CN116042915B - 一种氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化石墨烯‑多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法，属于微生物分子诊断领域。本发明提供了一种具有特定sp2和sp3杂化比例的氧化石墨烯，以及该氧化石墨烯与目标基因检测正向引物的复合体。利用该复合体进行多重qPCR检测，能够在兼具优异特异性的同时显著提升检测灵敏度，可以实现对新型冠状病毒的快速、灵敏、准确检测，具有推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物分子诊断领域，具体涉及一种氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法。
背景技术
新型冠状病毒主要通过呼吸道传播，在人群中极易传播，容易造成聚集性感染，因此检测新冠病毒尤为重要。目前，反转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)被认为是新型冠状病毒检测的金标准。然而，传统的RT-qPCR不能充分满足筛查新型冠状病毒感染的临床需求，并增加了新型冠状病毒二次传播的潜在风险。多重qPCR可同时检测不同的目标基因，但由于***的复杂性和不同扩增反应之间可能存在的干扰，其在临床诊断中的应用较少。因此，需要一种新型的或改进的、高灵敏度的多重qPCR***来提高新型冠状病毒检测的准确性。
GO是石墨烯的氧化衍生物，具有六角形蜂窝结构的sp2区域和与含氧官能团相连的sp3碳基区。sp2区域使GO对芳香族具有亲和力，并具有荧光淬灭能力。此外，连接到sp3区域的亲水基团使GO在水溶液中稳定。GO通过π-π堆叠和氢键来吸附ssDNA。基于这一特性，有研究表明GO-qPCR在疾病诊断中具有良好的检测性能；另外，目前也有利用GO提高多重PCR反应灵敏度和特异性的报道，例如公开号为CN105603055A的中国专利申请，在多重PCR反应体系中直接添加GO，提高了目标产物的特异性和产量，有助于抑制非特异性扩增，但其所用的GO的自身性能特点未知。
然而，对于多重qPCR检测而言，体系组成比多重PCR更为复杂，影响因素众多，特别是GO自身的性能、制备工艺及其在反应体系中的用量等参数会对多重qPCR检测效果带来何种影响难以预料，如何更显著地提升多重qPCR检测的灵敏度和特异性，提高对新型冠状病毒检测的准确性，仍需要进一步探索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度很高的氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的试剂盒和方法。
本发明提供了一种氧化石墨烯，所述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:(0.5～1.5)。
进一步地，上述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:1。
进一步地，上述氧化石墨烯是嵌锰石墨溶液与双氧水反应制备而成，所述嵌锰石墨溶液和双氧水的体积比为5:(1～5)，优选为5:2.5；
所述嵌锰石墨溶液按照如下方法制备而成：
(1)石墨粉、硝酸钾加入浓硫酸混匀得到体系A；高锰酸钾、硝酸钾和浓硫酸混匀得到体系B；
(2)将体系B分次加入体系A中，混匀后密封，自然沉降20～40天后再搅拌均匀。
本发明还提供了一种氧化石墨烯-引物复合体，它是上述的氧化石墨烯与基因引物复合而成，所述基因引物是新型冠状病毒特异性靶基因的引物。
进一步地，上述基因引物是新型冠状病毒RdRP基因和/或E基因的正向引物；优选地，所述RdRP基因正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；所述E基因正向引物序列如SEQ IDNO.4所示。
进一步地，上述复合体是氧化石墨烯溶液与基因引物混合后50℃孵育25～35分钟，再超声25～35分钟制备而成；所述氧化石墨烯溶液浓度为5.21～23.46μg/mL，优选为10.11～13.44μg/mL，更优选为13.44μg/mL。
本发明还提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括上述的氧化石墨烯-引物复合体。
进一步地，上述氧化石墨烯-引物复合体是氧化石墨烯分别与新型冠状病毒RdRP基因和E基因的正向引物复合而成的复合体；所述试剂盒还包括新型冠状病毒RdRP基因和E基因的反向引物；所述RdRP基因反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述E基因反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；
优选的，所述试剂盒还包括新型冠状病毒RdRP基因和E基因的检测探针，所述RdRP基因的检测探针序列如SEQ ID NO.3所示，所述E基因的检测探针序列如SEQ ID NO.6所示；所述检测探针修饰有荧光报告基团和荧光淬灭基团；
更优选地，所述试剂盒还包括内参基因的正向引物、反向引物和检测探针；所述检测探针修饰有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述内参基因优选为RNase P基因，所述RNase P基因的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，上述试剂盒还包括探针预混液、无酶水。
