CN110878266B

CN110878266B - 一株约氏乳杆菌及其用途

Info

Publication number: CN110878266B
Application number: CN201911151651.XA
Authority: CN
Inventors: 李有全; 贾丹; 刘爱红; 王锦明; 孟林明; 王佳慧; 李贺海; 关贵全; 刘军龙; 殷宏; 罗建勋; 石红梅; 赵索南; 任巧云; 杨吉飞; 刘志杰; 独军政; 高闪电; 刘光远; 李东平
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110878266A

Abstract

本发明公开了一株约氏乳杆菌及其在仔猪、羔羊、犊牛腹泻中的应用。该菌株分离自健康猪粪便，具有良好的体外益生潜能和安全性。将本发明约氏乳杆菌与其他菌株联合应用于腹泻幼畜中，该菌株对不同程度的腹泻病例均有明显防治作用。

Description

一株约氏乳杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及一株约氏乳杆菌及其用途。

背景技术

我国是畜牧业大国，畜禽的健康发展是养殖业经济发展的关键。在养猪业中，仔猪腹泻是规模化养殖场面临的最严重的问题，已成为影响养猪业健康稳定发展和经济收益的主要问题之一。许多病原微生物可导致仔猪、羔羊和犊牛等幼畜的腹泻，其中以大肠杆菌、沙门氏菌和链球菌等为主。在大规模养殖场中，解决此类问题的方法是使用抗生素。抗生素虽然在防病抗病等方面起到一定的积极作用，但其长期使用给人类健康和环境带来的危害不言而喻。随着多数国家对抗生素的限用和禁用，寻找作为新型抗生素替代品的工作已得到了极大的关注。有研究证实，在畜禽饲料中补充一定的益生菌对预防以及治愈家畜胃肠道疾病、促进家畜的营养吸收等有良好效果。

益生菌(probiotics)通常是定植于动物肠道、生殖***内，能产生确切健康功效的活性有益微生物的总称。其概念最早来源于1965年，Lilly等人将其定义为“能产生促生长因子的微生物”。2002 年，***粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)在《食品益生菌评价指南》中正式将益生菌定义为：当摄入足够的数量时，能给予宿主健康作用的活微生物。常见的益生菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌、链球菌、芽孢菌和酵母菌等。目前研究和应用最为广泛的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌。

乳酸菌是指一类能发酵碳水化合物并产生大量乳酸的***的统称，包括多个属，主要为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)等。乳酸菌作为人和动物肠道内正常存在的微生物对机体发挥着重要的生理作用，并且被国际公认为食品级安全微生物(GRAS)。目前，乳酸菌作为绿色、安全有效的益生菌已广泛应用到食品、药品及饲料添加剂中。

益生菌制剂以活的微生物为主，需要对宿主的胃肠道环境有一定的耐受性，并且菌株只有黏附、定植并在肠道内繁殖后才能发挥其益生作用。相关研究表明乳酸菌能够分泌多种酶促进各类营养物质的吸收，可通过吸附的方式减少体内微量元素的流失。乳酸菌在机体内除了产生细菌素以外，还可刺激机体产生防御素，可通过增强外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性，促进宿主的体液免疫和细胞免疫。已有研究证实，直接饲喂体外筛选得到的乳酸菌可提高畜禽的体增重，增加肠道中有益菌的数量，减少病原菌数量，增强免疫力，改善抗氧化功能，提高饲料利用率，降低死亡率且预防胃肠道菌群引起的疾病。因此，乳酸菌在畜牧生产和疾病防治中有广泛的应用前景，开发新型益生型乳酸菌菌株具有重要意义。

乳酸菌是应用在畜牧业中最早、最广泛的益生菌。有研究表明，肉鸡饲料中添加乳酸菌后，可提高肉鸡抗氧化能力和生长性能，降低骨质疏松症的发生，促进肉鸡增重；乳酸菌饲喂断奶仔猪后，明显降低了仔猪腹泻发生频率和死亡率，促进畜体增重；在猪生产中应用乳酸菌后，可显著促进猪的生长发育和生产性能；将乳酸菌饲料应用于奶牛养殖中，有提高饲料营养利用率、增加泌乳量、提高乳品质和预防***炎的作用。总之，畜禽饲料中添加益生类乳酸菌后，能够有效的促进动物生长、提高机体免疫力、降低死亡率、防治动物疾病。当然，益生菌作为安全、绿色、无公害的抗生素新型替代品，在减少养殖业中长期使用抗生素带来的细菌耐药性增加、抗生素残留、环境污染等问题中发挥着重要的作用，为畜禽的安全生产和人类健康提供重要保障。

