CN112048507B

CN112048507B - 一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用

Info

Publication number: CN112048507B
Application number: CN202010883620.XA
Authority: CN
Inventors: 王加峰; 侯艳; 郭涛; 陈淳; 杨瑰丽; 肖武名; 黄翠红; 王慧; 陈志强
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: CN112048507A

Abstract

本发明公开了一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用，属于植物基因工程技术领域。本发明miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明发明人鉴定并证实了miRNA‑T34可以通过抑制LOC_Os02g39410和LOC_Os01g46500的表达以调节水稻基础免疫反应，从而正向调控稻瘟病抗性。结合利用过表达miRNA技术上调miRNA‑T34，可以显著提高水稻对稻瘟病的抗性，具有较好的应用前景。

Description

一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用。

背景技术

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的一种破坏性病害，在水稻区常造成巨大的经济损失(Yi et al，2004)。实践证明，鉴定和利用广谱抗性基因进行水稻抗病育种是防治稻瘟病最为经济有效的策略(Deng et al，2006)。截至目前，研究人员先后用从不同抗病品种中鉴定出80多个稻瘟病抗性基因，已鉴定和克隆的基因分别以单基因或基因簇的形式分布在除3号染色体外的其它11条染色体上，且多个抗病基因成簇分布，主要存在于第6、11、12染色体。尽管全国各地选育出一批抗病或耐病的高产品种，但是新选育品种的抗源在总体上略呈单一化；长期单一化使用个别抗病基因会使得对应的无毒基因发生变异，使得部分用于品种选育的抗性基因在经过多代传递后，其抗性不能持久，并在适宜于稻瘟病菌的环境条件下，可造成大面积爆发。因此，需要多途径拓宽抗源，结合多基因聚合育种及生物技术等手段培育持久抗病新品种。

miRNAs是一类长度约21-24nt的非编码小RNA，属于一类有效的转录后基因调控因子。主要通过互补碱基配对蛋白质编码基因，导致mRNA降解或翻译抑制，从而调节许多细胞功能和过程，包括细胞增殖、分化、凋亡以及应激反应和病原防御(Bartel et al.，2004)等。在不同的植物中已经发现了大量的miRNA，这些miRNAs不仅调节生长发育，还调节重要的生理过程(Mallory et al.，2006；Jones-Rhoades et al.，2006；Li et al；Bartel etal.，2004；Zhang et al.，2013)。一些miRNAs甚至还通过调节NBS-LRR类因参与应对病原物的侵染(Zhai et al.，2011)。例如，NTA-miR6019和NTA-miR6020引导TIR-NBS-LRR免疫受体N的转录本的序列特异性切割，该转录本赋予烟草植株对烟草花叶病毒(TMV)的抗性。在烟草中，超级miRNA家族miR482针对NBS-LRR抗病基因，其N端具有卷曲的结构域。此外，一些miRNAs还参与NBS-LRR基因的切割，并产生阶段排列的串联siRNAs。

miRNA的调控与抗病反应途径具有重要的关系，如王兴军等发明的“利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA”(中国专利CN102676510A)，公开了一种利用人工miRNA提高水稻抗黑条矮缩病毒的方法及其专用双链RNA，我们也在前期公开了“一种稻瘟病抗性相关的miRNA及其应用”(中国专利ZL201711155567.6)，该miRNA主要靶向负调控抗病基因Pik-H4来调控抗病性，这些研究表明对miRNA的表达的调节可用于增强植物抗病性。进一步分析并克隆稻瘟病抗病反应相关的miRNA，可为更好控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害，增强植物的抗病性提供新思路，具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种增强稻瘟病抗性的miRNA。它通过靶向负调控LOC_Os02g39410与LOC_Os01g46500提高了水稻稻瘟病抗性。

本发明的另一目的在于提供上述增强稻瘟病抗性的miRNA的应用。过表达该miRNA能显著增强稻瘟病抗性，可通过在水稻中过表达该miRNA以提高水稻的稻瘟病抗性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种增强稻瘟病抗性的miRNA，其核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO:1所示)：

