CN1177862C - 人nip2相关蛋白和编码序列及其用途 - Google Patents
人nip2相关蛋白和编码序列及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1177862C CN1177862C CNB00125281XA CN00125281A CN1177862C CN 1177862 C CN1177862 C CN 1177862C CN B00125281X A CNB00125281X A CN B00125281XA CN 00125281 A CN00125281 A CN 00125281A CN 1177862 C CN1177862 C CN 1177862C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- associated protein
- sequence
- polynucleotide
- nip2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一类新的人NIP2相关蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的人NIP2相关蛋白的多核苷酸的用途。
Description
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及新的编码人NIP2相关蛋白的多核苷酸,以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备方法。
NIP的全称是NCBP(Nuclear cap binding protein)相互作用蛋白(NCBPinteracting protein)。NIP是一家族。其中NIP1,NIP2已证明不仅通过NCBP结合而参与mRNA cap的结合影响Pre-mRNA的剪接(splicing)和mRNA的转运;而且,NIP1,NIP2是细胞凋亡通路中的重要成员(Katoka N et al.Nucleic Acid Res.23:3638-3641;1995)。NIP2参与由TNFα诱导的凋亡。同时,NIP1与NIP2均与Bcl2相互作用:NIP2对抗Bcl2的抗凋亡作用,而Bcl2可抑制NIP2的促凋亡(Vegeto E.et al.FASEB J 13:793-803,1999)。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤,目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此,本领域迫切需要开发研究具有抑癌作用的蛋白及其激动剂/抑制剂。然而,在本申请之前,尚没有公开过本发明所涉及的新的NIP2相关蛋白的氨基酸或核苷酸序列。
本发明的目的是提供一类新的NIP2相关蛋白(NIP-2 associated protein,简称为“NIP2 AP”)多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的NIP2相关蛋白多肽,它包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽,或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地,该多肽是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:(a)编码上述的NIP2相关蛋白多肽的多核苷酸;(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地,该多核苷酸编码的多肽具有SEQ ID NO:2氨基酸序列。更佳地,该多核苷酸的序列选自下组:SEQ ID NO:3的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了制备具有人NIP2相关蛋白活性的多肽的制备方法,该方法包含:(a)在适合表达NIP2相关蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出具有人NIP2相关蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面,提供了与上述的NIP2相关蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子,它含有上述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明的NIP2相关蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
在附图中,图1显示了本发明的人NIP2相关蛋白(NIP2 AP)的表达谱。
图2显示了大肠杆菌T7 S30体外翻译***表达NIP2 AP的凝胶电泳图。其中,泳道1为空白对照;泳道2为PinPointTM对照DNA(编码CAT融合蛋白,约39kDa);泳道3为pT7X-NIP2 AP(约41kDa)。
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞,在获得具有抑癌作用的基础上,经测序证明为新的基因,进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明,本发明的人NIP2相关蛋白对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用。
在本发明的一个实施例中,人NIP2相关蛋白基因是从胎盘中分离的cDNA,它与NIP2在氨基酸序列有一定同源(相同性47%,相似性73%)。它可抑制肝癌细胞生长和促进癌细胞凋亡的作用。因此,这是一个具有功能的新基因,并在肿瘤治疗中具有应用价值。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的NIP2相关蛋白或多肽”是指NIP2相关蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化NIP2相关蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。NIP2相关蛋白多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人NIP2相关蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人NIP2相关蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,术语“人NIP2相关蛋白多肽”或“人NIP2 AP蛋白多肽”可互换使用,都指具有人NIP2相关蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人NIP2相关蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人NIP2相关蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人NIP2相关蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人NIP2相关蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含人NIP2相关蛋白多肽或其片段的融合蛋白(如包含SEQ ID NO:2所示序列的融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了人NIP2相关蛋白多肽的可溶性片段。通常,该片段具有人NIP2相关蛋白多肽序列的至少约10个连续氨基酸,通常至少约30个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人NIP2相关蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人NIP2相关蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中,“人NIP2相关蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3所示的编码区序列(第618-1445位)相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质,但与SEQ ID NO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述核酸序列杂交且两个序列之间具有至少60%,较佳地至少80%,更佳地至少85%,最佳地至少90%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上,更好是97%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码人NIP2相关蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如,用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于:1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列,和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码人NIP2相关蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得:1)从基因组DNA分离双链DNA序列;2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
