CN109207485B - OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用，从水稻中克隆得到OsAPS1基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过对OsAPS1基因的生物学功能的研究证明，在水稻中抑制或敲除OsAPS1基因能使水稻对多种不同的白叶枯病菌和细菌性条斑病菌表现出抗性增强的能力，通过调节OsAPS1基因表达水平影响水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的广谱抗病性。

Description

OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用，所述的基因为水稻OsAPS1基因，该基因可用于在培育增强广谱抗白叶枯病和细菌性条斑病的水稻品种中的应用。

背景技术

水稻是人类最重要的粮食作物之一，我国是水稻的第一生产大国，水稻的产量直接关系到我国乃至世界人口的生存。水稻的产量受很多因素影响，其中病害是影响水稻产量的重要因素之一。传统的病害防治主要是喷施化学药剂，从农业的可持续发展的观点长期喷施化学药剂一方面容易污染环境，另外一方面化学药剂会加快病原菌的变异，造成水稻感病。因此发掘水稻自身的抗病基因，改良水稻自身的防御体系，对培育优质抗病品种有着重要的意义。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：主效抗病基因和抗病相关基因。目前从植物中克隆了三十多个主效抗病基因，如水稻抗白叶枯病基因Xa21、Xa1、Xa26、xa5、Xa27、xa13等，水稻多个抗稻瘟病基因如Pib、Pi-ta、Pi9、Pi2等。但是主效抗病基因的资源有限，大多数的主效抗病基因仅仅对一个或少数几个致病小种有抗性，抗病范围有限，加上在主效抗病基因的克隆进度上总是慢于病原物致病性的变化，因而大大限制了主效抗病基因在农业生产中的应用。

植物中除主效抗病基因以外所有参与抗病反应的基因都称为抗病相关基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、信号传导或防卫反应等。目前，已克隆得到许多抗病相关基因。从水稻中鉴定到十多个抗病相关基因，例如OsWRKY45、OsGH3-8、OsEDR1、OsMAPK6、OsYLP4等基因，这些基因编码不同类型的蛋白质，通过调控水稻体内不同反应途径参与水稻对不同病原菌的抗病过程，这些抗病相关基因大多数对不同类型病原菌均有广谱抗病性。

硫元素是植物生长必需的大量元素之一，是生物体内一些重要化合物的组成成分之一。在植物的生长发育、生物和非生物胁迫等过程中起作用，并且还是影响作物品质的重要因素之一。早在19世纪初人们就已认识到硫元素对植物生长发育的重要性，施加含硫化肥可以增加作物对真菌类病原菌的抵抗力。

ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase，ATPS)是植物硫酸盐同化过程中起作用的第一个酶，是硫酸盐同化途径的关键酶。编码ATPS的基因已经从拟南芥、马铃薯和烟草等植物中克隆出来。在大多数植物中有两种同工ATPS，分别位于细胞质和叶绿体内。叶绿体内的ATPS能启动硫酸盐的还原反应，而胞质内的ATPS被认为是为接下来的磺化反应提供APS，而不参与硫酸盐的还原反应。

本发明研究发现，水稻中的OsAPS1基因定位于叶绿体，抑制或敲除OsAPS1基因可增强水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的广谱抗病性。本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病和细菌性条斑病的改良以及水稻对硫酸根离子的同化吸收上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，通过对OsAPS1基因的生物学功能的研究，发现其在水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病上具有重要调控作用，通过调节OsAPS1基因表达水平影响水稻对白叶枯病和细菌性条斑病的广谱抗病性。因此，本发明对于重要粮食作物水稻在抗白叶枯病和细菌性条斑病的改良上具有重要的意义。

本发明的技术方案如下所述：

1、本发明证实在水稻中抑制或敲除OsAPS1基因能使水稻对多种不同白叶枯病菌和细菌性条斑病菌表现出抗性增强的能力。通过***研究，申请人发现OsAPS1基因在水稻抗白叶枯病和细菌性条斑病方面有着重要调控功能。