因此，为满足我国养殖业需求，促进畜禽健康生长，开发具有益生菌特性并能防治或减缓幼畜腹泻的益生菌菌株具有重要意义。

发明内容

本发明提供一株可用于畜牧养殖中的益生菌，丰富饲用益生菌菌种，为复合益生菌制剂的开发提供菌种资源。

本发明提供一株分离自健康猪粪便的约氏乳杆菌GHZ10a (Lactobacillus johnsonii GHZ10a)，该菌株已保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，分类名为约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii，保藏编号CGMCC No.18472，保藏日期2019 年 9 月 6 日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的约氏乳杆菌可在制备治疗仔猪、羔羊、犊牛等饲料中应用，亦可在制备治疗仔猪、羔羊、犊牛等的腹泻药物中的应用。

本发明提供的菌株筛选自325株新分离乳酸菌中，具体方法为：首先，将新分离的325株乳酸菌接种至pH＝2.5和含0.3％猪胆盐的无菌PBS中，37℃分别耐受2h、4h后计算活菌数，筛选出64株耐受性较好的分离株；其次，采用牛津杯扩散法测定筛得的64株耐受型乳酸菌的抑菌活性，其中编号为 GHZ10a的菌株抑菌谱最广，抑菌活性最高；最后，通过形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA扩增鉴定该菌株为Lactobacillusjohnsonii GHZ10a。

本发明的约氏乳杆菌具有良好的体外益生潜能，能迅速进入对数生长期且产酸能力强；在模拟胃液中耐受3h后中存活率为83.93％，在模拟肠液中耐受6h后存活率为78.55％；有良好的疏水性和共聚集能力；对Caco-2细胞的黏附率为12.37±0.32％，并且可抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞。

本发明的约氏乳杆菌采用K-B法测定了菌株的抗生素敏感性，试验表明GHZ10a株对试验用10种抗生素中的7种敏感，对卡那霉素、萘定酸及头孢噻肟耐药；GHZ10a株于血平板上划线后未表现出溶血活性；GHZ10a高浓度(1×10⁹/只/天)饲喂昆明小鼠，小鼠精神状态正常、粪便颜色及形状均正常、无口鼻异常分泌物和死亡状况；小鼠剖解后各脏器指数均正常，与对照组无显著差异。

将本发明约氏乳杆菌与其他益生菌菌株配伍成复合益生菌制剂饲喂腹泻仔猪1511头，除个别病畜因腹泻严重和其他因素导致死亡外，其余病畜在饲喂第二天病情均好转，3-5天后基本痊愈。康复仔猪无腹泻复发现象。

将本发明约氏乳杆菌与其他益生菌菌株配伍成复合益生菌制剂初步应用于腹泻羔羊和犊牛中，均有减缓并治愈腹泻病的作用。

本发明的约氏乳杆菌GHZ10a具有较高的安全性，有良好的体外益生潜能，并具有一定的抗生素抗性，同时可有效抑制猪腹泻疾病。

附图说明

图1，GHZ10a抑制巴氏杆菌393图。

图2，GHZ10a抑制溶血性葡萄球菌ZSY2图。

图3，GHZ10a抑制致病性大肠杆菌ATCC43888图。

图4，GHZ10a的菌落形态图。约氏乳杆菌GHZ10a在MRS平板上呈扁平状，边缘不规则、表面光滑、近似透明状。

图5，GHZ10a的革兰氏染色图(100×)。约氏乳杆菌GHZ10a革兰氏染色呈阳性，显微镜下菌体呈长杆状，两端圆，以单个、成对、成链或簇状出现。

图6，GHZ10a的PCR扩增片段图谱。第一泳道为DNA分子质量为2000的DNAMarker。1、2泳道为菌株GHZ10a的片段长度，约为1500bp。

图7，GHZ10a的生长曲线-pH曲线。

图8，GHZ10a溶血试验图。平板上方区域为菌株GHZ10a，未出现溶血现象；平板下方区域为阳性对照(大肠杆菌)，出现溶血环，有溶血活性。

具体实施方式

以下是结合附图详细阐述本发明的方案。

实施例一乳酸菌的分离、筛选及鉴定

1.1乳酸菌的分离

采集青海省多个养猪场健康猪的新鲜粪便50份。称取10g粪便样品与90mL无菌PBS混匀后过滤，取1mL滤液进行梯度稀释，将10^-3、10^-4、10^-5的稀释液分别涂布于含0.75％碳酸钙的MRS平板上，于 37℃厌氧条件下培养24h。每份样品中约4～7个产生溶钙圈且形态、色泽不同的单菌落，分别在MRS 平板上划线纯化三次后，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后备用，共计初步分离得到325株分离株。

