CN113549635B - 大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗病性中的用途 - Google Patents
大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗病性中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物抗病性中的用途。本发明采用寄主诱导的基因沉默技术以大丽轮枝菌菌株为材料构建多个针对大丽轮枝菌VdPRMT1基因的烟草脆裂病毒干扰质粒，转化本氏烟草并进行大丽轮枝菌接种，初步确定大丽轮枝菌中VdPRMT1基因与致病性存在关联性。本发明进一步以大丽轮枝菌的VdPRMT1作为靶标基因，利用转基因和RNAi技术相结合，筛选获得能够显著提高植物抗病性的靶标基因片段。本发明所筛选的靶标基因片段以及应用该靶标基因片段所构建的Gateway干扰载体可应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种等方面。
Description
技术领域
本发明涉及大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因（VdPRMT1）的新用途，尤其涉及大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗病原危害中的用途，属于大丽轮枝菌VdPRMT1基因的新用途领域。
背景技术
棉花黄萎病（Verticillium Wilt of cotton）被称为“棉花癌症”， 在很多国家使棉花平均减产10-35%，严重危害棉花生产，造成了巨大的经济损失 （王孝坤；王春燕；谢成建；杨星勇，黄萎病菌致病及植物抗黄萎病分子机制研究进展. 河南农业科学. 2014, 43 (01), 1-6.）。其致病菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），它具有很强的致病性，在整个棉花生长阶段内，它都能够进行侵染，导致棉花出现叶片萎蔫、变黄等现象；发病严重时，整个棉花叶片枯焦破碎，最终死亡。同时，它的寄主植物范围较为广泛，能够侵染的植物种类达六百多种，包括一年生草本植物、多年生草本植物和木本植物，其中不乏十字花科、茄科、菊科和蔷薇科等多种具有重要经济价值的农作物、苗木和花卉等，并且可侵染的寄主的范围还在不断扩大（Sun L.; Qin J.; Rong W., Cellophane surface-induced gene,VdCSIN1, regulates hyphopodium formation and pathogenesis via cAMP-mediatedsignaling in Verticillium dahliae. Molecular plant pathology 2019,20 (3),323-33.）。由于大丽轮枝菌是土传植物病原真菌，所以防治起来非常困难，目前生产上还没有具有较好效果的药剂。
蛋白质精氨酸残基的甲基化是一种十分重要的蛋白质翻译后修饰类型，它参与了包括mRNA前体剪接加工、mRNA翻译、DNA损伤修复、蛋白互作、细胞自噬等多种生物学过程（Guccione E.; Richard S., The regulation, functions and clinical relevance ofarginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology2019, 20 (10),642-57.）。精氨酸残基的甲基化反应过程是由蛋白精氨酸甲基转移酶（protein argininemethyltransferases, PRMT）催化完成的，PRMT将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine, AdoMet/SAM）转移到蛋白质精氨酸残基的胍基氮原子上反应得到甲基精氨酸和S-腺苷-L-高半胱氨酸（S-Adenosyl-L-homocysteine, AdoHcy/SAH）（LeeH. W.; Kim S.; Paik W. K., S-Adenosylmethionine: protein-argininemethyltransferase. Purification and mechanism of the enzyme. Biochemistry 1977, 16 (1), 78-85.）。近年来，PRMT在人类、哺乳动物和植物中的研究有大量报道，而在真菌中的研究主要以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主，酿酒酵母中已报道的蛋白精氨酸甲基转移酶包括Hmt1（Rmt1）、Rmt2、Hsl7和Sfm1四种。Hmt1（Rmt1）是酿酒酵母最主要的蛋白精氨酸甲基转移酶，属于Ⅰ型PRMT，是哺乳动物体内PRMT1的同源物，它负责催化酿酒酵母体内大约89%的ω-MMA和大约66%的aDMA （Gary J. D.; Lin W. J.; Yang M. C.,The Predominant Protein-arginine Methyltransferase from Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 1996, 271 (21), 12585-94.）。Hmt1的反应底物既有组蛋白，也有非组蛋白。Hmt1能够催化酿酒酵母中组蛋白H4第3位的精氨酸残基和组蛋白H3第2位的精氨酸残基发生aDMA （Li H. T.; Gong T.; Zhou Z., Yeast Hmt1catalyses asymmetric dimethylation of histone H3 arginine 2 in vitro.Biochemical Journal 2015, 467 (3), 507-15.）。Hmt1的非组蛋白底物通常是含有RGG/RG重复序列的一类蛋白，RGG/RG重复序列在这类蛋白中大多位于蛋白的N端或C端，精氨酸甲基化反应位点就位于RGG/RG重复序列（Brandariz N. A.; Zeng F.; Lam Q. N., Sbp1modulates the translation of Pab1 mRNA in a poly(A)- and RGG-dependentmanner. RNA 2018, 24 (1), 43-55；Bedford M. T., Arginine methylation at aglance. Journal of Cell Science 2007, 120(24), 4243.）。研究表明U1小核糖核蛋白（snRNP）亚基Npl3蛋白经过Hmt1的甲基化修饰促进其与mRNA前体结合进而参与mRNA前体的剪接加工（Muddukrishna B.; Jackson C. A.; Yu M. C., Protein argininemethylation of Npl3 promotes splicing of the SUS1 intron harboring non-consensus 5′ splice site and branch site. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms 2017, 1860 (6), 730-9.）。李智强等人（Li Z.; Wu L.;Wu H., Arginine methylation is required for remodelling pre-mRNA splicing andinduction of autophagy in rice blast fungus. New Phytologist 2020, 225 (1):413-29.）对引起水稻稻瘟病的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的PRMT进行了研究，发现稻瘟病菌具有四种PRMT，但只有当敲除与酿酒酵母Hmt1同源的MoHMT1时，其生长表型和致病力较野生型才有明显的变化和下降，其余突变体与野生型相比无显著差别。
大丽轮枝菌中存在四种与酿酒酵母PRMTs同源的大丽轮枝菌PRMTs，分别为VdPRMT1（VDAG_08751）、VdPRMT2（VDAG_04075）、VdPRMT3（VDAG_04088）和VdPRMT4（VDAG_02006）。其中，VdPRMT1与酿酒酵母HMT1同源，其cDNA全长为1035 bp，编码蛋白长度为344aa。
已发表文献表明，HMT1是酿酒酵母中起主要作用的蛋白精氨酸甲基转移酶，因此与酵母HMT1同源的VdPRMT1可能是大丽轮枝菌中主要的蛋白精氨酸甲基转移酶。
迄今为止，尚不清楚大丽轮枝菌VdPRMT1与棉花黄萎病是否存在一定的关联，因此，确定大丽轮枝菌VdPRMT1基因与棉花黄萎病之间是否存在关联性并筛选获得大丽轮枝菌VdPRMT1基因靶标基因片段对于棉花黄萎病的防治具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是确定大丽轮枝菌VdPRMT1基因与与致病性是否存在关联性。
本发明的目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌VdPRMT1基因靶标基因片段的干扰载体；
本发明的目的之三是将所述大丽轮枝菌VdPRMT1基因靶标基因片段以及含有该靶标基因片段的干扰载体应用于抗大丽轮枝菌所导致的病害或构建获得抗大丽轮枝菌所导致病害的转基因植物新品种。
为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：
本发明首先公开了大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗致病菌危害中的用途。
作为本发明的一种具体的实施方案，所述的大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物抗致病菌危害中的用途包括：（1）构建含有大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因靶标基因片段的干扰载体；（2）将所构建的干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病抗性提高的转基因作物。
作为本发明的一种具体的实施方案，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体；作为本发明的一种优选的具体实施方案，所述的Gateway干扰载体的构建方法包括：将大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因靶标基因片段***到Gateway干扰载体，即得；更优选的，Gateway干扰载体的构建方法包括：所述通过BP反应，将大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因靶标基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。
作为本发明的一种优选的实施方案，所述大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因靶标基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示；更优选的，所述大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因靶标基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.19所示。
作为本发明的一种优选的实施方案，所述的致病菌是大丽轮枝菌；所述的作物或蔬菜包括但不限于烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
本发明还公开了含有所述的大丽轮枝菌VdPRMT1靶标基因片段的干扰载体以及含有所述干扰载体的宿主细胞。
此外，由SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示的靶标基因片段所转录的dsRNA也自然包含在本发明的保护范围之内。
本发明中所述的大丽轮枝菌所导致的疾病优选为棉花黄萎病。
本发明进一步公开了一种培育抗大丽轮枝菌所致病害的转基因植物新品种的方法，包括以下步骤：（1）构建含有所述大丽轮枝菌VdPRMT1靶标基因片段的干扰载体；（2）将所构建的干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物新品种。
本发明中所述转化的方案以及将所述核苷酸引入植物的方案可视用于转化的植物或植物细胞的类型而变化。将所述核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化或直接基因转移等。
本发明所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物或蔬菜，包括：烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
本发明采用寄主诱导的基因沉默技术（Host-induced gene silencing），以高致病力的大丽轮枝菌V991为实验材料，构建多个针对大丽轮枝菌VdPRMT1靶标基因的烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）干扰质粒。通过农杆菌注射的方法转化本氏烟草（Nicotina benthamiana），并进行大丽轮枝菌接种。将其中可以明显降低植物病情指数的靶标基因片段构建Gateway干扰载体，获得稳定遗传的转基因植物。通过病情指数以及分子生物学手段检测真菌生物量以及靶标基因的转录水平，筛选到效果最佳的干扰区段。本发明所筛选得到的大丽轮枝菌VdPRMT1靶标基因片段以及应用该靶标基因片段所构建的Gateway干扰载体能够应用于提高植物对大丽轮枝菌所导致疾病的抗病性以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。
