CN116042648B - OsGELP77基因在改良水稻抗病性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsGELP77基因在改良水稻抗病性中的应用。从水稻中克隆得到OsGELP77基因,其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。通过对OsGELP77基因的生物学功能的研究证明，在水稻中过量表达OsGELP77基因能使水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌的多个不同致病小种均表现出抗病性增强的能力，其农艺性状没有明显改变。在水稻中敲除OsGELP77基因能使水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌的多个不同致病小种均表现出抗病性降低，其农艺性状变差。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsGELP77基因在改良水稻抗病性中的应用，所述基因可用于在培育增强广谱抗白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的水稻品种改良中的应用。
背景技术
水稻在生产上遭受多种病害危害，其中细菌病害白叶枯病和细菌性条斑病、真菌病害稻瘟病是影响水稻生产最为严重的病害，对我国乃至世界稻米安全生产影响尤为显著。据研究报道稻瘟病可以造成水稻减产10-35％，白叶枯病可以造成水稻减产20-30％，细菌性条斑病可以造成水稻减产20％左右。近几十年来，随着气候变化、优质杂交稻大面积推广、氮肥大量施用，这些真菌和细菌病害在我国各个水稻生产区大面积发生，且有逐年增加的趋势。因此，发掘并有效利用水稻自身的抗病基因，改良水稻品种，以提高水稻对不同病害抗病性迫在眉睫。
植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：主效抗病基因和抗病QTL基因。但是主效抗病基因的资源有限，主效抗病基因仅仅对一种病害有抗性，或只对某一种病害的一个或少数几个致病小种有抗性，抗病范围有限。目前只有抗稻瘟病和白叶枯病的主效抗病基因被鉴定和克隆，尚无抗细菌性条斑病的主效抗病基因被发现或鉴定。除主效抗病基因以外还有一些抗病QTL基因被鉴定，其中少数抗病QTL基因被克隆，它们编码的蛋白质参于合成植物体内抗病信号分子、信号传导、防卫反应、此生代谢物等。但是在有效利用这些抗病QTL基因过程中发现部分抗病QTL基因对水稻重要农艺性状有负面影响，在一定程度上限制了对它们的育种应用。
本发明研究发现，水稻中的OsGELP77基因受白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌的诱导表达，过量表达OsGELP77基因可以增强水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的广谱抗病性，且对水稻重要农艺性状没有明显影响。而敲除OsGELP77基因可降低水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的广谱抗病性。本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的改良上具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，通过对OsGELP77基因的生物学功能的研究，发现其在水稻抗白叶枯病、抗细菌性条斑病和抗稻瘟病上具有重要调控作用，通过调节OsGELP77基因表达水平影响水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的广谱抗病性。因此，本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的改良上具有重要的意义。
本发明的技术方案如下所述：
本发明证实在水稻中过量表达OsGELP77基因使水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌的多个不同致病小种均表现出抗病性增强的能力。本发明通过敲除OsGELP77基因可降低水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的广谱抗病性。通过***研究，申请人发现OsGELP77基因在水稻抗白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病方面具有着重要的调控功能。
经过生物学功能验证证明，本发明所提供的水稻OsGELP77基因具有以下特性：
1、OsGELP77基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列由水稻OsGELP77基因及其上下游非编码序列共2289个脱氧核糖核苷酸组成。SEQ ID NO:1所示序列中第1位至177位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的上游非编码序列；第178位至412位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第一个外显子序列；第413位至545位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第一个内含子序列；第546位至755位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第二个外显子序列；第756位至842位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第二个内含子序列；第843位至1265位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第三个外显子序列；第1266位至1727位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第三个内含子序列；第1728位至1942位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的第四个外显子序列；第1943位至2289位的脱氧核糖核苷酸为OsGELP77基因的下游非编码序列。
2、本发明涉及的OsGELP77基因序列可用于在作物，特别是水稻抗病育种、转基因株系、基因新品种中的应用。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
