JP4634608B2 - 核酸増幅産物を得るために異なるプライマー濃度を用いるための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、核酸増幅反応、特に、標的配列のコピーを産生させるためにプライマー配列のペアを使用する増幅反応に関する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸増幅反応はよく知られており、試験サンプル中の標的核酸の濃度を増加させるために用いられる。「標的核酸」は、典型的には、サンプル中に低濃度で存在するため、それを増幅してサンプル中の標的配列の濃度を増加させなければ、容易に検出することができない。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、標的核酸配列を増幅するために一般に用いられる核酸増幅反応の1つである。
【０００３】
PCRの原理によれば、標的配列のコピーの合成を開始させるために「プライマー配列」を使用する。特に、適当な条件下、プライマー配列を、該プライマーが標的配列に隣接するよう二本鎖核酸配列の対向鎖にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたら、例えば、該プライマー配列を伸長させる酵素（例えば、DNAポリメラーゼ）を使用し、それにより標的配列のコピーを得る。（i）プライマー配列をハイブリダイズさせ伸長させ、（ii）伸長したプライマー配列（または標的配列のコピー）を解離させて、追加的なプライマーが元の標的に及び標的配列のコピーにハイブリダイズしうるようにする前記工程を繰返すことにより、標的配列の更なるコピーを生成させる。したがって、標的配列の多数のコピーが生成することになる。
【０００４】
増幅したら、標的配列が試験サンプル中に元々存在していたか否かを判定するために標的配列のコピーを検出することができる。もちろん、標的配列が存在していなければ、増幅が生じるはずはなく、標的配列は検出されないはずである。いずれにせよ、増幅された標的配列は、典型的には、標識を使用して検出される。標識は、検出可能な特性を有し標的配列のコピー内に取込まれうる部分である。典型的には、標識をプライマー配列に結合させ、ついでそれを前記のとおりに増幅産物内に取込ませることにより、増幅された標的配列内に標識を取込ませる。別法として、例えば、標識されたヌクレオチドをプライマー伸長中にそのような産物内に取込ませることにより、伸長産物を標識することができる。ついで、標識された増幅産物を検出することにより、試験サンプル中の標的配列の存在を判定する。
【０００５】
また、増幅された標的配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズする標識プローブを使用して、増幅された標的配列を検出することができる。しかし、時には、二本鎖増幅産物の一方の鎖だけにハイブリダイズするプローブを使用するのが望ましい。そのような検出方式の結果として、少なくともそれが二本鎖標的配列に適用された場合には、増幅された標的配列の一本鎖を検出して試験サンプル中の標的配列の存在が判定される。しかしながら、試験サンプル中に元々存在する標的配列の数が増加するにつれてシグナルが横ばい状態になり時には低下（または停留する）する限り、増幅産物の一本鎖の検出は非効率的となりうる。特に、試験サンプル中の標的配列を定量するように設計された増幅に基づくアッセイの場合には、「停留」または「横ばい」現象を緩和し、より広い標的配列濃度範囲にわたり直線的なシグナルを得ることができれば好都合であろう。
【０００６】
一方のプライマーの濃度を他方のプライマーに対して実質的に増加させて、より多くの検出配列を生成させることにより、この問題は緩和されると予想されるであろう。実際のところ、米国特許第5,066,584号は、一方のプライマーの濃度を著しく増加させることにより二本鎖標的配列の一方の鎖を優先的に生成させるための方法を記載している。しかしながら、これは過剰の試薬を必要とし、したがって2つの一本鎖のうちの一方の優先的な生成に伴う余分の経費を必要とする。また、プライマー濃度を実質的に増加させることは、非特異的プライミングおよびそれに伴う非標的配列の増幅の可能性を増加させうる。さらに、多くの場合、非特異的反応を競合させると、関心のある配列の効率的な増幅が妨げられるであろう。したがって、一方のプライマーの濃度を他方のプライマーに対して実質的に増加させると、高感度設計の（すなわち、少数の関心のある配列を検出するよう設計された）増幅アッセイにおいては問題が生じうると予想されうる。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、試験サンプル中の標的配列を検出する方法を提供する。本発明は、（a）試験サンプル、増幅試薬、第1プライマーおよび第2プライマーを含む反応混合物を、該反応混合物中の該第1プライマーの濃度が該第2プライマーの濃度より15％〜250％大きくなるように調製し、（b）標的配列を増幅して、該第1および第2プライマーからの増幅産物を含む標的配列のコピーを得、（c）該第1プライマーからの増幅産物にプローブをハイブリダイズさせてハイブリッド複合体を形成させ、（d）該試験サンプル中の標的配列の存在の指標として該ハイブリッド複合体を検出する工程を含む。好ましくは、直接的または間接的に検出されうる標識を使用して、該ハイブリッド複合体を検出する。
【０００８】
また、（a）試験サンプル、第1および第2プライマー配列ならびに増幅試薬を含む増幅混合物を調製し、（b）標的配列を増幅して、該第1および第2プライマーからの増幅産物を含む標的配列のコピーを得、（c）該試験サンプル中の核酸配列の存在の指標として該標的配列のコピーを検出する工程を含んでなる、試験サンプル中の標的核酸配列を増幅し検出するための改良された方法であって、該第1プライマー配列を該第2プライマーに対して15％〜250％過剰に与えることを含む改良がなされており、該第1プライマーからの増幅産物にプローブをハイブリダイズさせてハイブリッド複合体を形成させ、該試験サンプル中の核酸配列の存在の指標として該ハイブリッド複合体を検出することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法を実施するためのキットも提供する。
【００１０】
（発明の詳細な記載）
適当な条件下、プライマーのペアは二本鎖増幅産物の形態の標的配列のコピーを与えるであろう。しかし、残念ながら、二本鎖増幅産物の一本鎖をプローブで検出する場合には、元の標的配列の濃度が増加するにつれて、生じるシグナルは、横ばい、さらには停留状態となりうる。元の標的配列の濃度の増加は、より大きな濃度の最終産物を与えるはずであり、したがって、より大きなシグナルが検出されるはずであるため、この現象は或る程度は信じがたいことである。しかし、前記のとおり、生じるシグナルは横ばい状態になりうる。理論に束縛されることを望むものではないが、該停留効果は、産物鎖の再アニーリングによりプローブ／標的鎖のアニーリングの排除を引き起こす、より高濃度の、より長い産物鎖の存在に起因するものであるかもしれない。本出願人は、驚くべき且つ意外なことに、該横ばい又は停留現象が、一方のプライマーの濃度が他方のプライマーの濃度より若干高くなるようその一方のプライマーの濃度を増加させることにより軽減されうることを見出した。
【００１１】
