CN113265448A - 基于氧化石墨烯提高实时荧光pcr灵敏度和特异性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光定量PCR引物预处理方法，它是将氧化石墨烯经过超声1～5min处理后，与引物混合，在15～35℃温度下，孵育30min。本发明还公开了一种提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的方法，它是使用前述预处理方法处理过的引物进行荧光定量PCR反应。本发明的优点在于：利用氧化石墨烯可以有效提高PCR技术的灵敏度和特异性，且所需的氧化石墨烯用量低；此外，氧化石墨烯的制备步骤简单，贮存方便。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种基于氧化石墨烯提高实时荧光定量PCR灵敏度和特异性的方法。
背景技术
Hummers法制作的氧化石墨烯(GO)表面含有丰富的含氧官能团，是一种新型碳纳米材料。现已应用于许多方面。例如：研究发现Hummers法制备的石墨烯可以作为在铅酸蓄电池阴极板中应用，提高电池重复利用率(石墨烯水凝胶制备及在铅酸蓄电池阴极板中的应用，10.19311/j.cnki.1672-3198.2017.18.096)Hummers法制备的石墨烯还可用于制备纤维状碳材料，应用于超级电容器的电极制作(Comparison of ionic liquidelectrolyte to aqueous electrolytes on carbon nanofibres supercapacitorelectrode derived from oxygen-functionalized graphene，2019，375，121906)等。
实时荧光定量PCR(简称qRT-PCR，或qPCR)是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，通过对循环阈值和标准曲线的分析，进而对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。
当模板含量过低时，传统qRT-PCR易出现假阳性结果及非特异性扩增，导致定量不准确。近年来，有许多研究旨在提升qRT-PCR的灵敏度以及特异性，以获得更精确的结果。例如：利用集光多发色团结合模板，增强灵敏度(专利号：CN102021243A)；但该技术标记两个DNA位点比较困难，导致低产率，成本高，易产生单一标记的杂质，降低其检测灵敏度。利用C60提高qRT-PCR的效率(C60 affects DNA replication in vitro by decreasing themelting temperature of DNA templates，2009，47，1457-1465)但C60的制作步骤极复杂，成品C60价格又极高。总体上看，这些方法都没有在保证产率的前提下，既提高灵敏度，又提高特异性，故存在一定缺陷。
GO被认为是qRT-PCR的抑制剂，浓度0.15～0.35μg/ml的GO会在不同程度降低qRT-PCR的特异性，浓度超过0.5μg/ml的GO会完全抑制PCR反应的进行；其内在机制有可能是GO结合到DNA聚合酶上，抑制PCR反应的进行(魏晓磊.氧化石墨烯对蛋白质和DNA的构象和功能的影响[D].天津大学，2013)。因此，目前尚未见将GO用于改善qRT-PCR灵敏度或特异性的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于氧化石墨烯提高实时荧光PCR灵敏度和特异性的方法。
本发明的技术方案包括：
一种荧光定量PCR引物预处理方法，它是将氧化石墨烯经过超声1～5min处理后，与引物混合，在15～35℃温度下，孵育30±5min。
如前述的预处理方法，所述温度为35℃，和/或，所述孵育的时间为30min。
如前述的预处理方法，氧化石墨烯与正向引物或反向引物的用量比是7.4～10.9μg∶0.01μmol。通常应用中，是将7.4～10.9μg/ml的氧化石墨烯与10μM的正向引物、10μM的反向引物等体积混合。
优选地，氧化石墨烯与正向引物或反向引物的用量比是9.9μg∶0.01μmol。
一种优化荧光定量PCR(灵敏度和/或特异性)的方法，它是使用前述预处理方法，使用氧化石墨烯对引物进行处理后，配制成荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR。
如前述的提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的方法，所述荧光定量PCR为TaqMan探针法荧光定量PCR或染料法荧光定量PCR。
如前述的提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的方法，所述染料法荧光定量PCR的染料是SYBR Green I。
如前述的预处理方法，以及前述的提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的方法，所述氧化石墨烯的制备方法如下：
1)将1重量份的石墨置于40～50体积份的浓H2SO4中，加入0.8～1.2重量份的NaNO3，得体系A；
2)将MnO3 +分次加入体系A中，单次加入量按MnO3 +计不超过0.15重量份，累计加入3.5～4.0重量份MnO3 +，反应得到嵌锰石墨；
