CN110862995A

CN110862995A - 一种抗大豆菌核病基因GmPR5、GmPR5转基因植株的构建与应用

Info

Publication number: CN110862995A
Application number: CN201911309597.7A
Authority: CN
Inventors: 赵雪; 姜海鹏; 韩英鹏; 战宇航; 李文滨; 李海燕; 滕卫丽
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN110862995B

Abstract

一种抗大豆菌核病基因GmPR5、GmPR5转基因植株的构建与应用，属于遗传育种技术领域。为了研究大豆抗菌核病机制，加快大豆抗菌核病育种进程，本发明提供了一种抗大豆菌核病基因GmPR5，所述抗大豆菌核病基因GmPR5核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；以及含有该基因的重组载体、重组菌；本发明在过量表达抗病基因GmPR5得到转基因大豆植株基础上，通过后代表型鉴定，确定了GmPR5能够参与到抗大豆菌核病反应中，为获得对菌核病完全抗性的大豆品种提供一种新思路，为进一步研究该基因的功能及抗病机理提供依据，为大豆抗菌核病分子设计育种提供有效的分子标记和基因资源。

Description

一种抗大豆菌核病基因GmPR5、GmPR5转基因植株的构建与应用

技术领域

本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及一种抗大豆菌核病基因GmPR5、GmPR5转基因植株的构建与应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国乃至世界的重要粮食作物，同时还是食用植物蛋白和食用油脂的重要来源之一。大豆菌核病是危害程度严重的高发性病害，是世界范围内致使大豆产量损失最严重的三大病害之一。大豆菌核病是由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的真菌性病害，直接影响大豆的品质及产量，病情严重时发病率高达50％～90％，甚至绝产。由于传统育种方法的局限性，因此利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要，这为选育抗病品种提高了效率和准确性，加快了选育抗病品种的进程。大豆抗菌核病机制复杂，存在大量位点及关键基因有待挖掘与利用。由于菌核病是由多基因控制的复杂数量性状，大豆基因组庞大且大豆存在的多倍体化现象及低转化率等问题，迄今为止，人们尚未在植物中挖掘到对抗菌核病起到主效作用的基因，但是对菌核病的抗性起相关作用的一些基因已经被报道，为研究抗菌核病的生理生化进程以及培育抗菌核病优良品种提供了分子方面的基础。Jiang等将益母草中的一个非特异的抗菌蛋白基因LJAMP2转化到油菜中，将该转基因油菜进行核盘菌接种，证明LJAMP2基因与核盘菌的抗性相关。Donaldson等(2001)将小麦Germin基因转化大豆，转基因大豆的茎和子叶对核盘菌的耐受性增强。Zhang等(2008)克隆了大豆Germin-like基因GmGLP10，发现过表达该基因的转基因烟草对核盘菌的抗性提高。Cunha(2010)等将桑金钱菌(Flammulina)中的草酸脱羧酶基因转化到大豆中，结果表明转基因大豆植株病斑扩展速度显著低于野生大豆病斑面积。Ranjan等(2017)研究发现对GmRBOH-VI组中的基因进行基因沉默，提高了大豆对核盘菌的抗性，同时降低了ROS水平。

目前有关PR5基因的报道较少，PR5的功能尚不清楚。

发明内容

为了研究大豆抗菌核病机制，加快大豆抗菌核病育种进程，本发明提供了一种抗大豆菌核病基因GmPR5，所述抗大豆菌核病基因GmPR5核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了扩增上述抗大豆菌核病基因GmPR5的引物，所述引物序列如SEQID No.2-SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了含有上述抗大豆菌核病基因GmPR5的重组载体。