本发明上述使用的MRS液体培养基配方如下：

蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.29g、MnSO₄·H₂O0.058g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH为6.3，于121℃高压灭菌20min。

本发明上述使用的加钙MRS固体培养基配方如下：

在液体MRS培养基成分基础上加入碳酸钙7.5g，琼脂15.0g，调节pH为6.3，于121℃高压灭菌20 min。

本发明上述使用的无菌PBS配方如下：

称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.42 g，KH₂PO₄0.27 g加入到1L去离子水中，充分搅拌溶解后，滴加浓盐酸调节pH至7.4，121℃高压灭菌20min，室温保存备用。

1.2耐受型乳酸菌初筛

耐酸能力测定：分别取1mL上述325株新分离菌的新鲜培养液接种至pH＝2.5的无菌PBS中，于37 ℃条件下耐受3h后，取样并连续稀释至10^-4、10^-5，吸取0.1mL稀释液涂布于MRS平板上，37℃厌氧培养24h后计数测定活菌数，以0h活菌数为对照，计算存活率。

耐胆盐能力测定：分别取1mL上述325株分离菌的新鲜培养液接种至含0.3％猪胆盐的无菌PBS中，于37℃条件下耐受3h后计数测定活菌数，以0h活菌数为对照，计算存活率。

耐受结果表明，其中325株乳酸菌疑似株中，有168株对酸耐受性较高，存活率高于80％；酸耐受型乳酸菌中64株试验株对胆盐的耐受性较高，存活率在80％以上，而其余菌株对酸和胆盐表现出不同程度的敏感性。

1.3抑菌型乳酸菌复筛

发酵上清液的制备：将上述64株酸和胆盐耐受型分离株的新鲜菌液于4℃，6000r/min离心10min，取其上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后4℃保存，备用。

采用扩散法测定菌株的抑菌活性，选取副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、牛支原体及大肠杆菌等16株致病菌作为指示菌。用无菌PBS将活化后的致病菌调节浓度约为1×10⁶CFU/mL，取100μL致病菌均匀涂布于其对应的琼脂平板上，室温条件下静置10min；待平板表面菌液略干后，用孔径为7mm的打孔器均匀打孔，并向孔内加入150μL上述无细胞发酵上清液；平板于室温条件水平放置预扩散2h，37℃培养18h；试验结束后，用游标卡尺测量抑菌圏直径大小，重复3次试验求平均值。

抑菌试验结果表明，编号为GHZ10a的菌株对16株致病菌中的15株菌表现出不同程度的抑制作用 (图1-图3)，抑菌谱较其他菌株最广，抑菌直径最大，对沙门氏菌抑菌作用最强，但对产气荚膜梭菌MQ5无抑制作用。GHZ10a株抑菌效果如表1所示。

表1菌株GHZ10a抑菌能力测定(mm)

基于上述试验结果，最终筛选出菌株GHZ10a作为益生菌候选株。

1.4菌株鉴定

形态观察：菌株GHZ10a在MRS琼脂平板上呈扁平状，边缘不规则、表面光滑、近似透明状(图4)。革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，显微镜下菌体呈长杆状，两端圆，以单个、成对、成链或簇状出现(图5)。

生理生化鉴定：菌株GHZ10a的生理生化特征见表2。明胶试验、吲哚试验、过氧化氢试验及淀粉水解试验均呈阴性。碳水化合物发酵试验中，菌株GHZ10a可发酵葡萄糖和果糖，不能利用***糖和乳糖。

表2菌株GHZ10a的生理生化特征

试验菌株	明胶试验	吲哚试验	过氧化氢	淀粉水解
					GHZ10a	-	-	-	-
试验菌株	葡萄糖	果糖	***糖	乳糖
					GHZ10a	+	+	-	-

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

分子生物学鉴定：用DNA提取试剂盒提取菌株GHZ10a的基因组，采用细菌鉴定16SrDNA通用引物27F及1492R进行PCR扩增，PCR反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火45s， 72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸8min；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段长约为1500bp(图6)，序列提交NCBI进行BLAST比对，得到序列与Lactobacillusjohnsonii的序列同源性为99.99％，并申请获得登录号为：MK208491。

