CN116200400A - 一种增强番茄对根结线虫抗性的方法 - Google Patents

一种增强番茄对根结线虫抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强番茄对根结线虫抗性的方法，涉及生物技术领域。本发明通过敲除番茄中MED25基因或ERF1基因，与野生型植株相比，根结数目显著性减少，且防御基因PDF1.2a/b的表达受到了限制，说明了ERF1或MED25正向调节番茄对南方根结线虫的抗性。

Description

一种增强番茄对根结线虫抗性的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增强番茄对根结线虫抗性的方法。
背景技术
茉莉酸(JA)是一种主要的防御植物激素，在调节植物对机械伤害、昆虫攻击和病原体感染的防御反应中发挥关键作用。在机械伤害或昆虫/病原体攻击时，JA生物合成迅速启动。生物活性的茉莉酰基-L-异亮氨酸(JA Ile)被COI1-茉莉酸ZIM结构域(JAZ)复合物感知，导致JAZ阻遏蛋白通过26S蛋白酶体降解，并释放下游转录因子以启动各种JA响应基因。JA信号通路由两个分支组成；基本螺旋-环-螺旋(bHLH)蛋白(MYC)分支与昆虫食草动物的伤害和防御有关，以及乙烯反应因子(ERF)分支与增强对坏死性病原体的抵抗力有关。作为JA信号通路中的核心转录因子，MYC2要么与转录抑制因子JAZ相互作用以发挥其转录抑制功能，要么与转录激活介体25(MED25)相互作用以实现其转录激活功能。除了MYC2，ERF也是JA信号通路中的关键因素，并参与植物胁迫反应中各种生物过程的转录调节。JA和乙烯通常在病原体感染期间同时产生，并协同调节抗性防御信号通路。
先前的研究发现，ERFs可以特异性结合GCC-box和DRE/CRT顺式作用元件，以调节下游基因表达，例如乙烯(ET)诱导PR基因和非生物胁迫诱导基因的表达。近年发现ERFs还可以与Coupling Element 1(CE1：TGCCACCG))、缺氧反应启动子元件(HRPE)和ATCTA结合。然而，关于ERF1和根结线虫之间的报道很少，其调节机制尚不清楚。目前虽然已经在多种植物中发现了ERF，但许多番茄的ERF尚未见报道，尤其是在根结线虫抗性中，以及这些功能在番茄中的潜在机制仍然知之甚少。
根结线虫(RKNs，Meloidogyne spp.)是一种植物寄生线虫，如花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇线虫(M.javanica)、南方根结线虫(M.incognita)和北方根结线虫(M.hapla)，寄主范围广，对作物造成巨大的经济损失。为了应对线虫入侵，植物进化出各种防御策略以诱导免疫反应。值得注意的是，最近的研究发现，JA依赖性信号通路在针对线虫和坏死性病原体的病原体相关分子模式(PAMP)触发免疫(PTI)和效应物触发免疫(ETI)中发挥关键作用。在番茄中，先前的研究报道了JA依赖性信号传导不参与Mi-1介导的防御，而完整的JA信号传导途径是番茄对RKNs敏感性所必需的。在水稻(Oryza sativa)中，外源乙烯利(ET)和甲基茉莉酸(MeJA)在禾本科感染初期上调了OsPR1a和OsPR1b基因的表达，从而积极调节了水稻对线虫寄生的***防御。此外，JA响应基因，如植物防御素1.2(PDF1.2)和蛋白酶抑制剂(PI)参与JA诱导的RKN抗性。尽管JA信号通路在植物RKN抗性中占据关键地位，但其调控机制在很大程度上是未知的。
发明内容
申请人在番茄中找到了与拟南芥同源性较高的几个基因，进行筛选确定了具有DELLA结构的，与MED25互作参与病原体防御的基因ERF1可以被RKN诱导；并且其突变体可增强番茄对根结线虫的抗性，这揭示了一个番茄中ET参与南方根结线虫抗性的新机制，为加快对根结线虫抗性机制的研究以及抗性基因的发掘提供了重要依据，具有十分重要的科学和现实意义。研究发现乙烯在植物对坏死性病原体和食草昆虫的反应中起关键作用。本发明研究在番茄中发现了拟南芥同源基因ERF1(Solyc09g089930)，通过酵母互作筛选确定了其可与MED25互作参与病原体防御，并且可以被RKN迅速诱导表达。据此，本发明提供了一种番茄MED25或ERF1调控根结线虫的敏感性的应用。
具体技术方案如下：
本发明提供了番茄基因在增强番茄对根结线虫抗性中的应用，所述番茄基因为MED25基因或ERF1基因。
具体表现为根结数目减少以及根结线虫抗性增强。ERF1基因在植物中的表达量越低，在根结线虫侵染时所述植物根结数目越少，对根结线虫抗性增强。
所述MED25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ERF1基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明还提供了番茄基因编码的蛋白在增强番茄对根结线虫抗性中的应用，所述番茄基因为MED25基因编码的蛋白或ERF1基因编码的蛋白。
所述番茄MED25基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，ERF1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种增强番茄对根结线虫抗性的方法，将番茄中的MED25基因或ERF1基因沉默或者敲除。所述MED25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ERF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的增强番茄对根结线虫抗性的方法，包括以下步骤：