2、本发明证实OsAPS1定位于叶绿体，在叶绿体中发挥生物学功能。

经过生物学功能验证证明本发明所提供的水稻OsAPS1基因具有以下特性：

1、OsAPS1基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列由水稻OsAPS1基因及其上下游非编码序列共3413个脱氧核糖核苷酸组成。SEQ ID NO:1所示序列中第1位至183位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的上游非编码序列；第184位至716位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第一个外显子序列；第717位至1781位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第一个内含子序列；第1782位至2187位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第二个外显子序列；第2188位至2332位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第二个内含子序列；第2333位至2593位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第三个外显子序列；第2594位至2769位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第三个内含子序列；第2770位至2856位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第四个外显子序列；第2857位至2954位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第四个内含子序列；第2955位至3095位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的第五个外显子序列；第3096位至3413位的脱氧核糖核苷酸为OsAPS1基因的下游非编码序列。

2、本发明涉及的OsAPS1基因序列可用于在作物，特别是水稻抗病育种、转基因株系、基因新品种中的应用。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、OsAPS1基因负向调控水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的广谱抗病性。

2、OsAPS1蛋白质定于于叶绿体，在叶绿体细胞器中发挥功能。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是OsAPS1基因的核苷酸序列。序列长度为3413bp。

图1：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsAPS1基因以及验证OsAPS1基因功能的流程图。

图2：用定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术检测水稻品种中花11分别接种不同病原菌后OsAPS1基因的表达模式。附图标记说明：图2中的A图表示水稻接种白叶枯病原菌后不同时间点OsAPS1基因的表达量水平；图2中的B图表示水稻接种细菌性条斑病菌后不同时间点OsAPS1基因的表达量水平。每个样品中OsAPS1基因的表达量是相对于处理前水稻中花11样品中OsAPS1基因的表达量。每个数据是平均值(3个重复)±标准差。

图3：本发明所用遗传转化载体pDS1301-p35S-OsAPS1的的图谱。还包括起始转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH(KR029109)的载体图谱和亚细胞定位载体pM999-p35S-OsAPS1的载体图谱。附图标记说明：图3中的A图表示pDS1301-p35S-OsAPS1的载体图谱。RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，GUS表示β-葡糖苷酸酶基因，Hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因，35S表示花椰菜花叶病毒的35S启动子，AdhI表示玉米乙醇脱氢酶1基因序列，Waxy-a表示水稻蜡质基因部分序列，OCS表示多聚腺苷酸化信号序列。图3中的B图表示pYLCRISPR/Cas9-MH的载体图谱。P₃₅：HPT表示花椰菜花叶病毒的35S启动子启动表达的潮霉素磷酸转移酶基因，P_Ubi表示玉米泛素基因启动子，NLS表示核定位信号序列，T_nos表示根癌农杆菌终止子序列。图3中的C图表示pM999-p35S-OsAPS1的载体图谱。Ampicillin表示氨苄青霉素基因，CaMV35S表示花椰菜花叶病毒的35S启动子，GFP表示绿色荧光蛋白基因，polyA表示多聚腺苷酸化信号序列。

图4：OsAPS1基因敲除水稻株系靶位点的设计位点及基因型检测。附图标记说明：图4中的A图表示U3启动子引导gRNA和U6a启动子引导gRNA的设计位点；图4中的B图表示OsAPS1基因敲除水稻株系与野生型相比缺失的脱氧核糖核苷酸数目及位置；图4中的C图表示利用琼脂糖凝胶电泳检测OsAPS1基因敲除水稻株系的PCR产物与野生型相比明显变小。

图5：OsAPS1基因抑制表达水稻株系中OsAPS1基因表达量鉴定。附图标记说明：图5中的A图表示qRT-PCR显示OsAPS1基因抑制表达水稻家系13阳性单株的表达量明显低于野生型和分离出的阴性；图5中的B图表示qRT-PCR显示OsAPS1基因抑制表达水稻家系17阳性单株的表达量明显低于野生型和分离出的阴性。

图6：OsAPS1亚细胞定位分析。GFP作为空载体对照。结果显示OsAPS1蛋白是一个叶绿体蛋白。

图7：OsAPS1基因抑制表达水稻株系和OsAPS1基因敲除水稻株系接种白叶枯病菌PXO347后的病斑长度。附图标记说明：图7中的A图表示OsAPS1基因抑制表达家系13接种白叶枯病菌PXO347后的发病病斑长度与野生型植株和转基因阴性植株相比显著性变短；图7中的B图表示OsAPS1基因抑制表达家系17接种白叶枯病菌PXO347后的发病病斑长度与野生型植株和转基因阴性植株相比显著性变短；图7中的C图表示OsAPS1基因敲除水稻株系接种白叶枯病菌PXO347后的发病病斑长度与野生型植株和转基因阴性植株相比显著性变短。结果显示OsAPS1基因抑制表达水稻株系和OsAPS1基因敲除水稻株系对白叶枯病菌PXO347表现出抗病性增强的表型。