本发明还提供了含有上述抗大豆菌核病基因GmPR5的重组菌。

本发明还提供了一种抗大豆菌核病的转基因植株的构建方法，步骤如下：

1)构建过表达上述抗大豆菌核病基因GmPR5的重组载体；

2)将所述重组载体转化到农杆菌，获得到重组菌；

3)然后将所述重组菌转化植物，得到抗大豆菌核病的转基因植株。

进一步地限定，步骤1)所述的重组载体构建所用的中间载体为pCambia3300。

进一步地限定，步骤2)所述的农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

进一步地限定，步骤3)所述的植物为大豆，优选为大豆品种Maple Arrow、合丰25或Williams 82。

本发明还提供了上述抗大豆菌核病基因GmPR5在抗菌核病作物育种中的应用。

有益效果

GmPR5是本发明新发现的具有抗大豆抗菌核病作用的基因，本研究在过量表达抗病基因GmPR5得到转基因大豆植株基础上，通过后代表型鉴定，确定了GmPR5能够参与到大豆抗菌核病反应中，为获得对菌核病完全抗性的大豆品种提供一种新思路，为进一步研究该基因的功能及抗病机理提供依据，为大豆抗菌核病分子设计育种提供有效的分子标记和基因资源。

附图说明

图1GmPR5基因的克隆，其中M：DL2000；1：PCR产物；2：水对照；

图2大豆GmPR5基因的组织/器官特异性表达，R-根；S-茎；L-叶；H-下胚轴；C-子叶；F-花；P-叶柄；S-种子；

图3接种核盘菌后24h内GmPR5相对表达量的变化，其中，MC：抗病品种“MapleArrow”对照；MT：抗病品种“Maple Arrow”处理；HC：感病品种“合丰25”对照；HT：感病品种“合丰25”处理；

图4接种核盘菌后24h内GmPR5相对表达量的增长幅度，其中MA：抗病品种“MapleArrow”；HF：感病品种“合丰25”，*：p<0.05,**:p<0.01；

图5不同激素处理条件下大豆叶片中GmPR5的表达量，A：水杨酸处理感病品种“合丰25”和水对照；B：过氧化氢处理感病品种“合丰25”和水对照；C：茉莉酸处理感病品种“合丰25”和水对照；D：乙烯处理感病品种“合丰25”和水对照；

图6不同胁迫处理条件下大豆叶片中GmPR5的表达量，A：水杨酸处理抗病品种“Maple Arrow”和水对照；B：茉莉酸处理抗病品种“Maple Arrow”和水对照；C：过氧化氢处理抗病品种“Maple Arrow”和水对照；D：乙烯处理抗病品种“Maple Arrow”和水对照；

图7植物表达载体转化大肠杆菌，其中M：DL2000；1-3：PCR产物；4:水对照；

图8重组载体转化根癌农杆菌，其中M：DL2000；1:水对照；2-6：PCR产物；

图9转基因大豆的PCR检测，其中M：DL2000；1-5：受体为“Maple Arrow”的GmPR5基因过表达植株；6-11：受体为“合丰25”的GmPR5基因过表达植株；12：阴性对照；13：水；14：阳性对照；

图10转基因大豆的PCR检测，其中M：DL2000；1：水；2-4：受体为“Maple Arrow”的GmPR5基因过表达植株；5-7：受体为“合丰25”的GmPR5基因过表达植株；

图11抗病品种“Maple Arrow”T₁代转GmPR5基因大豆植株的qRT-PCR检测，其中CK：抗病品种“Maple Arrow”；1-5：GmPR5基因过表达抗病品种T₁代植株；

图12感病品种合丰25T₁代转GmPR5基因大豆植株的qRT-PCR检测，其中CK：感病品种“合丰25”；1-5：GmPR5基因过表达感病品种T₁代植株；

图13T₁代转基因大豆植株Western blotting检测，其中M：marker10－170kd；1：阳性对照2-4；过表达GmPR5基因植株；5：非转基因植株；

图14T₁代转GmPR5基因的“合丰25”植株接种大豆菌核病后叶片的变化，其中a：‘合丰25’对照；b-c：过表达GmPR5基因的‘合丰25’植株；

图15T₁代转GmPR5基因“Maple Arrow”植株接种大豆菌核病后叶片的变化，其中a：“Maple Arrow”对照；b-c：过表达GmPR5基因的“Maple Arrow”植株；