上述提到的方法中,分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时,DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时,DNA序列的直接化学合成是不可能的,选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录,形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术,试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory.New York,1989)。还可得到商业供应的cDNA文库,如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时,即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于):(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(2)标志基因的功能出现或丧失;(3)测定人NIP2相关蛋白的转录本的水平;(4)通过免疫学技术或测定生物学活性,来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用,也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中,杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源,其长度至少15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸。此外,探针的长度通常在2kb之内,较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素,荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中,检测人NIP2相关蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法,放射免疫沉淀法,酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因,或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列,测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列,才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或人NIP2相关蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的人NIP2相关蛋白多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码人NIP2相关蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,人NIP2相关蛋白多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人NIP2相关蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a LaboratoryManual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人NIP2相关蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物治疗人NIP2相关蛋白功能低下或丧失所致的疾病(尤其是用于抑制肿瘤生长,尤其是用于治疗肝癌),和用于筛选促进或对抗人NIP2相关蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如,抗体可用于激活或抑制人NIP2相关蛋白的功能。用表达的重组人NIP2相关蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人NIP2相关蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人NIP2相关蛋白的药剂的方法。激动剂提高人NIP2相关蛋白刺激细胞增殖等生物功能,而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如,能在药物的存在下,将哺乳动物细胞或表达人NIP2相关蛋白的膜制剂与标记的人NIP2相关蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
人NIP2相关蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人NIP2相关蛋白的拮抗剂可以与人NIP2相关蛋白结合并消除其功能,或是抑制人NIP2相关蛋白的产生,或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。人NIP2相关蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时,可以将人NIP2相关蛋白加入生物分析测定中,通过测定化合物影响人NIP2相关蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法,可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗,例如,各种恶性肿瘤和细胞异常增殖等。
本发明的多肽,及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术,三瘤技术,人B-细胞杂交瘤技术,EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒,容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起,可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示,该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外,本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药,如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。人NIP2相关蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人NIP2相关蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素,如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
人NIP2相关蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于人NIP2相关蛋白的无表达或异常/无活性的人NIP2相关蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的人NIP2相关蛋白,以抑制内源性的人NIP2相关蛋白活性。例如,一种变异的人NIP2相关蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的人NIP2相关蛋白,虽可与下游的底物结合,但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗人NIP2相关蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将人NIP2相关蛋白基因转移至细胞内。构建携带人NIP2相关蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组人NIP2相关蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制人NIP2相关蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多聚核苷酸直接注入到体内组织中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体内等。
本发明的多肽还可用作肽谱分析,例如,多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割,并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。
本发明还提供了针对人NIP2相关蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于):多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗人NIP2相关蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的人NIP2相关蛋白。