图8：OsAPS1基因抑制表达水稻株系相对于野生型对不同白叶枯病菌(PXO99、PXO61、PXO86、PXO112、PXO341、PXO347、FuJ23)具有广谱抗病性。

图9：OsAPS1基因抑制表达水稻株系相对于野生型对不同细菌性条斑病菌(RH3、RS85、RS105、JSB224、HNB8-47、GX01)具有广谱抗病性。

图10：OsAPS1基因抑制表达水稻株系接种白叶枯病菌PXO347后叶片中白叶枯病菌生长量。相对于野生型对照，OsAPS1基因抑制表达水稻株系中白叶枯病菌数量显著降低。

图11：OsAPS1基因抑制表达水稻株系接种细菌性条斑病菌RH3后叶片中细菌性条斑病菌生长量。相对于野生型对照，OsAPS1基因抑制表达水稻株系中细菌性条斑病菌数量显著降低。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步阐述。图1描述了鉴定和分离克隆OsAPS1基因以及验证OsAPS1基因功能的流程。需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不能以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参考：《Molecular Cloning:A Laborato；ry Manual》(Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)或相关产品。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场采购的常规产品。

实施例1：分析白叶枯病菌和细菌性条斑菌处理水稻后OsAPS1基因的表达模式

为了验证OsAPS1基因是否参与调控水稻的抗病反应。申请人对孕穗期水稻品种中花11(来自中国农业科学院作物科学研究所，下同)分别接种白叶枯病菌和细菌性条斑病菌，采用qRT-PCR技术分析OsAPS1基因的表达模式。结果显示OsAPS1基因都能被白叶枯病菌和细菌性条斑病菌抑制表达。这一结果提示：OsAPS1基因可能参与调控水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的抵抗反应，抑制或敲除OsAPS1基因的表达可能会提高水稻的抗病性。结果见图2。

实施例2：OsAPS1基因抑制表达和敲除突变体材料的获得

(1)OsAPS1基因抑制表达载体的构建

本实施例是关于pDS1301-p35S-OsAPS1载体构建的一个通用说明。

以是到品质中花11的cDNA为模板，设计引物dsAPS1F(5’-AGACTAGTGGTACCGGGACCTGTATGATGCTGA-3’)和dsAPS1R(5’-ACGAGCTCGGATCCCTTCCAATCAAACCCAAAT-3’)利用高保真DNA聚合酶PCR扩增得到OsAPS1基因的部分cDNA片段(其核苷酸片段如SEQ ID NO:1所示序列中第2511位至2593位脱氧核糖核苷酸，第2770位至2856位脱氧核糖核苷酸，第2955位至3228位脱氧核糖核苷酸，共计444个脱氧核糖核苷酸)。用高保真酶进行PCR扩增反应，电泳回收PCR产物，用限制性内切酶BamHI和KpnI酶切PCR产物，电泳回收酶切产物，同时将载体pDS1301用KpnI和BamHI酶切过夜并回收。将回收的酶切产物与载体片段以摩尔比约3：1的量进行连接(T4Ligase

)过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，从验证正确的克隆中提取质粒，并进一步测序验证备用。再用限制性内切酶Sac I和Spe I酶切PCR扩增得到的OsAPS1基因的部分cDNA片段和上一步已经连入第一链的重组载体，将回收的酶切产物与已经连入第一链的重组载体片段以摩尔比约3：1的量进行连接(T4Ligase

)过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，验证正确的克隆提取质粒，并进一步测序验证。从而获得植物转化载体pDS1301-p35S-OsAPS1，该植物转化载体的图谱见图3中的A图。