图16T₁代转GmPR5基因的‘合丰25’植株接种大豆疫霉菌3d后叶片的变化，其中a：‘合丰25’对照；b-d：过表达GmPR5基因的‘合丰25’植株；

图17T₁代转GmPR5基因‘Maple Arrow’植株接种大豆疫霉菌3d后叶片的变化，其中，a：‘Maple Arrow’对照；b-d：过表达GmPR5基因的‘Maple Arrow’植株。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，YEP固体平板、MS0培养基等，如无特殊说明，均为常规试剂，或自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明所用的植物品种：加拿大引进的世界公认的耐菌核病品种‘Maple Arrow’(部分抗性品种)，感病品种‘合丰25’和Williams 82。

病原菌：核盘菌，采自黑龙江省大庆大豆菌核病发病地块，经实验室分离纯化、保存，该病原菌记载于赵雪等2014年发表的题为“大豆种质对菌核病的耐病性评价及资源筛选”的文献中(安徽农业科学,2014，v.42，No.449(16):5014-5017)。疫霉菌：记载于赵雪等2014年发表的题为“大豆种质资源耐疫霉根腐病优异等位变异挖掘”的文献中[J].大豆科学,2014,33(4):000488-491.

名词缩写解释如下：

Str：链霉素；Kan：卡那霉素；Rif：利福平；PPT：草铵膦；

SA：水杨酸；JA：茉莉酸；ET：乙烯。

本发明所涉及引物信息如下：

引物对1

1S:5’-GGATCCATGTATGAAAGTATTGAAAACTATCT-3’,

1A:5’-ACTAGTTCATTCGATATTGTTTGGTGTTCT-3’；

引物对2

2S:5’-AGAACAAAACAACTTGATGCCTATTAG-3',

2A:5’-CGCAACTTTCCCTTGAACACAT-3’；

引物对3

3S:5’-TTTGGCGATGAGACTGAGGAA-3',

3A:5’-TCCCATAACCAACAGGAACCAG-3’；

引物对4

4S:5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3’,

4A:5’-GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3’；

引物对5

5S:5’-CGGGGGACTCTTGACATGTATGAAAGTATTGAAAACT-3’,

5A:5’-GTCAGATCTACCATGCATTCGATATTGTTTGGTGTTC-3’；

引物对6

6S:5’-GCGGTACCGGCAGGCTGAAG-3',

6A:5’-CCGCAGGAACCGCAGGAGTG-3’；

引物对7

7S:5’-ATGCCATCATTGCGATAAAGG-3’,

7A:5’-TCCTTTTACTTGCCATCTCCAT-3’；

引物对8

8S:5’-GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3’,

8A:5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3’

实施例1.GmPR5基因的克隆。

1)以大豆抗菌核病品种‘Maple Arrow’为材料，待长出第一组三出复叶时，取材，提取总RNA并反转录合成cDNA第一链。

2)根据Phytozome上预测的GmPR5基因序列，利用Primer 5软件设计基因克隆引物(引物对1)，以cDNA为模板进行RT-PCR反应，反应体系如下，反应程序：94℃ 5min；37个循环：95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 80s；72℃ 10min。反应后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收纯化目的片段(图1)。

3)按照TIANGEN公司的PGM-T克隆试剂盒的步骤，将上述得到的胶回收产物与克隆载体进行连接，并转化Top10大肠感受态细胞，挑取单克隆并进行PCR及测序验证。最终得到目的片段大小为996bp的GmPR5基因。表明GmPR5基因与PGM-T载体连接并成功转化到大肠杆菌中，测序验证，确认了GmPR5基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2.GmPR5基因的表达模式分析。

1.病原菌，核盘菌，采自黑龙江省大庆大豆菌核病发病地块，经实验室分离纯化，接菌在PDA培养基上扩繁。

2.取材。

(1)播种“Maple Arrow”和William82(William82作为实验参考对照组)，在长至成熟的过程中分别取其对生和三出时期的根、茎、叶、下胚轴以及子叶、花、种子各三次重复。

