Tyr Ser Thr Asp Ala Arg Thr Asp Asn Leu Ser Glu Gln

245 250 255

Glu Lys Leu Leu His Met Val Ser Glu Gln Ile Asp Asn

260 265

<210> 3

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaagattt tgttaatgct tgcgtgcgtc tttgcatgcg tttatggaga gcgatattgt 60

gctatgcaag ctgatagcgg cattacacaa tgtcgtaatg gcactaattc tgagtgtgaa 120

tcttgcttca atggtggcga tcttatttgg catctcgcta actggaactt cagctggtct 180

ataatattga ttgtatttat aactgtgtta caatatggta gacctcaatt tagctggttc 240

gtgtatggca ttaaaatgct tattatgtgg ctactatggc ccattgtgtt agctcttacg 300

atatttaatg catactcgga atacgaagtt tccagatatg taatggtcgg ctttagtgtt 360

gcatgtgcaa ttgttacttt catactttgg attatgtatt ttgttagatc cattcagtta 420

tacagaagga ctaagtcttg gtggtctttc aaccctgaaa ctaacgcaat tctttgcgtt 480

agtgctttag gaagaagcta cgtgcttcct cttgaaggtg taccaactgg tgtcacttta 540

acattgcttt cagggaattt gtatgctgaa ggattcaaaa ttgctggtgg tatgaacatc 600

gacaatttac caaaatacgt aatggttgca ttacctagca ggaccatcgt ctacacactt 660

gttggcaaga aattgaaagc aagtagcgta actggatggg cttactatgt aaaatctaaa 720

gccggtgatt actcaacaga cgcaagaact gacaatttga gtgagcaaga aaaattatta 780

catatggtat aa 792

<210> 4

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Ile Leu Leu Met Leu Ala Cys Val Phe Ala Cys Val Tyr Gly

1 5 10 15

Glu Arg Tyr Cys Ala Met Gln Ala Asp Ser Gly Ile Thr Gln Cys Arg

20 25 30

Asn Gly Thr Asn Ser Glu Cys Glu Ser Cys Phe Asn Gly Gly Asp Leu

35 40 45

Ile Trp His Leu Ala Asn Trp Asn Phe Ser Trp Ser Ile Ile Leu Ile

50 55 60

Val Phe Ile Thr Val Leu Gln Tyr Gly Arg Pro Gln Phe Ser Trp Phe

65 70 75 80

Val Tyr Gly Ile Lys Met Leu Ile Met Trp Leu Leu Trp Pro Ile Val

85 90 95

Leu Ala Leu Thr Ile Phe Asn Ala Tyr Ser Glu Tyr Glu Val Ser Arg

100 105 110

Tyr Val Met Val Gly Phe Ser Val Ala Cys Ala Ile Val Thr Phe Ile

115 120 125

Leu Trp Ile Met Tyr Phe Val Arg Ser Ile Gln Leu Tyr Arg Arg Thr

130 135 140

Lys Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ala Ile Leu Cys Val

145 150 155 160

Ser Ala Leu Gly Arg Ser Tyr Val Leu Pro Leu Glu Gly Val Pro Thr

165 170 175

Gly Val Thr Leu Thr Leu Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Ala Glu Gly Phe

180 185 190

Lys Ile Ala Gly Gly Met Asn Ile Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Val Met

195 200 205

Val Ala Leu Pro Ser Arg Thr Ile Val Tyr Thr Leu Val Gly Lys Lys

210 215 220

Leu Lys Ala Ser Ser Val Thr Gly Trp Ala Tyr Tyr Val Lys Ser Lys

225 230 235 240

Ala Gly Asp Tyr Ser Thr Asp Ala Arg Thr Asp Asn Leu Ser Glu Gln

245 250 255

Glu Lys Leu Leu His Met Val Ser Glu Gln Ile Asp Asn

260 265

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcttggtac cgaatgaaga ttttgtta 28

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atatctgcag aattttatac catatgtaat 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gttccagggg cccatgttag aagacagtag c 31

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgtttaaact taagcttggt accgagc 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cactgtgctg gatatctgca gaattc 26

Claims

1.一种CCV病毒M蛋白的单克隆抗体，其特征是：包括针对CCV病毒M蛋白的一对杂交瘤细胞株，其中第一个杂交瘤细胞株命名为2H11的保藏编号为CGMCC NO.17287，第二个杂交瘤细胞株命名为2G3的保藏编号为CGMCC NO.17288，2个杂交瘤细胞株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址均为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101；CCV病毒M蛋白的单克隆抗体，由所述的2个杂交瘤细胞株2H11和2G3分别产生。

2.一种免疫胶体金试纸条的制备方法，所述免疫胶体金试纸条中含有如权利要求1所述的CCV病毒M蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括由命名为2H11的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体2H11以及由命名为2G3的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体2G3；

其特征在于，所述免疫胶体金试纸条的制备方法如下：

（1）胶体金抗体标记：在胶体金上标记所述的单克隆抗体2H11；具体方法为：用柠檬三钠还原法制备粒径为20nm的胶体金，用0.2mol/L K2CO3调到pH的浓度8.0，在磁力搅拌下逐滴加入纯化单抗100μg/ml 2H11，室温搅拌30min，加入10%(w/v) BSA溶液，使其终浓度为1%，室温继续搅拌均匀，然后依次缓慢滴入终浓度0.2% (w/v)PEG-20000，继续搅拌30min后，置于4℃静置2h；100rpm 4℃离心15min弃去底部未结合的杂质成分，取上清10000rpm 4℃离心30min，弃去上清；沉淀用原体积1/20含5%(w/v)蔗糖、1%(w/v) BSA、0.2%(w/v)PEG20000以及0.02%(w/v)叠氮钠的0.01mol/L pH9.2硼酸盐缓冲液悬浮；置于4℃保存备用；

（2）喷金：将步骤（1）标记好的胶体金喷到玻璃纤维上，制成金标垫；

（3）制作硝酸纤维素膜：将兔抗鼠IgG和所述的单克隆抗体2G3共同喷到硝酸纤维素膜上，制成对照线和检测线；

（4）将样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水纸自下至上组装在PVC板上，然后切割制成试纸条；所述样品垫为空白的玻璃纤维素膜。

3.根据权利要求2所述一种免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述兔抗鼠IgG的制备方法是：将小鼠IgG与弗氏完全佐剂混合乳化，背部皮下、皮内多点注射免疫健康家兔，经3次免疫后，检测血清效价，当琼脂凝胶沉淀试验AGP效价≥1:16时，采血，分离血清，加入饱和硫酸铵沉淀，透析后获得兔抗鼠IgG。