3)取嵌锰石墨，加水配成悬液，每10g嵌锰石墨置于磁力搅拌器上，加入30％的双氧水2.5±0.5ml后立即停止搅拌；
4)3)中制得的氧化石墨烯原液置于3500Da透析袋内，再将透析袋置于pH为7.0的双蒸水中透析；至透析袋内溶液pH为7.0，收集透析袋内产物。
一种荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒中含有提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的成分；
所述提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的成分是氧化石墨烯。
氧化石墨烯在提高实时荧光定量PCR特异性或敏感度中的用途。
本发明的优点在于：
在进行qRT-PCR前将GO进行超声处理，并与引物共同孵育，可杜绝GO对qRT-PCR反应的抑制作用，反而增强qRT-PCR的特异性扩增，提高扩增产物浓度。
本发明的方法，可有效提高qRT-PCR的特异性和灵敏度，尤其适用于某些微量DNA样本的检测，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为GO的表征检测；(a，b)高分辨率透射电镜图；(c)X射线光电子能谱分析图；(d)红外吸收光谱图；(e)紫外-可见光吸收光谱图。
图2为GO对qRT-PCR灵敏度和特异性的影响。
图3为GO对染料法qRT-PCR灵敏度和特异性的影响。
图4为GO超声时间对对qRT-PCR灵敏度的影响。
图5为GO浓度对qRT-PCR灵敏度的影响。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、氧化石墨烯(GO)水溶液的制备
1.制备方法
所述氧化石墨烯水溶液是以改良Hummers法合成。以下为具体步骤：
(1)制备含紫色嵌锰石墨的混合物，在室温下将0.5g石墨置于20-25ml的浓H2SO4中，并加入0.5g NaNO3，另外将KMnO4加入70-75ml的浓H2SO4，并加入0.5gNaNO3形成MnO3 +(MnO3 +的浓度为0.03-0.06g/ml)，每隔18-22分钟取4ml的MnO3 +(总计70-75ml)加入至石墨、浓硫酸、硝酸钠的混合体系中，制得嵌锰石墨。
(2)将含有紫色嵌锰石墨的混合物溶液，室温下放置在无光的环境中密封保存，等待嵌锰石墨的自然沉降。
(3)取已沉降完成的嵌锰石墨，可适当颠倒混匀，取10ml混匀后的嵌锰石墨(含嵌锰石墨10g)加入30ml的去离子水，搅拌20min。
(4)取稀释后的混合物置于磁力搅拌器上，加入2.5ml 30％的双氧水后立即停止搅拌，即得氧化石墨烯原液。
(5)(4)中制得的氧化石墨烯原液置于3500Da透析袋内，再将透析袋置于pH为7.0的双蒸水中透析；至透析袋内溶液pH为7.0，收集透析袋内产物，即得氧化石墨烯。
2.鉴定
GO的透射电镜(TEM)结果(图1.a)显示，其中形态较规则的区域来自氧化石墨烯基底面的不完全氧化，为氧化石墨烯的sp2区域，六角形晶格间距约为0.34nm。氧化石墨烯基面的无序区域由高密度的含氧官能团区域组成，为氧化石墨烯的sp3区域。在图1.b中，通过在氧化石墨烯中加入单链DNA并进行HR-TEM成像，发现单链DNA可吸附于氧化石墨烯表面。GO的X射线光电子能谱(XPS)结果(图1.c)分析，氧化石墨烯结构中C1s峰由5个部分组成，其中284.6eV、285.4eV、286.7eV、287.9eV和289eV对应为碳骨架中的C＝C、C-C、C-O、C＝O和-COOH的特征峰，含量最多的为羟基。分析得氧化石墨烯中碳元素含量为61.96％，氧元素含量为35.08％，氧化石墨烯的C∶O为1.76。GO固体红外(图1.d)可以看出，在1080cm-1、1267cm-1、1352cm-1、1635cm-1、2349cm-1、2696cm-1、3481cm-1处有吸收峰。GO的红外光谱图显示3481cm-1附近有一个相对较小的隆峰，归属于水分子的-OH伸缩振动。1635cm-1附近有一个明显的吸收峰，归属于GO片层上C＝C的伸缩振动。1267cm-1附近的峰归属于氧化石墨烯表面C-O-C的伸缩振动。1080cm-1附近的峰归属于-OH伸缩振动。GO的UV-Vis测试结果(图1.e)显示氧化石墨烯有两个特征吸收峰，分别是在波长230nm处由于碳六元环C＝C发生π-π*的跃迁，在波长295nm处由于羧基或羰基C＝O发生n-π*的跃迁，其中最大吸收波长在230nm。
所有表征均符合氧化石墨烯的特征。
实施例2、荧光定量PCR引物预处理方法
将实施例1方法合成的浓度为7.4μg/ml的GO溶液超声1min，与PCR引物混合得混合物，在温度15℃下孵育30min。
再向前述混合物加入荧光定量PCR反应体系所需的其余组分，即得。
该体系直接用于荧光定量PCR，可提高后者的灵敏度和特异性。
实施例3、荧光定量PCR引物预处理方法
将实施例1方法合成的浓度为9.9μg/ml的GO溶液超声5min，与PCR引物混合得混合物，在25℃下孵育30min。
再向前述混合物加入荧光定量PCR反应体系所需的其余组分，即得。
该体系直接用于荧光定量PCR，可提高后者的灵敏度和特异性。
实施例4、荧光定量PCR引物预处理方法
将实施例1方法合成的浓度为10.9μg/ml的GO溶液超声1min，与PCR引物混合得混合物，在35℃下孵育30min。
再向前述混合物加入荧光定量PCR反应体系所需的其余组分，即得。
该体系直接用于荧光定量PCR，可提高后者的灵敏度和特异性。
