JP2609738B2 - 核酸の増幅および検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的被検体中の所定の核酸を精製し、
その精製した核酸を増幅する方法ならびに分析手段によ
るその検出方法にも関する。この発明は研究および商業
的な精製ならびに診断方法で使用することができる。

〔従来の技術〕

生化学、分子生物学、遺伝子工学および各種の診断方
法の進歩には、しばしば核酸を精製分離するための迅速
で単純な技法が必要とされる。例えば、遺伝子工学では
多種多様な核酸の複雑な混合物から純粋な核酸セグメン
トを入手しうることがしばしば必要になる。特定の感染
性疾患では、標的DNAやそれらの断片が低濃度で存在す
るので検出前に精製が必要となるかも知れない。一般
に、単一の核酸は核酸配列、分子量、大きさおよび形状
により特徴付けられている。

試験試料中に極めて少量存在する各種の疾病、生物体
または遺伝子的特徴の検出について、核酸プローブ技術
の有用性を研究者が見い出すにつれ、その技術は近年急
速に進歩してきた。プローブの使用は相補性概念に基礎
をおいている。例えば、DNAは二本鎖であり、これらの
鎖は相補的ヌクレオチド（また、ヌクレオチド対として
も知られる）間で水素結合によって相互にバインディン
グされる。

DNA複合体は、一般に安定であるが、水素結合を崩壊
する条件下で分離（または変性）することができる。分
離した一本鎖は、相補的なヌクレオチド配列を有する他
の鎖とのみ再会合しうる。このハイブリダイゼーション
法は、溶液中または固体材料上で生じうる。一般に、RN
Aは一本鎖である。それもまた、相補的なヌクレオチド
配列を有する他の鎖またはその一部分とハイブリッドし
うる。

標的生物体または細胞のDNAまたはRNAの標的核酸配列
は、全体の鎖中で小さな部分に限られる場合があるの
で、殆どの既知の標識したプローブを使用してその存在
を検出することは非常に困難である。この課題を解決す
るために行われてきた多くの研究は、プローブの感度の
改良と核酸の合成を含む。

当該技術分野の顕著な進歩は、米国特許第4,683,202
号明細書に記載された方法にみられる。その方法に関し
て広範囲にわたる詳細な説明はなされていないが、それ
は、重合試薬（例えば、ポリメラーゼ）および４種のヌ
クレオシド三リン酸ならびにプライマーから形成された
エクステンション生成物の存在下で核酸の鋳型にプライ
マーをハイブリッド化する増幅技術である。これらの生
成物は、変性されそしてそれらのその後の検出を容易に
する目的で多種多量に存在する核酸を増幅する周期的な
反応において鋳型として使用されている。ムリス（Mull
is）の増幅手順は、小量の標的核酸配列から多量の検出
可能な物質を生成するためにできるだけ長時間かけて周
期的に実施される可能性がある。

前述の増幅方法は高感度であるとはいえ、多くの場合
に生物学的被検体における目的のDNA物質量は極めて少
量である。被特異的な核酸または細胞砕片に由来する無
視できないバックグランドがアッセイ感度を低下する可
能性がある。相当な労力や時間をかけることなくかかる
物質を除去することはいまだ可能でないかも知れず、も
しそうであればアッセイは遅くなり、そして目的の診断
および処理もまた遅くなる。

不要な細胞砕片と核酸を除去して所定の核酸の増幅お
よび検出を促進するには、ブリン（Blin）ら、Nucleic
Acid Res.,３,2303〜2308ページ（1976）、マルマー（M
armur）,J.Mol.Biol.,３,208〜218ページ（1961）、ビ
ーボイン（Birnboin）ら、Nucleic Acid Res.７,1513〜
1523ページ（1979）、ボウテル（Bowtell）,Anal.Bioch
em.,162,463〜456ページ（1987）、ベジー（Beji）ら、
Anal.Biochem.,162,18〜32（1987）、ブッホネ（Buffon
e）ら、Clin.Cnem.,31,164〜165（1985）およびその他
は多すぎて列挙できない、に記載されるものを包含する
各種の既知の方法のいずれかを使用できるかも知れな
い。