本発明で提供する方法は、二本鎖増幅産物を得るためにプライマー配列のペアを使用し該二本鎖産物の一方の鎖だけを検出する任意の増幅反応に適用することができる。該方法は、増幅混合物を調製する工程を含む。該増幅混合物は、一般には、（i）試験サンプル、（ii）増幅試薬、ならびに（iii）第1および第2プライマー（「プライマーペア」と総称される）を含むであろう。本発明で用いる「試験サンプル」なる語は、標的配列を含有すると疑われる任意のものを意味する。試験サンプルは、例えば血液、眼水晶体液、脳脊髄液、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、組織、発酵ブロス、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものである。試験サンプルは、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。したがって、例えば、血液から血漿を調製する、細胞またはウイルス粒子を破壊する、固体材料から液体を調製する、粘液を希釈する、液体を濾過する、液体を蒸留する、液体を濃縮する、阻害成分を不活性化する、試薬を加える、核酸を精製することなどにより、試験サンプルを使用前に前処理することができる。試験サンプル中に存在しうる「標的配列」は、増幅される又は検出される又は増幅および検出される核酸配列である。また、標的配列なる語は一本鎖をさすことがあるが、当業者は、標的配列が実際には二本鎖となりうることを認識するであろう。
【００１２】
本発明で用いる「増幅反応試薬」なる語は、核酸増幅反応において使用されることが良く知られている試薬を意味し、DNAポリメラーゼおよび／または逆転写活性を別々または個々に有する酵素；酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）；デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸；および適当なバッファーを含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
該第1および第2プライマーは、典型的には核酸配列、通常はDNAまたはRNAである。該プライマーの長さは決定的に重要というわけではないが、プライマー配列は、通常、約10〜約100ヌクレオチド長、好ましくは、約15〜35ヌクレオチド長であり、所望の標的配列にハイブリダイズするのに適した一定の塩基配列を有する。プライマーペアは、通常、当技術分野においてよく知られているとおり、それらが標的配列に隣接するように選択される。また、該第1プライマーは、その濃度が該第2プライマーの濃度より15％〜250％、好ましくは20％〜150％大きくなるように該増幅混合物に加える。もちろん、該第1プライマーは、該第2プライマーの濃度より400％、500％および1000％以上大きな濃度で使用することが可能であるが、一方のプライマーの、他方のプライマーに対する濃度が増加するにつれて、試薬のコストおよび／または非特異的プライミングが限定要因となりうる。いずれにせよ、プライマーが標的配列にハイブリダイズすると、該プライマーが伸長されて、該プライマーがハイブリダイズした配列の相補体を与える。
【００１４】
プライマー配列は、天然または合成起源に由来するものであってもよく、現在利用可能な種々の技術を用いて常法により合成することができる。例えば、プライマーは、通常のヌクレオチドホスホルアミジット化学と、Perkin Elmer/Applied Biosystems, Div. (Foster City, CA）またはPerceptive Biosystems, Inc.（Framingham, MA）から入手可能な装置とを用いて合成することができる。所望により、当技術分野においてよく知られた方法（例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,464,746号、第5,424,414号および第4,948,882号に記載のもの）を用いてプライマーを標識することができる。
【００１５】
該増幅混合物を調製した後、標的配列の増幅を促進する条件である「増幅条件」に反応混合物を付すことにより該標的核酸を増幅する。増幅条件は当業者によく知られており、一般には、二本鎖標的配列の解離、該標的配列の一本鎖に対するプライマー配列のアニーリング、およびプライマー配列の伸長およびそれによる標的配列のコピーの形成を促進する条件を含む。ついで標的配列のコピーを該標的から解離させ、追加的なプライマーを元の標的配列と標的配列のコピーとの両方にアニーリングさせて、標的配列の増幅の新たなラウンドを開始させる。そのような増幅条件はよく知られており、参照により本明細書に組み入れる米国特許第4,683,202号および第4,683,195号に記載されている。サーモサイクリングが好ましく、これは、増幅条件を得るためのよく知られた方法である。増幅混合物が付されるサイクルの回数は、当業者により選択され、典型的には、反応混合物を2〜100回、より典型的には20〜40回のサイクルに付す。
【００１６】
サイクリング後には、標的配列の多数のコピーが存在しうる。第1プライマーにより産生される配列は、試験サンプル中の標的配列の存在を示すために検出される配列であり、第1プライマーにより合成されたこの配列は、本発明においては様々な場合に「一次配列」と称される。二本鎖増幅産物の一本鎖を検出するための任意の方法を、本発明の方法において用いることができる。例えば、一次配列を検出するために、配列決定、ゲル電気泳動、ゲルシフトアッセイ、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、「TaqMan」様アッセイおよび同様の方式を用いることができる。
【００１７】
好ましい検出実施形態においては、ハイブリダイゼーションプローブを使用して一次配列を検出する（特に、該プローブが比較的低濃度で存在する場合）。プローブ配列は一次配列にハイブリダイズして、ハイブリッド複合体を形成する。好ましくは、プローブは、該プライマーに対して内部の領域において一次配列にハイブリダイズする。いずれかの二本鎖標的配列を解離条件下に配置し、生じた一本鎖配列を、プローブの存在下、ハイブリダイゼーション条件下に配置することにより、一次配列とプローブとのハイブリッド複合体の形成を達成することができる。「解離条件」なる語は、一般には、二本鎖核酸から一本鎖形態への解離を促進する条件と定義される。これらの条件には、高い温度および／または低いイオン強度が含まれうる。「ハイブリダイゼーション条件」なる語は、一般には、相補的核酸配列の核形成およびアニーリングを促進する条件と定義される。そのようなアニーリングおよびハイブリダイゼーションは、温度、イオン強度、配列の長さおよび配列のG:C含量を含むいくつかのパラメーターに、ある程度予想されうる様態で依存することが、当技術分野においてよく知られている。与えられた任意のセットの配列に関して、いくつかの公知方法のいずれかにより溶融温度すなわちTmを推定することができる。典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、与えられたセットの核酸配列の溶融温度より若干低い温度を含む。イオン強度または「塩」濃度も溶融温度に影響を及ぼす。なぜなら、小さな陽イオンは、ホスホジエステルバックボーン上の負電荷を遮蔽することにより二本鎖の形成を安定化する傾向があるからである。典型的な塩濃度は該陽イオンの性質および原子価に左右されるが、これは当業者に容易に理解される。同様に、高いG:C含量および配列の長さの増加も、二本鎖の形成を安定化することが知られている。なぜなら、G:C対形成は3個の水素結合を含むが、A:T対形成はそれを2個しか有さず、また、より長い配列は、それらの鎖を合体させる、より多数の水素結合を有するからである。したがって、高いG:C含量およびより長い配列長は、「ハイブリダイゼーション条件」に含まれるものに影響を及ぼす。前記に基づき、ある特定のセットの核酸配列に適した「ハイブリダイゼーション条件」を決定することは当技術分野の通常の技量の範囲内に十分に含まれるものである。参照により本明細書に組み入れる1995年8月14日付け出願の米国特許出願第08/514,704号は、増幅された標的配列をプローブで検出する方法を例示している。
【００１８】