(2)OsAPS1基因敲除载体的构建

本实施例是关于pYLCRISPR/Cas9-MH-pUBIQUITION-OsAPS1载体构建的一个通用说明。

设计引物APS1U3F(5’-GGCAGTGGTGGTGGTGGAGGAGGGTTTTAGAGCTAG-3’)和APS1U3R(5’-CCTCCTCCACCACCACCACTGCCACGGATCATCTGC-3’)(即序列表SEQ ID NO:1所示序列中第137位至155位脱氧核糖核苷酸)，APS1U6aF(5’-GCCGCGAGCCTGATCGAGCCCGAGTTTTAGAGCTAG-3’)和APS1U6aR(5’-TCGGGCTCGATCAGGCTCGCGGCAGCCAAGCCAGCAC-3’)(SEQ ID NO:1所示序列中第344位至362位脱氧核糖核苷酸)位点，如图4中的A图所示。做二轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)/APS1U3R和APS1U3F/gRNA-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)以pYLgRNA-OsU3载体(KR029104)为DNA模版做PCR得到产物①和②，以及用U-F/APS1U6aR和APS1U6aF/gRNA-R以pYLgRNA-OsU6a载体(KR029105)为模版做PCR得到产物③和④；第二轮为重叠PCR，用引物Up-T1(5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gR-T1(5’-CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)以①②为模版得到PCR产物⑤，以及引物Up-T2(5’-GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’)和gR-T2(5’-CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)以③④为模版得到PCR产物⑥。用BsaI酶切pYLCRISPR/Cas9-MH载体(见图3中的B图)；将PCR产物⑤、⑥和BsaI酶切好的pYLCRISPR/Cas9-MH载体按照体积比为2：2：1混合，用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(购自北京全式金生物技术有限公司)50℃反应15分钟，将反应产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，从验证正确的克隆中提取质粒，并作进一步测序验证，从而获得植物转化载体pYLCRISPR/Cas9-MH-OsAPS1。

(3)OsAPS1基因抑制表达水稻株系的获得和鉴定

申请人将含有强启动子35S(AJ007626)驱动OsAPS1基因部分序列的pDS1301-p35S-OsAPS1载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11，获得了多个独立的转基因家系，选取家系13和家系17，利用qRT-PCR技术来检测OsAPS1基因的表达水平。

从中国，湖北，武汉大田取孕穗期的水稻剑叶叶片，根据TransZol(购自北京全式金生物技术有限公司)使用说明书抽提总RNA。取1～5μg总RNA用DNaseI(Invitrogen公司，美国)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后使用oligo(dT)15寡聚引物和M-MLV反转录酶(Promega公司，美国)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒

Green PCR MasterMix(宝生物工程大连有限公司)，并根据该公司生产的试剂盒说明书进行操作，在ABI7500Real-Time PCR system(Applied Biosystems公司，美国)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量。qRT-PCR分析中OsAPS1基因特异PCR引物是APS1realF(5′-AGTTTGCCAGACGCAATGCT-3′)和APS1realR(5′-AAGGCGTTTGCGTGTATCAGT-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actin F(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actin R(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

qRT-PCR结果显示，转基因家系中阳性单株中OsAPS1基因的表达水平显著低于阴性单株和野生型对照中的表达水平，结果见图5。

(4)OsAPS1基因敲除水稻株系的获得和鉴定

申请人将含有强启动子UBIQUITIN(JX947345)驱动OsAPS1基因序列的ppYLCRISPR/Cas9-MH-pUBIQUITION-OsAPS1通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11。获得了多个独立的转基因家系，选取家系1和家系2，用引物53230CgF(5’-AAGACCGATGGCATGACAGAGTA-3’)和53230CgR(5’-TCCACTCATGTAATTAGTAAT-3’)PCR扩增野生型和OsAPS1基因敲除水稻株系的家系1和家系2，鉴定基因敲除情况。OsAPS1基因敲除水稻株系的家系1在靶位点之间缺失218个脱氧核糖核苷酸，家系2在靶位点之间缺失208个脱氧核糖核苷酸。结果见图4中的B图。PCR产物琼脂糖凝胶电泳显示OsAPS1基因敲除水稻株系的家系1和家系2在基因组水平均存在大片段的脱氧核糖核苷酸缺失。结果见图4中的C图。