实施例5、GO提高TaqMan探针法实时荧光定量PCR反应灵敏度和特异性
1.实验试剂和材料：
引物1：5’-CTGCTTCGGCACACA-3’(SEQ ID NO.1)，浓度10μM。
引物2：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.2)，浓度10μM。
探针：5’-6-FAM-CCATGCTAATCTTCTCTGTATCGTTCCA-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)，浓度10μM。
DNA模板：PCR扩增DNA模板为U6质粒，U6序列为：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3’(SEQ ID NO.4)，浓度为107copies/μl。
2.预处理
GO组：实施例1所得GO溶液(9.9μg/ml)，使用前在20℃下超声1min。取0.5μl GO溶液加入PCR管中，与引物(含引物1和2各0.5μl)混合，在35℃下孵育30min。
阳性对照组：PCR管中加入引物1和引物2各0.5μl，在35℃下孵育30min。
3.qRT-PCR反应
体系：在前述装有引物和GO的PCR管中补加：2×probe mix 12.5μl，DNA模板1μl，探针0.5μl，再加无菌水补足体积到25μl。
PCR条件：(1)94℃预变性30s，(2)94℃变性5s，(3)60℃退火30s，步骤(2)～(3)重复40个循环。
4.结果
对扩增后的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，qRT-PCR结果和电泳结果如图2所示。
可见GO组相比阳性对照组更早出现荧光信号增长，Ct更小，表明GO组灵敏度更高。另外，GO组电泳条带单一且清楚，阳性对照组有多个条带且拖尾严重表明GO组特异性更高。
5.结论
使用GO预处理后的引物可以提高TaqMan探针法实时荧光定量PCR反应灵敏度和特异性。
实施例6、GO提高染料法实时荧光定量PCR反应灵敏度和特异性
1.实验试剂和材料：
引物1：5’-CTGCTTCGGCACACA-3’(SEQ ID NO.1)，浓度10μM。
引物2：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO.2)，浓度10μM。
DNA模板：PCR扩增DNA模板为U6质粒，U6序列为：5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT-3’(SEQ ID NO.4)，浓度为109copies/μl。
2.预处理
GO组：实施例1所得GO溶液(9.9μg/ml)，使用前在20℃下超声1min；取0.5μl GO溶液加入PCR管中，与引物(含引物1和2各0.5μl)混合，在35℃下孵育30min。
阳性对照组：PCR管中加入引物1和引物2各0.5μl，在35℃下孵育30min。
3.qRT-PCR反应
体系：在前述装有引物和GO的PCR管中补加：2×Green SuperMix(含SYBR Green I染料)12.5μl，DNA模板1μl，再加无菌水补足体积到25μl。
PCR条件：(1)94℃预变性30s，(2)94℃变性5s，(3)60℃退火30s，步骤(2)～(3)重复40个循环。
4.结果
对扩增后的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，qRT-PCR结果和电泳结果如图3所示。
可见GO组相比阳性对照组更早出现荧光信号增长，Ct更小，表明GO组灵敏度更高。另外，GO组电泳条带单一且清楚，阳性对照组有多个条带且拖尾严重表明GO组特异性更高。
5.结论
使用GO预处理后的引物可以提高SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR反应灵敏度和特异性。
实施例7、GO超声时间对qRT-PCR灵敏度的影响
1.实验试剂和材料：
引物1：5’-GCGCGTAGCAGCACAGAAAT-3’(SEQ ID NO.5)，浓度10μM。
引物2：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’(SEQ ID NO.6)，浓度10μM。
探针：5’-HEX-CACTGGATACGACGCCAATATTTCT-BHQ1-3’(SEQ ID NO.7)，浓度10μM。
DNA模板：PCR扩增DNA模板为合成ssDNA核酸序列：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCAATATTTCTGTGCTGCTA-3’(SEQ ID NO.8)，浓度为107copies/μl。
2.预处理
GO组：实施例1所得GO溶液(9.9μg/ml)，使用前在常温下超声0、5、10或20min。分别取0.5μl GO溶液加入PCR管中，与引物(含引物1和2各0.5μl)混合，在35℃下孵育30min。
对照组：PCR管中加入引物1和引物2各0.5μl，在35℃下孵育30min。
3.qRT-PCR反应
同实施例5。
4.结果
如图4所示，当超声时间为0min时，GO组与对照组Ct值相当；当超声时间为5min时，GO组相比对照组Ct值更小，即更灵敏；其余组别GO组Ct值大于对照组，灵敏度更低。
5.结论