米国特許第4,672,040号明細書は、被検体中の他の物
質からの分子、高分子または核酸の分離に磁性粒子の使
用を記載する。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許第4,672,040号の方法は、極めて精巧な臨床
的環境では使用可能であるかも知れないけれども、診断
結果の迅速性と効率性が望まれる個人病院、診断所およ
びその他の状況下で核酸の分離を可能にする迅速で単純
な精製方法を手にすることは好ましいであろう。本発明
が有利であるのはこのような課題と特徴が考慮に入れら
れる。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、ポリメラーゼ連鎖（チェーン）反応を
使用する、核酸混合物を含有することが予測される生成
学的被検体中の少なくとも１種の一本鎖標的核酸の増幅
方法であって、 A.不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で標
的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多孔
質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体を
接触させる工程、 B.その被検体の残りのものから前記ハイブリッドを分離
する工程、および C.前記不溶性のハイブリッドから、それらを変性してま
たは変性することなくポリメラーゼ連鎖反応を使用して
目的の核酸配列を増幅する工程、を含んでなる核酸の増
幅方法によって解決される。

この発明はまた、核酸混合物を含有することが予測さ
れる生物学的被検体中に存在する２つの相補鎖を有する
標的核酸を少なくとも１つ検出する方法であって、 A.被検体中の前記相補鎖を変性する工程、 B.不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で標
的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した被多孔
質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体を
接触させる工程、 C.精製した標的核酸を提供するために、前記被検体の残
りのものから前記ハイブリッドを分離する工程、 D.そのハイブリッドを変性して前記標的核酸から不溶性
の相補的断片を分離する工程、 E.一つが目的の核酸配列に相補的であり、もう一つが標
的核酸の他の鎖と相補的である第一および第二プライマ
ーと前記変性した標的核酸サンプルを接触させて、その
第一および第二プライマーと前記相補的核酸鎖のハイブ
リッド生成物を形成する工程、 F.前記プライマー類の第一エクステンション生成物と第
二エクステンション生成物がそれらの相補体（compleme
nt）から分離された場合にそれらのプライマーのエクス
テンション生成物の合成のための鋳型として役立ちうる
前記第一および第二プライマーの第一および第二エクス
テンション生成物を前記ハイブリッド生成物中で形成す
る工程、 G.鋳型上で合成された前記プライマー・エクステンショ
ン生成物をその鋳型から分離する工程、 H.追加の第一および第二プライマーを前記分離したエク
ステンション生成物および標的核酸と接触させて、相補
的生成物を形成するための特異的核酸配列を増幅する工
程、 I.工程Ｈで形成された相補的生成物から前記プライマー
・エクステンション生成物を分離する工程、 J.工程Ｉで分離された少なくとも１つのプライマー・エ
クステンション生成物を、検出のために標識されてお
り、かつそれに相補的であるオリゴヌクレオチドプロー
ブと接触させて、そのプローブおよびプライマー・エク
ステンション生成物の相補的生成物を形成する工程、な
らびに K.被検体中の標的核酸の存在を指標として工程Ｊで形成
された相補的生成物を検出する工程、を含んでなる核酸
の検出方法をも提供する。

以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明は、試験検体中の１種以上の標的（すなわち、
所定）の核酸の精製、増幅または検出に向けられる。こ
れらのサンプルとしては、細胞質物質、ウイルス体、
毛、体液または検出することのできる遺伝子DNAまたはR
NAを含むその他の材料を挙げることができる。精製の主
目的は主にその後の診断方法に向けられるであろうが、
精製した核酸DNAまたはメッセンジャーRNAのクローニン
グ効率を向上し、あるいは化学反応で得られる核酸混合
物から多量の目的の核酸を得る目的にも使用することが
できる。精製した標的核酸の他の用途は、当業者にとっ
て極めて明らかであろう。

核酸は、プラスミド、いずれかの起源（例えば、細
菌、酵母、ウイルス、植物および高等動物、ヒト）に由
来する天然のDNAまたはRNAから得ることができる。これ
らは、血液、組織材料または当該技術分野で既知の他の
起源を含む多様な組織から既知の方法を使用して抽出す
ることが可能である。本発明は、ウイルスまたはいずれ
かの生物体細胞に見られる核酸配列、例えば、細菌DN
A、ウイルスRNAまたは細菌もしくはウイルス感染細胞に
見られるDNAもしくはRNAの検出に特に有用である。この
発明は、HIV−Ｉまたは他のレトロウイルスが感染した
細胞由来のDNAの検出に特に有用である。

好ましい態様では、精製した核酸を関連する反応段階
の数に指数的な量で比例するように少なくとも１種の特
異的な核酸を生産するチェーン反応で使用することが望
ましい。この生成物は、使用される特異的プライマーの
末端に対応する複数の末端を有する個別的な核酸複製物
であろう。それを提供する出発原料としてどのような核
酸源も使用することができ、検出のための標的となる特
異的核酸を含むかまたは含有することが予測される。精
製されそして複製される「核酸」とは、断片または完全
な核酸を意味する。さらに、１種以上の核酸は、各標的
核酸に対して特異的な一組の精製試薬、プライマーおよ
び標識したプローブ（後述する）を使用することにより
同時に精製し増幅することができる。