本发明还提供一种检测新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：
(1)上述试剂盒的组分与待测样本混匀，孵育；
(2)检测扩增产物；所述检测是琼脂糖凝胶电泳、荧光检测或胶体金试纸条检测；
优选地，所述试剂盒包括型冠状病毒RdRP基因、E基因和RNase P基因的检测探针；所述检测扩增产物是荧光检测，更优选为实时荧光PCR检测。
本发明的有益效果：本发明采用改良的Hummers方法调节GO氧化程度制备得到具有适当的sp2和sp3比例的GO，用其吸附目标基因的正向引物构建GO-正向引物复合体，应用于多重qPCR检测新型冠状病毒的反应体系中，与其他sp2和sp3比例的GO-正向引物复合体建立的多重qPCR检测新型冠状病毒的反应体系相比，检测灵敏度显著提升；同时，还兼具优异的特异性，可以实现对新型冠状病毒的快速、灵敏、准确检测，具有推广应用价值。
本发明术语“浓硫酸”是指浓度大于或等于70％的硫酸溶液，最常用浓硫酸的浓度为98％。
“新型冠状病毒”指SARS-Cov-2。
本发明“RdRP基因”是：The RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)gene；基因ID:30897989。
“E基因”是Envelope(E)coding gene；基因ID:43740570。
“RNase P基因”是：The human ribonuclease P gene；基因ID:10556。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明氧化石墨烯的表征结果。
图2为氧化石墨烯制备工艺、氧化石墨烯-正向引物复合体制备工艺的筛选结果(Control是传统多重qPCR检测，即正向引物没有石墨烯修饰的qPCR检测)。
图3为不同病毒使用本发明方法进行多重qPCR检测结果。
图4为本发明方法与传统多重qPCR方法检测结果比较(Control是传统多重qPCR检测，即正向引物没有石墨烯修饰的qPCR检测)。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明涉及的引物、探针序列如下(请提供引物和探针的序列)：
RdRP基因正向引物序列(SEQ ID NO.1)：GTGARATGGTCATGTGTGGCGG
RdRP基因反向引物序列(SEQ ID NO.2)：CARATGTTAAASACACTATTAGCATA
RdRP基因检测探针序列(SEQ ID NO.3)：CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC
E基因正向引物序列(SEQ ID NO.4)：ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT
E基因反向引物序列(SEQ ID NO.5)：ATATTGCAGCAGTACGCACACA E基因检测探针序列(SEQ ID NO.6)：ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG
RNase P基因正向引物序列(SEQ ID NO.7)：AGATTTGGACCTGCGAGCG
RNase P基因反向引物序列(SEQ ID NO.8)：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
RNase P基因检测探针序列(SEQ ID NO.9)：TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG
其中，基因检测探针序列进行如下修饰：
RdRP基因检测探针序列标记：5’端修饰荧光报告基团JOE，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ-1；
E基因检测探针序列标记：5’端修饰荧光报告基团ROX，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ-2；
RNase P基因检测探针序列标记：5’端修饰荧光报告基团HEX，3’端修饰荧光淬灭基团BHQ-1。
实施例1、本发明氧化石墨烯的制备
(1)在室温下，将0.5g石墨粉、0.5g KNO3和23ml浓H2SO4加入烧杯1中。
(2)在室温下，将6g KMnO4、1g KNO3和46ml浓H2SO4加入烧杯2中。
(3)将烧杯1和烧杯2分别放在磁力搅拌器上，同时同转速充分搅拌1.5小时。
(4)将烧杯2中的混合液每隔20分钟取4ml加入烧杯1中，直至烧杯2中的混合液全部加入到烧杯1中。
(5)烧杯1中的混合液搅拌过夜后，装入蓝口瓶密封保存，自然沉降1个月后得到嵌锰石墨。
(6)沉降后将嵌锰石墨混合均匀后再取5ml加入烧杯中，再加入15ml去离子水搅拌20分钟。
(7)向烧杯中加入2.5ml H2O2并立即停止搅拌。
(8)将上述溶液置于3500Da透析袋内，再将透析袋置于的去离子水中透析；至透析袋内溶液pH为7.0，收集透析袋内产物，即得氧化石墨烯溶液。
实施例2、本发明氧化石墨烯-正向引物复合体构建
(1)将实施例1得到的氧化石墨烯溶液稀释到13.44μg/mL，超声20分钟使其分散均匀。
(2)将氧化石墨烯溶液与RdRP基因、E基因和RNase P基因)的正向引物分别按照1：1的比例混合。
(3)将(2)中的混合液置于50℃恒温加热器中孵育30分钟后再超声20分钟。
(4)将(3)中的混合液置于离心机中离心1小时，转速设置为15000rpm。