(1)构建用于敲除或者沉默MED25基因或ERF1基因的载体；
(2)将步骤(1)构建的用于敲除或者沉默MED25基因或ERF1基因载体导入水稻的细胞中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的MED25基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ERF1基因沉默或者敲除，培养后获得转基因植株。
具体的，步骤(1)中，载体为pCAMBIA1301。
具体的，步骤(2)中，将用于MED25基因或ERF1基因沉默或者敲除的载体转入农杆菌基因工程菌后，侵染水稻的细胞。所述农杆菌基因工程菌为农杆菌EHA105菌株。
本发明的有益效果：
本发明通过敲除番茄中MED25基因或ERF1基因，与野生型植株相比，根结数目显著性减少，且防御基因PDF1.2a/b的表达受到了限制，说明了ERF1或MED25正向调节番茄对南方根结线虫的抗性。
附图说明
图1为拟南芥中AtERF1、AtORA59和番茄中ERF1的氨基酸序列比对图。
图2为野生型番茄Ailsa Craig在接种根结线虫0h，24h，48h，72h不同时间点时ERF1的表达量分析图。
图3为ERF1与MED25互作结果图；3A为酵母结果图，3B为双分子荧光互补结果图。
图4为使用CRISPR/Cas9产生erf1(A)突变体和med25(B)突变体的测序结果图。
图5为野生型，erf1突变体和med25突变体中PDF1.2a/b的基因表达图。
图6为番茄植株接种根结线虫5周后的根结线虫表型观察图；A为植株根部代表性的酸性品红染色结果，标尺＝1cm；B为对A的根结数量统计结果。
具体实施方式
实施例1
总RNA提取和基因表达分析。
1.番茄总RNA提取
番茄(Ailsa Craig)可通过ucdavis种子库购买(网站链接：https://tgrc.ucdavis.edu/)联系获取)；采用Tiangen Plant total RNA extraction kit提取番茄根的总RNA：
(1)取0.1g根样在液氮中磨碎，加1mL裂解液RZ，涡旋混匀；
(2)4℃，12000rpm离心5min，去上清；
(3)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；
(4)4℃，12000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
(5)加入0.5倍体积的无水乙醇，混合均匀，转入吸附柱CR3，4℃，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；
(6)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；
(7)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；
(8)重复操作步骤(8)；
(9)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余废液；
(10)吸附柱于超净台吹干5min后，转入新的无RNase离心管中，加入50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min；
(11)用紫外分光光度计测定OD260/OD280检验RNA样品含量与纯度。
2.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
采用
Figure BDA0004041523110000051
480 II Real-Time PCR detection system(Roche，Swiss)，并使用SYBR Green PCR Master Mix(Takara，RR420A)，PCR反应条件为：95℃3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，40个循环。在每个循环的延伸末期采集荧光数据。使用番茄Actin和Ubiquitin3基因作为内参，根据cDNA的序列设计基因特异性引物，各引物序列如下表所示。基因相对表达量采用Livak和Schmittgen(2001)的方法计算。
MYC2和ERF是两个核心开关，在JA介导的对不同生物胁迫的抗性中发挥拮抗作用。MED25是介体转录共激活复合物的一个亚基，与MYC2和ERF物理相互作用，从而形成一个功能性转录复合物，以调节JA响应基因表达。在之前的一项研究中，申请人发现MYC2对番茄RKN防御产生负面影响。因此，我们假设JA可能通过ERF途径调节RKN抗性。通过序列比对，我们发现番茄ERF1(Solyc09g089930)与拟南芥ORA59是同源蛋白(图1)，并且发现根结线虫的侵染诱导了ERF1的表达(图2)，说明ERF1可能参与了根结线虫的调控。
表1 实时荧光定量PCR引物
基因名称 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’)
Actin TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT
Ubiquitin3 GCCGACTACAACATCCAGAAGG TGCAACACAGCGAGCTTAACC