实施例3：OsAPS1蛋白的亚细胞定位分析

(1)OsAPS1基因亚细胞定位载体的构建

本实施例是关于pM999-p35S-OsAPS1载体构建的一个通用说明。

以中花11的cDNA为模板，设计引物APS1PM999F(5’-AAGAATTCATGGCGATGCAGGCCGCCTT-3’)和APS1PM999R(5’-AAGGTACCGGCCGCAACCGCCTCGC-3’)，利用高保真DNA聚合酶PCR扩增OsAPS1基因(SEQ ID NO:1所示序列中第184位至716位脱氧核糖核苷酸，第1782位至2187位脱氧核糖核苷酸，第2333位至2593位脱氧核糖核苷酸，第2770位至2856位脱氧核糖核苷酸，第2955位至3095位脱氧核糖核苷酸)。电泳回收PCR产物，用EcoRI和KpnI酶切，回收OsAPS1基因片段；同时，将载体pM999(图谱见图3C)用EcoRI和KpnI酶切过夜并回收。将回收的OsAPS1片段与载体片段以摩尔比约3：1的量进行连接(T4Ligase

)过夜。第二天将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并于37℃培养过夜，可获得单克隆。选取单克隆进行培养，同时对其进行PCR验证，验证正确的克隆提取质粒，并进一步测序验证，从而获得亚细胞定位载体pM999-p35S-OsAPS1。

(2)水稻原生质体中瞬时表达pM999-p35S-OsAPS1，利用荧光定位OsAPS1

取无菌培养10-15天的水稻幼苗，用锋利的刀片快速将叶鞘切割成1mm以下的小段，用0.6M甘露醇缓冲液平衡10分钟。去掉甘露醇缓冲液，用酶解缓冲液(0.6M甘露醇，10mMMES，纤维素酶(1.5％)，果胶酶(0.75％)，0.1％牛血清蛋白，1mM氯化钙，β-巯基乙醇)酶解，避光反应4-5小时。然后用W5缓冲液(154mM氯化钠，125m氯化钙，5mM氯化钾，2mM MES(pH5.7))收集原生质体细胞。再将原生质体细胞重悬浮于MMG缓冲液(0.6M甘露醇，15mM氯化镁，4mM MES(pH5.7))中，加入pM999-p35S-OsAPS1载体和PEG4000溶液，立即轻柔上下颠倒混匀，室温放置10-15分钟。然后加入W5缓冲液终止转化。离心弃上清，加入WI缓冲液(0.6M甘露醇，4mM MES(pH5.7)，4mM氯化钾)，28℃暗培养12小时。

用共聚焦荧光显微镜观察荧光。见图6，以上结果表明，OsAPS1蛋白质定位于叶绿体细胞器中。

实施例4：OsAPS1基因抑制表达水稻株系和OsAPS1基因敲除水稻株系的相关分析与功能验证

(1)OsAPS1基因抑制表达水稻株系和OsAPS1基因敲除水稻株系孕穗期抗白叶枯病表型分析

在中国，湖北，武汉的夏季田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系和敲除水稻株系及野生型对照进行白叶枯病菌接种试验。结果显示，本发明的OsAPS1基因抑制表达水稻株系和OsAPS1基因敲除水稻株系在孕穗期接种白叶枯病菌致病小种PXO347，与野生型(非转基因，下同)相比，OsAPS1基因抑制表达水稻家系13和家系17阳性单株以及OsAPS1基因敲除水稻株系osaps1-1和osaps1-2发病长度均显著性短于阴性单株和野生型对照(p<0.01)。见图7。以上结果表明，OsAPS1基因抑制表达水稻株系和OsAPS1基因敲除水稻株系都能增强水稻对白叶枯病菌致病小种PXO347的抗性。

(2)OsAPS1基因抑制表达水稻株系对不同白叶枯病菌的广谱抗性分析

在中国，湖北，武汉夏季田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系及野生型对照进行白叶枯病菌接种实验。结果显示，OsAPS1基因抑制表达水稻株系在孕穗期接种不同白叶枯病菌致病小种(PXO99、PXO61、PXO86、PXO112、PXO341、PXO347、FuJ23，所有白叶枯病菌由国际水稻研究所赠送)，与野生型相比，OsAPS1基因抑制表达水稻家系13和家系17阳性单株发病长度均显著性变短(p<0.01)。见图8。以上结果表明，抑制表达OsAPS1基因增强水稻对不同白叶枯病菌的广谱抗病性。