5'-GUGGGGCGGCGGUGGUGGCGG-3'。

编码上述增强稻瘟病抗性的miRNA的基因，其核苷酸序列如下所示(亦如SEQ IDNO:2所示)：

5'-GTGGGGCGGCGGTGGTGGCGG-3'。

上述增强稻瘟病抗性的miRNA相应的前体，其核苷酸序列如下所示(亦如SEQ IDNO:3所示)：

5'-GCCCGCGGCGGUGGGGCGGCGGUGGUGGCGGCGAAGGUGAUGGACAGGAAGGAGCUGGCCGGGAGGAACAAGGAAGGGCGGGCGAGAACCGAGAGGGAGAUCCUCGAGGCCGUCGACCACCCCUUCCUCCCGCGCCUCUACGGCGUGGCCGAGGGGGAUCGCUGGUCCUGCCUCCUCACCGAGUUCUGCCCCGGCGGCGACCUCCACGUCCUCCGCCAGCGGCAGCCGCACCGCCGCUUCACCGAGUCCGCCGUCAGGUA-3'。

编码上述增强稻瘟病抗性的miRNA相应的前体的基因，其核苷酸序列如下所示(亦如SEQ ID NO:4所示)：

5'-GCCCGCGGCGGTGGGGCGGCGGTGGTGGCGGCGAAGGTGATGGACAGGAAGGAGCTGGCCGGGAGGAACAAGGAAGGGCGGGCGAGAACCGAGAGGGAGATCCTCGAGGCCGTCGACCACCCCTTCCTCCCGCGCCTCTACGGCGTGGCCGAGGGGGATCGCTGGTCCTGCCTCCTCACCGAGTTCTGCCCCGGCGGCGACCTCCACGTCCTCCGCCAGCGGCAGCCGCACCGCCGCTTCACCGAGTCCGCCGTCAGGTA-3'。

上述增强稻瘟病抗性的miRNA和/或其相应的前体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用。

上述增强稻瘟病抗性的miRNA和/或其相应的前体在培育抗稻瘟病水稻中的应用。

所述的应用，是利用基因工程技术，通过促进所述的miRNA在水稻中的过表达，从而提高水稻对稻瘟病菌的抗性。

所述的基因工程技术优选为过表达miRNA技术。

一种利用过表达miRNA技术培育抗稻瘟病水稻的方法，包括如下步骤：扩增得到上述与稻瘟病抗性相关的miRNA相应的前体序列，将其构建到pOX载体上得到过表达载体，采用农杆菌介导转化水稻，从而得到抗稻瘟病水稻；具体包括如下步骤：

(1)以水稻叶片总RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以T34-OX-F和T34-OX-R为引物，PCR扩增得到目的片段；

(2)将纯化的目的片段用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，再与经同样双酶切的pOX载体连接，获得连接产物；

(3)将连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选单菌落培养，提取质粒进行HindⅢ、BamH I酶切鉴定及菌落PCR鉴定，将以上两种检测结果符合要求的转化子继续进行测序鉴定，获得成功构建的过表达载体；

(4)将过表达载体进行农杆菌介导的水稻遗传转化，获得所述的抗稻瘟病水稻。

步骤(1)中所述的水稻优选为水稻高抗稻瘟病株系H4。

步骤(1)中所述的引物T34-OX-F和T34-OX-R的核苷酸序列如下所示：

T34-OX-F：5’-CCAAGCTTAAACCCACCTCATCACCACC-3’；

T34-OX-R：5’-CGGGATCCGGACGGAGGGAGTAACTTTTCC-3’。

步骤(1)中所述的PCR扩增的反应体系，按每50μL反应体系中含：2×Phanta MaxBuffer25μL，模板DNA 1μL，正反向引物各2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，ddH₂O余量计。

步骤(1)中所述的PCR扩增的反应条件优选为：95℃预变性3min；94℃15s、60℃15s、72℃90s，32个循环；最后72℃延伸5min。

步骤(2)中所述的连接的反应体系中，pOX载体与目的片段优选按摩尔比1:3～3:1配制。

步骤(2)中所述的连接的反应条件优选为：22℃连接2h或16℃过夜连接。

步骤(3)中所述的挑选单菌落的时间优选为转化后第2天，所述的培养的时间优选为7～9h。

步骤(3)中所述的测序所用的引物序列如下所示：

UBI-seq：5’-TTGTCGATGCTCACCCTGTTG-3’。

本发明发明人前期对高抗稻瘟病水稻材料H4及感稻瘟病品种中二软占接种稻瘟病菌GDYJ7，通过构建small RNA测序文库鉴定到多个受稻瘟病菌胁迫诱导表达的新miRNA，这些miRNA靶基因涉及到转录因子、蛋白激酶及植物激素等多种与抗病相关的防卫基因，进一步的降解组测序证实部分miRNA可能特异的负调控一些抗病相关靶基因的表达。