过量表达OsGELP77基因增强水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的广谱抗病性。敲除OsGELP77基因可降低水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的广谱抗病性。
附图说明
图1：本发明鉴定和分离克隆水稻OsGELP77基因以及验证OsGELP77基因功能的技术流程图。
图2：用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，RT-qPCR)技术检测水稻品种“中花11”分别接种不同病原菌后OsGELP77基因的表达模式。附图标记说明：图2中的A图表示水稻接种白叶枯病菌PXO99后OsGELP77基因的表达量水平，每个样品中OsGELP77基因的表达量是相对于水稻中花11接种白叶枯病菌0小时的表达量，每个数据是平均值(3个重复)±标准差；图2中的B图表示水稻接种细菌性条斑病菌GX01后OsGELP77基因的表达量水平，每个样品中OsGELP77基因的表达量是相对于水稻中花11接种细菌性条斑病菌0小时的表达量，每个数据是平均值(3个重复)±标准差；图2中的C图表示水稻接种稻瘟病菌M2后OsGELP77基因的表达量水平，每个样品中OsGELP77基因的表达量是相对于水稻中花11接种稻瘟病菌0天的表达量。每个数据是平均值(3个重复)±标准差。
图3：本发明所用遗传转化载体pU1301的载体图谱。附图标记说明：图3表示pU1301的载体图谱。其中RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，GUS表示β-葡萄糖苷酸酶基因，Hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因，PUbi表示玉米泛素基因启动子，TEVL表示烟草蚀刻病毒的5′非翻译区，NOS表示胭脂碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号。OsGELP77基因序列在组成型启动子PUbi的驱动下，连入到超量表达载体pU1301。利用该载体转化野生型水稻(即通常所说的非转基因水稻品种)，进而在水稻中过量表达OsGELP77基因。
图4：过量表达OsGELP77基因水稻株系中OsGELP77基因表达量检测。附图标记说明：OsGELP77基因过量表达(OsGELP77-OE)的8个转基因单株中OsGELP77基因的表达水平，以转基因背景野生型作为对照。
图5：本发明所用遗传转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH(KR029109)的载体图谱。附图标记说明：图5表示pYLCRISPR/Cas9-MH的载体图谱。其中：P35：HPT表示花椰菜花叶病毒的35S启动子启动表达的潮霉素磷酸转移酶基因；PUbi表示玉米泛素基因启动子；NLS表示核定位信号序列；Tnos表示根癌农杆菌终止子序列。
图6：本发明OsGELP77基因敲除水稻株系靶位点的设计位点及基因型检测。附图标记说明：图6中的A图表示U3启动子引导gRNA和U6a启动子引导gRNA的设计位点；图6中的B图表示OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2与野生型相比缺失的脱氧核糖核苷酸数目及位置；图6中的C图表示利用琼脂糖凝胶电泳检测OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2的PCR产物与野生型水稻相比明显变小。
图7：OsGELP77基因过量表达株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2接种不同白叶枯病菌(PXO61、PXO71、PXO341、PXO347，来自菲律宾国际水稻研究所)后的病斑长度。附图标记说明：OsGELP77基因过量表达株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10接种不同白叶枯病菌水稻后的病斑长度与野生型水稻植株相比显著性变短；OsGELP77基因敲除的水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2接种不同白叶枯病菌后的病斑长度与野生型水稻植株相比显著变长。结果显示OsGELP77基因过量表达水稻株系对不同白叶枯病菌表现出广谱抗病性增强的表型，而OsGELP77基因敲除水稻株系对不同白叶枯病菌表现出抗病性降低的表型。
图8：OsGELP77基因过量表达株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2接种不同细菌性条斑病菌(RH3、GX01、HNB8-47、RS105，上海交通大学陈功友教授馈赠)后的病斑长度。附图标记说明：OsGELP77基因过量表达株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10接种不同细菌性条斑病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变短；OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2接种不同细菌性条斑病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变长。结果显示OsGELP77基因过量表达水稻株系对不同细菌性条斑病菌表现出广谱抗病性增强的表型，而OsGELP77基因敲除水稻株系对不同细菌性条斑病菌表现出抗病性降低的表型。
图9：OsGELP77基因过量表达株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2接种稻瘟病菌M2后的病斑长度。附图标记说明：OsGELP77基因过量表达株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10接种稻瘟病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变短；OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2接种稻瘟病菌后的病斑长度与野生型植株相比显著性变长。结果显示OsGELP77基因过量表达水稻株系对稻瘟病菌表现出广谱抗病性增强的表型，而OsGELP77基因敲除水稻株系对稻瘟病菌表现出抗病性降低的表型。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是OsGELP77基因的核苷酸序列。序列长度为2289bp。