検出されるプライマー、プローブまたは核酸断片に関
して本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」の語
は、２個以上の、好ましくは３個より多くのデオキシリ
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをいう。限定さ
せるものではないが、正確なサイズは、オリゴヌクレオ
チドの最終的な用途または機能を含む多くの因子により
左右される。オリゴヌクレオチドは、合成的にまたはク
ローニングによって誘導されうる。

「プライマー」の語は、核酸鎖が相補的なプライマー
・エクステンション生成物の合成を誘発する条件下にお
かれたとき、合成開始点として機能することができる天
然または合成的に生成されたオリゴヌクレオチドをい
う。かかる条件には、ヌクレオチド（例えば、４種の標
準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸）およびDNA
ポリメラーゼのような重合試薬ならびに適当な温度およ
びpHが含まれる。

この発明の実施に際して、プライマー、プローブおよ
び断片は、標的核酸の特異的核酸配列に実質的に相補的
である。「実質的に相補的」とは、相補的材料上にハイ
ブリダイゼーションが起こりうるようにマッチする十分
な数の塩基が存在することを意味する。しかしながら、
すべての塩基対がマッチすることを意味しない。

この発明で有用な精製試薬は、標的核酸の核酸配列少
なくとも１つに実質的に相補的である核酸断片を含んで
なる。この断片は、標的と適当な相補性およびハイブリ
ダイゼーションを供給しうるいずれかの適当な長さを有
することができる。一般的に、断片の長さは少なくとも
10塩基、好ましくは15〜50塩基である。これらの断片は
標的核酸の少なくとも一つの配列に適合する。また、各
試薬が特殊な断片を有する精製試薬の混合物を有するこ
とも可能であるが、混合状態にある各断片は同一または
相違する標的核酸がハイブリダイズしうるものである。
有用な断片は、プライマーの調製について後述するよう
な既知の技術および装置を使用して各種の起源から得る
かまたは調製することができる。

ここに記載した核酸断片はポリマー粒子（後述）に適
当な手段で直接結合される。結合は化学的または物理的
手段（すなわち、吸着または共有結合）で形成され、ヌ
クレオチドから支持体へと直接的である。すなわち、粒
子と断片との間には全く中間的な連結材料が存在しな
い。一の態様では、ポリマー粒子表面に核酸が吸着され
ている。しかしながら、固体支持体上の対応する反応性
基と共有結合する反応性基を供給するために核酸断片を
化学的に変性することが好ましい。このような方法の多
くは当該技術分野で知られており、国際公開WO−Ａ−89
/02931号公報に記載されるものが挙げられる。この方法
についてより詳しくは、下記の例１で示される。

精製試薬を調製するのに有用な粒子は、セルロース系
材料、ガラス、セラミック、天然ポリマー、合成ポリマ
ー、金属および当業者に容易に明らかとなる他の材料を
包含するいずれかの適当な材料で調製することができ
る。しかしながら、これらはポリメラーゼ活性を阻害す
るかも知れないから磁気または磁化しうるものでない。
これらは、球体、楕円体、立方体、不定形体、平面形を
包含する形状および平均サイズ0.3〜３μｍを有する大
きさのいずれであってもよい。

精製試薬を調製するに際して有利に使用される供給結
合にとって好ましいポリマー粒子は、断片（変性または
未変性）が反応しうる反応性表面基を有する。一般的な
反応性基としては、カルボキシ、アミノ、スルフヒドリ
ル、アルデヒド、活性化２−置換エチルスルホニル、ビ
ニルスルホニル、活性ハロゲン原子、ニトロアリール、
エステルおよび当業者に自明の他の基が挙げられる。特
に有用な基としては、ヨーロッパ特許公開第0302715号
公報に詳細に記載されたエチレン系不飽和ポリメリゼー
ション可能なモノマーの一部のようなカルボキシ、エス
テル、活性ハロゲン原子、ビニルスルホニルおよび活性
化２−置換エチルスルホニルが挙げられる。

本明細書で記載される精製試薬は、標的核酸とのハイ
ブリッド化に使用され、こうして核酸を不溶化し、被検
体の残りのものから分離可能となる。この被検体と試薬
の接触は、当該技術分野で周知のハイブリダイゼーショ
ン条件下で行われ、一般に、少なくとも１分、緩和な撹
拌、pH範囲５〜９および０〜75℃の温度を必要とする。
当業者は、最適ハイブリダイゼーションのための条件を
調整することができる。代表的な手順は、下記例１に記
載される。