(2)播种抗病品种“Maple Arrow”和感病品种“合丰25”于蛭石中，生长至真叶抽出，叶缘分离，至真叶完全展开，在下胚轴近地表1/3处割一条长约一厘米深约1毫米的伤口，将事先繁好的核盘菌(菌丝正处于生长期)切成10*10*5mm的菌块，菌丝正面对准下胚轴内侧，并用封口膜缠好下胚轴将菌块固定，将接菌后的“Maple Arrow”和“合丰25”分别放置0h、4h、8h、12h、24h进行下胚轴的定时取样，每个时间点各取三次重复。

(3)播种感病品种“合丰25”于蛭石中，生长至V2时期，进行50mmol/L的茉莉酸(JA)和0.5mmol/L的水杨酸(SA)、0.5mmol/L的乙烯(CT)、0.5mmol/L的过氧化氢(H₂O₂)处理，分别取处理0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h的大豆叶片，每个时间点三次重复。

3.cDNA合成。

提取步骤2中样本的总RNA(Trizol总RNA提取试剂，TIANGEN BIOTECH，DP405—02),并反转录合成cDNA第一链(ReverTra Ace qpcr RT Master Mix withgDNA remover，TOYOBO，FSQ-301)。

4.荧光定量PCR分析。

1)内参基因选取大豆管家基因GmActin 4(Genbank No：AF049106)，根据qRT-PCR方法设计候选基因GmPR5的定量引物(引物对2)，依照TIANGEN公司的荧光定量SYBR Green试剂盒的反应体系进行加样，使用罗氏LightCycler 480定量仪器，PCR反应条件：95℃5min；95℃10s，60℃20s，72℃32s，40个循环；95℃1min，65℃30s，97℃30s。

2)组织特异性表达分析

GmPR5基因在大豆的各组织器官均有表达，在下胚轴中表达量最高、其次是根和茎，在子叶和叶柄中表达最少，证明该基因可能参与了抗大豆菌核病反应(图2)。

3)核盘菌胁迫诱导表达分析

对大豆抗病品种“Maple Arrow”和感病品种“合丰25”的下胚轴进行核盘菌胁迫处理，通过qRT-PCR方法分析核盘菌胁迫处理及未经胁迫处理的抗病品种“Maple Arrow”和感病品种“合丰25”中GmPR5的表达情况，结果表明，经核盘菌处理的抗病品种和感病品种中GmPR5基因表达量较未处理的对照具有明显上升的趋势，表明该候选基因GmPR5对核盘菌胁迫有响应，其中处理后的抗病品种和感病品种的GmPR5基因表达量均在2h达到最大值；在接种后的各个时间点中抗病品种的GmPR5基因增幅明显高于感病品种“合丰25”，这表明该基因在抗病品种“Maple Arrow”与核盘菌互作更为强烈，可能是引起抗感病品种抗性差异的原因(图3、图4)。

4)激素胁迫诱导表达分析

SA、JA和ET是植物防御反应信号转导途径中重要的信号分子，而H₂O₂也作为信号分子参与调节植物对生物与非生物胁迫反应的响应。对大豆V2期感病品种“合丰25”进行SA、JA、ET、H₂O₂激素处理，分别提取处理0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h的大豆叶片RNA，通过qRT-PCR方法对GmPR5基因的相对表达量进行分析(图5、图6)，结果表明GmPR5基因在SA处理下表达量有明显变化，表达量先升后降，并在处理4h后达到最大值；GmPR5基因在JA、ET、H₂O₂处理下表达量没有明显变化；说明SA可快速激活“合丰25”中GmPR5基因的表达，JA、ET、H₂O₂对GmPR5基因的表达无影响。

GmPR5基因在SA处理下表达量有明显变化，表达量先升后降，同时也在处理4h后达到最大值；GmPR5基因在JA、ET、H₂O₂处理下表达量没有明显变化；此结果与感病品种‘合丰25’在激素处理下的结果一致，初步推断GmPR5基因可能在SA介导的抗病信号传导途径中起作用来参与植物抗病过程。