(5)离心后，去除(4)中混合液的上层溶液，即可分别得到氧化石墨烯-RdRP基因正向引物复合体、氧化石墨烯-E基因正向引物复合体、氧化石墨烯-RNase P基因正向引物复合体。
实施例3、本发明氧化石墨烯-多重qPCR检测方法
(1)氧化石墨烯-多重qPCR体系：每个反应总体积为25μL，包括：12.5μL探针预混液，探针预混液为购买的市售的产品(II Probe qPCR SuperMix，北京全式金生物技术股份有限公司)、RdRP基因、E基因和RNase P基因的反向引物(10μM)各0.5μL、RdRP基因、E基因和RNase P基因的探针(10μM)各0.5μL、RdRP基因、E基因和RNase P基因的氧化石墨烯-正向引物复合体各1μL(复合体中对应的引物浓度为5μM)、3.5μL无酶水以及1μL各DNA标准对照模板。待测样品加入量为1μL。RNase P基因为内参基因。
(2)上述体系混匀，上述体系混匀后，在qTOWER 2.2荧光定量梯度热循环仪(Analytik Jena AG,Jena,Germany)上进行实时荧光检测。其反应程序分为两步：第一步：94℃30秒；第二步：94℃5秒；60℃30秒(荧光信号采集)(×40个循环)。
对比例1、氧化石墨烯的制备
按照实施例1的方案，将H2O2的用量调整为10mL，其余条件不变，制备得到氧化石墨烯。
对比例2、氧化石墨烯-正向引物复合体构建
使用对比例1制备的氧化石墨烯，按照实施例2的方案，制备得到RdRP基因、E基因和RNase P基因的氧化石墨烯-正向引物复合体。
对比例3、氧化石墨烯-多重qPCR检测
使用对比例2制备的氧化石墨烯-正向引物复合体，参照实施例3的方案，进行多重qPCR检测。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、氧化石墨烯的表征
检测对象：实施例1和对比例1制备得到的氧化石墨烯。
用TEM直接观察被无序区域包围的sp2晶格区域，从而揭示了GO在2.5mL和10mLH2O2中的结构形式(图1a和图1b)。在2.5mL H2O2中制备的GO含有丰富且均匀的sp2晶格。然而，在10mL H2O2中制备的GO有许多无序的区域，只有少数典型的sp2晶格。
AFM成像确定了GO片的尺寸，并比较了两种类型的GO的比表面积。图1c和1d显示了通过AFM成像可视化的GO样品的形态。在2.5mL的H2O2中，GO的平均横向尺寸大约为2μm。将H2O2的体积增加到10mL后，GO的横向尺寸就会减少。
因此，TEM和AFM的结果证实，2.5mL的H2O2可以合成具有最佳sp2-sp3比例和大比表面积的GO。
在GO的拉曼光谱中表现出两个突出的波段，1374cm-1和1598cm-1，分别对应于D(sp3杂化C)和G(sp2杂化C)波段(图1e)。D带和G带的强度比(ID/IG)被用来描述石墨烯的无序程度。在2.5mL和10mL H2O2中计算出的GO的ID/IG比值分别为2.63和8.28。为了进一步探索GO表面的基团，我们进行了FT-IR研究，结果如图1f所示。在2.5mL H2O2中的GO光谱显示了3419、1734、1626、1279和1052cm-1的特征吸收带，分别由O-H拉伸振动、C＝O拉伸振动、C＝C拉伸振动、环氧树脂C-O-C弯曲振动和C-O拉伸振动引起。值得注意的是，将H2O2的体积增加到10毫升，会导致1734厘米-1(C＝O)的峰值消失，这是由于环氧官能团被多余的H2O2破坏。因此，我们用拉曼和FT-IR分析了H2O2体积对GO合成的影响。过量的H2O2破坏了环氧官能团，因此，减少了比表面积，增加了无序区比例。
随后，用2.5mL H2O2合成的GO被进一步用XPS和UV-Vis分析。通过XPS描述了GO表面的化学成分和各元素的原子比。因此，每个官能团的解卷C1s峰为C＝C(284.6eV)、C-C(285.7eV)、C-O(287.0eV)、C＝O(288.0eV)和O-C＝O(289.0eV)(图1g)。碳和氧的含量为63.36和33.57％，碳氧比为1.89。GO的紫外-可见光谱显示，GO在230nm表现出C＝C的π-π*转变和295nm C＝O的n-π*转变的特征吸收峰(图1h)。
进一步根据XPS测试结果对应的不同官能团的峰面积，确定sp2-sp3的比例约为1:1，如表1所示：
表1：sp2-sp3的峰面积和比率
上述结果表明，本发明成功地合成了具有大比表面积和适当(约为1:1)sp2-sp3比例的水溶性GO。
实验例2、本发明氧化石墨烯的氧化程度、溶液浓度和复合体制备温度筛选优化
(1)氧化石墨烯的氧化程度筛选
实施例3和对比例3的体系实时荧光检测结果如图2a所示。可以看出，以本发明实施例1的工艺制备的GO修饰后的各基因正向引物，进行多重qPCR检测的Ct值显著低于对比例1的GO修饰产物，检测灵敏度明显更高。
(2)氧化石墨烯溶液浓度筛选
调整将实施例2步骤(1)中的GO溶液的稀释倍数，分别稀释至浓度为5.21μg/mL、7.45μg/mL、10.11μg/mL、13.44μg/mL(实施例2)、15.58μg/mL、19.12μg/mL、21.75μg/mL以及23.46μg/mL。按照与实施例2同样的方法构建氧化石墨烯-正向引物复合体。并按照实施例3的方法进行多重qPCR检测。
结果如图2b所示，可以看出，浓度为10.11～13.44μg/mL的石墨烯溶液制备的复合体，进行多重qPCR检测的Ct值显著更低，灵敏度显著更高。
(3)复合体制备温度筛选
