CN116199652A - 一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法 - Google Patents
一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗5‑羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法，涉及一种最大程度保留5‑羟甲基糠醛结构的抗5‑羟甲基糠醛半抗原、抗5‑羟甲基糠醛完全抗原和抗体的制备方法，通过化学合成方法制得的5‑羟甲基糠醛的活化酯与载体蛋白钥孔戚血蓝蛋白相连接合成抗5‑羟甲基糠醛完全抗原，抗体是人工抗原经过动物免疫，细胞融合及筛选，腹水抗体制备，纯化腹水而制得，本发明是通过实验设计合成了最大限度保留5‑羟甲基糠醛结构的半抗原，并突出了其特异性结构，获得的单克隆抗体的特异性较强。
Description
技术领域
发明属于免疫化学技术领域，具体涉及一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法。
背景技术
5-羟甲基糠醛，为无色针状结晶，具有甘菊花味，是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一种含有呋喃环的小分子化合物，是中药材及中药复方中常见的成分之一，也广泛存在于葡萄干、乳制品、蜂蜜、蛋糕等食品中。研究表明，5-羟甲基糠醛对眼、黏膜、皮肤有刺激性，具有神经毒性、遗传毒性，在体内可经过代谢转化为5-亚磺酰甲基糠醛，具有较强致癌性和基因毒性，所以其是一种具有潜在安全隐患的药品内源性污染物。
对于葡萄糖注射液和葡萄糖氯化钠注射液，ChP、BP和USP均采用紫外分光光度法在284nm测定吸收度的方法控制产品中5-羟甲基糠醛量，浓度不同，吸收度的限度不同；随着检测技术的发展和药品质量要求的提高，采用高效液相色谱法等选择性更好、灵敏度更高的检测手段已经成为未来的趋势。
国外有些企业标准对用到葡萄糖等单糖的口服制剂也进行了5-羟甲基糠醛的限度控制，我国药典对蜂蜜及某些含蜂蜜制剂也进行5-羟甲基糠醛的限度控制。但仪器检测普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以发展一种简单、快速、灵敏的分析技术是十分必要的。而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为5-羟甲基糠醛残留研究提供了一条新的分析检测途径。
发明内容
发明的目的在于提供一种抗5-羟甲基糠醛半抗原、完全抗原和抗体及制备方法，以解决上述背景技术中提出现有的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗5-羟甲基糠醛半抗原的化学式如式Ⅰ，一种抗5-羟甲基糠醛半抗原为起始原料，其分子量为226；
式Ⅰ所示的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取5-羟甲基糠醛1260mg，丁二酸酐1200mg，用20mL吡啶溶解，置于60度条件下搅拌反应8小时；
(2)旋干吡啶后，加入20mL的稀盐酸，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相；
(3)用饱和食盐水洗涤2次，最后无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯即可获得如式Ⅰ的抗5-羟甲基糠醛半抗原。
一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原，化学式如式Ⅱ；
所述5-羟甲基糠醛完全抗原为抗5-羟甲基糠醛半抗原中羧基与载体蛋白中的氨基发生化学反应形成酰胺键连接的偶联物；
优选的，载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。
优选的，一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原分为免疫原和包被原；免疫原的获取包含以下步骤：
(1)取半抗原活化酯3mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；
(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到免疫原；
包被原的获取包含以下步骤：
(1)取半抗原活化酯12mg，加入到溶有100mgBSA的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；
(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到包被原。
优选的，半抗原活化酯合成包含以下步骤：
(1)在5mL的玻璃瓶中，取半抗原23mg，用0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成A液；