本发明整体技术方案详述
本发明为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1（protein arginine methyltransferases 1, PRMT1,VDAG_08751）的编码序列，设计引物，扩增获得针对靶标基因的2个不同区段，分别命名为VdPRMT1-1和VdPRMT1-2，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过菌液扩增和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。
从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明了，接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行106个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10 dpi、第11dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果发现，与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分烟草病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。
本发明通过VIGS筛选的方法，获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段。为了进一步验证VdPRMT1与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的片段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。通过BP反应和LR反应，将克隆获得的1个VdPRMT1靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。
为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdPRMT1的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草。
对获得的含有dsVdPRMT1的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从试验结果可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约60-85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。试验结果表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的10-25%。病情指数统计以及真菌生物量分析，可以明显观察到转基因阳性烟草对病原菌具有更强的抗性。
为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约65%。同时，图片显示RNAi-VdPRMT1转基因烟草的抗病性明显优于野生型烟草。这说明VdPRMT1基因的区段1（VdPRMT1-1，其核苷酸序列为SEQ ID No.19所示）作为靶标片段设计dsRNA可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低大丽轮枝菌病原菌的致病力。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985); 和Cassol等人, (1992)；Rossolini等人, Mol Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行***以产生重组宿主细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“RNA干扰（RNA interference, RNAi）”意指通过外源或内源性的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。
附图说明
图1 VIGS载体信息。
图2 VIGS不同区段扩增结果；M：marker，1-2为针对VdPRMT1基因的不同区段扩增结果。
图3 VIGS干扰载体菌液扩增验证结果；M为marker，1-12为针对VDPRMT1基因构建VIGS质粒的菌液扩增结果。
图4 病情指数统计结果。
图5 RNAi扩增结果；M为marker，1为针对VdPRMT1的扩增条带。
图6 RNAi载体信息。
图7 转基因阳性烟草PCR检测；M：marker，1-9为RNAi-VdPRMT1转基因烟草，WT为野生型烟草。
图8 转基因烟草病情指数分析。
图9 植物体内真菌生物量分析。
图10 植物体内真菌靶标基因表达量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1大丽轮枝菌VdPRMT1基因抗病原菌靶标基因片段的筛选、干扰载体的构建和转烟草抗病性应用
⒈试验材料
⑴ 材料
烟草：本氏烟草（Nicotiana benthamiana）品系。
培养条件：种植于高温高压灭菌的混合营养土（芳洁营养土：蛭石 = 1：1）中，温度23 ± 2℃，相对湿度75 ± 5 %，光周期L：D为16 h：8 h。
⑵菌株和质粒
棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）V991，高致病力落叶型菌株，由中国农科院植物保护研究所简桂良研究员惠赠。
病毒载体：烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）双元载体（TRV1与TRV2）由清华大学刘玉乐教授惠赠。
农杆菌：菌株GV3101和LBA4404，由本发明人实验室保存。
植物稳定遗传载体：pDONR207和pK7GWIWG2(I),0载体由本发明人实验室保存。
⒉试验方法
⑴真菌的培养以及植物接种方式
将大丽轮枝菌孢子培养于液体CM培养基中，25℃振荡培养5-7天。经5层纱布过滤，离心收集孢子。用蒸馏水稀释，并在显微镜下观察，将孢子浓度调整至106个/mL后备用。
当本氏烟草的叶片长至6-8片真叶时，选取长势一致的幼苗进行接种。用镊子从根部将幼苗挖出，并在蒸馏水中清洗根部泥土。将幼苗根部完全浸泡于稀释好的106个/mL孢子悬液或蒸馏水中2 min后，尽快将幼苗移回原来的塑料钵中并浇水，使土壤湿润，进行病情指数统计。
⑵植物病情指数统计