また、プローブは、前記のとおりにプライマー配列を合成し標識するのと同様にして合成し標識しうる核酸配列または核酸類似体配列、例えばDNA、RNA、ペプチド核酸、モルホリノ核酸である。標識プライマーまたはプローブ上に用いる標識の選択は当業者により行われるものであり、本発明で用いる「標識」なる語は、検出されうる特性を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子、FRETペアなどのように、直接的に検出可能なものであってもよい。あるいは、標識は、例えば特異的結合メンバーのように、間接的に標識可能なものであってもよい。直接的に検出可能な標識は、該標識の検出を可能にする例えば基質、誘発試薬、光などの追加的成分を必要とすると理解されるであろう。間接的な標識を検出に使用する場合には、後記で更に詳しく説明するとおり、典型的には、それらをコンジュゲートと共に使用する。
【００１９】
プローブは、一次配列を検出するための当技術分野で公知の種々の方法で使用することができる。例えば、該プローブ、プライマーまたはプローブおよびプライマーは、一次配列の存在を検出するために標識および／または固体支持物質に固定化することができる。また、一次配列の検出を補助するために捕捉試薬を使用することができる。本発明で用いる「捕捉試薬」は、固体支持物質に結合した特異的結合メンバーを意味する。本発明で用いる「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペア（すなわち、一方の分子が例えば化学的または物理的手段を介してもう一方の分子に特異的に結合する2つの異なる分子）のメンバーを意味する。抗原および抗体の特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアには、アビジンおよびビオチン；相補的ヌクレオチド配列；それぞれ米国特許第5,424,414号および米国特許第5,464,746号（これらの特許の開示を参照により本明細書に組み入れる）に記載のカルバゾールおよびアダマンタンなどのハプテンに特異的な抗体およびハプテンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。「固体支持物質」は、不溶性であるか又は後続の反応により不溶性にされうる任意の物質を意味する。したがって、固体支持物質は、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラス、シリコンなどであってもよい。また、多数の固体支持物質形態がよく知られており、それらには、試験管の表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者によく知られている他の形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
プローブを使用して一次配列を検出するための1つの実施形態においては、捕捉試薬を形成させるために該プローブを固体支持物質に固定化することができる。そのようにして形成された捕捉試薬と一次配列とをハイブリダイゼーション条件下で接触させてハイブリッド複合体を形成させ、それにより該一次配列を捕捉し、所望により、それを他の増幅反応物および産物から分離することができる。ついで、一次配列に結合した標識からのシグナルを、捕捉試薬上の、したがって試験サンプル中の一次配列の存在の指標として検出することができる。
【００２１】
もう1つの別法として、第1プライマーおよびプローブを標識し、該標識を使用して一次配列を分離し検出することができる。例えば、そのような形態の両方の標識は特異的結合メンバーであってもよい。したがって、ハイブリッド複合体が形成したら、該複合体は二重標識されることになる。一方の標識は、ハイブリッド複合体の分離を可能にする捕捉試薬上の特異的結合メンバーに結合し、もう一方の標識は、該捕捉試薬上のハイブリッド複合体の存在の検出に使用されうるコンジュゲートに対する結合に用いられうる。本発明で用いる「コンジュゲート」なる語は、直接的に検出可能な標識に結合または共役している特異的結合メンバーを意味する。コンジュゲートを合成するための共役化学は当技術分野においてよく知られており、例えば、特異的結合メンバーの特異的結合特性または該標識の検出可能な特性を損なわない任意の化学的手段および／または物理的手段を含みうる。
【００２２】
実施例
以下の実施例においては、本発明で提供するDNAオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを使用するHIV核酸の検出を示す。これらのDNAプライマーおよびプローブは、配列番号2、配列番号3および配列番号4と表示されており、HIVのpol遺伝子内の領域に特異的である。HIV-1（サブタイプB、MN株）からの代表的pol配列の部分は、本発明では配列番号1と称される。これらのプライマーおよびプローブは、HIV-1のサブタイプA〜FおよびOを代表する31個のHIV-1分離株のpol領域の分析から導き出されたコンセンサス配列である。
【００２３】
以下の実施例においては、HIV-1のpol領域に特異的なコンセンサス増幅プライマーとして配列番号2および配列番号3を使用する。HIV-1 pol増幅産物に関するコンセンサス内部ハイブリダイゼーションプローブとしては、配列番号4を使用する。
【００２４】
実施例 1
HIV プライマーおよびプローブの調製
A．HIV プライマー
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションPCRにより全ての公知HIV-1サブタイプのHIV pol標的配列を検出するために、コンセンサスプライマーを設計した。これらのプライマーは配列番号2および配列番号3であった。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いてプライマー配列を合成し、米国特許第5,424,414号（参照により本明細書に組み入れる）に記載の標準的なシアノエチルホスホルアミジットカップリング化学を用いて配列番号3を5'末端にてカルバゾールでハプテン化した。
【００２５】
B．HIV プローブ
配列番号4で示されるコンセンサスプローブは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより増幅HIV pol標的配列にハイブリダイズするように設計した。該プローブ配列は、標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成し、米国特許第5,464,746号（参照により本明細書に組み入れる）に記載の標準的なシアノエチルホスホルアミジットカップリング化学を用いて5'末端にて2個のアダマンタンでハプテン化し、3'末端にてホスファートで保護した。
【００２６】
実施例 2
種々の未標識プライマー濃度における HIV の検出
HIV RNAを、RNAzol B RNA Isolation Solvent（Tel-Test, Inc., Friendswood, TX）を使用して既知量のビリオン（Advanced Biotechnologies Inc, Columbia, MD）から単離し、クロロホルム／イソプロパノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。RNアーゼを含まない水（5'-3', Boulder CO）中で該ペレットを再懸濁させた。ついで2ng/μlのリボソームRNA（rRNA; Boehringer-Mannheim, Indianapolis IN）を含有する希釈剤を使用して、このHIV RNAの10倍希釈物をRNA分子106〜101個/25μlの濃度で調製した。
【００２７】