进一步的降解组测序表明，miRNA-T34可能靶向调节一些稻瘟病抗性调节的相关基因。

经Northern blot表达验证证实，miRNA-T34真实存在于抗感病水稻叶片中。miRNA-T34受稻瘟病菌调控，在感病材料中表达量先上升后下降，并维持在较低的表达水平；而在抗病材料中其表达量先下降后上升，随后又下降的趋势。组织特异性表达分析表明，miRNA-T34主要在茎、叶片及节间中表达，在根中不表达。

靶基因预测表明该miRNA-T34可能分别靶向蛋白磷酸酶2C家族基因LOC_Os02g39410和含F-box结构域蛋白LOC_Os01g46500的mRNA。通过GFP-烟草瞬时表达***证实miRNA-T34可以剪切LOC_Os02g39410和LOC_Os01g46500的mRNA或抑制其翻译，降低其蛋白的表达，从而提高水稻对稻瘟病的抗性。

在水稻中过表达miRNA-T34或敲除miRNA-T34后的转基因植株的抗病性检测结果表明，过表达miRNA-T34增强了稻瘟病抗性，而敲除及靶模拟miRNA-T34增加了水稻对稻瘟病菌的敏感性，推测miRNA-T34通过负调控LOC_Os02g39410和LOC_Os01g46500的表达以调节水稻基础免疫反应。

深入探究miRNA-T34及其靶基因的分子机制具有重要的理论与应用价值。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明鉴定并证实了miRNA-T34可以调节水稻基础免疫反应，利用pOX载体过表达miRNA-T34，可以显著提高水稻对稻瘟病的抗性，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为Northern blot检测miRNA-T34表达的结果图。

图2为实时荧光定量PCR结果分析图；其中，A为miRNA-T34的表达模式，B为靶基因LOC_Os02g39410的表达模式，C为靶基因LOC_Os01g46500的表达模式。

图3为GFP-烟草瞬时表达验证结果图；其中，A为单独注射LOC_Os02g39410，B为注射GFP-LOC_Os02g39410和过表达载体OX-miRNA-T34，C为单独注射GFP-LOC_Os01g46500，D为注射GFP-LOC_Os01g46500和过表达载体OX-miRNA-T34。

图4为转基因材料的抗病性测定结果图；其中，A为野生型植株，B为过表达miRNA-T34(OX-miRNA-T34)植株，C为敲除miRNA-T34(KO-miRNA-T34)植株。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所使用的各种原料及各项设备，如无特别说明，均为常规市售产品，能够通过市场购买直接获得。

本发明实施例所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。

实施例1 Northern blot检测miRNA-T34的表达

1.水稻叶片总RNA的提取

1)取3-4叶期水稻高抗稻瘟病株系H4及感病品种中二软占(水稻高抗稻瘟病株系H4、感病品种中二软占均已在文献“水稻抗稻瘟病蛋白Pik₂-H4基因的克隆及互作蛋白的筛选[J].广东农业科学,2014,(04):156-160.”中公开)幼苗，液氮冷冻并研磨成粉状，按照每100mg叶片加入1mL提取试剂(Trizol)，混合均匀；

2)按照每100mg叶片加入200μL氯仿的比例加入氯仿，混合均匀，13,000rpm、4℃离心15min，去除中间层及下层有机相，收集上层水相到新的离心管中；

3)加入600μL异丙醇，混合均匀，室温静置20min，13,000rpm、4℃离心20min，弃上清，用70％无水乙醇洗一次，离心收集沉淀，待乙醇挥发后溶于无RNA酶的的ddH₂O水中，-80℃冻存备用。