与人NIP2相关蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记,注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人NIP2相关蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人NIP2相关蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人NIP2相关蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭人NIP2相关蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人NIP2相关蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
人NIP2相关蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗人NIP2相关蛋白的单链抗体。
能与人NIP2相关蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时,必须对人NIP2相关蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人NIP2相关蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的,且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人NIP2相关蛋白水平,可以用作解释人NIP2相关蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断人NIP2相关蛋白起作用的疾病。
人NIP2相关蛋白的多聚核苷酸可用于人NIP2相关蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面,人NIP2相关蛋白的多聚核苷酸可用于检测人NIP2相关蛋白的表达与否或在疾病状态下人NIP2相关蛋白的异常表达。如人NIP2相关蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断人NIP2相关蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人NIP2相关蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人NIP2相关蛋白的转录产物。
检测人NIP2相关蛋白基因的突变也可用于诊断人NIP2相关蛋白相关的疾病。人NIP2相关蛋白突变的形式包括与正常野生型人NIP2相关蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具***置且并可以与其杂交。目前,需要鉴定染色体上的各基因的具***点。现在,只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色***置。根据本发明,为了将这些序列与疾病相关基因相关联,其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之,根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法,是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物,通过类似方法,可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选,从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH),可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述,参见Verma等,Human Chromosomes:a Manualof Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色***置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着,需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变,而该突变在任何正常个体中未观察到,则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体,通常涉及首先寻找染色体中结构的变化,如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力,被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA,可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
本发明的人NIP2相关蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
在本发明的一个实施例中,从人胎盘cDNA文库中,通过对肝癌细胞7721体外DNA转染筛选、分离,并通过5′-RACE及全克隆技术获得NIP2相关蛋白的全长cDNA克隆。此外,Northern杂交证明,本发明的NIP2相关蛋白基因在心、脑、胎盘、肺、肝、肌肉、胰中有表达,肾中无表达或较弱。
鉴于NIP2 AP具有抑制癌细胞生长的作用,因此它不仅有调控细胞***和促进癌细胞凋亡的作用,而且具有对恶性肿瘤治疗与诊断的应用价值。此外,由于本发明的人NIP2相关蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此与来源于其他物种的同族蛋白相比,预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
NIP 2 AP cDNA克隆的分离及对人肝癌细胞的生长抑制
取3、6、10月龄的胎盘组织,用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXRcDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL),反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受态细胞,获得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆,其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针,杂交筛选cDNA文库,挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒,按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ngDNA酒精沉淀干燥后,加6μl H2O溶解,待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液,混匀后,室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液,均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中,37℃放置2小时,每孔再加50μl无血清培液,37℃24小时。每孔换100μl全培液,37℃24小时,换含G418的全培液100μl,37℃24~48小时,边观察,边换G418浓度不等的培液。约2~3次后,直到镜检细胞有克隆形成,计数。结果发现cDNA克隆PP753有抑制克隆形成的功能(空载体克隆形成数为50、26、31,克隆PP753为0、0、0)
对cDNA克隆序列分析后发现基因尚不完整,采用Clontech公司SMART RACEcDNA扩增试剂盒(Cat.No.K1811-1),基因特异引物为5′ATTCAGCCTTCCGTCCCAGCAACTG 3′和5′CCCAGCAGATCAGTTTCCCAGCCTC 3′,按说明书进行操作,获得全长克隆,命名为NIP 2 AP。
实施例2:NIP2 AP cDNA的序列分析
实施例1获得的NIP2 AP cDNA全长为2360核苷酸,含阅读框架725(第618-1445位)个核苷酸,编码一个由275个氨基酸(不包括终止密码子)组成的蛋白。
A:核苷酸序列:(SEQ ID NO:1)长度:2360bp
1 ACGCGGGGGA GCTACAACAG CTGAGACAGA AAAGAGGTAA GGAAGTGTTG
51 GGGGCTGGGA CAACCAGCTC CCCGACAACT CCTAGGTGTT TAAAGAAGGA
101 GGCAGGAAGA CTTGTGAAGA TGGGAACTAT ACAAGAGGCA GGAAAAAAGA
151 CAGATGTTGG GTGGAGCAAC TGCTACAGAG GTAAATATGA TTAACTTTAC
201 ATTCCATCTT TCGTCTGCTC CCAAACTTAA CAGCAGGTAA TCTGCTTCTA
251 GCAAGTGGTG AAGGTAAGAG AAGCATCTGT ATAGGAGGCA AGAGATCTGA
301 GTCCTTTTGA AGGCCTATCC TCTGCTCTGT ATCTCAATTA CTGTTCTTCA
351 TTTCAATTAT TCTTACCTAC TATTCAGTTC CCTTGATCTT TTCTTCTTGG
401 GGGCTGTCTT AGGGTCAGGG AGATTGCAGA AGCACCAGAA CTAGGAGCAG
451 CCCTGAGACA TGGGGAGTTG GAGCTGAAGG AGGAATGGCA GGATGAAGAA
501 TTCCCTAGAT TGCTTCCTGA GGAGGCTGGC ACTTCTGAAG ATCCTGAAGA
551 CCCTAAAGGA GATTCACAGG CAGCTGCAGG TACCCCCAGC ACTTTAGCCC
601 TGTGTGGCCA GCGCCCCATG CGCAAGCGTC TTTCTGCCCC AGAGTTGCGG
