CN113832166A

CN113832166A - 大丽轮枝菌pex30基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

Info

Publication number: CN113832166A
Application number: CN202111117687.3A
Authority: CN
Inventors: 苏晓峰; 刘璐; 吴思源; 王�琦; 程红梅
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明公开了大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用。本发明采用寄主诱导的基因沉默技术以大丽轮枝菌菌株为材料构建多个针对大丽轮枝菌PEX30基因的靶标基因的烟草脆裂病毒干扰质粒转化本氏烟草并进行大丽轮枝菌接种，确定了大丽轮枝菌PEX30基因与致病性之间的关联性；本发明进一步采用大丽轮枝菌PEX30基因的靶标区段构建Gateway干扰载体获得稳定遗传的转基因植物，获得干扰效果最佳的靶基因片段。本发明的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段以及该靶基因片段所构建的Gateway干扰载体能应用于提高作物对大丽轮枝菌所导致病害的抗性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种等方面。

Description

大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段以及含有所述靶基因片段的干扰载体，本发明进一步涉及所述大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段以及所述干扰载体在提高作物或蔬菜抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌抗病原菌靶基因片段及抗病性应用领域。

背景技术

疾病是棉花生产的一大阻碍，细菌、病毒、真菌和线虫可以引起棉花40多种不同的疾病，真菌造成的棉花感染占了棉花疾病总数的三分之一左右(Carris,L.；Little,C.；Stiles,C.,Introduction to Fungi.The Plant Health Instructor 2012,3,367-377.)，由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)所引起的棉花黄萎病是极具破坏性的疾病，造成棉花作物的平均产量损失约为10％-35％(Guo,X.H.；Cai,C.P.；Yuan,D.D.；Zhang,R.S.；Xi,J.L.；Guo,W.Z.,Development and identification of Verticillium wilt-resistantupland cotton accessions by pyramiding QTL related to resistance.J Integr Agr2016,15(3),512-520.)。大丽轮枝菌是一种土传病害真菌，可引起棉花各个组织的感染，当真菌孢子与植物表面接触时，孢子会通过根系组织进入植物体内并传播到其维管***中。病原菌的微菌核能够在土壤中存活数十年之久，并以该结构逃避恶劣环境的威胁(Chen,Q.；Ji,X.；Sun,W.,Identification of races of cotton wilt Fusarium inChina.Scientia Agricultura Sinica 1985,6,1-6.)。大丽轮枝菌通常导致棉花植株发育不良、维管束褐化及叶片枯萎，最终导致病株的死亡。目前，还没有专门针对棉花黄萎病的有效杀菌剂，因此大丽轮枝菌给棉花的生产带来了重大经济损失。

过氧化物酶体(Peroxisome)是一类单层膜细胞器，普遍存在于各种真核细胞中，其内部至少含有50多种酶类，是细胞中丰富的酶库，参与包括乙醛酸循环、脂肪酸的β-氧化及活性氧的调节等在内的多种生理生化活动。研究表明，通过脂肪酸的β-氧化、乙醛酸循环产生的乙酰辅酶a可以刺激植物病原真菌脂肪的快速分解，参与病原菌能量代谢、附着胞膨压产生及次级代谢产物的合成，如黑色素、聚酮类化合物等，这些生理过程对植物病原真菌的致病力至关重要。参与过氧化物酶体形成与增殖的基因，通常称为PEX基因(Kiel J.,A；Veenhuis M；van der Klei IJ,PEX genes in fungal genomes:common,rare orredundant.Traffic 2006,7(10),1291-1303.)。黄瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)的附着胞含有黑色素和甘油等物质，从而形成机械作用力帮助病原菌进入寄主体内，且黑色素及甘油的合成都依赖于脂质代谢(Kogej T；Wheeler M.,H；