(2)分别称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐20mg，N-羟基丁二酰亚胺12mg，两者混合一起用0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成B液；
(3)冰浴条件下B液逐滴加入A液中，然后室温搅拌过夜，终止反应后即得半抗原活化酯；
一种抗5-羟甲基糠醛抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取8周龄左右的雌性Balb/C小鼠作为免疫动物进行免疫，分别将小鼠编号为1号、2号、3号、4号，免疫采取颈背部皮下多点注射法；
(2)免疫程序：是通过第2次免疫和第3次免疫后测定抗血清的效价和抑制率，具体为：1)初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，相同体积的免疫原和弗氏完全佐剂混合进行乳化，剂量为.1mg；2)加强免疫：初次免疫后第21天和42天进行加强免疫，剂量为0.1mg，乳化方法相同，以后每隔21天加强免疫一次，共免疫3次，从第2次加强免疫开始，每次免疫10天后对动物试采血进行血清效价测定和特异性测定；
(2)抗体制备：选取加强免疫后效价高且特异性强的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，7天后对培养的细胞进行筛选，找到达到要求的细胞孔，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，对其进行亚克隆，最终获得单一的细胞株，扩大培养；
(3)将扩大培养的杂交瘤细胞注入已提前注射石蜡的小鼠体内，7天左右，抽取小鼠腹腔积液，对其进行蛋白提纯既可获得想要的目标抗体。
血清效价检测方法包含以下步骤：
(1)将制备好的5-羟甲基糠醛包被原溶于pH9.6 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液中，将5-羟甲基糠醛包被原稀释为1.0μg/mL作为包被液，96孔微孔板每孔各加入100μL，4℃放置过夜或者37℃恒温温育2～3小时，用PBST即磷酸盐缓冲液0.05％(V/V)，Tween20洗液洗涤1次；
(2)每孔加入200μL1％牛血清蛋白(BSA)/PBS封闭液，封闭2小时，用洗液洗涤1次；
(3)加抗血清及标准品：将抗血清梯度稀释；将5-羟甲基糠醛标准品溶于适量DMF配制成1.0mg/mL的标准品溶液，4℃保存备用。效价列：每孔加50uL的空白稀释液和50uL梯度稀释的抗血清，最后两孔加一抗稀释液作空白对照；抑制列：每孔加50uL的标准品溶液和50uL梯度稀释的抗血清，最后两孔加标准品稀释液作空白对照，37℃温育30min；
(4)用洗液洗微孔板2次，将孔内液体甩掉，微孔板脱水仪甩干，向每微孔加100微升羊抗鼠酶标二抗，37℃反应30分钟；
(5)用洗液洗微孔板3次，将孔内液体甩掉，微孔板脱水仪甩干，加入底物A和底物B的混合液，该底物A和底物B的混合液的配比为100：1，室温下反应0.25小时；
(6)读数测定：450nm波长下测吸光值；选择吸光度值在1.5～2.0区间内的抗血清稀释倍数为抗血清效价，抗血清的效果由其抑制率得出。
与现有技术相比，发明的有益效果是：
(1)本发明是通过实验设计合成了最大限度保留5-羟甲基糠醛结构的半抗原，并突出了其特异性结构，获得的单克隆抗体的特异性较强。
附图说明
图1为抗5-羟甲基糠醛完全抗原合成路线图
具体实施方式
下面将结合图1和表1说明本发明实施例，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于发明保护的范围。
实施例1：5-羟甲基糠醛半抗原制备
(1)取5-羟甲基糠醛1260mg，丁二酸酐1200mg，用20mL吡啶溶解，置于60度条件下搅拌反应8小时；
(2)旋干吡啶后，加入20mL的稀盐酸，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相；
(3)用饱和食盐水洗涤2次，最后无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯即可获得如式Ⅰ的抗5-羟甲基糠醛半抗原。
实施例2：免疫原和包被原的制备
免疫原的制备包括以下：
(1)取半抗原活化酯3mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；
(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到免疫原；
包被原的获取包含以下步骤：
(1)取半抗原活化酯12mg，加入到溶有100mgBSA的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；