ハイブリダイゼーション後、一般に、適当な分離手
段、例えば遠心、濾過、不溶性マトリックスへの選択的
吸着、沈降または結合種の洗浄により被検体から不溶化
標的核酸を分離することが望ましい。遠心または濾過が
好ましい。

この発明の増幅および検出方法で有用なプライマー
は、数多くの供給先から入手するかあるいは、例えばAB
I DNAシンセサイザー（Synthesizer）（Applied Biosys
temsから入手可能）またはバイオサーチ（Biosearch）8
600シリーズもしくは8800シリーズ・シンセサイザー（M
illigen−Biosearch,Inc.より入手可能）およびこれら
を使用するための既知の方法、を包含する既知の方法お
よび装置を使用して調製することができる。生物起源か
ら単離された天然産のプライマー（制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）もまた利用可能である。

ある態様では、検出に使用されるプライマー類（また
はそれらのセット）の少なくとも１つは、特異的バイン
ディングリガンドによって標識される。「標識した（さ
れる）」の語は、簡単に脱離しないような状態でリガン
ドが前記プライマーに結合されていることを意味する。
特異的バインディングリガンドとしては、ビオチンもし
くはその誘導体、アビジン、ストレプトアビジンもしく
はその誘導体、レクチン、糖、蛋白質、ハプテン、薬剤
または免疫学的種（例えば、抗体もしくは抗原物質）を
挙げることができる。

本発明は、２つの相補的な鎖を有する標的精製核酸の
増幅および検出に利用できる。既に興味を喚起した殆ど
の核酸配列が、DNAに見られるように日本鎖である。し
かしながら、mRNAのような一本鎖核酸配列も、同様に増
幅および検出することができる。

特定の核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核
酸を使用して調製される。その酸が２つの鎖を含む場合
には、プライマー・エクステンション生成物の形成と別
の段階かまたは同時にその鎖を分離すること（いわゆ
る、脱ハイブリダイゼーションまたは変性）が必要であ
る。変性は、従来技術文献に記載されているような、い
ずれかの適当な物理的、化学的または酵素的手段を使用
して行うことができる。適当な温度に加熱することが好
ましい方法である。

使用目的の分離した鎖が入手可能になったならば、追
加の核酸鎖の合成はpH7〜９に緩衝化した水性溶液中で
２種以上のプライマー（少なくとも１つは前述のように
標識されている）を使用して実施することができる。好
ましくは２種のプライマーの過剰モル量が緩衝液に添加
され、具体的な量は従来技術文献に示されている。ま
た、適当量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸dATP,d
CTP,dGTPおよびdTTPが合成混合物に添加され、得られた
溶液は、10分未満、好ましくは１〜４分間90〜100℃に
加熱される。酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマ
ンガンイオンを前記三リン酸に対して過剰モル量存在さ
せることが好ましい。この加熱後、前記溶液は、好まし
くは室温まで冷却され、次いでプライマー・エクステン
ション生成物の形成を誘導（または促進）するための適
当な試薬が導入される。これに含まれる誘導試薬は、当
該技術分野で重合試薬として一般に知られている。これ
らの生成物を調製するための反応は、既知の条件下（一
般に、室温からもはや重合が起こらなくなる温度までの
間）で行われる。

重合試薬は、プライマー・エクステンション生成物の
合成を達成する機能を有するいずれかの化合物または試
薬類の組み合わせであってよく、酵素（例えば、大腸菌
DNAポリメラーゼＩ、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウポ
リメラーゼ、逆転写酵素および当該技術分野で既知の他
のもの）が含まれる。特に有用な酵素としては、クロー
ンまたは天然源の熱安定性酵素、例えば、各種サーマス
（Thermus）属細菌に由来するものが挙げられる。他の
重合試薬は、米国特許第4,683,202号明細書に記載され
ている。

好ましい熱安定性酵素としては、ヨーロッパ特許公開
第258017号公報に記載されるようなサーマス・アクアテ
ィカス（Thermus aquaticus）に由来するDNAポリメラー
ゼが挙げられる。他の利用可能な酵素は、RossiらのSys
t.Appl.Microbiol.７（２〜３）,337〜341ページ、1986
に公表されている。数多くの利用可能な酸素が市販され
ている。一般に、エクステンション生成物の合成は、各
プライマーの３′末端で開始し、合成が停止するまで鋳
型に沿って５′−３′方向に進められる。いくつかの重
合試薬（例えば、逆転写酵素）は、鋳型に沿って３′か
ら５′の方向に進めるであろう。