(3)OsAPS1基因抑制表达水稻株系对不同细菌性条斑病的广谱抗性分析

在中国，湖北，武汉夏季田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系及野生型对照进行细菌性条斑病菌接种实验。结果显示，OsAPS1基因抑制表达水稻株系在分蘖期接种不同细菌性条斑病菌致病小种(RH3、RS85、RS105、JSB224、HNB8-47、GX01，所有细菌性条斑病菌菌株由上海交通大学陈功友教授赠送)，与野生型相比，OsAPS1基因抑制表达水稻家系1和家系10阳性单株发病长度均显著性变短(p<0.01)。见图9。以上结果表明，抑制表达OsAPS1基因增强水稻对不同细菌性条斑病菌的广谱抗病性。

(4)OsAPS1基因抑制表达水稻株系中白叶枯病菌数量分析

在中国，湖北，武汉夏季田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系在孕穗期接种白叶枯病菌致病小种PXO347后分析叶片中白叶枯病菌生长情况。在孕穗期于田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系和野生型对照分别接种白叶枯病菌致病小种PXO347(由国际水稻研究所赠送)，接种后在不同时间取叶片材料(接种剪口下6cm的叶片)，同一份材料取三片叶(代表三个实验重复)。根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌的生长数量。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1ml灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯队，每个浓度梯度重复涂三个PSA培养皿(马铃薯200g，琼脂20g，蔗糖20g，去离子水定容至1000ml)，22～25℃黑暗下生长2-3天后统计细菌菌落数。以每片叶上白叶枯病菌菌落数的LOG值绘制细菌生长曲线。白叶枯病菌生长分析表明，在接种白叶枯病菌致病小种PXO347后，OsAPS1基因抑制表达水稻株系叶片中白叶枯病菌数量显著低于野生型对照。见图10。

(5)OsAPS1基因抑制表达水稻株系中细菌性条斑病菌数量分析

在中国，湖北，武汉夏季田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系在分蘖期接种细菌性条斑病菌致病小种RH3(由上海交通大学陈功友教授赠送)后分析叶片中细菌性条斑病菌生长情况。在分蘖期于田间对OsAPS1基因抑制表达水稻株系和野生型对照分别接种细菌性条斑病菌致病小种RH3，接种后在不同时间取叶片材料(接种部位上下6cm的叶片)，同一份材料取三片叶(代表三个实验重复)。根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌的生长数量。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1ml灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯度，根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌性条斑病菌的生长数量。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1ml灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯度，每个浓度梯度重复涂三个PSA培养皿，在22～25C黑暗下生长2-3天后统计细菌性条斑病菌菌落数。以每片叶上细菌菌落数的LOG值绘制细菌生长曲线。细菌性条斑病菌生长分析表明，在接种细菌性条斑病菌致病小种RH3后，OsAPS1基因抑制表达水稻株系叶片中细菌性条斑病菌数量显著低于野生型对照。见图11。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> OsAPS1基因在改良水稻抗病性中的应用

<130>

<141> 2018-09-22

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3413

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3413)

<223>

<220>

<221> 3'UTR

<222> (3096)..(3413)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (2955)..(3095)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (2857)..(2954)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (2770)..(2856)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (2594)..(2769)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (2333)..(2593)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (2188)..(2332)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (1782)..(2187)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (717)..(1781)

<223>

<220>

<221> exton

<222> (184)..(716)

<223>

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(183)