651 CTGAGTCTGA CTAAGGGGCC TGGAAATGAT GGAGCTTCAC CCACCCAGTC
701 TGCACCTTCC TCTCCTGATG GCAGTTCTGA CCTGGAGATA GACGAATTGG
751 AGACACCTTC AGACTCGGAG CAGCTGGACA GTGGACATGA ATTTGAATGG
801 GAAGATGAAC TACCCCGGGC AGAGGGTCTG GGCACCAGTG AGACAGCTGA
851 AAGGCTGGGC CGAGGTTGTA TGTGGGATGT GACTGGAGAA GATGGACATC
901 ACTGGAGGGT GTTCCGAATG GGACCACGGG AGCAGCGCGT AGACATGACT
951 GTCATTGAGC CCTATAAGAA AGTCCTGTCT CATGGAGGTT ACCACGGTGA
1001 TGGCCTCAAT GCTGTCATCC TTTTTGCTTC CTGTTATCTA CCCAGAAGCA
1051 GCATCCCCAA CTACACCTAT GTCATGGAAC ACTTGTTTAG GTATATGGTG
1101 GGAACTCTGG AGCTGCTAGT AGCTGAAAAT TACCTGCTTG TTCATTTGAG
1151 TGGAGGCACA AGCAGGGCCC AAGTTCCACC TCTAAGCTGG ATACGTCAGT
1201 GTTACCGTAC CCTGGATCGG CGGCTACGGA AAAACCTGCG AGCCCTGGTG
1251 GTTGTCCATG CTACATGGTA TGTGAAAGCA TTTCTGGCAC TGCTTCGGCC
1301 CTTCATCAGT TCCAAATTCA CACGAAAAAT CCGTTTTCTG GACAGCCTGG
1351 GGGAGCTGGC CCAACTCATA TCCCTGGATC AAGTCCACAT CCCTGAAGCT
1401 GTCAGACAGC TGGACCGGGA TCTCCATGGC TCAGGAGGGA CATAGCACAG
1451 GACTGGATAA AGGGCCTTAG AACCAGTTAG TGATCTGCCT ACACCTGAAT
1501 CCCTGAAACA TCTGAACTGT TTTGTAAATC ATCTTATCCC CAACCTCAGT
1551 ACCACCGGAT CTTCACTTCT CAGTGGGATT TTGTCCTTTG CATGACCCTA
1601 CTTTCAGCAG GGCTTTGAGG CTGGGAAACT GATCTGCTGG GTGACTTTCA
1651 TTCCAGTTGC TGGGACGGAA GGCTGAATGT AGGGTCATTT TGTATGGGAT
1701 ATGCAGAGCT CTGGGTTTTT TTGTTTTTTG TTTTTTGAGA CGGAGTCTCG
1751 CTCTGTCGCC AGGCTGGAGT GCAGTGGTGC GATCTCGGCT CACTGCAACC
1801 TCCGCCTCCC GGTTCAAGCC ATTCTTCTGC CTCAGCCTCA GCGAGTAGCT
1851 GAGACTACCG GCGCACGCCA CCACGCCCAG CTAATTGTTT TGTATTTTTA
1901 GTAGAGACGG GGTTTCACCA TGTTGGCCAG GATGGTCTCG ATCTCTTGAC
1951 CTCGTGATCT GCCCGCCTCG GCCTCCCAAA GTGCCGAGAT TACAGGTGTG
2001 AGCCACCGCG CTCGGCCAGA GCTCTGGGTT TTAATCCTAC TTTAGCTGTA
2051 GAACCTTGGG CAAATAACTT CATCTTTTTG GGTCCTAATT TTCCTCCTGT
2101 CTAACTGGAG GGACTGTGAT CCTTCCACCT TGGATGGAAG AGGCTTACCT
2151 GACAGCCAGC CTGCCTGCTG GGAGCCAGGA GAGTCAGCTC ATTAAATCTT
2201 GAAGAACCGC TGTATGCCCT TTTTCCTTCT AAGTCATGTC TGCTGCCTGT
2251 GAGCCTGGGA AGGAGTGCTT TCAAAACCTG TATTTTTGCC CTCTTTAGTA
2301 AATTTAGAAC TGTAGAGGCT AATAAACTGC GATGAGACAT TTAAAAAAAA
2351 AAAAAAAAAA
B:氨基酸序列:(SEQ ID NO:2)长度:275个氨基酸
1 MRKRLSAPEL RLSLTKGPGN DGASPTQSAP SSPDGSSDLE IDELETPSDS
51 EQLDSGHEFE WEDELPRAEG LGTSETAERL GRGCMWDVTG EDGHHWRVFR
101 MGPREQRVDM TVIEPYKKVL SHGGYHGDGL NAVILFASCY LPRSSIPNYT
151 YVMEHLFRYM VGTLELLVAE NYLLVHLSGG TSRAQVPPLS WIRQCYRTLD
201 RRLRKNLRAL VVVHATWYVK AFLALLRPFI SSKFTRKIRF LDSLGELAQL
251 ISLDQVHIPE AVRQLDRDLH GSGGT
C:组合序列:NIP 2 AP(SEQ ID NO:3)
起始编码子:618 ATG 终止编码子:1445 TAG
蛋白质分子量:30972.46
1 AC GCG GGG GAG CTA CAA CAG CTG AGA CAG AAA AGA GGT AAG GAA GTG 47
48 TTG GGG GCT GGG ACA ACC AGC TCC CCG ACA ACT CCT AGG TGT TTA AAG 95
96 AAG GAG GCA GGA AGA CTT GTG AAG ATG GGA ACT ATA CAA GAG GCA GGA 143
144 AAA AAG ACA GAT GTT GGG TGG AGC AAC TGC TAC AGA GGT AAA TAT GAT 191
192 TAA CTT TAC ATT CCA TCT TTC GTC TGC TCC CAA ACT TAA CAG CAG GTA 239
240 ATC TGC TTC TAG CAA GTG GTG AAG GTA AGA GAA GCA TCT GTA TAG GAG 287
288 GCA AGA GAT CTG AGT CCT TTT GAA GGC CTA TCC TCT GCT CTG TAT CTC 335
336 AAT TAC TGT TCT TCA TTT CAA TTA TTC TTA CCT ACT ATT CAG TTC CCT 383
384 TGA TCT TTT CTT CTT GGG GGC TGT CTT AGG GTC AGG GAG ATT GCA GAA 431
432 GCA CCA GAA CTA GGA GCA GCC CTG AGA CAT GGG GAG TTG GAG CTG AAG 479
480 GAG GAA TGG CAG GAT GAA GAA TTC CCT AGA TTG CTT CCT GAG GAG GCT 527
528 GGC ACT TCT GAA GAT CCT GAA GAC CCT AAA GGA GAT TCA CAG GCA GCT 575
576 GCA GGT ACC CCC AGC ACT TTA GCC CTG TGT GGC CAG CGC CCC ATG CGC 623
1 Met Arg 2
624 AAG CGT CTT TCT GCC CCA GAG TTG CGG CTG AGT CTG ACT AAG GGG CCT 671
3 Lys Arg Leu Ser Ala Pro Glu Leu Arg Leu Ser Leu Thr Lys Gly Pro 18
672 GGA AAT GAT GGA GCT TCA CCC ACC CAG TCT GCA CCT TCC TCT CCT GAT 719
19 Gly Asn Asp Gly Ala Ser Pro Thr Gln Ser Ala Pro Ser Ser Pro Asp 34
720 GGC AGT TCT GAC CTG GAG ATA GAC GAA TTG GAG ACA CCT TCA GAC TCG 767
35 Gly Ser Ser Asp Leu Glu Ile Asp Glu Leu Glu Thr Pro Ser Asp Ser 50
768 GAG CAG CTG GAC AGT GGA CAT GAA TTT GAA TGG GAA GAT GAA CTA CCC 815
51 Glu Gln Leu Asp Ser Gly His Glu Phe Glu Trp Glu Asp Glu Leu Pro 66
816 CGG GCA GAG GGT CTG GGC ACC AGT GAG ACA GCT GAA AGG CTG GGC CGA 863
67 Arg Ala Glu Gly Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ala Glu Arg Leu Gly Arg 82
864 GGT TGT ATG TGG GAT GTG ACT GGA GAA GAT GGA CAT CAC TGG AGG GTG 911
83 Gly Cys Met Trp Asp Val Thr Gly Glu Asp Gly His His Trp Arg Val 98