PDF1.2a ATTTGCAAAGCACCAAGCCAAAC CATCATAATCTCTTCTTCAAGCA
PDF1.2b ACTTATGGTCTTGGCAATGGTGCT AGTTTGCTACAATGTCCACCTGTA
ERF1 GTGCGTCAAGGAGATCAACA ACAGCACTCTGGCTTCTTCT
实施例2
1、酵母双杂交验证ERF1与MED25互作
根据MED25和ERF1基因CDS全长设计特异性引物(见表2)，以番茄cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物用EcoRI和SalI酶切，连接到酵母表达载体pGBKT7(BD-MED25)。PCR产物用BamHI和SacI酶切，连接到酵母表达载体pGADT7(AD-ERF1)。将BD-MED25和AD-ERF1载体共转化酵母菌株Y2H，转化后取50μL分别点在SD-Leu-Trp(SD-L/T)和SD-Leu-Trp-Ade-His(SD-L/T/A/H)的平板上，置于28℃培养箱中2-4d，记录酵母生长情况(图3A)。
表2 酵母双杂交载体引物
载体 序列
AD-ERF1-F atggccatggaggccgaattcATGGATTCTTCTTCTTCTTCATCTCA
AD-ERF1-R ccgctgcaggtcgacggatccCCATGGACTAAAATAAGTTGCATCA
BD-MED25-F atggccatggaggccgaattcATGGTGGACAAACTGATCGTCG
BD-MED25-R ccgctgcaggtcgacggatccATTCATAAACCCGCCTCCTGG
2、双分子荧光互补技术(BiFC)验证ERF1与MED25互作
对于BiFC测定，根据MED25和ERF1基因CDS全长设计特异性引物，以番茄cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物用PacI和SpeI酶切，构建ERF1-cYFP和MED25-nYFP载体(特异性引物如表3所示)，利用农杆菌侵染烟草进行双分子荧光互补实验。在48小时渗透后，用ZeissLSM 780共焦显微镜测定叶片中YFP或mCherry信号的亚细胞定位，YFP的激发/发射波长为514nm/520-560nm，mCherry的激发/辐射波长为561nm/580-620nm。如图3所示，将MED25与黄色荧光蛋白(YFP)N端融合，ERF1与黄色荧光蛋白(YFP)C端融合。当融合的ERFl-cYFP和MED25-nYFP共注射到烟草叶片中表达，BiFC信号在转化的烟草细胞中被检测到，以上结果表明ERF1与MED25相互作用。
表3 双分子荧光互补载体引物
载体 序列
ERF1-cYFP-F atttacgaacgatagttaattaacATGGATTCTTCTTCTTCTTCATCTCA
ERF1-cYFP-R actgccacctcctccactagtCCATGGACTAAAATAAGTTGCATCA
MED25-nYFP-F atttacgaacgatagttaattaacATGGTGGACAAACTGATCGTCG
MED25-nYFP-R actgccacctcctccactagtATTCATAAACCCGCCTCCTGG
实施例3
med25突变体和erf1突变体植株的构建。
首先从野生型番茄幼嫩根系中提取总RNA；将获得的番茄总RNA反转录成cDNA；利用CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计sgRNA序列如下(ERF1-sgRNA：TCCGAAGAGATGCTTCTCTT；MED25-sgRNA1：ATAGTGCTTGCCTGGTTCAG；MED25-sgRNA2：ACATGGATACCTTTTTGCAG)。将合成的序列退火并***AtU6-sgRNA-AtOBQ-Cas9载体的BbsI位点，将AtU6-sgRNA-AtoBQ-Cas9box***pCAMBIA1301二元载体的HindIII和KpnI位点。将上述所有得到的质粒分别转化到根癌农杆菌EHA105菌株中，并感染到AC子叶中。基于潮霉素抗性选择转化的植物，并通过对目标基因座的PCR扩增子进行测序来鉴定敲除。PCR产物由杭州有康生物技术有限公司测序，测序结果如图4所示，用BioXM软件(V2.7)进行序列比对，通过农杆菌介导侵染番茄子叶，将目的载体转化进番茄子叶，利用潮霉素初步筛选出候选植株。以潮霉素基因序列的正向引物和反向引物(M13F：tgtaaaacgacggccagt；M36-R：ggtattggtttatctcatcggaactgca)配对，筛选独立的med25突变体和erf1突变体用于实验。同时，申请人研究发现共敲除med25和erf1基因的番茄植株无法存活。
1)无菌苗的培养
番茄种子在28℃摇床200r/min摇种6～8h，然后用75％酒精消毒30s，之后在10％NaClO中消毒15min，灭菌蒸馏水冲洗3次并转移到灭菌器皿，接种于1/2MS培养基。25℃黑暗条件下培养至露白后转入光下培养。
2)准备外植体、培养农杆菌
待子叶伸展开真叶尚未长出时，用新的手术刀将子叶切成两段，平铺于看护培养基中预培养24h(避光)。在含有抗生素的LB平板上挑取农杆菌单菌落，接种于30mL含有抗生素的LB中，28℃、200r/min过夜培养至对数中期(OD600≈1.0，约16～24h)。
3)转化再生