T.,L；Gunde-Cimerman N.Evidence for 1,8-dihydroxynaphthalene melanin in threehalophilic black yeasts grown under saline and non-saline conditions.FEMSMicrobiol Lett 2004,232(2),203-209.)，而过氧化物酶体是脂类物质代谢的主要场所，所以过氧化物酶体与病原菌的侵染能力息息相关。Fujihara等人在黄瓜炭疽病菌中利用随机***的方法构建突变体，筛选脂肪酸利用能力和致病力下降的突变体(N,Sakaguchi A.；Tanaka S.；Fujii S.；Tsuji G.；Shiraishi T.；O’Connell R.；Kubo Y.,Peroxisomebiogenesis factor PEX13 is required for appressorium-mediated plant infectionby the anthracnose fungus Colletotrichum orbiculare.Mol.Plant MicrobeInteract 2010,23(4),436-445.)。检测发现病原菌的过氧化物酶体基因PEX13被干扰后，其黑色素合成能力下降，并且用黑色素合成前体Scytalone处理后，突变体可以恢复合成细胞壁内侧黑色素的能力。PEX13突变体附着胞中甘油的浓度低于野生型，以上结果表明PEX13可能通过附着胞中黑色素及甘油物质的合成参与病原菌致病过程(Howard R.,J.；Ferrari M.,A.；Roach D.,H.；Money N.,P.,Penetration of hard substrates by afungus employing enormous turgor pressures.Proc Natl Acad Sci USA 1991,88,11281-11284.)。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的PEX6基因突变后，该突变体在脂肪酸利用、黑色素生物合成和脂质体降解方面均存在缺陷，导致其附着胞功能缺陷，无法正常致病(Wang Z.,Y；Soanes D.,M.；Kershaw M.,J.；Talbot N.,J.,Functional analysis oflipid metabolism in Magnaporthe grisea reveals a requirement for peroxisomalfatty acid beta-oxidation during appressorium-mediated plantinfection.Mol.Plant Microbe Interact 2007,20,475-491.)。

大丽轮枝菌PEX30(peroxisomal membrane protein PEX30)基因(VDAG_09094)所编码的蛋白含有617个氨基酸，分子量大小为68.067kDa，理论等电点为9.46。该蛋白属于Pex24p(PF06398)家族蛋白，该家族是Peroxisome超家族(CL0484)的成员，TMHMM预测分析表明该蛋白属于过氧化物酶体外膜蛋白，不含跨膜结构域。目前对过氧化物酶体所含酶类功能的研究日益增多，但关于病原真菌中PEX基因和其所参与的生化过程的进一步发掘以及各种代谢过程之间的联系有待于进一步研究。

发明内容

本发明的目的之一是提供大丽轮枝菌PEX30基因抗病靶基因片段；

本发明的目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌PEX30基因抗病靶基因片段的干扰载体；

本发明的目的之三是将所述大丽轮枝菌PEX30基因抗病靶基因片段以及含有该靶基因片段的干扰载体应用于植物抗病或构建获得抗病的转基因植物新品种。

为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

本发明首先公开了能够提高植物抗病原菌的大丽轮枝菌PEX30靶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9；优选的，所述靶基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。

本发明还公开了含有所述的大丽轮枝菌PEX30靶基因片段的干扰载体以及含有所述干扰载体的宿主细胞。

此外，由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示的靶基因片段所转录的dsRNA也包含在本发明的保护范围之内。

本发明所述大丽轮枝菌PEX30靶基因片段能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致的疾病的抗病性，包括以下步骤：(1)构建含有所述大丽轮枝菌PEX30靶基因片段的干扰载体；(2)将所构建的干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

优选的，一种构建所述干扰表达载体的方法，包括：通过BP反应，将所述的大丽轮枝菌PEX30靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，得到Gateway干扰载体。

本发明所述干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致的疾病的抗病性，包括以下步骤：(1)将所述干扰载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。

本发明中所述的大丽轮枝菌所导致的病害优选为棉花黄萎病。

本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：(1)构建含有所述大丽轮枝菌PEX30靶基因片段的干扰载体；(2)将所构建的干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。

所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可适用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移等。

本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物或蔬菜，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。

本发明采用寄主诱导的基因沉默技术(Host-induced gene silencing)，以高致病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，构建多个针对大丽轮枝菌靶标基因peroxisomalmembrane protein PEX30基因(VDAG_09094)的烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)干扰质粒。通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草(Nicotina benthamiana)，并进行大丽轮枝菌接种。将其中可以明显降低植物病情指数的靶标区段构建Gateway干扰载体，获得稳定遗传的转基因植物。通过病情指数以及分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平，筛选到效果最佳的干扰区段。本发明所筛选得到的大丽轮枝菌PEX30靶基因片段以及应用该靶基因片段所构建的Gateway干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。