912 TTC CGA ATG GGA CCA CGG GAG CAG CGC GTA GAC ATG ACT GTC ATT GAG 959
99 Phe Arg Met Gly Pro Arg Glu Gln Arg Val Asp Met Thr Val Ile Glu 114
960 CCC TAT AAG AAA GTC CTG TCT CAT GGA GGT TAC CAC GGT GAT GGC CTC 1007
115 Pro Tyr Lys Lys Val Leu Ser His Gly Gly Tyr His Gly Asp Gly Leu 130
1008 AAT GCT GTC ATC CTT TTT GCT TCC TGT TAT CTA CCC AGA AGC AGC ATC 1055
131 Asn Ala Val Ile Leu Phe Ala Ser Cys Tyr Leu Pro Arg Ser Ser Ile 146
1056 CCC AAC TAC ACC TAT GTC ATG GAA CAC TTG TTT AGG TAT ATG GTG GGA 1103
147 Pro Asn Tyr Thr Tyr Val Met Glu His Leu Phe Arg Tyr Met Val Gly 162
1104 ACT CTG GAG CTG CTA GTA GCT GAA AAT TAC CTG CTT GTT CAT TTG AGT 1151
163 Thr Leu Glu Leu Leu Val Ala Glu Asn Tyr Leu Leu Val His Leu Ser 178
1152 GGA GGC ACA AGC AGG GCC CAA GTT CCA CCT CTA AGC TGG ATA CGT CAG 1199
179 Gly Gly Thr Ser Arg Ala Gln Val Pro Pro Leu Ser Trp Ile Arg Gln 194
1200 TGT TAC CGT ACC CTG GAT CGG CGG CTA CGG AAA AAC CTG CGA GCC CTG 1247
195 Cys Tyr Arg Thr Leu Asp Arg Arg Leu Arg Lys Asn Leu Arg Ala Leu 210
1248 GTG GTT GTC CAT GCT ACA TGG TAT GTG AAA GCA TTT CTG GCA CTG CTT 1295
211 Val Val Val His Ala Thr Trp Tyr Val Lys Ala Phe Leu Ala Leu Leu 226
1296 CGG CCC TTC ATC AGT TCC AAA TTC ACA CGA AAA ATC CGT TTT CTG GAC 1343
227 Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Phe Thr Arg Lys Ile Arg Phe Leu Asp 242
1344 AGC CTG GGG GAG CTG GCC CAA CTC ATA TCC CTG GAT CAA GTC CAC ATC 1391
243 Ser Leu Gly Glu Leu Ala Gln Leu Ile Ser Leu Asp Gln Val His Ile 258
1392 CCT GAA GCT GTC AGA CAG CTG GAC CGG GAT GTC CAT GGC TCA GGA GGG 1439
259 Pro Glu Ala Val Arg Gln Leu Asp Arg Asp Leu His Gly Ser Gly Gly 274
1440 ACA TAG CAC AGG ACT GGA TAA AGG GCC TTA GAA CCA GTT AGT GAT CTG 1487
275 Thr *** 276
1488 CCT ACA CCT GAA TCC CTG AAA CAT CTG AAC TGT TTT GTA AAT CAT CTT 1535
1536 ATC CCC AAC CTC AGT ACC ACC GGA TCT TCA CTT CTC AGT GGG ATT TTG 1583
1584 TCC TTT GCA TGA CCC TAC TTT CAG CAG GGC TTT GAG GCT GGG AAA CTG 1631
1632 ATC TGC TGG GTG ACT TTC ATT CCA GTT GCT GGG ACG GAA GGC TGA ATG 1679
1680 TAG GGT CAT TTT GTA TGG GAT ATG CAG AGC TCT GGG TTT TTT TGT TTT 1727
1728 TTG TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC TCT GTC GCC AGG CTG GAG TGC AGT 1775
1776 GGT GCG ATC TCG GCT CAC TGC AAC CTC CGC CTC CCG GTT CAA GCC ATT 1823
1824 CTT CTG CCT CAG CCT CAG CGA GTA GCT GAG ACT ACC GGC GCA CGC CAC 1871
1872 CAC GCC CAG CTA ATT GTT TTG TAT TTT TAG TAG AGA CGG GGT TTC ACC 1919
1920 ATG TTG GCC AGG ATG GTC TCG ATC TCT TGA CCT CGT GAT CTG CCC GCC 1967
1968 TCG GCC TCC CAA AGT GCC GAG ATT ACA GGT GTG AGC CAC CGC GCT CGG 2015
2016 CCA GAG CTC TGG GTT TTA ATC CTA CTT TAG CTG TAG AAC CTT GGG CAA 2063
2064 ATA ACT TCA TCT TTT TGG GTC CTA ATT TTC CTC CTG TCT AAC TGG AGG 2111
2112 GAC TGT GAT CCT TCC ACC TTG GAT GGA AGA GGC TTA CCT GAC AGC CAG 2159
2160 CCT GCC TGC TGG GAG CCA GGA GAG TCA GCT CAT TAA ATC TTG AAG AAC 2207
2208 CGC TGT ATG CCC TTT TTC CTT CTA AGT CAT GTC TGC TGC CTG TGA GCC 2255
2256 TGG GAA GGA GTG CTT TCA AAA CCT GTA TTT TTG CCC TCT TTA GTA AAT 2303
2304 TTA GAA CTG TAG AGG CTA ATA AAC TGC GAT GAG ACA TTT AAA AAA AAA 2351
2352 AAA AAA AAA 2360
D.同源比较
本发明的NIP2 AP cDNA克隆,含全长cDNA序列。
(1)核苷酸序列同源比较
没有同源。
(2)氨基酸序列与相关基因的比较
Query=PP753(275个氨基酸)
>gi|6093506|sp|Q12982|NIP2_HUMAN BCL2/ADENOVIRUS E1B 19-KD
PROTEIN-INTERACTING PROTEIN 2
长度=314
分值=287bits(726),预计值=3e-82
相同性=131/275(47%),相似性=204/275(73%),缺口=22/275(8%)
Query:1 MRKRLSAPELRLSLTKGPGNDGASPTQSAPSSPDGSSDLEIDELETPSDSEQLDSGHEFE 60
+RK+L AP++ L+L G+ D S ++++D L+TPS++ +EFE
Sbjct:49 VRKKLMAPDISLTLDPSDGS-------VLSDDLDESGEIDLDGLDTPSENS-----NEFE 96
Query:61 WEDELPRAEGLGTSETAERLGRGCMWDVTG----EDGHHWRVFRMGPREQRVDMTVIEPY 116
WED+LP+ + T E + +G + + T EDG WR+FR+G ++ RVDM IEPY
Sbjct:97 WEDDLPKPK------TTEVIRKGSITEYTAAEEKEDGRRWRMFRIGEQDHRVDMKAIEPY 150
Query:117 KKVLSHGGYHGDGLNAVILFASCYLPRSSIPNYTYVMEHLFRYMVGTLELLVAENYLLVH 176
KKV+SHGGY+GDGLNA+++FA C++P SS PNY Y+M++LF+Y++GTLELLVAENY++V+
Sbjct:151 KKVISHGGYYGDGLNAIVVFAVCFMPESSQPNYRYLMDNLFKYVIGTLELLVAENYMIVY 210
Query:177 LSGGTSRAQVPPLSWIRQCYRTLDRRLRKNLRALVVVHATWYVKAFLALLRPFISSKFTR 236
L+G T+R ++P L W+R+CY+ +DRRLRKNL++L++VH +W+++ LA+ RPFISSKF++
Sbjct:211 LNGATTRRKMPSLGWLRKCYQQIDRRLRKNLKSLIIVHPSWFIRTLLAVTRPFISSKFSQ 270
Query:237 KIRFLDSLGELAQLISLDQVHIPEAVRQLDRDLHG 271
KIR++ +L ELA+L+ ++ V IPE ++Q+D++L+G
Sbjct:271 KIRYVFNLAELAELVPMEYVGIPECIKQVDQELNG 305
E:氨基酸序列的基序分析