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。图1描述了鉴定和分离克隆OsGELP77基因以及验证OsGELP77基因功能的流程。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参考：《Molecular Cloning:A Laborato；ry Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)或相关产品。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购的常规产品。
实施例1：分析不同病原菌处理水稻后OsGELP77基因的表达模式
为了验证OsGELP77基因是否参与调控水稻的抗病反应。申请人对孕穗期水稻品种“中花11”(该品种来自于中国农业科学院作物科学研究所，为一种公知公用和科研用的模式品种)的叶片分别接种白叶枯病菌PXO99、细菌性条斑病菌GX01和稻瘟病菌M2，采用RT-qPCR技术分析OsGELP77基因响应病原菌的表达模式，其中所用引物为OsGELP77RTF(5’-CATGTACGCCGACTTCTACTC-3’)和OsGELP77RTR(5’-GCCCTCAAATTCGTGCTAAAC-3’)。结果显示OsGELP77基因能被白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌诱导表达。这一结果提示：OsGELP77基因可能参与调控水稻对白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和稻瘟病菌的抵抗反应(结果见图2)。
实施例2：过量表达OsGELP77基因水稻材料的获得
(1)过量表达OsGELP77基因表达载体的构建
本实施例是关于pU1301-OsGELP77载体构建的一个通用说明。
首先以中花11水稻DNA为模板，设计如下引物OsGELP77F(5’-ATTTACGAACGATAGCCGGTACCGGCATTGCCTCATCCAT-3’)和OsGELP77R(5’-TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCGGGCATGATCGGCGGGT-3’)，利用高保真DNA聚合酶PCR扩增OsGELP77基因序列。电泳回收PCR产物，并连接到克隆载体pGEM-T-EASY vector上，转化大肠杆菌DH5α，涂板获取单克隆。选择测序正确的克隆提取质粒，用KpnI和BamHI酶切，回收OsGELP77基因片段。同时，将载体pU1301(图谱见图3)用KpnI和BamHI酶切过夜并回收。将回收的OsGELP77基因片段与载体片段以摩尔比约3：1的量进行连接(T4 Ligase)过夜。第二天用连接产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，获得单克隆。然后选取所得单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，从验证正确的克隆中提取质粒，并进一步测序验证，从而获得用于植物转化的pU1301-OsGELP77载体。
(2)过量表达OsGELP77基因水稻株系的获得和鉴定
申请人将pU1301-OsGELP77载体通过农杆菌介导的遗传转化方法转入水稻品种中花11，获得了8个独立的转基因株系。采用RT-qPCR技术分析这些株系中OsGELP77基因的表达量，其中所用引物为OsGELP77RTF(5’-CATGTACGCCGACTTCTACTC-3’)和OsGELP77RTR(5’-GCCCTCAAATTCGTGCTAAAC-3’)。结果显示这8个独立的转基因株系中OsGELP77基因的表达量显著高于其在野生型对照中的表达水平(见图4)。随机选取OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10开展后续试验。
实施例3：OsGELP77基因敲除水稻材料的获得
(1)OsGELP77基因敲除载体的构建
本实施例是关于pYLCRISPR/Cas9-MH-OsGELP77载体构建的一个通用说明。设计如下引物OsGELP77 U3F(5’-GGCAGGCTGGGTGAGCGTCAGGCGTTTTAGAGCTAG-3’)和OsGELP77 U3R(5’-GCCTGACGCTCACCCAGCCTGCCACGGATCATCTGC-3’)，这对引物可以特异性匹配SEQ ID NO:1所示序列中第320位至339位脱氧核糖核苷酸，OsGELP77 U6aF(5’-GCCGGTTGCGTCCGCCATGTTCGGTTTTAGAGCTAG-3’)和OsGELP77 U6aR(5’-CGAACATGGCGGACGCAACCGGCAGCCAAGCCAGCAC-3’)，这对引物可以特异性匹配SEQ ID NO:1所示序列中第207位至226位脱氧核糖核苷酸，如图6A所示。进行2轮巢式PCR：第一轮PCR做2个反应，分别用U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)/OsGELP77 U3R和OsGELP77 U3F/gRNA-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)以pYLgRNA-OsU3载体(KR029104)为DNA模版进行PCR反应得到产物①和②，以及用U-F/OsGELP77 U6aR和OsGELP77 U6aF/gRNA-R以pYLgRNA-OsU6a载体(KR029105)为模版做PCR反应得到产物③和④；第二轮为重叠PCR，即用引物Up-T1(5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gR-T1(5’-CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)以①和②为模版做PCR反应得到产物⑤，以及引物Up-T2(5’-GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gR-T2(5’-CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)以③和④为模版做PCR反应得到产物⑥。用BsaI酶切pYLCRISPR/Cas9-MH载体(见图5)；将PCR产物⑤、⑥和BsaI酶切好的pYLCRISPR/Cas9-MH载体按照2：2：1体积混合，用pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit(北京全式金生物技术有限公司)50℃反应15分钟，用反应产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，从验证正确的克隆中提取质粒，并进一步测序验证。从而获得植物遗传转化载体(pYLCRISPR/Cas9-MH-OsGELP77)。