根据相关文献（Wang HM, Lin ZX, Zhang XL, Chen W, Guo XP, Nie YC, LiYH. 2008. Mapping and quantitative trait loci analysis of verticillium wiltresistance genes in cotton. Journal of Integrative Plant Biology 50: 174-182.）并做出适当调整，制定本试验中本氏烟草感染大丽轮枝菌的病情等级（如表1）。病情指数计算公式见下述的公式1：
表1 病情指数统计
公式1：病情指数=[Ʃ (number × level)/(total plant × highest level)]×100。
⑶ VIGS干扰载体的构建
为了筛选得到干扰效果最佳的靶标基因区段，根据大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1（protein arginine methyltransferases 1, PRMT1,VDAG_08751）的编码序列，设计2对特异性引物，引物两端含有EcoR I和BamH I酶切位点（如表2），分别对目的片段进行扩增。然后利用l％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段以及载体分别进行酶切反应，并利用T4连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用酶切以及测序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。
表2 VdPRMT1不同区段引物信息
注：加粗斜体处为酶切位点。
⑷VIGS转化方法
将含有阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基（25 µg/mL Rif和50 µg/mLKan）中，28℃摇床过夜培养。次日将菌液（比例为2%）加入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至OD600为0.5-0.6时，低温离心收集菌体。弃去废液，将菌体重悬于注射基质（10 mM MES、10 mM MgCl2、100µM 乙酰丁香酮）中，调整OD600至0.8-1.0。把两种农杆菌菌株（TRV1与TRV2+靶标基因片段）以1：1混合，在室温中静置3-5 h，不要摇动。最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。
⑸稳定遗传载体的构建
为了获得稳定遗传的含有靶标基因dsRNA的本氏烟草，对能够明显提高植物对病原菌抗性的DNA区段，重新设计引物（两端含有部分BP位点），然后再用attb引物进行扩增（如表3），用于稳定遗传干扰载体的构建。通过BP反应，将靶标序列连接至pDONR207中；然后通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中，最后将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。
表3 稳定遗传干扰引物信息
⑹本氏烟草的转化
将种在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，切成0.4×0.6 cm大小的小段（除去边缘和主要叶脉），放入OD600为0.1-0.2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中浸泡5 min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草芽分化培养基（MS+NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2 mg/L）上进行培养，25℃暗室内培养3天。将经过共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基（MS+NAA 0.2 mg/L+ 6-BA 2 mg/L + Kan100 mg/L + Carb 500 mg/L）中进行培养，光照周期为16 h光照/8 h黑暗。2 - 3周后待抗性芽生长至1-2 cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基（MS + Kan 100 mg/L +Carb 500 mg/L）中诱导生根，1 ~ 2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DNA，并进行PCR检测（如表4），获得转基因阳性植株。
表4检测引物信息
⑺真菌生物量检测
为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，本试验利用qRT-PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总DNA，以大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为靶标片段，同时以本氏烟草的持家基因actin为持家片段，进行相对定量测定（如表5）。
qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2-∆∆Ct法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。
表5 荧光定量引物信息
⑻靶标基因的表达量分析
为了确定本氏烟草抗性的提高与靶标基因的下降存在一定的关系，我们利用qRT-PCR进一步测定本氏烟草中靶标基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA，并进行反转录分析。以病原菌中VdPRMT1基因的编码序列设计引物作为目的片段（如表6），同时以病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。
qRT-PCR反应在ABI7500上反应完成，结果采用2-∆∆Ct法进行结果分析。引物的单峰性以及扩增效率满足实验要求。
表6 荧光定量引物信息
⒊试验结果
⑴大丽轮枝菌VdPRMT1干扰载体的构建
本实验采用清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）载体（如图1）。TRV的cDNA位于双35S启动子和胭脂碱合成酶终止子（nopaline synthaseterminator，NOSt）之间。TRV1包含了病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerase，RdRp）、可移动蛋白（Movement Protein，MP）、16 kDa富含半胱氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白（coat protein，CP）、多克隆位点（multiple cloningsite，MCS）等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的***。根据大丽轮枝菌VdPRMT1编码序列信息，设计引物，扩增获得针对靶标基因的2个不同区段（图2），分别命名为VdPRMT1-1和VdPRMT1-2，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示。