实施例3.GmPR5基因亚细胞定位分析

以pCambia1302为骨架载体，利用Clontech的In-Fusion无缝连接试剂盒(

HD Cloning Kit)，根据其提供的操作说明完成pCambia1302-GmPR5-GFP融合表达载体的构建，具体为：设计GmPR5基因的全长CDS引物，并在引物5’端添加15bp来自pCambia1302的NcoⅠ酶切位点侧翼序列作为修饰(引物对5)，以反应程序：98℃3min；38个循环：98℃10s，55℃10s，72℃5s；72℃10min。进行PCR反应，产物进行胶回收，pCambia1302质粒用Nco Ⅰ酶进行单酶切后胶回收，将胶回收产物与载体片段按照

HD CloningKit操作说明完成连接反应，转化大肠杆菌，最终挑取单斑PCR验证，获得的阳性单斑并提取阳性质粒，进行测序分析，并通过注射法顺势表达烟草表皮细胞，进行荧光检测，结果显示GmPR5基因主要定位于细胞膜和细胞质以及细胞骨架，并伴部分核定位。

实施例4.转GmPR5基因大豆植株的构建。

1)构建重组载体：将pCambia3300载体质粒和实施例1制备的pGM-T-GmPR5载体质粒分别用限制性内切酶BamH I和Spe I进行双酶切，酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化pCambia3300载体骨架以及GmPR5基因酶切片段，将纯化后的产物进行连接，得到含有GmPR5基因的重组载体pCambia3300-GmPR5。重组载体转化大肠杆菌后，挑单斑，进行PCR扩增鉴定，结果表明在996bp位置上有GmPR5基因目的条带，表明GmPR5基因与表达载体连接并成功转化到大肠杆菌中(图7)。

2)重组载体转化根癌农杆菌

将pCambia3300-GmPR5载体通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105中，转化后的菌液经PCR鉴定，获得长度为996bp的目标条带(图8)，证明pCambia3300-GmPR5已经成功转入到根癌农杆菌EHA105中。

3)根癌农杆菌介导法转化大豆：

a.通过根癌农杆菌介导的大豆茎尖转化法创制GmPR5基因过量表达材料，过表达转化受体为感病品种“合丰25”和部分抗性品种‘Maple Arrow’。

b.菌液制备：取制备好的菌液分别在YEP固体平板(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mL Rif)上划线28℃培养，挑取单菌落接种于YEP液体培养基(50mg/mL Str，50mg/mLKan，25mg/mL Rif)中，28℃ 200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的YEP液体培养基中震荡培养至OD600为0.6-0.8。

c.种子灭菌：选取饱满、无菌斑种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16h后置于超净工作台内吹走残留的氯气，大约30min左右，密封待用。

d.种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下种于MS₀培养基中，每瓶种10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗条件下萌发5-6天。

e.茎尖外植体的制备：种子萌发至子叶即将冲破种皮时，用镊子和解剖刀去掉种皮，将两半子叶中的一半切掉，用解剖刀轻轻刮掉子叶和生长点之间的腋芽，并在子叶节处轻轻划3-5道伤口，剩余的部分作为外植体用于侵染。

f.侵染与共培养：将制备好的外植体放入侵染液中进行抽真空处理，抽真空条件为0.6pa，10min。真空侵染后的外植体用灭菌蒸馏水清洗三次，用无菌纸将外植体表面的侵染液吸干，***MS₀培养基中共培养3天，观察复活情况，根据外植体返青的情况确定移栽时间。