2.生物素介导的Northern blot分析

参考“沈建强.水稻逆境应答小RNA筛选与3'非翻译区微小反向重复序列抑制翻译研究[D].2017.”中的方法，根据miRNA-T34成熟序列设计探针5’-GTGGGGCGGCGGTGGTGGCGG-3’，并在3′端加上生物素标记。然后取100-500μg步骤1.得到的总RNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转3h后，将膜置于紫外交联仪中1200J交联2min，然后将尼龙膜转至杂交炉中50℃预杂交30min以将RNA固定于尼龙膜上。利用探针对尼龙膜进行预杂交与杂交、洗膜，后利用碧云天生物技术的化学发光法生物素检测试剂盒检测miRNA-T34的表达情况。结果如图1所示。

结果表明，miRNA-T34在中二软占及H4植株中均能正确表达，表明该miRNA真实存在于中二软占及H4植株中。

实施例2定量分析miRNA-T34在稻瘟病抗性中的作用

1.RNA反转录及实时定量PCR的引物设计

根据miRNA-T34序列预测的前体序列(SEQ ID NO:3)设计茎环PCR引物，引物序列如下：

(1)RT引物序列

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCGCCACC-3’(SEQ ID NO:5)

(2)miRNA-T34正向引物

5’-GCGTTTTGAAACGGAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:6)

根据靶基因的编码序列，设计以下靶基因的qRT-PCR检测引物：

(3)LOC_Os02g39410正向引物

5’-ACATCAACACAACCCCGAG-3’(SEQ ID NO:7)

(4)LOC_Os02g39410反向引物

5’-ATCTAACCCCAAAACTCCCTG-3’(SEQ ID NO:8)

(5)LOC_Os01g46500正向引物

5’-CTTGACGATGCAAATGACGC-3’(SEQ ID NO:9)

(6)LOC_Os01g46500反向引物

5’-ACAACCCCTGAGTGTTCAAAC-3’(SEQ ID NO:10)

内参基因的qRT-PCR检测引物：

(7)U6正向引物

5’-TACAGATAAGATTAGCATGGCCCC-3’(SEQ ID NO:11)

(8)U6反向引物

5’-GGACCATTTCTCGATTTGTACGTG-3’(SEQ ID NO:12)

2.植株培养及稻瘟病菌侵染

温室种植中二软占与H4至3叶期，采用高压喷雾法把稻瘟病菌GDYJ7(已在文献“吴澎志，响应稻瘟病菌侵染的水稻MicroRNA鉴定及初步功能研究(D)，2019”中公开)孢子的明胶溶液均匀喷施在叶片表面(分生孢子浓度为5×10⁵/mL)，接种苗于25℃暗室中保湿24h后，保湿至7-10d后调查发病情况。

3.水稻叶片总RNA的提取

同实施例1。

4.反转录及反转录体系

普通反转录：取-80℃保存的总RNA样品1μg，加入1μL Oligo(dT16)(10mmol/L)，用RNase free ddH₂O补到总体积12μL，混匀置于65℃水浴锅中水浴5min后，立即置于冰上，并向管中加入4μL 5×RT bμffer，2μL dNTP(10mmol/L)，RNase抑制剂1μL(10U/μL)和1μLReverTraAce并混匀。将管置于PCR仪中，设置反应程序：30℃10min，42℃60min，99℃5min，25℃5min，得到第一链cDNA，-20℃冰箱保存。

miRNA的反转录：取0.5μg DNase处理过的RNA，加入1.5μL引物混合液(0.25μL RT引物(10mmol/L)、0.25μL dNTP(10mmol/L)和1μL DEPC。然后稍离心，65℃孵育5min，立即置于冰上3min。将1μL 5×First strand buffer，0.5μL 0.1mol/L DTT，0.15μL RRI以及0.15μL Superscript III配制成混合液，每管中加入1.8μL混合液。离心后，放置于PCR仪上，16℃30min，50℃30min，85℃5min，25℃1min，将反转录产物置于-20℃备用。

5.实时荧光定量PCR分析

(1)实时定量PCR反应体系

选用诺唯赞公司的定量试剂对miRNA进行定量，反应体系如下：10μL AceQ qPCRSYBR Green Master Mix，各0.8μL 10μmol/L上下游引物，0.4μL ROX Reference Dye1，0.2μL cDNA(miRNA反转录产物)，无菌水补足至20μL，进行定量检测。定量PCR仪设置反应程序为：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。以U6作为内参基因，所有反应均为三次重复。