HIV RNAの希釈物（104を除く）を逆転写し、PCR増幅し、HIVプローブとしての配列番号4と共にプライマーとしての配列番号2および3を使用して検出した。1×EZバッファー、2.5mM塩化マンガン、それぞれ最終濃度0.15mMで存在するdNTP（dATP、dGTP、dTTPおよびdCTP）および5単位/反応の濃度の組換えサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）ポリメラーゼを使用してRT-PCRを行った。標識プライマー（配列番号3）は50nMの濃度で使用し、未標識プライマーの濃度は、HIV RNA希釈物の各組ごとの別々の反応において、25、37.5、50または62.5nMの濃度を用いて種々変化させた。生じるハイブリッド複合体の検出前に該標識プライマーの産物にハイブリダイズする前記のとおりに標識されたプローブを、10nMの濃度で使用した。25μlのサンプル容積中のHIV RNAの10倍希釈物を、前記混合物を含有する175μlに加えて0.2mlの合計反応容積にした。陰性対照は50ngのrRNA/反応を含むものであった。すべての反応は二重に行った。
【００２８】
反応混合物を逆転写し、Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler中で増幅した。反応混合物を、該RNAを逆転写するためにまず62℃で30分間、ついで94℃で2分間インキュベートした。ついで、増幅の初期段階における反応のストリンジェンシーを補助するためにタッチダウン（touchdown）またはステップ・ダウン（step-down）プロトコールでPCR増幅を開始した。これは以下の8サイクルを用いるものであった：94℃で30秒間およびそれに続く70℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く69℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く68℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く67℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く66℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く65℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く64℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く63℃で80秒間の1サイクル。ついで、94℃で30秒間およびそれに続く62℃で80秒間の35サイクルで、更なる増幅を行った。該反応混合物をサーマルサイクルに付した後、すべての重複体をプールし、ピペッティングにより混合して、サイクリングによるばらつきを排除した。ついで該混合物を分割し、97℃で5分間変性させた。この後、温度を15℃に5分間低下させることによりプローブオリゴハイブリダイゼーションを行った。ついで該温度を4℃に低下させ、反応産物の検出までサンプルを4℃に維持した。
【００２９】
反応産物をAbbott LCx（登録商標）系（Abbott Laboratories, Abbott Park, ILから入手可能）上で検出した。抗カルバゾール抗体でコーティングされた微粒子（0.06％固体）および抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート（これらはすべてAbbott Laboratories, Abbott Park, ILから入手可能）の懸濁液をLCx（登録商標）と共に使用して、増幅産物／プローブハイブリッドを捕捉し検出した。使用した酵素基質はメチル-ウンベリフェリルホスファート（MUP）であった。MUPからMUへの変換速度を測定し、カウント/秒/秒（c/s/s）で表した。
【００３０】
この実験からのデータは表1に示されており、未標識プライマーが標識プライマーの濃度より低い濃度で存在する場合には、より高い標的濃度において、より高いシグナルが得られ、該シグナルの横ばいが避けられることを示している。逆に、未標識プライマーの濃度が標識プライマーの濃度より高いまたは等しい場合には、より高い標的濃度が開始するとより低いシグナルが生じる「停留効果」が認められる。
【００３１】
【表１】
【００３２】
また、この実験を、5分間の代わりに15分間の変性時間を用いて行ったところ、同等の結果が得られた。
【００３３】
実施例 3
種々の標識プライマー濃度における HIV の検出
未標識プライマー（配列番号2）の2つの別々の調製物（GおよびA）（共に50nM）を使用し標識プライマー（配列番号3）の濃度をHIV RNA希釈物の各組ごとの別々の反応において25、50および75nMの標識プライマーを使用して種々変化させた以外は実施例2と同様にして、実施例2で用いたのと同じHIV RNAサンプル希釈物を逆転写し、PCR増幅し、検出した。すべての反応は二重に行い、増幅およびプローブハイブリダイゼーションの後に二重のセットをプールして、サイクリングによるばらつきを排除した。反応産物の検出には、抗カルバゾール抗体でコーティングされた微粒子を、実施例2で使用した0.06％固体に加えて0.12％および0.18％固体の濃度で使用した。
【００３４】
【表２】
【００３５】
それらの2つの未標識プライマー調製物（GおよびA）は、若干異なる値を与えたが、同じ全体的傾向を示した。いずれの場合においても、未標識プライマーの濃度が標識プライマーの濃度より高い又は等しい場合には、実施例2と同様に、高い標的濃度が低いシグナルを与える「停留効果」が再び認められた。未標識プライマーが標識プライマーより低い濃度で存在する場合にのみ、標的濃度と相関した、より直線的なシグナルが得られた。これらの条件下では、実施例2と同様にこの場合においても、より高いシグナルが、より高い標的濃度で得られ、該シグナルの横ばいは避けられた。
【００３６】
0.12％および0.18％固体の微粒子濃度の使用は同等の結果を与え、共に、0.06％固体を使用した場合より若干高いシグナルを与えた。しかし、該微粒子濃度の変更は、標識プライマーに対する未標識プライマーの比率により認められる全体的傾向に影響を及ぼさなかった。
【００３７】
実施例 4
種々のプライマーおよびプローブ濃度における HIV の検出
実施例2で用いたのと同じHIV RNAサンプル希釈物を、両方のプライマーおよびプローブの濃度を種々変化させた以外は実施例3と同様にして、逆転写し、PCR増幅し、検出した。未標識プライマー（配列番号2）は、50nMの増加量で変化する100〜250nMの濃度で使用した。標識プライマー（配列番号3）は、50〜100nMの増加量で変化する50〜500nMの濃度で使用した。表3に示すとおりの種々の濃度のプライマーと共に、該プローブを10、25および40nMの濃度で使用した。
【００３８】
【表３】
【００３９】
全3個の微粒子濃度を試験したが、0.12％固体を使用したデータが、全3個の微粒子濃度で得られたデータに典型的なものであったため（実施例3と同様）、このデータのみが表3に示されている。
【００４０】
本実施例に示されるとおり、未標識プライマーの濃度が標識プライマーの濃度より高い又は等しい場合には、「停留効果」が認められた。標識プライマーが未標識プライマーより高い濃度で存在した場合には、該停留効果は消失した。
【００４１】
本発明は特定の実施形態に関して詳細に説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなくそのような実施形態に種々の変更および修飾を施しうることが当業者に明らかであろう。
【配列表】
（発明の技術分野）
本発明は、核酸増幅反応、特に、標的配列のコピーを産生させるためにプライマー配列のペアを使用する増幅反応に関する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸増幅反応はよく知られており、試験サンプル中の標的核酸の濃度を増加させるために用いられる。「標的核酸」は、典型的には、サンプル中に低濃度で存在するため、それを増幅してサンプル中の標的配列の濃度を増加させなければ、容易に検出することができない。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、標的核酸配列を増幅するために一般に用いられる核酸増幅反応の1つである。
【０００３】