本发明整体技术方案详述

本发明为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌PEX30(peroxisomal membrane protein PEX30，VDAG_09094)的编码序列，扩增获得针对靶标基因的3个不同区段，即：PEX30-1，PEX30-2和PEX30-3，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.7、SEQID No.8和SEQ ID No.9所示。根据3个靶标基因设计3对特异性引物，引物两端含有EcoR I和BamH I酶切位点，分别对目的片段进行扩增。通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中成为VIGS系列RNAi载体。通过PCR扩增验证和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。

从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA并发挥着干扰作用。因此，本试验选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行10⁶个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10dpi、11dpi和12dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果发现，与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入可以降低植物的病情指数，其中，引入靶标片段PEX30-1的病情指数显著低于其它的两个靶标片段的病情指数。

通过VIGS筛选的方法，本发明获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段PEX30-1。为了进一步验证PEX30与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，进一步设计了针对靶标基因PEX30-1的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可以发现明亮的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的PEX30-1靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。

为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因PEX30的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草。

对获得的含有dsPEX30的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图8可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约75％。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。结果表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的26％。

为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约70％。这说明PEX30基因的PEX30-1区段(SEQ ID No.7)作为靶标片段设计dsRNA可有效降低大丽轮枝菌所导致的致病力。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行***以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“RNA干扰(RNA interference,RNAi)”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。

附图说明

图1、VIGS载体信息。

图2、VIGS不同区段扩增结果；M：marker，1-3为针对PEX30基因的不同区段扩增结果。

图3、VIGS干扰载体菌液PCR验证；M为marker，1-3为针对PEX30基因构建VIGS质粒的菌液PCR验证结果。

图4、病情指数统计结果。

图5、RNAi扩增结果；M为marker，1为针对PEX30的扩增条带。

图6、RNAi载体信息。

图7、转基因阳性烟草PCR检测；M：marker，1-5为RNAi-PEX30-1转基因烟草；WT为野生型烟草。

图8、转基因烟草病情指数分析。

图9、植物体内真菌生物量分析。

图10、植物体内真菌靶标基因表达量分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1大丽轮枝菌PEX30抗病原菌靶基因片段的筛选、干扰载体的构建和转烟草抗病性应用

⒈试验材料

⑴材料

烟草：本氏烟草(Nicotiana benthamiana)品系。

培养条件：种植于高温高压灭菌的混合营养土(芳洁营养土：蛭石＝1：1)中，温度23±2℃，相对湿度75±5％，光周期L：D为16h：8h。

⑵菌株和质粒

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)V991，高致病力落叶型菌株，由中国农科院植物保护研究所简桂良研究员惠赠。

病毒载体：烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)双元载体(TRV1与TRV2)由清华大学刘玉乐教授惠赠。

农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本发明人实验室保存。

植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明人实验室保存。

⒉试验方法

⑴真菌的培养以及植物接种方式

将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。经5层纱布过滤，离心收集孢子。用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至10⁶个/mL后备用。

当本氏烟草的叶片长至6-8片真叶时，选取长势一致的幼苗进行接种。用镊子从根部将幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的10⁶个/mL孢子悬液或蒸馏水中2min后，尽快将幼苗移回原来的塑料钵中，并浇水，使土壤湿润，进行病情指数统计。

⑵植物病情指数统计

根据相关文献(Wang HM,Lin ZX,Zhang XL,Chen W,Guo XP,Nie YC,LiYH.2008.Mapping and quantitative trait loci analysis of verticillium wiltresistance genes in cotton.Journal of Integrative Plant Biology 50:174-182.)并做出适当调整，制定本试验中本氏烟草感染大丽轮枝菌的病情等级(如表1)。病情指数计算公式见下述的公式1：

表1病情指数统计

公式1：病情指数＝[∑(number×level)/(total plant×highest level)]×100

⑶VIGS干扰载体的构建

为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌PEX30(peroxisomal membrane protein PEX30，VDAG_09094)的编码序列，设计3对特异性引物，引物两端含有EcoR I和BamH I酶切位点(如表2)，分别对目的片段进行扩增。然后利用l％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以及载体分别进行酶切反应，并利用T₄连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用PCR扩增检测以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。