(2)结果分析

利用2^-ΔΔCt方法进行结果的分析，结果如图2所示。实时荧光定量PCR分析的结果显示，miRNA-T34的表达受到稻瘟病菌的诱导，在感病材料中表达量呈现先上升后下降趋势并维持在较低的表达水平；而在抗病材料表达量呈现先下降后上升又降低趋势，而其靶基因LOC_Os02g39410及LOC_Os01g46500表达量在稻瘟病菌侵染后抗、感病材料接种稻瘟病后表达量均显著下降，并维持在较低的水平。在转基因材料中，靶基因的表达水平基本与预期一致，与microRNA的表达量的变化基本呈负相关关系。这表明miRNA-T34有可能通过对靶基因LOC_Os02g39410及LOC_Os01g46500的调控来调控稻瘟病抗性。

实施例3 miRNA-T34的靶基因验证

1.靶基因-GFP融合蛋白表达载体的构建

将靶基因中包含miRNA-T34识别区域在内的200bp左右作为目标区段，通过重组克隆方式克隆至GFP表达***载体骨架p35S-GFP(已在文献“Wei et al.A novel Co-immunoprec ipitation protocol based on protoplast transient gene expressionfor studying protein–protein i nteractions in rice[J].Plant Mol Biol Rep,2013”中公开)。具体的操作为：

在p35S-GFP中，选择BamH I和Sal I两个酶切位点酶切p35S-GFP载体，通过琼脂糖胶回收纯化备用；

根据酶切位点设计重组克隆引物，利用实施例2普通反转录的cDNA为模板进行靶基因的目标区段的扩增(PCR反应体系为20μL：2μL 10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μmol/L)，dNTP 0.3μL(10mmol/L)，0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL模板，双蒸水补足至20μL。扩增反应PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，反应进行35个循环；后72℃延伸5min)，经琼脂糖胶回收纯化。

随后通过同源重组反应，利用BamH I和Sal I将靶基因的目标片段连接至p35S-GFP中，连接反应体系：1μL ExnaseⅡ、2μL 5×CEⅡBuffer、10-100ng靶基因的目标片段、25-100ng p35S-GFP；反应条件：37℃水浴30min，转化大肠杆菌DH5a后进行检测，然后将测序验证成功的克隆载体利用电激法转化至根癌农杆菌EHA105中，-80℃超低温冰箱中保存甘油中备用。

1.本生烟草的种植、农杆菌介导的瞬时转化与荧光分析

本生烟(已在文献“Zhang T,Zheng Q F,Yi X et al.Establishing RNA virusresistance in plants by harnessing CRISPR immune system.Plant Biotechnol J,2018,16(8):1415-1423”中公开)种子播种后，25℃光照/黑暗各12h培养至5-6叶。

参考文献“陈香嵩,李甜甜,周少立,赵毓.(2018).外源蛋白在烟草叶片瞬时表达.Bio-101:e1010127.DOI:10.21769/BioProtoc.1010127.”中的方法进行农杆菌注射，具体操作为：

1)将转化有GFP-靶基因融合蛋白表达载体的农杆菌在加有20mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的培养皿上划线接种，28℃黑暗培养2-3d；

2)挑取单菌落接种到5mL含有相应抗生素的LB培养液中，28℃、250rpm培养24h；

3)随后将菌液按50-100倍稀释于含有0.4mmol/L AS(乙酰丁香酮)、10mmol/L MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)以及相应抗生素的LB培养液中28℃、250rpm培养；

4)当菌液的OD₆₀₀值到达0.8-1.0后，4,000rpm常温离心10min收集菌体，用10mmol/L的MgCl₂溶液将菌体的OD₆₀₀值调至1.0，以每毫升菌液加入2μL的比例加入100mmol/l AS，静置3h以上；