调整实施例2步骤(3)中氧化石墨烯和正向引物的孵育温度，分别为：35℃、50℃(实施例2)、65℃以及80℃，分别构建出4组氧化石墨烯-正向引物复合体，并按照实施例3的方法进行多重qPCR检测。
结果如图2c所示，可以看出，赋予温度为50℃时，能够显著降低Ct值，提升灵敏度。
实验例3、本发明氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒的性能评估
(1)特异性评估
使用九种常见的呼吸道病毒，包括两种RNA病毒和七种DNA病毒，评估了GO-多重qPCR的特异性。两种RNA病毒(冠状病毒HKU1和副流感病毒)和七种DNA病毒(肠道病毒、腺病毒、鼻病毒、人类巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、腮腺炎病毒和麻疹病毒)。使用GO-多重qPCR和传统多重qPCR同时检测新型冠状病毒和这9种病毒。结果见图3，除新型冠状病毒的特异性基因RdRP基因和E基因外，其余病毒均无扩增曲线，表明该方法特异性良好。
(2)灵敏度评估
使用含有RdRP、E和RNase P目标序列的三个质粒来确定GO-multiplex qPCR方法的灵敏度。每个质粒模板从107到101拷贝/μL进行了连续稀释。因此，使用两种方法同时测试每种质粒浓度，以比较本发明氧化石墨烯-多重qPCR检测新型冠状病毒和常规多重qPCR检测新型冠状病毒的敏感性。结果见图4，本发明氧化石墨烯-多重qPCR对新冠病毒的检测限为10拷贝/反应，相较于常规多重qPCR提高了10倍。
因此，本发明方法对新型冠状病毒具有很高的检测灵敏度和特异性。
综上，本发明采用改良的Hummers方法调节GO氧化程度制备得到具有适当的sp2和sp3比例的GO，用其吸附目标基因的正向引物构建GO-正向引物复合体，应用于多重qPCR检测新型冠状病毒的反应体系中，显著提高了多重qPCR的灵敏度，与传统的多重qPCR相比检测极限降低了10倍；同时，还兼具优异的特异性，可以实现对新型冠状病毒的快速、灵敏、准确检测，具有推广应用价值。
Claims (3)
1.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，
其包括一种氧化石墨烯-引物复合体，所述复合体是氧化石墨烯与基因引物复合而成，所述基因引物是新型冠状病毒特异性靶基因的引物；
所述氧化石墨烯中sp2杂化的碳原子与sp3杂化的碳原子的数量比为1:1；所述数量比根据XPS测试结果对应的不同官能团的峰面积确定；
所述基因引物是新型冠状病毒RdRP基因和E基因的正向引物；所述RdRP基因正向引物序列如SEQ ID NO.1所示；所述E基因正向引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述复合体是氧化石墨烯溶液与基因引物混合后50℃孵育25~35分钟，再超声25~35分钟制备而成；所述氧化石墨烯溶液浓度为13.44μg/mL；
所述氧化石墨烯是嵌锰石墨溶液与双氧水反应制备而成，所述嵌锰石墨溶液和双氧水的体积比为5:2.5；
所述嵌锰石墨溶液按照如下方法制备而成：
（1）石墨粉、硝酸钾加入浓硫酸混匀得到体系A；高锰酸钾、硝酸钾和浓硫酸混匀得到体系B；
（2）将体系B分次加入体系A中，混匀后密封，自然沉降20~40天后再搅拌均匀；
所述试剂盒还包括新型冠状病毒RdRP基因和E基因的反向引物；所述RdRP基因反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述E基因反向引物序列如SEQ ID NO.5所示；
所述试剂盒还包括新型冠状病毒RdRP基因和E基因的检测探针，所述RdRP基因的检测探针序列如SEQ ID NO.3所示，所述E基因的检测探针序列如SEQ ID NO.6所示；所述检测探针修饰有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因的正向引物、反向引物和检测探针；所述检测探针修饰有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针预混液、无酶水。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102502612A (zh) * | 2011-11-21 | 2012-06-20 | 南京工业大学 | 一种氧化还原制备石墨烯的方法 |
| CN102978201A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-03-20 | 厦门大学 | 石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用 |
| CN102998447A (zh) * | 2012-12-03 | 2013-03-27 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法 |
| CN105460922A (zh) * | 2015-11-29 | 2016-04-06 | 福建医科大学 | 部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备方法 |
| MX2016007399A (es) * | 2016-06-07 | 2017-12-06 | Centro De Investigacion En Mat Avanzados S C | Método de reducción parcial de óxido de grafeno mediante reductores suaves a temperatura ambiente. |