对NIP2 AP蛋白的氨基酸序列进行基序分析,发现第126..269位为:Nip21Nip2 W02b12.8 GTP酶活化Rho缺口、Rho相关小GTP酶活化区(Protein Nip21Nip2 W02b12.8 GTPase activating Rho gap Rho-related Small GTPase Activator)
第1..132为:NIP2L NIP2 O54940(1),Q12982(1)
实施例3:NIP 2 AP在人组织中mRNA表达谱
用NIP 2 AP基因为探针,于多种组织mRNA膜片(Clontech)进行杂交。结果如图1所示。结果表明,NIP 2 AP在心、脑、胎盘、肺、肝、肌肉、胰中有表达,肾中无表达或较弱。
实施例4:NIP 2 AP在体外翻译***的表达
(1)将NIP 2 AP基因克隆于含T7启动子的表达载体
设计NIP 2 AP基因开放阅读框架(ORF)的一对特异引物,5′端引物含有NCOI酶切点,3′端引物含有HindIII酶切点,以NIP 2 AP克隆质粒或RT-PCT扩增产物为模板,PCR扩增片段,产物经NcoI和HindIII酶切。本实施例所用表达载体为p22450(该载体为中科院上海生物工程中心构建),含有T7启动子。载体也经NcoI和HindIII酶切,与PCR酶切片段连接,组建表达质粒pT7X-NIP 2 AP。
(2)体外翻译
采用E.coli T7 S30 Extract System for Circular DNA(Promega,Cat#L1130),并利用TranscendTM Colorimetric Translation Detection System(Promema,Cat.#L5070),体外表达INP 2 AP。
1.建立体外翻译反应体系:
质粒DNA: 1-4μg
完全氨基酸tRNA混合液: 5μl
无氨基酸的S30预混合液: 20μl
TranscendTM tRNA*: 1μl
T7 S30细胞裂解液: 15μl
无核酸酶无菌水加至终浓度: 50μl
*TranscendTM tRNA是ε-NH2被生物素标记的Lys-tRNA。
37℃反应1-2小时。
2.体外翻译产物的分析:
SDS-PAGE电泳分析:15%分离胶,4%浓缩胶。
电转移至PVDF:100V,60分钟。
利用Streptavidin-Alkaline Phosphatase(链霉抗生物素-碱性磷酸脂酶)结合含生物素的翻译蛋白,并通过Western Blue Stablized Substrate for AlkalinePhosphatase(碱性磷酸脂酶固定化染色剂)显色。
结果显示正对照样品CA7融合蛋白表达质粒在39KD处有蛋白条带,NIP 2AP表达质粒pT7X-NIP 2 AP在41KD处有蛋白条带,表明NIP 2 AP在体外表达***中获得了表达(图2)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
(1)一般信息:
(i)申请人:上海市肿瘤研究所
(ii)发明名称:人NIP2相关蛋白和编码序列及其用途
(iii)序列数目:3
(2)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征:
(A)长度:2360bp
(B)类型:核苷酸
(C)链性:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:核苷酸
(ix)序列描述:SEQ ID NO.1:
ACGCGGGGGA GCTACAACAG CTGAGACAGA AAAGAGGTAA GGAAGTGTTG GGGGCTGGGA 60
CAACCAGCTC CCCGACAACT CCTAGGTGTT TAAAGAAGGA GGCAGGAAGA CTTGTGAAGA 120
TGGGAACTAT ACAAGAGGCA GGAAAAAAGA CAGATGTTGG GTGGAGCAAC TGCTACAGAG 180
GTAAATATGA TTAACTTTAC ATTCCATCTT TCGTCTGCTC CCAAACTTAA CAGCAGGTAA 240
TCTGCTTCTA GCAAGTGGTG AAGGTAAGAG AAGCATCTGT ATAGGAGGCA AGAGATCTGA 300
GTCCTTTTGA AGGCCTATCC TCTGCTCTGT ATCTCAATTA CTGTTCTTCA TTTCAATTAT 360
TCTTACCTAC TATTCAGTTC CCTTGATCTT TTCTTCTTGG GGGCTGTCTT AGGGTCAGGG 420
AGATTGCAGA AGCACCAGAA CTAGGAGCAG CCCTGAGACA TGGGGAGTTG GAGCTGAAGG 480
AGGAATGGCA GGATGAAGAA TTCCCTAGAT TGCTTCCTGA GGAGGCTGGC ACTTCTGAAG 540
ATCCTGAAGA CCCTAAAGGA GATTCACAGG CAGCTGCAGG TACCCCCAGC ACTTTAGCCC 600
TGTGTGGCCA GCGCCCCATG CGCAAGCGTC TTTCTGCCCC AGAGTTGCGG CTGAGTCTGA 660
CTAAGGGGCC TGGAAATGAT GGAGCTTCAC CCACCCAGTC TGCACCTTCC TCTCCTGATG 720
GCAGTTCTGA CCTGGAGATA GACGAATTGG AGACACCTTC AGACTCGGAG CAGCTGGACA 780
GTGGACATGA ATTTGAATGG GAAGATGAAC TACCCCGGGC AGAGGGTCTG GGCACCAGTG 840
AGACAGCTGA AAGGCTGGGC CGAGGTTGTA TGTGGGATGT GACTGGAGAA GATGGACATC 900
ACTGGAGGGT GTTCCGAATG GGACCACGGG AGCAGCGCGT AGACATGACT GTCATTGAGC 960
CCTATAAGAA AGTCCTGTCT CATGGAGGTT ACCACGGTGA TGGCCTCAAT GCTGTCATCC 1020
TTTTTGCTTC CTGTTATCTA CCCAGAAGCA GCATCCCCAA CTACACCTAT GTCATGGAAC 1080
ACTTGTTTAG GTATATGGTG GGAACTCTGG AGCTGCTAGT AGCTGAAAAT TACCTGCTTG 1140
TTCATTTGAG TGGAGGCACA AGCAGGGCCC AAGTTCCACC TCTAAGCTGG ATACGTCAGT 1200
GTTACCGTAC CCTGGATCGG CGGCTACGGA AAAACCTGCG AGCCCTGGTG GTTGTCCATG 1260
CTACATGGTA TGTGAAAGCA TTTCTGGCAC TGCTTCGGCC CTTCATCAGT TCCAAATTCA 1320
CACGAAAAAT CCGTTTTCTG GACAGCCTGG GGGAGCTGGC CCAACTCATA TCCCTGGATC 1380
AAGTCCACAT CCCTGAAGCT GTCAGACAGC TGGACCGGGA TCTCCATGGC TCAGGAGGGA 1440
CATAGCACAG GACTGGATAA AGGGCCTTAG AACCAGTTAG TGATCTGCCT ACACCTGAAT 1500
CCCTGAAACA TCTGAACTGT TTTGTAAATC ATCTTATCCC CAACCTCAGT ACCACCGGAT 1560
CTTCACTTCT CAGTGGGATT TTGTCCTTTG CATGACCCTA CTTTCAGCAG GGCTTTGAGG 1620
CTGGGAAACT GATCTGCTGG GTGACTTTCA TTCCAGTTGC TGGGACGGAA GGCTGAATGT 1680
AGGGTCATTT TGTATGGGAT ATGCAGAGCT CTGGGTTTTT TTGTTTTTTG TTTTTTGAGA 1740
CGGAGTCTCG CTCTGTCGCC AGGCTGGAGT GCAGTGGTGC GATCTCGGCT CACTGCAACC 1800
TCCGCCTCCC GGTTCAAGCC ATTCTTCTGC CTCAGCCTCA GCGAGTAGCT GAGACTACCG 1860
GCGCACGCCA CCACGCCCAG CTAATTGTTT TGTATTTTTA GTAGAGACGG GGTTTCACCA 1920
TGTTGGCCAG GATGGTCTCG ATCTCTTGAC CTCGTGATCT GCCCGCCTCG GCCTCCCAAA 1980
GTGCCGAGAT TACAGGTGTG AGCCACCGCG CTCGGCCAGA GCTCTGGGTT TTAATCCTAC 2040
TTTAGCTGTA GAACCTTGGG CAAATAACTT CATCTTTTTG GGTCCTAATT TTCCTCCTGT 2100
CTAACTGGAG GGACTGTGAT CCTTCCACCT TGGATGGAAG AGGCTTACCT GACAGCCAGC 2160
CTGCCTGCTG GGAGCCAGGA GAGTCAGCTC ATTAAATCTT GAAGAACCGC TGTATGCCCT 2220
TTTTCCTTCT AAGTCATGTC TGCTGCCTGT GAGCCTGGGA AGGAGTGCTT TCAAAACCTG 2280
TATTTTTGCC CTCTTTAGTA AATTTAGAAC TGTAGAGGCT AATAAACTGC GATGAGACAT 2340
TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2360
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征:
(A)长度:275氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)链性:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:多肽
(ix)序列描述:SEQ ID NO.2:
MRKRLSAPEL RLSLTKGPGN DGASPTQSAP SSPDGSSDLE IDELETPSDS 50
EQLDSGHEFE WEDELPRAEG LGTSETAERL GRGCMWDVTG EDGHHWRVFR 100
MGPREQRVDM TVIEPYKKVL SHGGYHGDGL NAVILFASCY LPRSSIPNYT 150
YVMEHLFRYM VGTLELLVAE NYLLVHLSGG TSRAQVPPLS WIRQCYRTLD 200
RRLRKNLRAL VVVHATWYVK AFLALLRPFI SSKFTRKIRF LDSLGELAQL 250
ISLDQVHIPE AVRQLDRDLH GSGGT 275
(2)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征:
(A)长度:2360bp
(B)类型:核苷酸
(C)链性:双链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:核苷酸
(ix)序列描述:SEQ ID NO.3:
1 AC GCG GGG GAG CTA CAA CAG CTG AGA CAG AAA AGA GGT AAG GAA GTG 47
48 TTG GGG GCT GGG ACA ACC AGC TCC CCG ACA ACT CCT AGG TGT TTA AAG 95
96 AAG GAG GCA GGA AGA CTT GTG AAG ATG GGA ACT ATA CAA GAG GCA GGA 143
144 AAA AAG ACA GAT GTT GGG TGG AGC AAC TGC TAC AGA GGT AAA TAT GAT 191
192 TAA CTT TAC ATT CCA TCT TTC GTC TGC TCC CAA ACT TAA CAG CAG GTA 239
240 ATC TGC TTC TAG CAA GTG GTG AAG GTA AGA GAA GCA TCT GTA TAG GAG 287
288 GCA AGA GAT CTG AGT CCT TTT GAA GGC CTA TCC TCT GCT CTG TAT CTC 335
336 AAT TAC TGT TCT TCA TTT CAA TTA TTC TTA CCT ACT ATT CAG TTC CCT 383
384 TGA TCT TTT CTT CTT GGG GGC TGT CTT AGG GTC AGG GAG ATT GCA GAA 431
432 GCA CCA GAA CTA GGA GCA GCC CTG AGA CAT GGG GAG TTG GAG CTG AAG 479
480 GAG GAA TGG CAG GAT GAA GAA TTC CCT AGA TTG CTT CCT GAG GAG GCT 527
528 GGC ACT TCT GAA GAT CCT GAA GAC CCT AAA GGA GAT TCA CAG GCA GCT 575
576 GCA GGT ACC CCC AGC ACT TTA GCC CTG TGT GGC CAG CGC CCC ATG CGC 623
1 Met Arg 2
624 AAG CGT CTT TCT GCC CCA GAG TTG CGG CTG AGT CTG ACT AAG GGG CCT 671
3 Lys Arg Leu Ser Ala Pro Glu Leu Arg Leu Ser Leu Thr Lys Gly Pro 18
672 GGA AAT GAT GGA GCT TCA CCC ACC CAG TCT GCA CCT TCC TCT CCT GAT 719
19 Gly Asn Asp Gly Ala Ser Pro Thr Gln Ser Ala Pro Ser Ser Pro Asp 34
720 GGC AGT TCT GAC CTG GAG ATA GAC GAA TTG GAG ACA CCT TCA GAC TCG 767
35 Gly Ser Ser Asp Leu Glu Ile Asp Glu Leu Glu Thr Pro Ser Asp Ser 50
768 GAG CAG CTG GAC AGT GGA CAT GAA TTT GAA TGG GAA GAT GAA CTA CCC 815
51 Glu Gln Leu Asp Ser Gly His Glu Phe Glu Trp Glu Asp Glu Leu Pro 66
816 CGG GCA GAG GGT CTG GGC ACC AGT GAG ACA GCT GAA AGG CTG GGC CGA 863
67 Arg Ala Glu Gly Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ala Glu Arg Leu Gly Arg 82
864 GGT TGT ATG TGG GAT GTG ACT GGA GAA GAT GGA CAT CAC TGG AGG GTG 911
83 Gly Cys Met Trp Asp Val Thr Gly Glu Asp Gly His His Trp Arg Val 98
912 TTC CGA ATG GGA CCA CGG GAG CAG CGC GTA GAC ATG ACT GTC ATT GAG 959
99 Phe Arg Met Gly Pro Arg Glu Gln Arg Val Asp Met Thr Val Ile Glu 114
960 CCC TAT AAG AAA GTC CTG TCT CAT GGA GGT TAC CAC GGT GAT GGC CTC 1007
115 Pro Tyr Lys Lys Val Leu Ser His Gly Gly Tyr His Gly Asp Gly Leu 130
1008 AAT GCT GTC ATC CTT TTT GCT TCC TGT TAT CTA CCC AGA AGC AGC ATC 1055
131 Asn Ala Val Ile Leu Phe Ala Ser Cys Tyr Leu Pro Arg Ser Ser Ile 146
1056 CCC AAC TAC ACC TAT GTC ATG GAA CAC TTG TTT AGG TAT ATG GTG GGA 1103
147 Pro Asn Tyr Thr Tyr Val Met Glu His Leu Phe Arg Tyr Met Val Gly 162
1104 ACT CTG GAG CTG CTA GTA GCT GAA AAT TAC CTG CTT GTT CAT TTG AGT 1151
163 Thr Leu Glu Leu Leu Val Ala Glu Asn Tyr Leu Leu Val His Leu Ser 178
1152 GGA GGC ACA AGC AGG GCC CAA GTT CCA CCT CTA AGC TGG ATA CGT CAG 1199
179 Gly Gly Thr Ser Arg Ala Gln Val Pro Pro Leu Ser Trp Ile Arg Gln 194
1200 TGT TAC CGT ACC CTG GAT CGG CGG CTA CGG AAA AAC CTG CGA GCC CTG 1247
195 Cys Tyr Arg Thr Leu Asp Arg Arg Leu Arg Lys Asn Leu Arg Ala Leu 210
1248 GTG GTT GTC CAT GCT ACA TGG TAT GTG AAA GCA TTT CTG GCA CTG CTT 1295
211 Val Val Val His Ala Thr Trp Tyr Val Lys Ala Phe Leu Ala Leu Leu 226
1296 CGG CCC TTC ATC AGT TCC AAA TTC ACA CGA AAA ATC CGT TTT CTG GAC 1343
227 Arg Pro Phe Ile Ser Ser Lys Phe Thr Arg Lys Ile Arg Phe Leu Asp 242
1344 AGC CTG GGG GAG CTG GCC CAA CTC ATA TCC CTG GAT CAA GTC CAC ATC 1391
243 Ser Leu Gly Glu Leu Ala Gln Leu Ile Ser Leu Asp Gln Val His Ile 258
1392 CCT GAA GCT GTC AGA CAG CTG GAC CGG GAT CTC CAT GGC TCA GGA GGG 1439
259 Pro Glu Ala Val Arg Gln Leu Asp Arg Asp Leu His Gly Ser Gly Gly 274
1440 ACA TAG CAC AGG ACT GGA TAA AGG GCC TTA GAA CCA GTT AGT GAT CTG 1487
275 Thr *** 276
1488 CCT ACA CCT GAA TCC CTG AAA CAT CTG AAC TGT TTT GTA AAT CAT CTT 1535
1536 ATC CCC AAC CTC AGT ACC ACC GGA TCT TCA CTT CTC AGT GGG ATT TTG 1583