PCRの原理によれば、標的配列のコピーの合成を開始させるために「プライマー配列」を使用する。特に、適当な条件下、プライマー配列を、該プライマーが標的配列に隣接するよう二本鎖核酸配列の対向鎖にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたら、例えば、該プライマー配列を伸長させる酵素（例えば、DNAポリメラーゼ）を使用し、それにより標的配列のコピーを得る。（i）プライマー配列をハイブリダイズさせ伸長させ、（ii）伸長したプライマー配列（または標的配列のコピー）を解離させて、追加的なプライマーが元の標的に及び標的配列のコピーにハイブリダイズしうるようにする前記工程を繰返すことにより、標的配列の更なるコピーを生成させる。したがって、標的配列の多数のコピーが生成することになる。
【０００４】
増幅したら、標的配列が試験サンプル中に元々存在していたか否かを判定するために標的配列のコピーを検出することができる。もちろん、標的配列が存在していなければ、増幅が生じるはずはなく、標的配列は検出されないはずである。いずれにせよ、増幅された標的配列は、典型的には、標識を使用して検出される。標識は、検出可能な特性を有し標的配列のコピー内に取込まれうる部分である。典型的には、標識をプライマー配列に結合させ、ついでそれを前記のとおりに増幅産物内に取込ませることにより、増幅された標的配列内に標識を取込ませる。別法として、例えば、標識されたヌクレオチドをプライマー伸長中にそのような産物内に取込ませることにより、伸長産物を標識することができる。ついで、標識された増幅産物を検出することにより、試験サンプル中の標的配列の存在を判定する。
【０００５】
また、増幅された標的配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズする標識プローブを使用して、増幅された標的配列を検出することができる。しかし、時には、二本鎖増幅産物の一方の鎖だけにハイブリダイズするプローブを使用するのが望ましい。そのような検出方式の結果として、少なくともそれが二本鎖標的配列に適用された場合には、増幅された標的配列の一本鎖を検出して試験サンプル中の標的配列の存在が判定される。しかしながら、試験サンプル中に元々存在する標的配列の数が増加するにつれてシグナルが横ばい状態になり時には低下（または停留する）する限り、増幅産物の一本鎖の検出は非効率的となりうる。特に、試験サンプル中の標的配列を定量するように設計された増幅に基づくアッセイの場合には、「停留」または「横ばい」現象を緩和し、より広い標的配列濃度範囲にわたり直線的なシグナルを得ることができれば好都合であろう。
【０００６】
一方のプライマーの濃度を他方のプライマーに対して実質的に増加させて、より多くの検出配列を生成させることにより、この問題は緩和されると予想されるであろう。実際のところ、米国特許第5,066,584号は、一方のプライマーの濃度を著しく増加させることにより二本鎖標的配列の一方の鎖を優先的に生成させるための方法を記載している。しかしながら、これは過剰の試薬を必要とし、したがって2つの一本鎖のうちの一方の優先的な生成に伴う余分の経費を必要とする。また、プライマー濃度を実質的に増加させることは、非特異的プライミングおよびそれに伴う非標的配列の増幅の可能性を増加させうる。さらに、多くの場合、非特異的反応を競合させると、関心のある配列の効率的な増幅が妨げられるであろう。したがって、一方のプライマーの濃度を他方のプライマーに対して実質的に増加させると、高感度設計の（すなわち、少数の関心のある配列を検出するよう設計された）増幅アッセイにおいては問題が生じうると予想されうる。
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、試験サンプル中の標的配列を検出する方法を提供する。本発明は、（a）試験サンプル、増幅試薬、第1プライマーおよび第2プライマーを含む反応混合物を、該反応混合物中の該第1プライマーの濃度が該第2プライマーの濃度より15％〜250％大きくなるように調製し、（b）標的配列を増幅して、該第1および第2プライマーからの増幅産物を含む標的配列のコピーを得、（c）該第1プライマーからの増幅産物にプローブをハイブリダイズさせてハイブリッド複合体を形成させ、（d）該試験サンプル中の標的配列の存在の指標として該ハイブリッド複合体を検出する工程を含む。好ましくは、直接的または間接的に検出されうる標識を使用して、該ハイブリッド複合体を検出する。
【０００８】
また、（a）試験サンプル、第1および第2プライマー配列ならびに増幅試薬を含む増幅混合物を調製し、（b）標的配列を増幅して、該第1および第2プライマーからの増幅産物を含む標的配列のコピーを得、（c）該試験サンプル中の核酸配列の存在の指標として該標的配列のコピーを検出する工程を含んでなる、試験サンプル中の標的核酸配列を増幅し検出するための改良された方法であって、該第1プライマー配列を該第2プライマーに対して15％〜250％過剰に与えることを含む改良がなされており、該第1プライマーからの増幅産物にプローブをハイブリダイズさせてハイブリッド複合体を形成させ、該試験サンプル中の核酸配列の存在の指標として該ハイブリッド複合体を検出することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明の方法を実施するためのキットも提供する。
【００１０】
（発明の詳細な記載）
適当な条件下、プライマーのペアは二本鎖増幅産物の形態の標的配列のコピーを与えるであろう。しかし、残念ながら、二本鎖増幅産物の一本鎖をプローブで検出する場合には、元の標的配列の濃度が増加するにつれて、生じるシグナルは、横ばい、さらには停留状態となりうる。元の標的配列の濃度の増加は、より大きな濃度の最終産物を与えるはずであり、したがって、より大きなシグナルが検出されるはずであるため、この現象は或る程度は信じがたいことである。しかし、前記のとおり、生じるシグナルは横ばい状態になりうる。理論に束縛されることを望むものではないが、該停留効果は、産物鎖の再アニーリングによりプローブ／標的鎖のアニーリングの排除を引き起こす、より高濃度の、より長い産物鎖の存在に起因するものであるかもしれない。本出願人は、驚くべき且つ意外なことに、該横ばい又は停留現象が、一方のプライマーの濃度が他方のプライマーの濃度より若干高くなるようその一方のプライマーの濃度を増加させることにより軽減されうることを見出した。
【００１１】
本発明で提供する方法は、二本鎖増幅産物を得るためにプライマー配列のペアを使用し該二本鎖産物の一方の鎖だけを検出する任意の増幅反応に適用することができる。該方法は、増幅混合物を調製する工程を含む。該増幅混合物は、一般には、（i）試験サンプル、（ii）増幅試薬、ならびに（iii）第1および第2プライマー（「プライマーペア」と総称される）を含むであろう。本発明で用いる「試験サンプル」なる語は、標的配列を含有すると疑われる任意のものを意味する。試験サンプルは、例えば血液、眼水晶体液、脳脊髄液、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水、組織、発酵ブロス、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものである。試験サンプルは、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。したがって、例えば、血液から血漿を調製する、細胞またはウイルス粒子を破壊する、固体材料から液体を調製する、粘液を希釈する、液体を濾過する、液体を蒸留する、液体を濃縮する、阻害成分を不活性化する、試薬を加える、核酸を精製することなどにより、試験サンプルを使用前に前処理することができる。試験サンプル中に存在しうる「標的配列」は、増幅される又は検出される又は増幅および検出される核酸配列である。また、標的配列なる語は一本鎖をさすことがあるが、当業者は、標的配列が実際には二本鎖となりうることを認識するであろう。
【００１２】