(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到包被原。
实施例3：半抗原活化酯制备
(1)在5mL的玻璃瓶中，取半抗原23mg，用0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成A液；
(2)分别称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐20mg，N-羟基丁二酰亚胺12mg，两者混合一起用0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成B液；
(3)冰浴条件下B液逐滴加入A液中，然后室温搅拌过夜，终止反应后即得半抗原活化酯；
实施例4：5-羟甲基糠醛完全抗原的鉴定
按合成5-羟甲基糠醛免疫完全抗原反应所用的载体蛋白与偶联产物的比例，进行200nm～400nm的紫外线扫描测定，在同样的蛋白浓度扫描下，偶联物，在279nm处的吸收峰明显高于载体蛋白的吸收峰，表明5-羟甲基糠醛免疫完全抗原合成成功。
实施例5：一种抗5-羟甲基糠醛抗体的制备：
(1)选取8周龄左右的雌性Balb/C小鼠作为免疫动物进行免疫，分别将小鼠编号为1号、2号、3号、4号，免疫采取颈背部皮下多点注射法；
(2)免疫程序：是通过第2次免疫和第3次免疫后测定抗血清的效价和抑制率，具体为：1)初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，相同体积的免疫原和弗氏完全佐剂混合进行乳化，剂量为.1mg；2)加强免疫：初次免疫后第21天和42天进行加强免疫，剂量为0.1mg，乳化方法相同，以后每隔21天加强免疫一次，共免疫3次，从第2次加强免疫开始，每次免疫10天后对动物试采血进行血清效价测定和特异性测定；
(3)抗体制备：选取加强免疫后效价高且特异性强的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，7天后对培养的细胞进行筛选，找到达到要求的细胞孔，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，对其进行亚克隆，最终获得单一的细胞株，扩大培养；
(5)将扩大培养的杂交瘤细胞注入已提前注射石蜡的小鼠体内，7天左右，抽取小鼠腹腔积液，对其进行蛋白提纯既可获得想要的目标抗体。
实施例6：抗血清的效价和特异性测定
从第3次加强免疫开始，每次免疫后的第10天，小鼠尾部采血30uL，离心取抗血清，-20℃保存备用；
通过间接酶联免疫法测定抗血清的效价和特异性，具体包含以下步骤：
(1)包被：将5mg/mL的包被抗原用包被缓冲液稀释5000倍，并做空白对照组，100uL/孔加入到酶标板中，置于4℃冰箱孵育过夜，然后用PBST即磷酸盐缓冲液0.05％(V/V)，Tween20洗液洗涤1次；
(2)封闭：倾去孔内液体，洗板1次，每孔加洗涤液200μL，甩干每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，甩干，置于4℃冰箱中备用；
(3)加样：每孔加入50μL稀释一定倍数的抗体和50μL药物稀释液；震荡混匀，37℃反应30min后，洗板机洗板2次，每孔加入洗涤液200μL，甩干；
(4)加入二抗：每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠IgG，37℃烘箱中反应30min，洗板3次，甩干；
(5)显色：每孔加入显色液100μL，置于37℃烘箱中显色10min后，每孔加入50μL终止液(1moL/L的H2SO4)；
(6)测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值，读数测定：450nm波长下测吸光值；选择吸光度值在1.5～2.0区间内的抗血清稀释倍数为抗血清效价，抗血清的效果由其抑制率得出。
实施例7：抗血清的效价和特异性测定
通过间接竞争酶联免疫(icELISA)反应实现，具体为：
(1)包被：用包被液将包被原稀释至合适浓度，加入酶标板孔中，100μL/孔，4℃冰箱中过夜；
(2)封闭：倾去孔内液体，洗板1次，每孔加洗涤液200μL，甩干每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h，甩干，置于4℃冰箱中备用；
(3)加样：每孔加入50μL稀释一定倍数的抗体和50μL药物稀释液；震荡混匀，37℃反应30min后，洗板机洗板2次，每孔加入洗涤液200μL，甩干；
(4)加入二抗：每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠IgG，37℃烘箱中反应30min，洗板3次，甩干；
(5)显色：每孔加入显色液100μL，置于37℃烘箱中显色10min后，每孔加入50μL终止液(1moL/L的H2SO4)；