<223>

<400> 1

cccgcaatcc catccaggtt catccgcctc ccgtcttctt tttttttaat tcatccgcaa 60

ccactgcgaa cttgcgaagg ccgcgggtac aagaaaagaa gagaaaaata aaaaggagcc 120

gcattataag taggtagtgg tggtggtgga ggaggaggag agcaaatcga ggtagccatg 180

gcgatgcagg ccgccttcgc cgcctcgatg ttcccgcagc tggcgcagcg gaggggaagc 240

gatcgcgcgg tggtggtggc gccgccggcg ccggcgccgg tgagggtggc gatgaggagc 300

ggtggggcgg cggcggcggc ggcgagaggg gtgaggtgca gggcgagcct gatcgagccc 360

gacgggggga ggctggtgga gctggtggtg ccggaggagg gagggcggcg ggaggcggcg 420

cggcgggagg cggcggcgct ggcgcaccgg gtgaggctgg ggcgggtgga gacggagtgg 480

ctgcacgtgc tgagcgaagg gtgggcgagc ccgctgcgag ggttcatgcg cgaggccgag 540

ttcctccaag cacttcattt caacgccatc cgcggcggag acggggccat ggtcaacatg 600

tccgtgccca tcgtcctccc cctcggtgac gcccagcgcc gcgccatcga ggcgtccggc 660

gcccgccgcg tcgcgctcgt cgacgccgcc gaccgccccc tcgccgtcct cagcgagtga 720

gacatccccc ctaccccacc tcttcttgtt tcccttgttt agttagttgc atttccctgt 780

tcagacgctt aattgcaatt atttggttac taggagtgct tgctagaaga gtaaaattac 840

taattacatg agtggatgga atgtagatat attgattgtt cgtgttggtt ggttgattct 900

cacagttgtg ggatgccttt ggacctccaa aagccgtaat ttttgtgctt gggttggaaa 960

ttggaattgt gggggttgta gcctgaatgg ttcagagaag ttcataggtg gtttcttcaa 1020

ttggaaacat aatatgcaga aatacagatt atgagtgttt ctgtgcagtt cccacatttc 1080

gtgagcttat ccctcacaaa cttgtgctct ggttatattt tagactttaa tgctagtaaa 1140

caatttgttt cacagcaacc tggtcaatga tatatcattc atggcggagg ttttatcttg 1200

ggcgttaaac taattttaag gttgtggcat tcctcttttg tcgattagac tacaatatcg 1260

tcatgcggat aacctttgtc atgctatatc aggaactcag gacatcttta tacatctcgg 1320

tcgttttcag gtcatatttt tttgagtcgt atatatataa tacgatgatc ggtaatacca 1380

ttggtagtcc ttataaatac atgttccgta gttcttttgc cgtgttctct aggtatttta 1440

gttttatcta tattaaactg acaagtgata ttatatttgt ttcgttgttt tttcgccgcg 1500

ttctatgggt attttagttt aagcaactga cacatgatat gatttacatc agaaagatta 1560

ttttttattc accatttgtt tataaggttt tgtacacatc cagctattgt aagatgttgt 1620

tatagaggtg acgtaacaac gtcaaccgtt tacatctgtg tctaggaact cctcaagtca 1680

tgtgtgttca aaacaatccg acttgattta gcatggtttt agttcttttt aattagttat 1740

accatggcat tccctgacat atttttcttc tttgttgtca g cat tga gat cta caa 1796

His Asp Leu Gln

1

gca taa caa aga aga aag gat tgc acg gac atg ggg aac aac tgc acc 1844

Ala Gln Arg Arg Lys Asp Cys Thr Asp Met Gly Asn Asn Cys Thr

5 10 15

tgg gct gcc tta tgt tga tga ggc gat tac aaa tgc tgg tga ttg gtt 1892

Trp Ala Ala Leu Cys Gly Asp Tyr Lys Cys Trp Leu Val

20 25 30

aat tgg tgg tga ctt gga ggt tat aga acc aat caa gta caa tga tgg 1940

Asn Trp Trp Leu Gly Gly Tyr Arg Thr Asn Gln Val Gln Trp

35 40 45

tct tga tca gta tcg ctt gtc tcc agc cca gct gcg tga aga gtt tgc 1988

Ser Ser Val Ser Leu Val Ser Ser Pro Ala Ala Arg Val Cys

50 55 60

cag acg caa tgc tga tgc ggt att cgc gtt tca gct tcg caa tcc tgt 2036

Gln Thr Gln Cys Cys Gly Ile Arg Val Ser Ala Ser Gln Ser Cys

65 70 75

aca caa tgg aca tgc ttt gct cat gac tga tac acg caa acg cct tct 2084