新たに合成した鎖とそれらの個々のプライマー類を含
む新たに形成したプライマー・エクステンション生成物
は、その方法の次の工程で使用される最初の標的鎖を有
する二本鎖分子を形成する。

次に、これらの鎖は前述のような変性によって分離さ
れて一本鎖分子とされ、その上で前述のように新たな核
酸が合成される。この増幅手順の進行を維持するために
追加の試薬類を必要とする場合もあり、その後、これら
のエクステンション生成物の殆どは２種のプライマー
（すなわち、相補的な生成物）によってバインディング
された特定の核酸配列から構成されるであろう。

鎖の分離およびエクステンション生成物合成工程は必
要に応じて繰り返えされ、用途、例えば検出に必要な目
的量の特定の核酸を生成する。一般に、一連の工程は最
低１回、そして好ましくは最低10〜30回繰り返えされ
る。

１種より多くの標的精製核酸を生成する必要がある場
合には、適当数のプライマーセットが前記一般的な手順
により使用される。

プライマー・エクステンション生成物少なくとも１種
が生じた後、この発明の方法におけるいずれかの時点
で、その生成物は検出可能に標識したプローブ（後述す
る）とハイブリッド化することができる。

検出可能なハイブリッドの存在を測定するには、サザ
ーンブロッド、ゲル電気泳動、染色および当該技術分野
で既知の他の方法を包含する各種検出手段を使用するこ
とができる。

一般に、所定量の目的核酸配列が生じたならば、その
最後にプライマー・エクステンション生成物が分離さ
れ、第一プライマー・エクステンション生成物は、検出
のために標識されそしてそれに相補的であるオリゴヌク
レオチドプローブと接触され、生成物を形成する。この
プローブは、標的核酸配列に相補的な核酸配列である。
これらのプローブは、いずれか適当な核酸の鎖長を有し
てよいが、好ましくは15〜40個の核酸である。それは、
特異的バインディングリガンドとその受容体の複合体化
を防げないいずれか適当で検出可能な物質により標識さ
れる（通常、５′未満）。

標識を結合させる方法およびプローブを調製する方法
は、例えば、AgrawalらのNucleic Acid Res.,14,6227〜
6245ページ（1986）およびプライマーに特異的バインデ
ィングリガンドを結合することに関する前記文献に記載
されるような従来技術で周知である。利用可能な標識と
しては、ラジオアイソトープ、電子密度の高い試薬、発
色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよび他の磁性
粒子、化学発光成分ならびに酵素（これが好ましい）が
挙げられる。利用可能な酵素としては、グルコースオキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリホ
スファターゼおよび当該技術分野で周知な他のものが挙
げられる。このような酵素に対する基質および色素生成
組成物は周知である。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、アッセイのある時点で、過酸化水素および適当な色
素生成組成物が添加され、検出可能な色素が提供され
る。例えば、利用可能な色素供給性試薬類としては、ト
リアリールイミダゾールロイコ染料（米国特許第4,089,
747号明細書に記載されるような）またはペルオキシダ
ーゼおよび過酸化水素の存在下で反応して色素を提供す
る他の化合物のような、テトラメチルベンジンおよびそ
の誘導体ならびにロイコ染料が挙げられる。

相補的生物におけるプローブの存在の検出は、適切な
既知の検出装置および方法を使用して遂行することがで
きる。ある種のプローブは、検出装置を使用することな
く肉眼で観察しうるであろう。本発明の方法にとって、
適当な容器中で実施することもまた有用である。殆ど加
工されていない容器としては試験管、フラスコまたはビ
ーカーが挙げられるが、より精巧な容器は前記方法を実
行するについて自動化手順を容易にするために仕上げら
れる。例えば、この方法を実施する間中一定の温度特性
を提供するように組み立てられたキュベットは、特開平
１−168272号および同１−266858号公報に記載されそし
て特許請求されている。他の有用な容器は、この発明の
方法の自動化または使い捨て用として適当に加工されう
る。

相補的な生成物中のプローブを検出するには、相補的
な生成物の反応媒体中の他の物質から分離することがし
ばしば重要になる。これは、適当な不溶化手段、例え
ば、前述のある時点で固体材料に結合するか結合を起こ
すプライマーまたはプローブを使用することで行うこと
ができる。得られる不溶化複合体生成物は、濾過、遠心
または他の適当な分離手段によって複合化していない物
質から分離することができる。