本発明で用いる「増幅反応試薬」なる語は、核酸増幅反応において使用されることが良く知られている試薬を意味し、DNAポリメラーゼおよび／または逆転写活性を別々または個々に有する酵素；酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン；塩；ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）；デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、例えばデオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸；および適当なバッファーを含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
該第1および第2プライマーは、典型的には核酸配列、通常はDNAまたはRNAである。該プライマーの長さは決定的に重要というわけではないが、プライマー配列は、通常、約10〜約100ヌクレオチド長、好ましくは、約15〜35ヌクレオチド長であり、所望の標的配列にハイブリダイズするのに適した一定の塩基配列を有する。プライマーペアは、通常、当技術分野においてよく知られているとおり、それらが標的配列に隣接するように選択される。また、該第1プライマーは、その濃度が該第2プライマーの濃度より15％〜250％、好ましくは20％〜150％大きくなるように該増幅混合物に加える。もちろん、該第1プライマーは、該第2プライマーの濃度より400％、500％および1000％以上大きな濃度で使用することが可能であるが、一方のプライマーの、他方のプライマーに対する濃度が増加するにつれて、試薬のコストおよび／または非特異的プライミングが限定要因となりうる。いずれにせよ、プライマーが標的配列にハイブリダイズすると、該プライマーが伸長されて、該プライマーがハイブリダイズした配列の相補体を与える。
【００１４】
プライマー配列は、天然または合成起源に由来するものであってもよく、現在利用可能な種々の技術を用いて常法により合成することができる。例えば、プライマーは、通常のヌクレオチドホスホルアミジット化学と、Perkin Elmer/Applied Biosystems, Div. (Foster City, CA）またはPerceptive Biosystems, Inc.（Framingham, MA）から入手可能な装置とを用いて合成することができる。所望により、当技術分野においてよく知られた方法（例えば、参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,464,746号、第5,424,414号および第4,948,882号に記載のもの）を用いてプライマーを標識することができる。
【００１５】
該増幅混合物を調製した後、標的配列の増幅を促進する条件である「増幅条件」に反応混合物を付すことにより該標的核酸を増幅する。増幅条件は当業者によく知られており、一般には、二本鎖標的配列の解離、該標的配列の一本鎖に対するプライマー配列のアニーリング、およびプライマー配列の伸長およびそれによる標的配列のコピーの形成を促進する条件を含む。ついで標的配列のコピーを該標的から解離させ、追加的なプライマーを元の標的配列と標的配列のコピーとの両方にアニーリングさせて、標的配列の増幅の新たなラウンドを開始させる。そのような増幅条件はよく知られており、参照により本明細書に組み入れる米国特許第4,683,202号および第4,683,195号に記載されている。サーモサイクリングが好ましく、これは、増幅条件を得るためのよく知られた方法である。増幅混合物が付されるサイクルの回数は、当業者により選択され、典型的には、反応混合物を2〜100回、より典型的には20〜40回のサイクルに付す。
【００１６】
サイクリング後には、標的配列の多数のコピーが存在しうる。第1プライマーにより産生される配列は、試験サンプル中の標的配列の存在を示すために検出される配列であり、第1プライマーにより合成されたこの配列は、本発明においては様々な場合に「一次配列」と称される。二本鎖増幅産物の一本鎖を検出するための任意の方法を、本発明の方法において用いることができる。例えば、一次配列を検出するために、配列決定、ゲル電気泳動、ゲルシフトアッセイ、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、「TaqMan」様アッセイおよび同様の方式を用いることができる。
【００１７】
好ましい検出実施形態においては、ハイブリダイゼーションプローブを使用して一次配列を検出する（特に、該プローブが比較的低濃度で存在する場合）。プローブ配列は一次配列にハイブリダイズして、ハイブリッド複合体を形成する。好ましくは、プローブは、該プライマーに対して内部の領域において一次配列にハイブリダイズする。いずれかの二本鎖標的配列を解離条件下に配置し、生じた一本鎖配列を、プローブの存在下、ハイブリダイゼーション条件下に配置することにより、一次配列とプローブとのハイブリッド複合体の形成を達成することができる。「解離条件」なる語は、一般には、二本鎖核酸から一本鎖形態への解離を促進する条件と定義される。これらの条件には、高い温度および／または低いイオン強度が含まれうる。「ハイブリダイゼーション条件」なる語は、一般には、相補的核酸配列の核形成およびアニーリングを促進する条件と定義される。そのようなアニーリングおよびハイブリダイゼーションは、温度、イオン強度、配列の長さおよび配列のG:C含量を含むいくつかのパラメーターに、ある程度予想されうる様態で依存することが、当技術分野においてよく知られている。与えられた任意のセットの配列に関して、いくつかの公知方法のいずれかにより溶融温度すなわちTmを推定することができる。典型的には、ハイブリダイゼーション条件は、与えられたセットの核酸配列の溶融温度より若干低い温度を含む。イオン強度または「塩」濃度も溶融温度に影響を及ぼす。なぜなら、小さな陽イオンは、ホスホジエステルバックボーン上の負電荷を遮蔽することにより二本鎖の形成を安定化する傾向があるからである。典型的な塩濃度は該陽イオンの性質および原子価に左右されるが、これは当業者に容易に理解される。同様に、高いG:C含量および配列の長さの増加も、二本鎖の形成を安定化することが知られている。なぜなら、G:C対形成は3個の水素結合を含むが、A:T対形成はそれを2個しか有さず、また、より長い配列は、それらの鎖を合体させる、より多数の水素結合を有するからである。したがって、高いG:C含量およびより長い配列長は、「ハイブリダイゼーション条件」に含まれるものに影響を及ぼす。前記に基づき、ある特定のセットの核酸配列に適した「ハイブリダイゼーション条件」を決定することは当技術分野の通常の技量の範囲内に十分に含まれるものである。参照により本明細書に組み入れる1995年8月14日付け出願の米国特許出願第08/514,704号は、増幅された標的配列をプローブで検出する方法を例示している。
【００１８】
また、プローブは、前記のとおりにプライマー配列を合成し標識するのと同様にして合成し標識しうる核酸配列または核酸類似体配列、例えばDNA、RNA、ペプチド核酸、モルホリノ核酸である。標識プライマーまたはプローブ上に用いる標識の選択は当業者により行われるものであり、本発明で用いる「標識」なる語は、検出されうる特性を有する分子または部分を意味する。標識は、例えば放射性同位体、発蛍光団、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子、FRETペアなどのように、直接的に検出可能なものであってもよい。あるいは、標識は、例えば特異的結合メンバーのように、間接的に標識可能なものであってもよい。直接的に検出可能な標識は、該標識の検出を可能にする例えば基質、誘発試薬、光などの追加的成分を必要とすると理解されるであろう。間接的な標識を検出に使用する場合には、後記で更に詳しく説明するとおり、典型的には、それらをコンジュゲートと共に使用する。
【００１９】