表2 AK不同区段引物信息

注：加粗斜体处为酶切位点。

⑷VIGS转化方法

将含有阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基(25μg/mL Rif和50μg/mLKan)中，28℃摇床过夜培养。次日将菌液(比例为2％)加入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至OD₆₀₀为0.5-0.6时，低温离心收集菌体。弃去废液，将菌体重悬于注射基质(10mMMES、10mM MgCl₂、100μM乙酰丁香酮)中，调整OD₆₀₀至0.8-1.0。把两种农杆菌菌株(TRV1与TRV2+靶标基因片段)以1：1混合，在室温中静置3-5h，不要摇动。最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。

⑸稳定遗传载体的构建

为了获得稳定遗传的含有靶标基因dsRNA的本氏烟草，对能够明显提高植物对病原菌抗性的DNA区段(SEQ ID No.7)，重新设计引物(两端含有部分BP位点)，然后再用attb引物进行扩增(如表3)，用于稳定遗传干扰载体的构建。通过BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中，然后通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中；最后将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。

表3稳定遗传干扰引物信息

⑹本氏烟草的转化

将种在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，切成0.4×0.6cm大小的小段(除去边缘和主要叶脉)，放入OD₆₀₀为0.1-0.2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基(MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2mg/L)上进行培养，25℃暗室内培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基(MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中进行培养，光照周期为16h光照/8h黑暗。2-3周后待抗性芽生长至1-2cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中诱导生根，1-2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并进行PCR检测(如表4)，获得转基因阳性植株。

表4检测引物信息

⑺真菌生物量检测

为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，本试验利用qRT-PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总DNA，以大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段，进行相对定量测定(如表5)。

qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2^-ΔΔCt法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。

表5荧光定量引物信息

⑻靶标基因的表达量分析

为了确定本氏烟草抗性的提高与靶标基因的下降存在一定的关系，我们利用qRT-PCR进一步测定本氏烟草中靶标基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA，并进行反转录分析。以病原菌PEX30基因的编码序列设计引物作为目的片段(如表6)，同时以病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。

表6、荧光定量引物信息

⒊试验结果

⑴大丽轮枝菌PEX30干扰载体的构建

本试验采用清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)载体(如图1)。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合成酶终止子(nopaline synthaseterminator，NOSt)之间。TRV1包含了病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRp)、可移动蛋白(Movement Protein，MP)、16kDa富含半胱氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白(coat protein，CP)、多克隆位点(multiple cloningsite，MCS)等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的***。

根据大丽轮枝菌PEX30编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的3个不同区段(如图2)，即：PEX30-1，PEX30-2和PEX30-3，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.7、SEQID No.8和SEQ ID No.9所示。

通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中成为VIGS系列RNAi载体。通过PCR扩增验证和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致(如图3)。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。

⑵本氏烟草的病情指数分析

从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA并发挥着干扰作用。因此，本试验选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行10⁶个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10天(dayspost-inoculation，dpi)、11dpi和12dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果如图4所示，与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入可以降低植物的病情指数，其中，引入靶标片段PEX30-1的病情指数显著低于其它的两个靶标片段的病情指数。

⑶转基因植株的获得

通过VIGS筛选的方法，获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段PEX30-1。为了进一步验证PEX30与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，设计了针对靶标基因PEX30-1的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可以发现明亮的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。

通过BP反应和LR反应，将克隆获得的PEX30-1靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0(如图6)上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。

为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因PEX30的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草(如图7)。

⑷转基因烟草的抗病性分析

对获得的含有dsPEX30的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图8可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约75％。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。图9表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的26％。

为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，可以观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约70％(如图10)。这说明PEX30基因的PEX30-1区段(SEQ ID No.7)作为靶标片段设计dsRNA，可以有效降低病原菌的致病力。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用