5)取5-6叶期的烟草，用1mL注射器吸取菌液，将菌液从叶片背面缓慢渗透进入表皮细胞，注射后正常培养(25℃光照/黑暗各12h)。

3-5d后剪取注射部位周围的叶片，背面朝上，在荧光显微镜下观察目标蛋白的表达情况。结果如图3所示。结果表明，GFP-LOC_Os02g39410与GFP-LOC_Os01g46500分别单独注射烟草时，可以正常观测到绿色荧光，当其与miRNA-T34的过表达载体OX-miRNA-T34(具体制备方法参考实施例4)共同注射后，其绿色荧光的发光强度明显减弱，证实了miRNA-T34能抑制其靶基因对应的GFP-靶基因融合蛋白的表达。

实施例4过表达miRNA-T34、敲除miRNA-T34的转基因水稻的构建

利用pOX(已在文献“李超.水稻SDG711和SDG723的克隆与功能分析[D].2012.”中公开)为过量表达载体，以UBI启动子驱动miRNA-T34的过表达；利用CRISPR/Cas9技术进行miRNA-T34的敲除。具体如下：

1.miRNA-T34的过表达载体的构建

利用实施例2普通反转录的cDNA为模板扩增得到miRNA-T34前体序列片段，所需引物如下：

正向引物Pre-miRNA-T34 F：

5’-CCAAGCTTAAACCCACCTCATCACCACC-3’(SEQ ID NO:13)；

反向引物Pre-miRNA-T34 R：

5’-CGGGATCCGGACGGAGGGAGTAACTTTTCC-3’(SEQ ID NO:14)。

反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，模板DNA 1μL，正反向游引物各2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，ddH₂O补足至50μL。

反应条件为：95℃预变性3min，94℃15s、60℃15s、72℃90s，32个循环，最后72℃延伸5min。

通过1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段，利用Hind III与BamH I将该片段连接到pOX载体上(连接反应体系中，pOX载体与目的片段按摩尔比1:3-3:1配制，反应条件为：22℃连接2h或16℃过夜连接)，连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后第2d挑取单克隆，培养约8h后抽提质粒，将得到的克隆载体转化大肠杆菌菌种DH5α，经HindⅢ、BamHI酶切鉴定，菌落PCR及后续测序鉴定(所用的引物序列：UBI-seq：5’-TTGTCGATGCTCACCCTGTTG-3’)，获得OX-miRNA-T34载体。

2.miRNA-T34敲除载体构建

敲除载体的构建参照文献“Ma X L,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing inmonocot and dicotplants.Mol Plant,2015,8:1274–1284”记载的方法)。首先根据miRNA-T34成熟序列及其前体在CRISPR/Cas9在线靶点设计网站：http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/设计两个gRNA靶点(5’-CCGACATACGGTTTGTCCGG-3’与5’-CCGAGAGGGAGATCCTCGAG-3’)，根据靶点设计引物。所需引物如下：

正向引物U3F：

5’-GGCACCGACATACGGTTTGTCCGG-3’(SEQ ID NO:15)；

反向引物U3R：

5’-AAACCCGGACAAACCGTATGTCGG-3’(SEQ ID NO:16)；

正向引物U6aF：

5’-GCCGCCGAGAGGGAGATCCTCGAG-3’(SEQ ID NO:17)；

反向引物U6aR：

5’-AAACCTCGAGGATCTCCCTCTCGG-3’(SEQ ID NO:18)。

进行以下实验：(1)制备双链接头：分别取等量每个靶点的1对gRNA寡核苷酸链的上游引物与下游引物混合(终浓度1μmol/L)，95℃处理30s，然后移至室温冷却完成退火；

(2)酶切：取pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA质粒(以上质粒均在文献“Ma XL,ZhangQ,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicotplants.Mol Plant,2015,8:1274-1284”中公开)各1μg，制备20μL反应体系，用5-10U Bsa I(NEB)酶切20min，70℃处理10min使酶失活；

(3)连接和PCR扩增：分别将酶切过的pYL-U3-gRNA及pYL-U6a-gRNA质粒与各自所对应双链接头连接，然后分别利用引物B1’/B2、B2’/BL对gDNA(gRNA对应的DNA序列)进行扩增，先95℃1min，然后按95℃15s、60℃15s和68℃30s进行30个循环的反应；所用引物序列如下：

B1’:5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO:19)；

B2:5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGT CCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO:20)；

B2’:5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCA GCAAAGG-3’(SEQ ID NO:21)；