特に有用な分離手段としては、ポリアミド膜（例え
ば、商品名LoProdyneまたはBiodyne膜）のような微孔質
濾過膜が挙げられる。それらは塗布しないで使用する
か、または界面活性剤もしくは分析手順を容易にする他
の物質を塗布して使用することができる。一の態様で
は、膜それ自体が第一プライマー・エクステンション生
成物を捕捉するためにそれに結合した（吸収または共有
結合によって）受容体分子を有する。

これらの膜は、アッセイの他の段階を実施するのに適
する容器を有する別の支持体として使用することができ
る。しかしながら、試験装置の一部として固定されるの
が好ましい。

各種の試験装置は、米国特許第3,825,410号、同3,88
8,629号、同3,970,429号および同4,446,232号明細書に
記載されるものを包含する当該技術分野で既知である。

本明細書に記載される方法は、感染性疾患、遺伝病ま
たはガンのような細胞性疾患に関連する特定の核酸配列
の検出法または特性決定法を提供するために使用するこ
とができる。それはまた、法医学的調査およびDNAタイ
ピングで使用することも可能であろう。この発明の目的
とする遺伝病には、いずれかの生物体に由来するゲノム
DNA中の特殊な欠失または突然変異、例えば、鎌状赤血
貧血、嚢胞性繊維症、α−サラセミア、β−サラセミア
および当業者に容易に明らかな他の疾患が含まれる。各
種の感染症は、生物体（それが酵母、細菌またはウイル
スであるかどうか）を特徴付ける臨床資料中に少量で存
在する特定のDNA配列によって診断することができる。
限定されるものでないが、検出することができるそれら
の細菌としては、サルモネラ（Salmonella）、クラミジ
ア（Chlamydia）、淋菌（Gonorrhea）、赤痢菌（Shigel
la）およびリステリア（Listeria）属に属する菌が挙げ
られる。限定されるものではないが、検出可能なウイル
スとしては、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイル
ス、エプスタイン・バールウイルス、肝炎ウイルスなら
びにHTLV−ＩおよびHIV−Ｉのようなレトロウイルスが
挙げられる。原生動物の寄生体、酵母およびカビもまた
検出可能である。他の検出可能な種は当業者にとって容
易に明らかであろう。本発明は、試験試料中のHIV−Ｉ
のようなレトロウイルスの存在の検出に有用である。

〔実施例〕

以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するため
に含めるものであるが、この発明がいずれかの態様に限
定されることを意味しない。

例 １ 精製試薬の調製と使用 この発明の実施に際して使用される精製試薬は、標準
的な方法を用いて製造されるポリマーラテックス粒子
と、次の配列 ５′−Ｘ−CCTCTGTTCCACAGACTTAGATTTG−３′ （配列中、Ｘは、国際公開89/02931号公報に記載される
ように調製されたエチレングリコール・スペーサー・ア
ームを介してそのオリゴヌクレオチドに結合したフリー
のアミン基である）を有するヒト白血球抗原（HLA）タ
イプ２およびタイプ３と相補的な核酸断片とを使用して
調製した。

材 料 ラテックス粒子（2.9％固体）は、ポリ（スチレン−
コ−アクリル酸）（90:10、モル比）から構成されてい
た。

メチルイミダゾール緩衝液（0.2モル濃度、pH6）は、
過塩素酸を添加することでpH6に調整した。

SSPE緩衝液（２％）は、水１中、塩化ナトリウム4
3.5gをリン酸ナトリウム0.276gおよびエチレンジアミン
四酢酸0.074gからなり、pH7.4に調整した。

ガラス蒸留水（40 OD/ml）中５′−アミノオリゴヌク
レオチド（200ミリモル）溶液を使用した。

EDC試薬は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミド塩酸塩である。

手 順 ラテックス溶液（1ml、29mgビーズ）を遠心（13,000x
にて2.5分）して上澄を除去した。次に、激しく撹拌し
ながらガラス−蒸留水（1ml）にビーズを懸濁させた。
混合物を再度遠心して上澄を廃棄した。ビーズをメチル
イミダゾール緩衝液（1ml）で１度洗浄し、遠心により
この緩衝液を廃棄し、次いで同じ緩衝液（0.5ml）にビ
ーズを再懸濁させた。

このビーズ液に、５′−アミノオリゴヌクレオチドプ
ローブ（原液25μまたは約5000ピコモル）を加え、得
られた溶液をよく混合した。この溶液に、１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩
酸塩試薬（15mg）を加えた。渦巻混合した後、この反応
混合物を時々混合しながら少なくとも２時間（通常15時
間）20〜25℃に置いた。

まず最初に、遠心により上澄を除去した後、遠心しそ
して溶液間の上澄をピペット除去することで下記緩衝液
によりビーズを連続して洗浄した： a.ガラス−蒸留水1mlで１度、 b.SSPE緩衝液で１度、 c.リン酸緩衝溶液で１度、次いで d.ガラス−蒸留水で２度。