GO超声预处理时间影响qRT-PCR的灵敏度；超声时间在10min以上，GO无法提高qRT-PCR的灵敏度。结合实施例5可知，超声时间设置为1～5min，GO可提高qRT-PCR的灵敏度。
实施例8、GO浓度对qRT-PCR灵敏度的影响
1.实验试剂和材料：
同实施例7。
2.预处理
GO组：实施例1所得GO溶液，稀释70、80、90、100、110、120倍浓度，分别为12.2μg/ml、10.9μg/ml、9.9μg/ml、9.0μg/ml、8.7μg/ml、7.4μg/ml，使用前在20℃下超声1min。分别取0.5μl GO溶液加入PCR管中，与引物(含引物1和2各0.5μl)混合，在35℃下孵育30min。
对照组：PCR管中加入引物1和引物2各0.5μl，在35℃下孵育30min。
3.qRT-PCR反应
同实施例5。
4.结果
如图5所示，当GO浓度高于9.9μg/ml时，GO组Ct值大于对照组，灵敏度更低；当GO浓度为9.9μg/ml时，GO组相比对照组Ct值更小，Ct值大约降低2.6的循环，即更灵敏；当GO浓度低于9.9μg/ml时，GO组Ct值越来越趋近于对照组，灵敏度改变不明显。
5.结论
GO浓度影响qRT-PCR的灵敏度；GO浓度在9.9μg/ml以上，GO无法提高qRT-PCR的灵敏度。结合实施例8可知，GO浓度设置为9.9μg/ml，GO可提高qRT-PCR的灵敏度。
综上，本发明使用氧化石墨烯对qPCR的引物预处理，可以提高qPCR的灵敏度和特异性，应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都中医药大学
<120> 基于氧化石墨烯提高实时荧光PCR灵敏度和特异性的方法
<130> GY041-2020P018951CC
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
ctgcttcggc acaca 15
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
ccatgctaat cttctctgta tcgttcca 28
<210> 4
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggc 60
ccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tatttt 106
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
agtgcagggt ccgaggtatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
cactggatac gacgccaata tttct 25
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacgccaat atttctgtgc 60
tgcta 65
Claims (10)
1.一种荧光定量PCR引物预处理方法，其特征在于：它是将氧化石墨烯经过超声1～5min处理后，与引物混合，在15～35℃温度下，孵育30±5min。
2.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：所述温度为35℃，和或，所述孵育时间为30min。
3.如权利要求1或2所述的预处理方法，其特征在于：氧化石墨烯与正向引物或反向引物的用量比是7.4～10.9μg∶0.01μmol。
4.如权利要求3所述的预处理方法，其特征在于：所述氧化石墨烯与正向引物或反向引物的用量比是9.9μg∶0.01μmol。
5.一种优化荧光定量PCR的方法，其特征在于：它是使用权利要求1～4任一所述预处理方法，使用氧化石墨烯对引物进行处理后，配制成荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR为TaqMan探针法荧光定量PCR或染料法荧光定量PCR。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述染料法荧光定量PCR的染料是SYBRGreen I。
8.如权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于：所述氧化石墨烯的制备方法如下：
1)将1重量份的石墨置于40～50体积份的浓H2SO4中，加入0.8～1.2重量份的NaNO3，得体系A；
2)将MnO3 +分次加入体系A中，单次加入量按MnO3 +计不超过0.15重量份，累计加入3.5～4.0重量份MnO3 +，反应得到嵌锰石墨；
3)取嵌锰石墨，加水配成悬液，每10g嵌锰石墨置于磁力搅拌器上，加入30％的双氧水2.5±0.5ml后立即停止搅拌，得氧化石墨烯原液；
4)3)中制得的氧化石墨烯原液置于3500Da透析袋内，再将透析袋置于pH为7.0的双蒸水中透析；至透析袋内溶液pH为7.0，收集透析袋内产物。
9.一种荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的成分；
所述提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的成分是氧化石墨烯。
10.氧化石墨烯在提高实时荧光定量PCR特异性或敏感度中的用途。
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