结合菌株GHZ10a的形态、生理生化特征和16S r DNA序列，最终确定该菌株为约氏乳杆菌 (Lactobacillusjohnsonii)。该菌株于于2019年9月6日提交并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:18472。

实施例二约氏乳杆菌GHZ10a的体外益生特性研究

2.1约氏乳杆菌GHZ10a种液的制备

从纯化的MRS平板上挑取单菌落接种于10mL MRS培养基中，37℃恒温培养24h，连续传代两次即制成分离菌菌种液，备用。

2.2约氏乳杆菌GHZ10a生长曲线及pH曲线的测定

取2.1中约氏乳杆菌GHZ10a种液以2％接种于MRS培养基中，37℃静置培养，以未接菌的液体培养基为对照，在接种培养后的0-24h内，每间隔2h取样一次测定菌液OD_(600nm)值及pH值。结果表明(图7)，约氏乳杆菌GHZ10a接种后4h时进入对数生长期，4-8h内OD_(600nm)值呈现直线增长，培养10h以后细菌进入稳定期，此时菌体OD_(600nm)值为3.551，该时期菌体数目达到最高值。菌株GHZ10a接种后的前4h内pH下降缓慢，产酸能力较弱；进入对数生长期后，菌液的pH下降明显， 10h时，菌株的生长进入稳定期，菌液pH下降平缓。随着接种时间的延长，菌体数目的增长和发酵液pH的下降呈一定关系，菌体处于对数生长期时，菌液pH下降较快。

2.3GHZ10a株对胃肠道耐受性的研究

配制模拟胃液：称取胃蛋白酶(1:15000)溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，盐酸调节pH至3.0) 中，配制成浓度为3g/L的溶液。0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃保存。

配制模拟肠液：称取胰蛋白酶(1:250)溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，NaOH调节pH至8.0) 中，配制成浓度为1g/L的溶液，加入0.3％胆盐。0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃保存。

将2.1中分离菌种液离心并收集菌体，用无菌PBS重悬后调节其浓度为1×10⁹CFU/mL，取1mL 菌液加入到9mL模拟胃液中37℃静置培养1h、2h、3h时分别取样计数。3h后，取1mL上述培养物放入到9mL模拟肠液中，37℃培养2h、4h、6h后，分别取样计数测定活菌总数。菌株GHZ10a 胃肠道耐受性结果见表3，经过模拟胃液处理3h后菌株GHZ10a存活率为83.93％，模拟肠液处理6h 后，存活率为78.55％，可知该菌能很好地耐受胃肠道环境。

表3菌株GHZ10a胃肠道耐受性检测

2.4菌株GHZ10a的表面性质测定

过夜培养的约氏乳杆菌GHZ10a和大肠杆菌ATCC43888菌液于5000r/min、4℃条件下离心10min，并收集菌体。菌株自凝集率测定(％)：调节约氏乳杆菌GHZ10a浓度在波长600nm处吸光值为0.5±0.02 (A₀)，静置24h后测定吸光值A₂₄，计算菌株GHZ10a自凝集率，公式为(A₀-A₂₄)/A₀×100％；菌株与大肠杆菌共聚集率测定(％)：调节约氏乳杆菌GHZ10a和大肠杆菌ATCC43888的混合悬菌液在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A₀)，静置24h后测定吸光值A₂₄，计算菌株GHZ10a共聚集率，公式为(A₀-A₂₄)/A₀×100％；菌株疏水性测定(％)：用无菌的PBS将约氏乳杆菌GHZ10a制成在波长600 nm处的吸光值为0.5±0.02(A₀)的菌悬液，将1mL二甲苯加入到3mL菌悬液中，在室温条件下预培养 10min后将该两相体系涡旋振荡2min充分混匀，37℃静置共培养1h后去除二甲苯相，于600nm处测定水相的吸光值A₁，计算菌株GHZ10a疏水率，公式为(A₀-A₁)/A₀×100％。测定结果见表4，可知菌株GHZ10a的自凝集率为69.53％，与大肠杆菌共凝集率为69.28％，疏水性为51.79％，表明约氏乳杆菌 GHZ10a能与大肠杆菌聚集，并且疏水性能良好。