(6)测定：用酶联免疫检测仪测定各孔A450nm的吸光值；
(7)计算：用graphpadprism7.0拟合模块计算抑制曲线的IC50值；
(8)配制400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL的5-羟甲基糠醛标准品溶液，建立间接酶联免疫检测方法的标准曲线，条件优化后该方法针对5-羟甲基糠醛的IC50＝102ng/mL，线性检测范围为25～400ng/mL。
实施例8：细胞融合和阳性杂交瘤的筛选
(1)复苏骨髓瘤细胞：将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解冻，融化后1000r/min离心5min，在超净工作台中倒掉上清液，并在细胞沉淀中加入完全培养液约1mL，吹散细胞，用移液枪取出和完全培养基混均后放入25cm2培养瓶中，并扩大至4～6瓶，其间需多次换液，当每个培养瓶的细胞铺满底部时，可用于细胞融合。
(2)饲养细胞制备：在细胞融合前1天对Balb/C小鼠脱颈椎处死，经75％酒精浸泡5min后移入超净工作台进行解剖。剪开腹部，剥离腹部皮肤，剪开腹膜，取出脾脏，移入9cm培养皿，加入DMEM基础培养基，用注射器反复抽吸冲洗，冲洗液转入50mL离心管，1200r/min离心5min，弃上清液，底部细胞沉淀用完全培养基重悬后加入96孔细胞培养板，每孔100uL。
(3)脾细胞制备：将已多次免疫并检血合格的Balb/c小鼠眼眶放血，收集血清，然后在75％酒精浸泡5min消毒，移入超净工作台进行解剖。无菌取出脾脏，用DMEM基础培养基冲洗后置于培养皿中待用。用一次性注射器吸取培养基，左手用镊子夹住取下的脾脏，右手将注射器***脾脏，缓慢注入培养基，以将脾脏里的细胞洗出。反复进行直至脾脏由深红色转为无色透明状，弃脾脏。将混合的培养基收集到50mL离心管中，封口后离心，转速1200r/min共6min。离心后弃去上清液，待用。
(4)细胞融合：将离心去上清液的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞按1:6左右混合于离心管内，加入25mL的基础培养基，封口后离心，转速1500r/min共8min。离心后弃上清待用。将经离心混合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞弃上清，离心管口朝下用枪吸掉的多余的培养基。将沉淀的细胞用手指弹松，把离心管置于37℃温水中，用枪头吸取预热至37℃的PEG1mL，在1min内将PEG缓慢加入到沉淀的细胞中，每加一滴PEG就用枪头轻柔搅拌一下以混均，静置1min，预热好完全培养基，在2min内加入10mL，伴随轻轻搅拌，沿壁加入，使PEG分开。离心管封口1000r/min离心10min，倒掉上清，加入HAT完全培养基，用弯头吸管轻轻吸液放液，轻柔搅拌，均匀加入到前一天准备的10块含有饲养细胞的96孔培养板里。保持每孔中添加饲养细胞的HAT培养基和含有融合细胞的HAT培养基体积相同。
(5)阳性杂交瘤的筛选：融合后3～4天内使用HAT培养基换液一次，7天后抽取多孔培养板中里的上清，用间接ELISA检测培养液中的特异性抗体，选择效价高和对药物抑制强的阳性杂交瘤细胞，筛选出融合效果最好的阳性孔，做好标记。无菌条件下，用显微镜挑取阳性孔中团簇生长的细胞，移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成96孔，待细胞贴壁长满1/4孔底后，取上清液，icELISA检测，同样以效价和抑制率做为衡量指标，取呈阳性强者利用有限稀释法进行亚克隆，如此反复3～4轮(注意每轮挑出的阳性孔细胞需扩大培养，后冻存备用)，直至每板每个孔都为阳性且经检测效价和抑制相近，至此杂交瘤细胞系建立成功，得到能稳定分泌均一抗体的杂交瘤细胞系。挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或细胞培养皿中扩大培养，及时冻存。
实施例9：单克隆抗体的大量制备
在获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆后，通常以体外培养法和动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单克隆抗体。常规的做法是：提前在十多只8周龄以上的Balb/c小鼠的腹腔内注射液体石碏，剂量为0.5mL/只，1～2两周后在小鼠的腹腔注射杂交瘤细胞。接种细胞后每天观察小鼠状态，特别是从第七天开始，小鼠的腹腔会胀大，在小鼠死亡前用一次性注射器无菌采取腹水，将采集的腹水12000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白，收集中间层，用icELISA法测定其效价和抑制率，纯化后在-20℃保存备用。