(2)OsGELP77基因敲除水稻株系的获得和鉴定
申请人将植物遗传转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH-OsGELP77通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11。获得了多个独立的转基因家系，选取家系1(命名为osgelp77-1)和家系2(命名为osgelp77-2)开展后续试验，用引物OsGELP77 CgF(5’-GGTGAGTAAGTTGAAGGTGGTC-3’)和OsGELP77CgR(5’-AGGGAGTTATGGCGGGAG-3’)PCR扩增野生型和OsGELP77基因敲除水稻株系的家系1和家系2，鉴定基因敲除情况。OsGELP77基因敲除水稻株系的家系1在两个设计靶位点之间缺失了99个脱氧核糖核苷酸，家系2在两个设计靶位点之间缺失了100个脱氧核糖核苷酸。结果见图6中的B图。利用PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示OsGELP77基因敲除水稻株系的家系1和家系2在基因组水平均存在大片段的脱氧核糖核苷酸的缺失(结果见图6中的C图)。
实施例4：OsGELP77基因过量表达水稻株系和敲除水稻株系的抗病性分析
(1)OsGELP77基因过量表达水稻株系和敲除水稻株系抗白叶枯病表型分析
在中国，湖北，武汉的夏季田间对OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2及野生型对照进行白叶枯病菌接种试验。结果显示，本发明的OsGELP77基因过量表达水稻株系在孕穗期接种不同白叶枯病菌致病小种(例如PXO61、PXO71、PXO341、PXO347，来自于菲律宾国际水稻研究所)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10发病长度均显著性短于野生型对照(p<0.01)。本发明的OsGELP77基因敲除水稻株系在孕穗期接种不同白叶枯病菌致病小种(PXO61、PXO71、PXO341、PXO347)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2发病长度均显著性长于野生型对照(p<0.01)。见图7。以上结果表明，OsGELP77基因过量表达水稻株系能增强水稻对白叶枯病菌多个致病小种的广谱抗病性，OsGELP77基因敲除表达水稻株系降低水稻对白叶枯病菌多个致病小种的抗病性。
(2)OsGELP77基因过量表达水稻株系和敲除水稻株系抗细菌性条斑病表型分析
在中国，湖北，武汉的夏季田间对OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2及野生型对照进行细菌性条斑病菌接种实验。结果显示，本发明的OsGELP77基因过量表达水稻株系在孕穗期接种不同细菌性条斑病菌致病小种(RH3、GX01、HNB8-47、RS105，菌株,由上海交通大学陈功友教授馈赠)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10发病长度均显著性短于野生型对照(p<0.01)。本发明的OsGELP77基因敲除水稻株系在孕穗期接种不同细菌性条斑病菌致病小种(RH3、GX01、HNB8-47、RS105)，与野生型(非转基因，下同)相比，OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2发病长度均显著性长于野生型对照(p<0.01)。见图8。以上结果表明，OsGELP77基因过量表达水稻株系能增强水稻对细菌性条斑病菌多个致病小种的广谱抗病性，OsGELP77基因敲除表达水稻株系降低水稻对细菌性条斑病菌多个致病小种的抗病性。
(3)OsGELP77基因过量表达水稻株系和敲除水稻株系抗稻瘟病表型分析
在中国，湖北，武汉的夏季田间对OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2及野生型对照进行稻瘟病菌接种试验。结果显示，本发明的OsGELP77基因过量表达水稻株系在孕穗期接种稻瘟病菌致病小种M2，与野生型(非转基因，下同)相比，OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10发病长度均显著性短于野生型对照(p<0.01)。本发明的OsGELP77基因敲除水稻株系在孕穗期接种稻瘟病菌M2，与野生型(非转基因，下同)相比，OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2发病长度均显著性长于野生型对照(p<0.01)。见图9。以上结果表明，OsGELP77基因过量表达水稻株系能增强水稻对稻瘟病菌的抗病性，OsGELP77基因敲除表达水稻株系降低水稻对稻瘟病菌的抗病性。
实施例5：OsGELP77基因过量表达水稻株系和敲除水稻株系的农艺性状的分析
在中国，湖北武汉华中农业大学校内科研基地，通过夏季种植野生型(非转基因，下同)、OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10、敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2。每份材料种植100株，正常水肥管理。
表1 OsGELP77基因过量表达水稻株系农艺性状考察及统计分析
表2 OsGELP77基因敲除水稻株系农艺性状考察及统计分析
于秋季成熟后收获水稻，调查农艺性状，包括株高、分蘖数、穗长、剑叶长、剑叶宽、粒长、粒宽、千粒重、结实率、单株产量。结果显示，OsGELP77基因过量表达水稻株系OsGELP77-OE6和OsGELP77-OE10的上述农艺性状与非转基因野生型对照相比没有明显差异(表1)。OsGELP77基因敲除水稻株系osgelp77-1和osgelp77-2的株高、剑叶长、剑叶宽、粒宽与非转基因野生型对照相比没有明显差异，而分蘖数、穗长、粒长、千粒重、结实率、单株产量与非转基因野生型对照相比明显降低(p<0.01)(见表2)。
Claims (1)
1.过量表达OsGELP77基因在培育广谱抗白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的水稻品种中的应用，其特征在于,所述OsGELP77基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
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