通过BamH I和EcoR I将克隆获得的靶标片段进行酶切，然后将其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过菌液扩增和DNA测序进行验证后，发现序列与靶标片段序列完成一致（如图3）。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101，用于本氏烟草的注射。
⑵本氏烟草的病情指数分析
从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新生的叶片全部为白色，并且这种叶片白化的现象可以持续45天。这表明了，接种后的第7天，本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，选择了从注射VIGS系列载体后的第7天，进行106个/mL孢子悬液的蘸根法接种。对接菌后的第10天（dayspost-inoculation，dpi）、11 dpi和12 dpi进行本氏烟草的病情指数统计。结果如图4所示，与空载相比，注射真菌靶标基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数的增加，病情指数逐渐上升。部分烟草病情指数一直保持在较低水平，初步说明靶标片段的引入可以降低植物的病情指数。
⑶转基因植株的获得
通过VIGS筛选的方法，获得了可以提高植物对病原菌抗性的靶标区段。为了进一步验证VdPRMT1与病原菌致病性之间的关系以及干扰后能显著降低病原菌致病力的区段，获得稳定遗传的转基因本氏烟草，设计了针对靶标基因的引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可以发现明亮的目的条带，通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与靶标序列完全一致。
通过BP反应和LR反应，将克隆获得的1个VdPRMT1靶标片段连接到Gateway干扰载体pK7GWIWG2(I),0（如图6）上，形成含有真菌靶标基因的植物转化载体。
为了获得能够稳定遗传针对病原菌靶标基因VdPRMT1的dsRNA，通过农杆菌介导及组织培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草（如图7）。
⑷转基因烟草的抗病性分析
对获得的含有dsVdPRMT1的阳性转基因烟草，进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图8可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约60-85%。提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。图9表明，转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，约为野生型的10-25%。病情指数统计以及真菌生物量分析明显观察到转基因阳性烟草对病原菌具有更强的抗性。
为了进一步验证植物病情指数降低与靶标基因表达之间的关系，通过对植物根部病原菌靶标基因的表达量分析，观察到与野生型植物相比，转基因植物体内靶标基因表达量下降了约65%（图10）。同时，图片显示RNAi-VdPRMT1转基因烟草的抗病性明显优于野生型烟草。这说明VdPRMT1基因的区段1（VdPRMT1-1，其核苷酸序列为SEQ ID No.19所示）作为靶标片段设计dsRNA，可以达到最佳的干扰效果，从而可以有效降低病原菌的致病力。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 大丽轮枝菌VdPRMT1基因在提高作物或蔬菜抗病性中的用途
<130> BJ-2002-210714A-L
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
atagaattcg gagcactctg agcagcacta c 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
ataggatcca ggtgtcacga gcgtagagga 30
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
ataggatccc gctcgtgaca cctacctgaa c 31
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
ataggatcca atctcctcgc cgtgctgga 29
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<211> 35
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
aagaaagctg ggtaggtgtc acgagcgtag agga 34
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 7
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 8
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 9
gagcagcact acttcaaga 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
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ccactcggag atgataatgt 20
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 11
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<211> 30
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<213> Artifical sequence
<400> 12
cgcctgcggg actccgatgc gagctgtaac 30
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 13
ggacctttat ggaaacattg tgctcagt 28