实施例5.GmPR5基因过表达植株的鉴定表型分析。

1.GmPR5基因过表达植株的鉴定。

1)T₁代过表达植株的PCR检测

本发明实施例4通过根癌农杆菌介导的大豆茎尖转化法，将GmPR5基因过表达载体分别转入抗病品种‘Maple Arrow’和感病品种‘合丰25’中，各转化300、200个植株，将获得的植株提取DNA，用Bar(引物对6)引物进行PCR鉴定，共鉴定3次，都检测得到大小为996bp的目的片段的植株鉴定为阳性，最终得到阳性植株抗病品种“Maple Arrow”和感病品种“合丰25”各5个。将收获的T₀代鉴定为转基因植株播种，待T₁代植株第一组三出复叶完全展开时取植株叶片提取DNA，并用Bar引物(引物对7)PCR检测，并将转GmPR5基因大豆植株用于进一步筛选(图9、图10)。

2)T₁代过表达植株的qRT-PCR检测

根据GmPR5基因序列设计定量引物，利用qRT-PCR的方法分别对抗病品种“MapleArrow”和感病品种“合丰25”的T₁代(图11、图12)，结果检测到转GmPR5基因的大豆叶片中GmPR5基因的相对表达量高于对照品种，说明了转GmPR5基因对大豆菌核病产生了一定的抗病性。以超过对照2.5倍的相对表达量为基准，统计出抗病品种“Maple Arrow”T₁代转GmPR5基因大豆植株为3株；感病品种“合丰25”T₁代转GmPR5基因大豆植株为3株。

3)T₂代转基因植株Western Blot分析，将部分T2代植株取新鲜叶片提取大豆组织总蛋白，跑电泳将大小不同蛋白的蛋白分离并转移至PVDF膜上，经一抗二抗杂交显色，最终未检出Bar蛋白(图13)。

2.GmPR5基因过表达植株的表型鉴定。

1)T₁代转基因植株核盘菌接种表型分析。

当T₁代植株处于R3期时，进行转基因植株叶片进行接种实验，将培养4天的核盘菌，在其生长的固体培养基上取1cm直径琼脂块，接种于叶片上，结果发现，接菌后“MapleArrow”对照大豆叶片初期叶面产生暗褐色水渍状斑纹，后扩展为不规则状病斑，为典型的感菌核病症状。转GmPR5基因的“Maple Arrow”植株大豆叶片初期叶面产生不明显的水渍状病斑，后期病斑变为深褐色，最后叶片变黄，病斑扩展停止。“合丰25”对照大豆叶片初期产生较大的暗绿色水渍状斑纹，后期病斑扩展速度加快，最后几乎布满整个叶片。转GmPR5基因的“合丰25”植株大豆叶片初期叶面产生暗绿色水渍状病斑，后期病斑变为深褐色，外部有黄色晕圈，最后叶片变黄，湿度大时产生少量白色菌丝，随后病斑扩展停止。说明转GmPR5基因对大豆菌核病产生抗性(图14、图15)。

2)T₁代转基因植株疫霉菌接种表型分析。

T₁代转基因植株疫霉菌接种表型分析，取T₁代转基因植株R3时期的三出复叶进行疫霉菌离体接种实验，将培养4天的疫霉菌，在其生长的固体培养基上取1cm直径琼脂块，接种于叶片上，结果发现，接菌3天后“合丰25”对照植株叶片变黄，叶片接菌部位产生褐色水渍状斑纹，病斑中心为黄褐色，产生暗绿色水渍状斑纹，四周浅褐色，局部有黄色病斑，后期病斑颜色变黄，病斑扩展不明显；转GmPR5基因的“合丰25”植株叶片接菌部位产生暗绿色水渍状病斑局部变褐色，不明显的深绿色水渍状病斑，后期病斑颜色变淡，病斑扩展终止。这表明GmPR5基因参与了大豆对疫霉病的抗性反应(图16、图17)。

综上，本发明通过将获得的GmPR5在大豆中过量表达，证明该基因可显著提高受体大豆种质对核盘菌的抗性，且在SA介导的抗病信号传导途径中起作用，同时对大豆疫霉菌存在一定的抗性。为大豆抗菌核病分子设计育种提供有效的分子标记和基因资源。

核苷酸序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种抗大豆菌核病基因GmPR5、GmPR5转基因植株的构建与应用