表4约氏乳杆菌GHZ10a表面性质测定结果

菌株	自凝集率	共凝集率	疏水率
				约氏乳杆菌GHZ10a	69.53％	69.28％	51.79％

2.5GHZ10a株黏附Caco-2细胞能力测定

本试验选取鼠李糖乳杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG)为对照菌株。

荧光标记试验菌株：选取活化后的试验均株于4℃，6000r/min离心收集菌体，用无菌PBS洗涤 3次后加入到工作浓度为500μg/mL的异硫氰酸荧光素(FITC)溶液中，37℃暗处理2h；6000r/min 离心标记后的菌液，并用PBS洗涤3次去除未结合的FITC；将菌体重悬于RPMI-1640细胞培养液中，调整菌液浓度为2×10⁸CFU/mL，吸取100μL荧光标记后的菌液于96孔板中，用酶标仪测定其在吸收光波长为485nm以及发射光波长为530nm时的荧光强度，即为初始相对荧光值。

黏附试验：向培养至单层细胞的12孔培养板中加入0.5mL FITC标记的细菌，于37℃，5％CO₂培养箱中封闭孵育2h，用无菌PBS漂洗3-5次去除未黏附的细菌；加入300μL胰酶，消化细胞5min，显微镜下细胞呈雪花状散落时加入细胞培养液终止反应，吹打混匀细胞悬液。吸取100μL细胞悬液于96孔板中并测定荧光强度，即为黏附后相对荧光值。菌株的黏附率计算公式为：

黏附率＝(黏附后相对荧光值/初始相对荧光值)×100％

菌株GHZ10a及对照菌株GG黏附率如表5所示。表明约氏乳杆菌GHZ10a具有较高的黏附率，与益生菌产品中鼠李糖乳杆菌GG黏附率无显著差异。

表5菌株GHZ10a黏附率

菌株	黏附率(％)
		约氏乳杆菌GHZ10a	12.37±0.32
鼠李糖乳杆菌GG	12.15±0.58

2.6菌株GHZ10a通过不同方式抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞能力的测定

荧光标记大肠杆菌：标记方法同2.5中菌株GHZ10a的标记方法。

竞争试验：设置试验组和对照组。试验组向培养至单层细胞的12孔培养板中分别加入试验菌株 (GHZ10a、LGG；2×10⁸CFU/mL)和已标记的大肠杆菌各0.25mL并混合均匀；对照组加入0.5mL FITC标记的大肠杆菌；37℃，5％CO₂培养箱中孵育2h后，用无菌PBS洗涤3～5次。

排斥试验：试验组向培养至单层细胞的12孔培养板中加入试验菌株(GHZ10a、LGG；2×10⁸CFU /mL)0.5mL；对照组加入0.5mL细胞培养液；于37℃、5％CO₂培养箱中孵育1h后弃去孔内液体，用无菌PBS漂洗3次，每孔加入0.5mLFITC标记的大肠杆菌，37℃封闭孵育1h后，用无菌PBS漂洗3～5次。

置换试验：向培养至单层细胞的12孔培养板中加入0.5mLFITC标记的大肠杆菌，于37℃，5％ CO₂培养箱中封闭孵育1h，弃去孔内液体，用无菌PBS漂洗3次；试验组加入0.5mL试验菌株 (GHZ10a、LGG；2×10⁸CFU/mL)，对照组加入0.5mL细胞培养液，37℃封闭孵育1h后，用无菌PBS漂洗3～5次。

试验结束后，向孔中加入300μL胰酶，消化细胞5min，显微镜下细胞呈雪花状散落时加入细胞培养液终止反应并混匀细胞悬液。吸取细胞悬液于96孔板中，并用酶标仪测定相对荧光强度。计算试验菌株对大肠埃希氏菌ATCC43888对Caco-2细胞中的黏附抑制率，计算公式如下：

黏附抑制率(％)＝1-(试验组相对荧光强度/对照组相对荧光强度)×100％

如表6所示，约氏乳杆菌GHZ10a可通过竞争、排斥和置换的方式抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞，但主要是通过竞争和排斥的方式抑制大肠杆菌黏附，且竞争方式抑制率作用更显著，而排斥的方式抑制率较低。

表6约氏乳杆菌GHZ10a抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞能力的测定

菌株	竞争试验(％)	排斥试验(％)	置换试验(％)
				约氏乳杆菌GHZ10a	52.19±1.05	1.65±0.32	23.04±2.17

实施例三约氏乳杆菌GHZ10a的安全性研究

3.1菌株GHZ10a的药敏试验(K-B法)