1584 TCC TTT GCA TGA CCC TAC TTT CAG CAG GGC TTT GAG GCT GGG AAA CTG 1631
1632 ATC TGC TGG GTG ACT TTC ATT CCA GTT GCT GGG ACG GAA GGC TGA ATG 1679
1680 TAG GGT CAT TTT GTA TGG GAT ATG CAG AGC TCT GGG TTT TTT TGT TTT 1727
1728 TTG TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC TCT GTC GCC AGG CTG GAG TGC AGT 1775
1776 GGT GCG ATC TCG GCT CAC TGC AAC CTC CGC CTC CCG GTT CAA GCC ATT 1823
1824 CTT CTG CCT CAG CCT CAG CGA GTA GCT GAG ACT ACC GGC GCA CGC CAC 1871
1872 CAC GCC CAG CTA ATT GTT TTG TAT TTT TAG TAG AGA CGG GGT TTC ACC 1919
1920 ATG TTG GCC AGG ATG GTC TCG ATC TCT TGA CCT CGT GAT CTG CCC GCC 1967
1968 TCG GCC TCC CAA AGT GCC GAG ATT ACA GGT GTG AGC CAC CGC GCT CGG 2015
2016 CCA GAG CTC TGG GTT TTA ATC CTA CTT TAG CTG TAG AAC CTT GGG CAA 2063
2064 ATA ACT TCA TCT TTT TGG GTC CTA ATT TTC CTC CTG TCT AAC TGG AGG 2111
2112 GAC TGT GAT CCT TCC ACC TTG GAT GGA AGA GGC TTA CCT GAC AGC CAG 2159
2160 CCT GCC TGC TGG GAG CCA GGA GAG TCA GCT CAT TAA ATC TTG AAG AAC 2207
2208 CGC TGT ATG CCC TTT TTC CTT CTA AGT CAT GTC TGC TGC CTG TGA GCC 2255
2256 TGG GAA GGA GTG CTT TCA AAA CCT GTA TTT TTG CCC TCT TTA GTA AAT 2303
2304 TTA GAA CTG TAG AGG CTA ATA AAC TGC GAT GAG ACA TTT AAA AAA AAA 2351
2352 AAA AAA AAA 2360
Claims (9)
1.一种分离的NIP2相关蛋白,其特征在于,它选自下组:
(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽;
(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的缺失、***或取代而形成的,且具有抑制肝癌细胞系7721克隆形成功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,该多肽是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列选自下组:
(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸编码的多肽具有SEQID NO:2的氨基酸序列。
5.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸的序列选自下组:
SEQ ID NO:3的编码区序列或全长序列。
6.一种载体,其特征在于,它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它是选自下组的一种宿主细胞:
(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞;
(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有NIP2相关蛋白活性的多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a)在适合表达NIP2相关蛋白的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出具有NIP2相关蛋白活性的多肽。
9.一种药物组合物,其特征在于,它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB00125281XA CN1177862C (zh) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | 人nip2相关蛋白和编码序列及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB00125281XA CN1177862C (zh) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | 人nip2相关蛋白和编码序列及其用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1343688A CN1343688A (zh) | 2002-04-10 |
CN1177862C true CN1177862C (zh) | 2004-12-01 |
Family
ID=4591073
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB00125281XA Expired - Fee Related CN1177862C (zh) | 2000-09-19 | 2000-09-19 | 人nip2相关蛋白和编码序列及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1177862C (zh) |
-
2000
- 2000-09-19 CN CNB00125281XA patent/CN1177862C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1343688A (zh) | 2002-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1170850C (zh) | 人血管生成素样蛋白和编码序列及其用途 | |
CN1160370C (zh) | 新的人细胞周期控制相关蛋白及其编码序列 | |
CN1177862C (zh) | 人nip2相关蛋白和编码序列及其用途 | |
CN1244595C (zh) | 一种肿瘤抑制蛋白及其应用 | |
CN1170844C (zh) | 人长寿保障蛋白和编码序列及其用途 | |
CN1169954C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1170848C (zh) | 新的人肝癌相关蛋白及其编码序列 | |
CN1234728C (zh) | 新的人淋巴因子、其编码序列及用途 | |
CN1765925A (zh) | 肝癌中上调表达的两种新的人蛋白及其编码序列和另外二十种人蛋白在肝癌诊断中的新用途 | |
CN1289524C (zh) | 一种人端粒酶活性抑制蛋白及其应用 | |
CN1194010C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白及基编码序列 | |
CN1155615C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1249082C (zh) | 促凋亡基因bnipl及其编码蛋白和用途 | |
CN1277844C (zh) | 新型人细胞周期蛋白,其编码序列及用途 | |
CN1209373C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1243017C (zh) | 肿瘤抑制基因及其编码蛋白和应用 | |
CN1194989C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1166686C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白及其编码序列 | |
CN1169958C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1169955C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1170843C (zh) | 具有促进癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1169957C (zh) | 编码具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白的多核苷酸 | |
CN1155613C (zh) | 人类17号染色体短臂1区3带3亚带区域内人肿瘤相关基因和编码蛋白 | |
CN1155614C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 | |
CN1193041C (zh) | 具有抑制癌细胞生长功能的人蛋白及其编码序列 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20041201 Termination date: 20130919 |