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 996

<212> DNA

<213> GmPR5 CDS

<400> 1

atgtatgaaa gtattgaaaa ctatctagaa caaaacaact tgatgcctat tagatactca 60

tacaaggaaa ttaagaagat gggtgggggt ttcaaagaca agttgggcga aggaggatat 120

ggacatgtgt tcaagggaaa gttgcgtagt gggcctagtg tggcaattaa aatattgggt 180

aaattaaaag gtaatggaca agattttatc aatgaagttg caactattgg aagaatacat 240

catcaaaatg tagtacaatt aattggattt tgtgttgagg gatcaaaacg tgctttgctt 300

tgtgaattta tgcccagtgg atctctcgat aaatttattt tttctaaaga tggaagtaag 360

catttaagct atgacaaaat atataatata tcaattggag ttgctcgtgg gatttcttat 420

ctccaccatg ggtgtgagat gcagattttg cattttgata tcaagcccca caacatctta 480

ctagatgaaa attttatccc aaaaatctct gactttggat tggcaaagct atatccaata 540

gataatagca ttgtcacaat gactggagta agagggacaa ttgggtacat ggctccagaa 600

ttattttata aaaatattgg aggaatatcc tataaggctg atgtttatag ttttggaatg 660

cttttgatgg agatggcaag taaaaggaaa aacctaaatc cttatgcaga gcgttcaagc 720

caactatact atcctttttg gatttataat catcttgtag aagagaaaga tatagaaacg 780

aaagatgtca cagaggagga aaataaaata gcaaagaaga tgatcatagt tgcactatgg 840

tgcatacaat tgaaaccaaa tgatcgtcca tcgatgaaca aggtagtgga aatgcttgaa 900

ggagacattg agaacctaga aataccccca aagcctactc tatatccaca tgaaacgacg 960

ataagggatc aaagaacacc aaacaatatc gaatga 996

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 1S

<400> 2

ggatccatgt atgaaagtat tgaaaactat ct 32

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 1A

<400> 3

actagttcat tcgatattgt ttggtgttct 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 2S

<400> 4

agaacaaaac aacttgatgc ctattag 27

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 2A

<400> 5

cgcaactttc ccttgaacac at 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 3S

<400> 6

tttggcgatg agactgagga a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 3A

<400> 7

tcccataacc aacaggaacc ag 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 4S

<400> 8

gtgtcagcca tactgtcccc attt 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 4A

<400> 9

gtttcaagct cttgctcgta atca 24

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 5S

<400> 10

cgggggactc ttgacatgta tgaaagtatt gaaaact 37

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 5A

<400> 11

gtcagatcta ccatgcattc gatattgttt ggtgttc 37

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 6S

<400> 12

gcggtaccgg caggctgaag 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 6A

<400> 13

ccgcaggaac cgcaggagtg 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 7S

<400> 14

atgccatcat tgcgataaag g 21

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 7A

<400> 15

tccttttact tgccatctcc at 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 8S

<400> 16

gtttcaagct cttgctcgta atca 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 8A

<400> 17

gtgtcagcca tactgtcccc attt 24

Claims

1.一种抗大豆菌核病基因GmPR5，其特征在于，所述抗大豆菌核病基因GmPR5核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.扩增权利要求1所述的抗大豆菌核病基因GmPR5的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID No.2-SEQ ID No.3所示。

3.含有权利要求1所述的抗大豆菌核病基因GmPR5的重组载体。

4.含有权利要求1所述的抗大豆菌核病基因GmPR5的重组菌。

5.一种抗大豆菌核病的转基因植株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)构建过表达权利要求1所述的抗大豆菌核病基因GmPR5的重组载体；

2)将所述重组载体转化到农杆菌，获得到重组菌；

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述的重组载体构建所用的中间载体为pCambia3300。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述的农杆菌为根癌农杆菌EHA105。

8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述的植物为大豆。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述大豆，品种为MapleArrow、合丰25或Williams 82。

10.权利要求1所述的抗大豆菌核病基因GmPR5在抗菌核病作物育种中的应用。