按实施例7中所得最佳包被抗原浓度和最佳抗血清稀释倍数，以5-羟甲基糠醛、糠酸、糠醇、5-羟甲基-2-糠酸、2,5-呋喃二甲酸等为竞争标准品，进行间接竞争ELISA实验，检测5-羟甲基糠醛单克隆抗体的特异性，其半数抑制浓度(IC50)和交叉反应率(CR)数值在表1中列出。
表1
| 药物 | IC50(ng/mL) | 交叉反应率(％) |
| 5-羟甲基糠醛 | 207 | 100 |
| 5-羟甲基-2-糠酸 | >30000 | <1 |
| 2,5-呋喃二甲酸 | >30000 | <1 |
| 糠醇 | >30000 | <1 |
| 糠酸 | >30000 | <1 |
实验结果表明，5-羟甲基糠醛单克隆抗体与结构类似物几乎无交叉反应。说明本发明的5-羟甲基糠醛单克隆抗体特异性还是比较强的，建立的间接酶联免疫检测方法可以用于食品或药品中5-羟甲基糠醛的限量检测。
尽管已经示出和描述了发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，发明的范围由所附权利要求及其等同物限。
Claims (5)
1.一种抗5-羟甲基糠醛半抗原，其特征在于：所述抗5-羟甲基糠醛半抗原的化学式如式Ⅰ；
式Ⅰ所示的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取5-羟甲基糠醛1260mg，丁二酸酐1200mg，用20mL吡啶溶解，置于60度条件下搅拌反应8小时；
(2)旋干吡啶后，加入20mL的稀盐酸，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相；
(3)用饱和食盐水洗涤2次，最后无水硫酸钠干燥，旋干乙酸乙酯即可获得如式Ⅰ所述抗5-羟甲基糠醛半抗原。
2.一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原，其特征在于：所述5-羟甲基糠醛完全抗原化学式如式Ⅱ；
所述5-羟甲基糠醛完全抗原为抗5-羟甲基糠醛半抗原中羧基与载体蛋白中的氨基发生化学反应形成酰胺键连接的偶联物。
3.根据权利要求2所述的一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原，其特征在于，所述的一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原分为免疫原和包被原；所述免疫原的获取包含以下步骤：
(1)取半抗原活化酯3mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；
(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到免疫原；
所述包被原的获取包含以下步骤：
(1)取半抗原活化酯12mg，加入到溶有100mgBSA的PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，与4度条件下反应过夜；
(2)然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS溶液充分透析，得到包被原。
5.根据权利要求2所述的一种抗5-羟甲基糠醛完全抗原，其特征在于，所述半抗原活化酯保护以下步骤：
(1)在5mL的玻璃瓶中，取半抗原23mg，用0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成A液；
(2)分别称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐20mg，N-羟基丁二酰亚胺12mg，两者混合一起用0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解配制成B液；
(3)冰浴条件下B液逐滴加入A液中，然后室温搅拌过夜，终止反应后即得半抗原活化酯；
一种抗5-羟甲基糠醛抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取适龄雌性Balb/C小鼠进行免疫，第2次免疫和第3次免疫后测定抗血清的效价和抑制率，在细胞融合前3天加强免疫；
(2)取加强免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩大培养；
(3)将扩大培养的杂交瘤细胞注入已提前注射石蜡的小鼠体内，收集腹水，得到单克隆抗体。
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|---|---|---|---|---|
| CN116947632A (zh) * | 2023-06-09 | 2023-10-27 | 深圳市绿诗源生物技术有限公司 | 一种新型邻苯二甲酸酯类半抗原的制备方法及应用 |
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2022
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