BL:5’-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO:22)。

(4)产物纯化、酶切和连接：将所有靶点gDNA PCR产物回收混合后用20U Bsa I在37℃酶切30min，然后75℃处理5min；将酶切片段纯化后与Bsa I酶切回收的pYLCRISPR/Cas9-MT(I)载体(在文献“Ma X L,Zhang Q,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 systemfor convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot anddicotplants.Mol Plant,2015,8:1274-1284”中公开)片段利用T4 DNA ligase(NEB)20℃连接2h；

(5)转化及质粒测序：连接产物转化DH5a感受态细胞后，挑取单克隆接种培养，抽提质粒后利用Asc I进行酶切鉴定，并挑取酶切(AscI)验证正确的克隆送Thermo FisherScientific公司测序，获得KO-miRNA-T34载体。

2.转基因水稻的构建

将OX-miRNA-T34载体、KO-miRNA-T34载体分别通过电激法转化根癌农杆菌EHA105，参考文献“Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Efficient transformationof rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis ofthe boundaries of the T-D NA.Plant J,1994,6:271-282”中的方法，用籼稻品系H4、中二软占的成熟种子诱导愈伤组织，21d后将愈伤进行继代；10d继代一次，继代培养2d后挑选状态良好的胚性愈伤组织用于载体的根癌农杆菌EHA105侵染；共培养3d后进入抗性愈伤组织筛选，利用50mg/L潮霉素培养基筛选，每隔2周筛选一次；挑选状态良好的抗性愈伤组织进行2周的预分化培养，再进行2周的分化培养，并将分化苗移至生根培养基中，获得转基因植株。经潮霉素基因Hyg的PCR检测(所用引物为HygR-F/HygR-R)，并对miRNA-T34前体基因进行PCR检测(所用引物为T34-F/T34-R)，获得过表达miRNA-T34或者敲除miRNA-T34的转基因阳性植株。所用的引物序列如下：

HygR-F：5’-AAGATGTTGGCGACCTCGTATT-3’(SEQ ID NO:23)；

HygR-R：5’-CGTGCTTTCAGCTTCGATGTAG-3’(SEQ ID NO:24)；

T34-F：5’-GCCCGCGGCGGTGGGGCGGC-3’(SEQ ID NO:25)；

T34-R：5’-TACCTGACGGCGGACTCGGTGAAGCGG-3’(SEQ ID NO:26)。

实施例5过表达miRNA-T34、敲除miRNA-T34的转基因水稻的抗病性分析

对转基因后代阳性植株进行抗病性检测，接种方法参照实施例2。7-9d后统计结果，结果如图4所示。

结果表明，接种稻瘟病菌后，miRNA-T34过表达转基因植株病斑数量及大小减少，抗病性明显增强，而miRNA-T34敲除植株叶片的病斑较大，扩散严重，部分叶片直接枯死，抗性明显降低。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种增强稻瘟病抗性的miRNA的克隆与应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 增强稻瘟病抗性的miRNA

<400> 1

guggggcggc ggugguggcg g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码增强稻瘟病抗性的miRNA的基因

<400> 2

gtggggcggc ggtggtggcg g 21

<210> 3

<211> 260

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA相应的前体

<400> 3

gcccgcggcg guggggcggc ggugguggcg gcgaagguga uggacaggaa ggagcuggcc 60

gggaggaaca aggaagggcg ggcgagaacc gagagggaga uccucgaggc cgucgaccac 120

cccuuccucc cgcgccucua cggcguggcc gagggggauc gcugguccug ccuccucacc 180

gaguucugcc ccggcggcga ccuccacguc cuccgccagc ggcagccgca ccgccgcuuc 240

accgaguccg ccgucaggua 260

<210> 4

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码miRNA相应的前体的基因

<400> 4

gcccgcggcg gtggggcggc ggtggtggcg gcgaaggtga tggacaggaa ggagctggcc 60

gggaggaaca aggaagggcg ggcgagaacc gagagggaga tcctcgaggc cgtcgaccac 120

cccttcctcc cgcgcctcta cggcgtggcc gagggggatc gctggtcctg cctcctcacc 180

gagttctgcc ccggcggcga cctccacgtc ctccgccagc ggcagccgca ccgccgcttc 240

accgagtccg ccgtcaggta 260

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT引物序列

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccgcca cc 52

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miRNA-T34 正向引物

<400> 6

gcgttttgaa acggagggag c 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LOC_Os02g39410 正向引物