<130> BJ-2002-210715A

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<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 6

ataggatccc gctcatgacc tcgctctct 29

<210> 7

<211> 450

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 7

caccagaaaa gccccctgtt gctggccacg ccgccacaaa tcacgcgcgc cctcgcctac 60

tcgcactctt ttctcctacc catgaacaag gccgttgggc tgctgagctg gacgacgggt 120

gacccctggg agagcttcct cctcgtctgt gcctggtggg ccatcgtcct ctacggcgat 180

gtcgtcatcc gcagtgccgg ccccttggtc ctcgtcctcg gcctcattct cgccatgtac 240

tcccgccgtt acagcccttt gagcagcagc ggctggatgg atgaccgcga ccccgaaccg 300

acaagaaacc agaagggaca tgcacgctca ggctctgaga tcacacacac ccgccaccag 360

aagacgttgg acgagattgt cgagacgttg aaggagttca cgggacggtg caacgtgctg 420

ctgggcccgg cccttgagtt gacggacttt 450

<210> 8

<211> 450

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 8

cacgctcgtc ttgacatggc acgcgcgcgt ggccaaggtt gccagaacca ttctctggcg 60

gagcgcgact gtgaggaaga ctgtggctct cgtcacgggg ttgcgcttcg aaaagcccga 120

tcgcaagctt acgcctcagc ccgactctga tgttgtcacg gcatcggccg atgggcctgt 180

gccgaaggtt gatcgccaga cctccgagct gacgaaagcc ctccgtcaga ggagccacaa 240

gcacgggaac aacgccacgg gacgagatgc tggggtcaaa tttaccttta tcctgtacga 300

gaaccagaga cgatgggtcg gtctgggttg gacacagagt ttgtttgcct acgagcgtgc 360

ggcatggacg gatgagcata acaattccgt cccagcaaag gatgtctttg agttgcctga 420

cgtcgaggac ggcagcaaga tgaggtggcg 450

<210> 9

<211> 440

<212> DNA

<213> Verticillium dahliae

<400> 9

aaagaatggc tggatttact atgacaacaa gtggcaagca ggccgtcgca gggaagatgg 60

ctggggcaag tggacacggc gccgaaagtg gtaccgcgat gccgagctcg tcgagatctc 120

ggaggaggag ctcgcagcgg cggcggcggc agcgacaaca gcagcatctc agccaacaac 180

acacgtttat agcacacttt ccgagaagat ggtatcacca acgcaatcga cgcataatct 240

accgccattc tccgaagacg gggcgagcga acaggccccg gcatccctgt cgtcttccgg 300

tgggggtcga tcattcttcc gcaagccatt gcgaaggcga ggaacgggcc agtcgtctac 360

ctcggtagcg acgagtacga cggccgtcga aggtgctcca gaaagaaaga agggaaggcg 420

agagagcgag gtcatgagcg 440

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 10

aaaaaagcag gctcaccaga aaagccccct gtt 33

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 11

aagaaagctg ggtaaagtcc gtcaactcaa gggc 34

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 12

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 13

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 14

ctacccatga acaaggccgt tgggc 25

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 15

agttcacggg acggtgcaac gtgc 24

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 16

ccgccggtcc atcagtctct ctgtttatac 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 17

cgcctgcggg actccgatgc gagctgtaac 30

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 18

ggacctttat ggaaacattg tgctcagt 28

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 19

ccaagataga acctccaatc cagacac 27

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 20

acgagatgct ggggtcaaat ttacc 25

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 21

gcaacatcat cagtcacgcc at 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 22

ggcttcctca aggtcggcta tg 22

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 23

gctgcatgtc atcccacttc ttc 23

Claims

1.大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)PEX30基因抗病原菌靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。

2.按照权利要求1所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。

3.由权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段所转录的dsRNA。

4.含有权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体。

5.一种构建权利要求4所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段***到Gateway干扰载体，即得；

其中，通过BP反应，将权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。

6.权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段在提高植物对大丽轮枝菌所导致病害抗性中的应用。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段的Gateway干扰载体；(2)将所构建的Gateway干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌所导致病害抗性提高的转基因植物。

8.权利要求4所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性中的应用，其特征在于，包括：(1)将所述RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性提高的转基因植物。

9.一种培育抗大丽轮枝菌所导致病害的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有权利要求1或2所述的大丽轮枝菌PEX30基因抗病原菌靶基因片段的RNA干扰载体；(2)将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；(3)筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性提高的转基因植物新品种。

10.按照权利要求6或8所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。