| CN112626209A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 绵竹市人民医院 | 用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒 |
| CN113025476A (zh) * | 2020-06-17 | 2021-06-25 | 山东大学 | 一种双层微流控芯片、检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
| CN113265448A (zh) * | 2020-02-14 | 2021-08-17 | 成都中医药大学 | 基于氧化石墨烯提高实时荧光pcr灵敏度和特异性的方法 |
| WO2021215556A1 (ko) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | (주)오상헬스케어 | 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 |
| KR20220009233A (ko) * | 2020-07-15 | 2022-01-24 | 울산과학기술원 | 환원된 그래핀옥사이드 및 이의 제조방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11731875B2 (en) * | 2020-01-15 | 2023-08-22 | University Of Wyoming | Methods for production of graphene oxide |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211213523.5A patent/CN116042915B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102502612A (zh) * | 2011-11-21 | 2012-06-20 | 南京工业大学 | 一种氧化还原制备石墨烯的方法 |
| CN102998447A (zh) * | 2012-12-03 | 2013-03-27 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的电化学免疫传感器及其制备方法 |
| CN102978201A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-03-20 | 厦门大学 | 石墨烯作为增强剂在聚合酶链式反应中的应用 |
| CN105460922A (zh) * | 2015-11-29 | 2016-04-06 | 福建医科大学 | 部分还原氧化石墨烯荧光共振能量转移纳米探针及其制备方法 |
| MX2016007399A (es) * | 2016-06-07 | 2017-12-06 | Centro De Investigacion En Mat Avanzados S C | Método de reducción parcial de óxido de grafeno mediante reductores suaves a temperatura ambiente. |
| CN113265448A (zh) * | 2020-02-14 | 2021-08-17 | 成都中医药大学 | 基于氧化石墨烯提高实时荧光pcr灵敏度和特异性的方法 |
| WO2021215556A1 (ko) * | 2020-04-22 | 2021-10-28 | (주)오상헬스케어 | 코로나 바이러스 진단 키트를 제조하는 방법, 이로부터 제조된 코로나 바이러스 진단 키트 및 이를 사용하여 코로나 바이러스를 진단하는 방법 |
| CN113025476A (zh) * | 2020-06-17 | 2021-06-25 | 山东大学 | 一种双层微流控芯片、检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
| KR20220009233A (ko) * | 2020-07-15 | 2022-01-24 | 울산과학기술원 | 환원된 그래핀옥사이드 및 이의 제조방법 |
| CN112626209A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 绵竹市人民医院 | 用于卵巢癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Effect of hydrogen peroxide on properties of graphene oxide in Hummers method;Myung Jin Yoo;Carbon;第141卷;摘要，第2节实验及第3节结果讨论部分 * |
| 氧化石墨烯对聚合酶链式反应扩增效率、灵敏度和特异性的影响;蒋城等;环境化学;第36卷(第4期);第724-729页 * |
| 陈润峰著.有机化学与光电材料实验教程.南京：东南大学出版社,2019,第233-234页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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