プローブは、一次配列を検出するための当技術分野で公知の種々の方法で使用することができる。例えば、該プローブ、プライマーまたはプローブおよびプライマーは、一次配列の存在を検出するために標識および／または固体支持物質に固定化することができる。また、一次配列の検出を補助するために捕捉試薬を使用することができる。本発明で用いる「捕捉試薬」は、固体支持物質に結合した特異的結合メンバーを意味する。本発明で用いる「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペア（すなわち、一方の分子が例えば化学的または物理的手段を介してもう一方の分子に特異的に結合する2つの異なる分子）のメンバーを意味する。抗原および抗体の特異的結合ペアに加えて、他の特異的結合ペアには、アビジンおよびビオチン；相補的ヌクレオチド配列；それぞれ米国特許第5,424,414号および米国特許第5,464,746号（これらの特許の開示を参照により本明細書に組み入れる）に記載のカルバゾールおよびアダマンタンなどのハプテンに特異的な抗体およびハプテンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。「固体支持物質」は、不溶性であるか又は後続の反応により不溶性にされうる任意の物質を意味する。したがって、固体支持物質は、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラス、シリコンなどであってもよい。また、多数の固体支持物質形態がよく知られており、それらには、試験管の表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者によく知られている他の形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
プローブを使用して一次配列を検出するための1つの実施形態においては、捕捉試薬を形成させるために該プローブを固体支持物質に固定化することができる。そのようにして形成された捕捉試薬と一次配列とをハイブリダイゼーション条件下で接触させてハイブリッド複合体を形成させ、それにより該一次配列を捕捉し、所望により、それを他の増幅反応物および産物から分離することができる。ついで、一次配列に結合した標識からのシグナルを、捕捉試薬上の、したがって試験サンプル中の一次配列の存在の指標として検出することができる。
【００２１】
もう1つの別法として、第1プライマーおよびプローブを標識し、該標識を使用して一次配列を分離し検出することができる。例えば、そのような形態の両方の標識は特異的結合メンバーであってもよい。したがって、ハイブリッド複合体が形成したら、該複合体は二重標識されることになる。一方の標識は、ハイブリッド複合体の分離を可能にする捕捉試薬上の特異的結合メンバーに結合し、もう一方の標識は、該捕捉試薬上のハイブリッド複合体の存在の検出に使用されうるコンジュゲートに対する結合に用いられうる。本発明で用いる「コンジュゲート」なる語は、直接的に検出可能な標識に結合または共役している特異的結合メンバーを意味する。コンジュゲートを合成するための共役化学は当技術分野においてよく知られており、例えば、特異的結合メンバーの特異的結合特性または該標識の検出可能な特性を損なわない任意の化学的手段および／または物理的手段を含みうる。
【００２２】
実施例
以下の実施例においては、本発明で提供するDNAオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを使用するHIV核酸の検出を示す。これらのDNAプライマーおよびプローブは、配列番号2、配列番号3および配列番号4と表示されており、HIVのpol遺伝子内の領域に特異的である。HIV-1（サブタイプB、MN株）からの代表的pol配列の部分は、本発明では配列番号1と称される。これらのプライマーおよびプローブは、HIV-1のサブタイプA〜FおよびOを代表する31個のHIV-1分離株のpol領域の分析から導き出されたコンセンサス配列である。
【００２３】
以下の実施例においては、HIV-1のpol領域に特異的なコンセンサス増幅プライマーとして配列番号2および配列番号3を使用する。HIV-1 pol増幅産物に関するコンセンサス内部ハイブリダイゼーションプローブとしては、配列番号4を使用する。
【００２４】
実施例 1
HIV プライマーおよびプローブの調製
A．HIV プライマー
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションPCRにより全ての公知HIV-1サブタイプのHIV pol標的配列を検出するために、コンセンサスプライマーを設計した。これらのプライマーは配列番号2および配列番号3であった。標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いてプライマー配列を合成し、米国特許第5,424,414号（参照により本明細書に組み入れる）に記載の標準的なシアノエチルホスホルアミジットカップリング化学を用いて配列番号3を5'末端にてカルバゾールでハプテン化した。
【００２５】
B．HIV プローブ
配列番号4で示されるコンセンサスプローブは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより増幅HIV pol標的配列にハイブリダイズするように設計した。該プローブ配列は、標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成し、米国特許第5,464,746号（参照により本明細書に組み入れる）に記載の標準的なシアノエチルホスホルアミジットカップリング化学を用いて5'末端にて2個のアダマンタンでハプテン化し、3'末端にてホスファートで保護した。
【００２６】
実施例 2
種々の未標識プライマー濃度における HIV の検出
HIV RNAを、RNAzol B RNA Isolation Solvent（Tel-Test, Inc., Friendswood, TX）を使用して既知量のビリオン（Advanced Biotechnologies Inc, Columbia, MD）から単離し、クロロホルム／イソプロパノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。RNアーゼを含まない水（5'-3', Boulder CO）中で該ペレットを再懸濁させた。ついで2ng/μlのリボソームRNA（rRNA; Boehringer-Mannheim, Indianapolis IN）を含有する希釈剤を使用して、このHIV RNAの10倍希釈物をRNA分子106〜101個/25μlの濃度で調製した。
【００２７】
HIV RNAの希釈物（104を除く）を逆転写し、PCR増幅し、HIVプローブとしての配列番号4と共にプライマーとしての配列番号2および3を使用して検出した。1×EZバッファー、2.5mM塩化マンガン、それぞれ最終濃度0.15mMで存在するdNTP（dATP、dGTP、dTTPおよびdCTP）および5単位/反応の濃度の組換えサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）ポリメラーゼを使用してRT-PCRを行った。標識プライマー（配列番号3）は50nMの濃度で使用し、未標識プライマーの濃度は、HIV RNA希釈物の各組ごとの別々の反応において、25、37.5、50または62.5nMの濃度を用いて種々変化させた。生じるハイブリッド複合体の検出前に該標識プライマーの産物にハイブリダイズする前記のとおりに標識されたプローブを、10nMの濃度で使用した。25μlのサンプル容積中のHIV RNAの10倍希釈物を、前記混合物を含有する175μlに加えて0.2mlの合計反応容積にした。陰性対照は50ngのrRNA/反応を含むものであった。すべての反応は二重に行った。
【００２８】