最後の処理後、ビーズをガラス−蒸留水に懸濁して最
終容量920mlとし、３％ビーズ懸濁液を調製して４℃で
保存した。

例 ２ HLA DNAの増幅および検出方法 この例は、精製した標的HLA DNAの増幅および検出を
具体的に説明する。

煮沸、遠心および上澄の廃棄により粗全血サンプル
（100μ）から粗全血溶解物を調製した。この粗溶解
物の分画（それぞれ５μ）を、それぞれ５分間95℃で
加熱変性し、次いでSSPE緩衝液とトリトン（Triton、商
品名）Ｘ−100非イオン界面活性剤（0.02重量％）のサ
ンプル（40μ）に添加して試験検体を提供した。

精製手順 前記試験検体に例１で使用した精製試薬（水中２重量
％で２μ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら30
分間55℃でインキュベーションした。

次に、混合物を14,000rpmで１分間遠心し、次いで上
澄を廃棄した。得られたペレットを、SSPE緩衝液とトリ
トンＸ−100非イオン界面活性剤（0.02重量％）の溶液
（50μ）中に再懸濁し、55℃に加熱した後、再度遠心
した。この操作を２回以上繰り返して、精製試薬にハイ
ブリッド化した精製核酸を提供した。

次に、得られたペレットを次の溶液（100μ）中で
懸濁した：塩化カリウム（50ミリモル濃度）、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（10ミリモル
濃度、pH8）、ゼラチン（0.1mg/ml）、塩化マグネシウ
ム（2.5ミリモル濃度）、HLAプライマー（−および＋、
各0.2マイクロモル濃度）およびdNTP（各0.67ミリモル
濃度）。

HLA DNAは次の配列を有していた： （＋）５′−Ｘ−GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG−３′ （−）５″−Ｘ−CGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG−３′ 配列中のＸは、国際公開89/02931号公報に記載された
手順で調製しそしてプライマーに結合させたビオチンテ
トラエチレングリコールリンカーを表す。

次に、所定の核酸を５分間95℃に加熱することにより
精製試薬から脱ハイブリダイズド化し、次いですぐさま
遠心して上澄を集めた。

標的核酸の増幅 前記の上澄を、市販のサーマス・アクアティカス（Th
ermus aquaticus）から単離したDNAポリメラーゼ（4 I.
U./μ含有、約μ）と混合し、次のような遂次的な3
0サイクルで増幅を行った： 70℃を94℃まで昇温 １分 94℃ 0.5分（変性） 94℃を50℃まで降温 1.25分 50℃ 0.5分（ハイブリッド化） 50℃を70℃まで昇温 0.75分 70℃ １分（伸長） 増幅後、脱ハイブッド化した生成物を４％アガロース
を用いるゲル電気泳動、次いでエチジウムブロマイド染
色により評価した。結果は、本発明の精製試薬を使用し
て粗溶解物から所定の核酸が特異的に精製されそして分
離され、増幅が成功裏に行われたことを示した。

例 ３ ヒトβ−グロビンの検出方法 この例は例２と類似であるが、ヒトβ−グロビンDNA
の精製および検出に関する本発明の実施例を説明する。

例２に記載したように粗全血溶解物を得た。

精製試薬は、表面にアルデヒド基を有するポリマー粒
子を使用して調製した。これらの粒子は次の工程で調製
した:0.5モル濃度のメタノール中ナトリウムメトキシド
250ml、２−ニトロプロパン（12.5ml）およびポリ（ス
チレン−コ−ビニルベンジルクロライド）（70:30モル
比）の水性検濁液（3.5％、固体）の混合物を２時間還
流し、次いで濾過した。フィルター上の粒子をメタノー
ル洗浄、乾燥、最少量のピリジンで膨潤し、次いで水に
再懸濁した。

標的ヒトβ−グロビンDNAに相補的な核酸断片は次の
配列を使用した： ５′−Ｘ−CTCCTGAGGAGAAGTCTGC−３′ 配列中、Ｘは例１で記載したように調製したエチレン
グリコール・スペーサー・アームを介して結合したフリ
ーアミノ基である。

粒子上のアルデヒド基とアミノオリゴヌクレオチドを
米国特許第4,587,046号明細書に記載された方法を用い
て連結した。

本例では、２種のヒトβ−グロビンDNAプライマーを
使用し、さらに対照として２種の例２のHLA DNAプライ
マーを添加した以外は例２の精製方法と増幅方法に従っ
た。