将含有目的载体质粒的根癌农杆菌工程菌菌液在含有抗生素的YEB平板上活化后，挑取农杆菌单菌落，接种于2mL含有抗生素的YEB中，28℃，200rpm震荡过夜培养，再按1∶100比例扩摇培养至OD600＝0.8～1.0。将预培养的子叶外植体避光侵染2～3min，后吸干残留的菌液，转移到灭菌滤纸上吸干残留的菌液，反面朝上平铺回原来的看护培养基中，22℃黑暗共培养48h。共培养后的外植体，正面朝上转入2Z培养基上，每隔两周更换一次新鲜的2Z培养基，待分化出芽后将褐化的外植体切除，将分化好的芽转入0.2Z培养基中选择培养。
4)生根培养与移栽
待再生芽长至1em左右时，放入生根培养基中生根。2周后对转化苗进行炼苗，移栽，得番茄med25突变体和erf1突变体植株。
实施例5
对med25突变体和erf1突变体进行抗性检测。
对得到的番茄med25突变体和erf1突变体植株进行接种根结线虫处理。
将野生型WT，med25突变体和erf1突变体植株均分为两组，一组为对照组(不做根结线虫处理)，一组为实验组(接种根结线虫)。
当番茄长至五叶一心时，对实验组进行接种线虫处理，每株约接种1000条J2期线虫，期间正常浇水。
植株栽培在装有高温灭菌的河沙的塑料杯中，每次用Hoagland营养液浇灌。生长条件为：日夜温度23℃/20℃，14h光周期和600μmol m-2 s-1光照强度。线虫处理时间为5周。实验结束即进行取样并测定相关指标。
根结数目的观察方法如下：
采用酸性品红染色法，用于根结线虫感染的根系表型观察：
(1)将根结线虫侵染过的番茄根系用自来水冲洗干净后选用1％的次氯酸钠溶液漂白5分钟，再用自来水反复冲洗至无刺鼻味；
(2)用吸水纸将根系水分吸干，在3.5％的酸性品红溶液中浸泡，加热煮沸后室温冷却；
(3)用自来水冲洗根系，除去表面多余的品红液体；
(4)将根系放至常温酸性甘油中保存；
(5)24h后进行拍照和根结数统计。
为了验证MED25或ERF1是否参与番茄对RKN的抗性，通过CRISPR-Cas9***生成了番茄med25突变体和erf1突变体植株，用med25突变体和erf1突变体以及野生型WT对照植株为实验材料，每株番茄接种1000条孵化的J2期幼虫，对防御基因表达检测发现，根结线虫诱导野生型中的PDF1.2a/b的表达，而在med25突变体和erf1突变体中受到限制(图5)。同时，培养5周后，发现med25突变体和erf1突变体相较于野生型的根结数目显著性减少，从根系品红染色结果可以明显看到该差异(图6)。因此，这些发现说明了ERF1和MED25均正向调节番茄对南方根结线虫的抗性。

Claims (10)

1.番茄基因在增强番茄对根结线虫抗性中的应用，所述番茄基因为MED25基因或ERFl基因。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MED25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ERF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.番茄基因编码的蛋白在增强番茄对根结线虫抗性中的应用，所述番茄基因为MED25基因编码的蛋白或ERF1基因编码的蛋白。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MED25基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，ERF1基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.一种增强番茄对根结线虫抗性的方法，其特征在于，将番茄中的MED25基因或ERF1基因沉默或者敲除。
6.如权利要求5所述的增强番茄对根结线虫抗性的方法，其特征在于，所述MED25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ERF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.如权利要求5所述的增强番茄对根结线虫抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建用于敲除或者沉默MED25基因或ERF1基因的载体；
(2)将步骤(1)构建的用于敲除或者沉默MED25基因或ERF1基因载体导入水稻的细胞中，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的MED25基因或核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ERF1基因沉默或者敲除，培养后获得转基因植株。
8.如权利要求7所述的增强番茄对根结线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，载体为pCAMBIA1301。
9.如权利要求7所述的增强番茄对根结线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(2)中，将用于MED25基因或ERF1基因沉默或者敲除的载体转入农杆菌基因工程菌后，侵染水稻的细胞。
10.如权利要求9所述的增强番茄对根结线虫抗性的方法，其特征在于，所述农杆菌基因工程菌为农杆菌EHA105菌株。
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