反応混合物を逆転写し、Perkin-Elmer 480 Thermal Cycler中で増幅した。反応混合物を、該RNAを逆転写するためにまず62℃で30分間、ついで94℃で2分間インキュベートした。ついで、増幅の初期段階における反応のストリンジェンシーを補助するためにタッチダウン（touchdown）またはステップ・ダウン（step-down）プロトコールでPCR増幅を開始した。これは以下の8サイクルを用いるものであった：94℃で30秒間およびそれに続く70℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く69℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く68℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く67℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く66℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く65℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く64℃で80秒間の1サイクル、ついで94℃で30秒間およびそれに続く63℃で80秒間の1サイクル。ついで、94℃で30秒間およびそれに続く62℃で80秒間の35サイクルで、更なる増幅を行った。該反応混合物をサーマルサイクルに付した後、すべての重複体をプールし、ピペッティングにより混合して、サイクリングによるばらつきを排除した。ついで該混合物を分割し、97℃で5分間変性させた。この後、温度を15℃に5分間低下させることによりプローブオリゴハイブリダイゼーションを行った。ついで該温度を4℃に低下させ、反応産物の検出までサンプルを4℃に維持した。
【００２９】
反応産物をAbbott LCx（登録商標）系（Abbott Laboratories, Abbott Park, ILから入手可能）上で検出した。抗カルバゾール抗体でコーティングされた微粒子（0.06％固体）および抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート（これらはすべてAbbott Laboratories, Abbott Park, ILから入手可能）の懸濁液をLCx（登録商標）と共に使用して、増幅産物／プローブハイブリッドを捕捉し検出した。使用した酵素基質はメチル-ウンベリフェリルホスファート（MUP）であった。MUPからMUへの変換速度を測定し、カウント/秒/秒（c/s/s）で表した。
【００３０】
この実験からのデータは表1に示されており、未標識プライマーが標識プライマーの濃度より低い濃度で存在する場合には、より高い標的濃度において、より高いシグナルが得られ、該シグナルの横ばいが避けられることを示している。逆に、未標識プライマーの濃度が標識プライマーの濃度より高いまたは等しい場合には、より高い標的濃度が開始するとより低いシグナルが生じる「停留効果」が認められる。
【００３１】
【表１】
また、この実験を、5分間の代わりに15分間の変性時間を用いて行ったところ、同等の結果が得られた。
【００３３】
実施例 3
種々の標識プライマー濃度における HIV の検出
未標識プライマー（配列番号2）の2つの別々の調製物（GおよびA）（共に50nM）を使用し標識プライマー（配列番号3）の濃度をHIV RNA希釈物の各組ごとの別々の反応において25、50および75nMの標識プライマーを使用して種々変化させた以外は実施例2と同様にして、実施例2で用いたのと同じHIV RNAサンプル希釈物を逆転写し、PCR増幅し、検出した。すべての反応は二重に行い、増幅およびプローブハイブリダイゼーションの後に二重のセットをプールして、サイクリングによるばらつきを排除した。反応産物の検出には、抗カルバゾール抗体でコーティングされた微粒子を、実施例2で使用した0.06％固体に加えて0.12％および0.18％固体の濃度で使用した。
【００３４】
【表２】
それらの2つの未標識プライマー調製物（GおよびA）は、若干異なる値を与えたが、同じ全体的傾向を示した。いずれの場合においても、未標識プライマーの濃度が標識プライマーの濃度より高い又は等しい場合には、実施例2と同様に、高い標的濃度が低いシグナルを与える「停留効果」が再び認められた。未標識プライマーが標識プライマーより低い濃度で存在する場合にのみ、標的濃度と相関した、より直線的なシグナルが得られた。これらの条件下では、実施例2と同様にこの場合においても、より高いシグナルが、より高い標的濃度で得られ、該シグナルの横ばいは避けられた。
【００３６】
0.12％および0.18％固体の微粒子濃度の使用は同等の結果を与え、共に、0.06％固体を使用した場合より若干高いシグナルを与えた。しかし、該微粒子濃度の変更は、標識プライマーに対する未標識プライマーの比率により認められる全体的傾向に影響を及ぼさなかった。
【００３７】
実施例 4
種々のプライマーおよびプローブ濃度における HIV の検出
実施例2で用いたのと同じHIV RNAサンプル希釈物を、両方のプライマーおよびプローブの濃度を種々変化させた以外は実施例3と同様にして、逆転写し、PCR増幅し、検出した。未標識プライマー（配列番号2）は、50nMの増加量で変化する100〜250nMの濃度で使用した。標識プライマー（配列番号3）は、50〜100nMの増加量で変化する50〜500nMの濃度で使用した。表3に示すとおりの種々の濃度のプライマーと共に、該プローブを10、25および40nMの濃度で使用した。
【００３８】
【表３】
全3個の微粒子濃度を試験したが、0.12％固体を使用したデータが、全3個の微粒子濃度で得られたデータに典型的なものであったため（実施例3と同様）、このデータのみが表3に示されている。
【００４０】
本実施例に示されるとおり、未標識プライマーの濃度が標識プライマーの濃度より高い又は等しい場合には、「停留効果」が認められた。標識プライマーが未標識プライマーより高い濃度で存在した場合には、該停留効果は消失した。
【００４１】
本発明は特定の実施形態に関して詳細に説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなくそのような実施形態に種々の変更および修飾を施しうることが当業者に明らかであろう。
【配列表】
Claims (6)
- （a）試験サンプル、第1および第2プライマー配列ならびに増幅試薬を含む増幅混合物を調製し、ここにおいて第1および第2プライマー配列は、該混合物中のみのプライマー配列であり、
（b）標的配列を増幅して、該第1および第2プライマーからの増幅産物を含む標的配列のコピーを得、
（c）前記増幅産物を解離させ、及び
（d）該試験サンプル中の核酸配列の存在の指標として該標的配列のコピーを検出する、の工程を（ａ）から（ｄ）の順に行う、試験サンプル中の標的核酸配列を増幅し検出するための方法において、
該第1プライマー配列を該第2プライマーに対して15％〜250％過剰に与えることを含む改良がなされており、
（ｃ）工程において解離した該第1プライマーからの前記増幅産物にプローブをハイブリダイズさせてハイブリッド複合体を形成させ、該試験サンプル中の核酸配列の存在の指標として該ハイブリッド複合体を検出することを特徴とする前記方法。 - 該第1プライマーが標識されている、請求項1に記載の方法。
- 該プローブが標識されている、請求項1に記載の方法。
- 該第1プライマーが該第2プライマーに対して20％〜150％過剰である、請求項1に記載の方法。
- 該プローブが特異的結合メンバーで標識されており、該第1プライマーが特異的結合メンバーで標識されており、該ハイブリッド複合体を捕捉試薬およびコンジュゲートで検出する、請求項1に記載の方法。
- 請求項1乃至5のいずれかに記載の方法を行なうための、第1および第2プライマーを含んでなるキットであって、該第1プライマーが、その濃度が該第2プライマーより15％〜250％大きくなるように該キットに含まれていることを特徴とするキット。
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