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 14
ccaagataga acctccaatc cagacac 27
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 15
cggcactgcc attctgtcc 19
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<212> DNA
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tgtcgacctt ggggaaggg 19
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<212> DNA
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<400> 17
ggcttcctca aggtcggcta tg 22
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<400> 18
gctgcatgtc atcccacttc ttc 23
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<212> DNA
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<400> 19
ggagcactct gagcagcact acttcaagag ttacgaccac catggcattc acgaggagat 60
gctgaaagac gaggttcgca cccgctctta catgaacgct attgttcaga acaagcacct 120
gttcaaggac aaggtcgtcc ttgacgttgg ctgcggcact gccattctgt ccatgttcgc 180
cgccaaggcc ggcgctaagc acgtcattgg tgttgacatg tcgaccatta ttcacaaggc 240
ccgcgagatc gttgaggtca acggcctctc tgacaagatt accctcatcc agggcaagat 300
ggaggaggtc cagctcccct tccccaaggt cgacattatc atctccgagt ggatgggcta 360
cttcctgctg tacgagagca tgctcgacac ggtcctctac gctcgtgaca cct 413
<210> 20
<211> 457
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 20
cgctcgtgac acctacctga acaaggacgg cctcatcttc cccgacaagg ccaccatttt 60
cgccgccggc atcgaggacg gcgagtacaa ggacgagaag attggcttct gggacaacgt 120
gtacggcttc aactactccc ccctcaaggc cacggcgctg tccgagcccc tcgtcgacac 180
ggtcgaggtc aaggccgtcg tgacggagcc cgtgcccatc ctgacactgg acctctacaa 240
gtgccaggtc tccgacctcg ccttcaacac gaccttcaag ctgcccgtgc gccgcgacga 300
ctttgtgcac gccgtcgtcg cctggttcga cattgacttc accgccgccc acaagcccat 360
ccgcttctcc acgggccccc acacaaaata cacccactgg aagcagaccg tcttctacct 420
caaggagatg ctcactgtcc agcacggcga ggagatt 457
Claims (8)
1.大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段在提高作物或蔬菜抗致病菌危害中的用途；所述大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.19所示或SEQ ID No.20所示；所述的致病菌是大丽轮枝菌；所述作物或蔬菜是大丽轮枝菌的寄主植物。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段的干扰载体；（2）将所构建的干扰载体转化到作物或蔬菜细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致疾病抗性提高的转基因作物或蔬菜。
3.按照权利要求2所述的用途，其特征在于，所述干扰载体是Gateway干扰载体。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的Gateway干扰载体的构建方法包括：将大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段***到Gateway干扰载体，即得。
5.按照权利要求4所述的用途，其特征在于，通过BP反应，将大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段连接至pDONR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2(I),0中得到Gateway干扰载体。
6.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的作物或蔬菜包括但不限于烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
7.一种培育抗病性转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建含有大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段的RNA干扰载体；（2）将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3）筛选获得对大丽轮枝菌所导致病害的抗性提高的转基因植物新品种；所述大丽轮枝菌蛋白精氨酸甲基转移酶1基因的靶标基因片段的核苷酸序列为SEQ ID No.19或SEQ ID No.20所示；所述植物为大丽轮枝菌的寄主植物。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体；所述大丽轮枝菌的寄主植物包括但不限于烟草、棉花、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
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