Thr Gln Trp Thr Cys Phe Ala His Asp Tyr Thr Gln Thr Pro Ser

80 85 90

tga gat ggg tta caa aaa tcc tgt tct tct gct tca tcc att ggg agg 2132

Asp Gly Leu Gln Lys Ser Cys Ser Ser Ala Ser Ser Ile Gly Arg

95 100 105

att cac aaa agc aga tga tgt gcc tct tag ttg gag aat gaa gca gca 2180

Ile His Lys Ser Arg Cys Ala Ser Leu Glu Asn Glu Ala Ala

110 115

tga aaa g gtacgcttta agagtagcaa tcgtactgtc aaatcttttt agcaaatgca 2237

Lys

120

tgttggtgcc ttgttgttga tgaaaccatt tgatttaatt acactactgt aaggcccaat 2297

tcatgcacaa ttttgatgcg tgtttatttt ggtag gt tct tga gga agg tgt 2349

Gly Ser Gly Arg Cys

125

cct caa ccc aga atc aac tgt cgt tgc aat ctt ccc ctc tcc aat gca 2397

Pro Gln Pro Arg Ile Asn Cys Arg Cys Asn Leu Pro Leu Ser Asn Ala

130 135 140

tta tgc agg gcc aac tga agt gca atg gca tgc taa ggc tcg tat aaa 2445

Leu Cys Arg Ala Asn Ser Ala Met Ala Cys Gly Ser Tyr Lys

145 150 155

tgc tgg tgc aaa ctt cta cat agt tgg aag aga tcc tgc tgg tat ggg 2493

Cys Trp Cys Lys Leu Leu His Ser Trp Lys Arg Ser Cys Trp Tyr Gly

160 165 170

cca ccc aac tga aaa gag gga cct gta tga tgc tga tca tgg gaa aaa 2541

Pro Pro Asn Lys Glu Gly Pro Val Cys Ser Trp Glu Lys

175 180

ggt gtt gag cat ggc tcc tgg gct tga gaa gct caa tat cct tcc ttt 2589

Gly Val Glu His Gly Ser Trp Ala Glu Ala Gln Tyr Pro Ser Phe

185 190 195

caa g gtatgtcatc ctaccagacc agatatcaca ttttttggat gcactagatt 2643

Gln

200

gtgtagttcg ctagcttact gtccatcttg tacatttgaa tttggatgtc aagcaacata 2703

ttttagtttt cagataaacc ttgttgtatt ctttttcttg gcatgactcc tgatttgttt 2763

tatcag gt ggc tgc ata tga cac aaa gca aaa gaa aat gga ctt ttt 2810

Gly Gly Cys Ile His Lys Ala Lys Glu Asn Gly Leu Phe

205 210

cga tcc atc aag gaa aga tga ttt cct gtt cat ctc tgg cac aaa g 2856

Arg Ser Ile Lys Glu Arg Phe Pro Val His Leu Trp His Lys

215 220 225

gtaacatcca tttcaatcct gttttggtac accagttaat tttgagcacc aatgtttttt 2916

tccagcccag tcctaacaac attgcctgtg ttatatag at gcg tac tct tgc caa 2971

Asp Ala Tyr Ser Cys Gln

230

gaa ctg cca gag ccc ccc tga cgg att cat gtg ccc ggg tgg ctg gaa 3019

Glu Leu Pro Glu Pro Pro Arg Ile His Val Pro Gly Trp Leu Glu

235 240 245

ggt cct tgt tga ata cta cga cag ctt gac gcc atc agc gga cag cag 3067

Gly Pro Cys Ile Leu Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ser Gly Gln Gln

250 255 260

caa act gcg cga ggc ggt tgc ggc cta g aaagctgaaa ctacctcaaa 3115

Gln Thr Ala Arg Gly Gly Cys Gly Leu

265 270

taagcaagaa cattgcatct tgcaactgta aaatggttct ttcagagaga gaaccaatgg 3175

tatatgtgta tactactggt cgcaaggcct aaacatttgg gtttgattgg aagcgcattc 3235

tggtgtgatt tgtatgtgcc ctatcatctg gtaatgctac attggaagct catcatgttg 3295

ttggtgttaa taaggatgag cctttgtgtg ctctgctaga tatgtacata tacaatgtgg 3355

tggtatttat atagtgcttg gtgtgtttgc tattatagaa gagcaggttt catcttct 3413

Claims (2)

1.来源于水稻OsAPS1基因在增强水稻对白叶枯病和细菌性条斑病抗性的应用，其特征在于,所述OsAPS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于,所述的应用还包括将OsAPS1基因构建在抑制表达载体或敲除载体上转化水稻，获得具有增强水稻对白叶枯病和细菌性条斑病抗性的转基因株系。

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