ヒトβ−グロビンDNAプライマーは次の配列を有して
いた： （＋）５′−Ｘ−ACACAACTGTGTTCACTAGC−３′ （−）５′−Ｘ−CAACTTCATCCACGTTGACC−３′ 配列中、Ｘは、国際公開89/02931号公報（前記）に記
載されたように調製し、結合したビオチンテトラエチレ
ングリコール・スペーサー・アームを表す。

結果は、ヒトβ−グロビンDNA標的が粗溶解物から成
功裏に採取、増幅されそしてエチジウムブロマイドを使
用して検出されることを示した。この例では、HLA DNA
は増幅または検出されなかった。

〔発明の効果〕

この発明は、従来技術が教示するような多孔質または
磁性粒子あるいは精巧な装置または試薬類を使用するこ
となく、核酸混合物中の目的の核酸を精製するための有
利な手段を提供する。アフィニティー分離は核酸につい
て知られているが、それをポリメラーゼ・チェーン反応
を用い極めて少量の標的核酸の増幅を改良するために使
用したものはかつて存在しなかった。従って、既に大い
に利用されている方法が本発明によってより一層望まし
く高感度になった。これらの望ましい結果は、適当な形
状と大きさの非多孔質で非磁性粒子に直接ある相補的核
酸断片を結合させてなる精製試薬を使用することで達成
される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブレント アーサー バーディック アメリカ合衆国、ニューヨーク 14624, ロチェスター，フリントロック サーク ル 30 (72)発明者 ジェネット リン ファイルス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14519, オンタリオ，スローカム ロード 5961 (72)発明者 チュ―アン チャン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94530，エル セリト，リッチモンド ストリート 936 (56)参考文献 特開 昭63−188399（ＪＰ，Ａ) 欧州特許301899（ＥＰ，Ａ１)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリメラーゼ連鎖反応を使用する、核酸混
   合物を含有することが予測される生物学的被検体中の少
   なくとも１種の一本鎖標的核酸の増幅方法であって、 A.不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で標
   的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多孔
   質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体を
   接触させる工程、 B.その被検体の残りのものから前記ハイブリッドを分離
   する工程、および C.前記不溶性のハイブリッドから、それらを変性してま
   たは変性することなくポリメラーゼ連鎖反応を使用して
   目的の核酸配列を増幅する工程、を含んでなる核酸の増
   幅方法。
2. 【請求項２】核酸混合物を含有することが予測される生
   物学的被検体中に存在する２つの相補鎖を有する標的核
   酸を少なくとも１つ検出する方法であって、 A.被検体中の前記相補鎖を変性する工程、 B.不溶性ハイブリッドを形成するのに適する条件下で標
   的核酸の核酸配列に相補的な核酸断片が直結した非多孔
   質で非磁性の粒子を含んでなる精製試薬と前記被検体を
   接触させる工程、 C.精製した標的核酸を提供するために、前記被検体の残
   りのものから前記ハイブリッドを分離する工程、 D.そのハイブリッドを変性して前記標的核酸から不溶性
   の相補的断片を分離する工程、 E.一つが目的の核酸配列に相補的であり、もう一つが標
   的核酸の他の鎖と相補的である第一および第二プライマ
   ーと前記変性した標的核酸サンプルを接触させて、その
   第一および第二プライマーと前記相補的核酸鎖のハイブ
   リッド生成物を形成する工程、 F.前記プライマー類の第一エクステンション生成物と第
   二エクステンション生成物がそれらの相補体から分離さ
   れた場合にそれらのプライマーのエクステンション生成
   物の合成のための鋳型として役立ちうる前記第一および
   第二プライマーの第一および第二エクステンション生成
   物を前記ハイブリッド生成物中で形成する工程、 G.鋳型上で合成された前記プライマー・エクステンショ
   ン生成物をその鋳型から分離する工程、 H.追加の第一および第二プライマーを前記分離したエク
   ステンション生成物および標的核酸と接触させて、相補
   的生成物を形成するための特異的核酸配列を増幅する工
   程、 I.工程Ｈで形成された相補的生成物から前記プライマー
   ・エクステンション生成物を分離する工程、 J.工程Ｉで分離された少なくとも１つのプライマー・エ
   クステンション生成物を、検出のために標識されてお
   り、かつそれに相補的であるオリゴヌクレオチドプロー
   ブと接触させて、そのプローブおよびプライマー・エク
   ステンション生成物の相補的生成物を形成する工程、な
   らびに K.被検体中の標的核酸の存在を指標として工程Ｊで形成
   された相補的生成物を検出する工程、を含んでなる核酸
   の検出方法。