<400> 7

acatcaacac aaccccgag 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LOC_Os02g39410 反向引物

<400> 8

atctaacccc aaaactccct g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LOC_Os01g46500 正向引物

<400> 9

cttgacgatg caaatgacgc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LOC_Os01g46500 反向引物

<400> 10

acaacccctg agtgttcaaa c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6 正向引物

<400> 11

tacagataag attagcatgg cccc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> U6 反向引物

<400> 12

ggaccatttc tcgatttgta cgtg 24

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物 Pre-miRNA-T34 F

<400> 13

ccaagcttaa acccacctca tcaccacc 28

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物 Pre-miRNA-T34 R

<400> 14

cgggatccgg acggagggag taacttttcc 30

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物U3F

<400> 15

ggcaccgaca tacggtttgt ccgg 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物U3R

<400> 16

aaacccggac aaaccgtatg tcgg 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向引物U6aF

<400> 17

gccgccgaga gggagatcct cgag 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向引物U6aR

<400> 18

aaacctcgag gatctccctc tcgg 24

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物B1’

<400> 19

ttcagaggtc tctctcgcac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物B2

<400> 20

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物B2’

<400> 21

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物BL

<400> 22

agcgtgggtc tcgaccgggt ccatccactc caagctc 37

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HygR-F

<400> 23

aagatgttgg cgacctcgta tt 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HygR-R

<400> 24

cgtgctttca gcttcgatgt ag 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T34-F

<400> 25

gcccgcggcg gtggggcggc 20

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T34-R

<400> 26

tacctgacgg cggactcggt gaagcgg 27

Claims

1.一种miRNA在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1中所述的miRNA的前体在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用，其特征在于：所述的miRNA的前体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：利用基因工程技术，通过促进所述的miRNA在水稻中的过表达，从而提高水稻对稻瘟病菌的抗性。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的基因工程技术为过表达miRNA技术。

5.一种利用过表达miRNA技术培育抗稻瘟病水稻的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）以水稻叶总RNA为模板，反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，分别以T34-OX-F和T34-OX-R为引物，PCR扩增得到目的片段；

（2）将纯化的目的片段用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切，再与经同样双酶切的pOX载体连接，获得连接产物；

（3）将连接产物直接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选单菌落培养，提取质粒进行HindⅢ、BamH I酶切鉴定及菌落PCR鉴定，将以上两种检测结果符合要求的转化子继续进行测序鉴定，获得成功构建的过表达载体；

（4）将过表达载体进行农杆菌介导的水稻遗传转化，获得所述的抗稻瘟病水稻；

步骤（1）中所述的引物T34-OX-F和T34-OX-R的核苷酸序列如下所示：

T34-OX-F：5’- CCAAGCTTAAACCCACCTCATCACCACC -3’ ；

T34-OX-R：5’- CGGGATCCGGACGGAGGGAGTAACTTTTCC -3’ ；

步骤（3）中所述的测序所用的引物序列如下所示：

UBI-seq：5’-TTGTCGATGCTCACCCTGTTG-3’。

6.根据权利要求5所述的利用过表达miRNA技术培育抗稻瘟病水稻的方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的水稻为水稻高抗稻瘟病株系H4；

步骤（1）中所述的PCR扩增的反应体系，按每50 µL反应体系中含：2×Phanta MaxBuffer 25 µL，模板DNA 1 µL，正反向引物各2 µL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1 µL，10 mM each dNTP Mix 1 µL，ddH₂O余量计；

步骤（1）中所述的PCR扩增的反应条件为：95 ℃预变性3 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 15s、72 ℃ 90 s，32个循环，最后72 ℃延伸5 min；

步骤（2）中所述的连接的反应体系中，pOX载体与目的片段按摩尔比1:3～3:1配制；

步骤（2）中所述的连接的反应条件为：22℃连接2 h或16 ℃过夜连接；

步骤（3）中所述的挑选单菌落的时间为转化后第2 d，所述的培养的时间为7～9 h。