将活化后的菌株GHZ10a离心并用无菌PBS调节浓度约为1×10⁶CFU/mL，用灭菌棉棒蘸取菌液并均匀涂布于MRS固体平板上；用无菌镊子将药敏片均匀放置在平板表面，37℃厌氧培养24h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，重复3次试验求平均值。本试验选用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC 25922作为质控菌株，参照美国CLSI(临床和实验室标准协会)国际标准中对抗菌药物敏感性的最小抑菌圈直径大小来判定菌株对抗生素的敏感性。在本试验用10种抗生素中，菌株 GHZ10a对四环素、氨苄西林、万古霉素等7种抗生素敏感，对卡那霉素、萘定酸及头孢噻肟耐药。

表7菌株GHZ10a对10种抗生素的药敏性试验结果

注：R，耐药；S，敏感；-，无药敏圈。

3.2菌株GHZ10a的溶血试验

用接种环挑取新鲜培养的菌株GHZ10a菌液划线接种于血琼脂平板上，于37℃厌氧培养20h后观察菌落周围是否形成溶血环。结果表明，约氏乳杆菌GHZ10a周围未出现溶血环(图8)，表明该菌株不存在溶血作用。

本发明上述使用的血琼脂平板配方如下：

蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至 1000mL，于121℃高压灭菌20min，待冷却至温度约为60℃时加入50mL无菌脱纤维羊血，混匀。

3.3菌株GHZ10a的高浓度饲喂试验

购买健康昆明系小鼠20只，体重约为15g，将小鼠随机分为两组(各10只)，试验组和对照组。试验组小鼠饲喂基础日粮+GHZ10a(1×10⁹/只/天)，对照组小鼠饲喂基础日粮+MRS液体培养基。试验期为30d。试验期间两组小鼠精神状态均良好、毛色光亮、无口鼻异常分泌物、饮食饮水均正常、粪便颜色形状均正常且无死亡状况。试验结束后，称量小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖采集心、肝、脾、肺、肾以及胸腺等器官，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重并计算各脏器指数。结果显示(表 8)，试验组与对照组脏器指数差异不显著，可知约氏乳杆菌GHZ10a未对机体脏器产生不良影响，可判定为安全菌株，作为微生态制剂的备选菌株。

表8高浓度约氏乳杆菌GHZ10a饲喂小鼠后脏器指数计算

心脏(％)

肝脏(％)

脾脏(％)

肺脏(％)

肾脏(％)

胸腺(％)

对照组

0.63±0.08

4.77±0.29

0.36±0.09

1.05±0.07

1.36±0.16

0.55±0.15

试验组

0.79±0.27

4.93±0.56

0.40±0.12

1.00±0.25

1.20±0.62

0.46±0.09

实施例四约氏乳杆菌GHZ10a在防治幼畜腹泻中的初步应用研究

将本发明约氏乳杆菌GHZ10a与实验室分离的枯草芽孢杆菌BSC16a及唾液乳杆菌ZLp4b按一定比例配伍成复合微生态制剂，应用于仔猪腹泻病的防治。结果如表9所示，分别饲喂甘肃永靖、平凉、民乐、陕西杨凌和河南明权5个养殖场共计1511头腹泻仔猪，饲喂第二天，腹泻症状明显缓解，连续饲喂3-5天后，病畜基本痊愈，饲喂期间甘肃平凉养殖场无动物死亡发生，治愈率达100％，其余养殖场中个别病畜因腹泻严重及其他因素导致死亡，其中甘肃民乐养殖场中有5头猪因脱水严重而死亡。除陕西杨凌养殖场中仔猪腹泻治愈率为87.60％外，其余养殖场中腹泻病例治愈率均高于90.00％。上述饲喂试验中，益生菌制剂在对仔猪腹泻治愈效果显著，且未出现康复动物病情复发等现象。此外，将上述复合微生态制剂初步应用于腹泻羔羊和犊牛中，均有缓解并治愈腹泻病的效果。因此，本发明约氏乳杆菌GHZ10a可作为复合微生态制剂复配菌株应用于幼畜腹泻病的防治。

表92019年仔猪腹泻病例防治结果统计表

地区

动物

养殖规模

发病数

康复数

死亡数

治愈率

死亡率

甘肃永靖

仔猪

2000

326

302

20

92.63％

6.67％

甘肃平凉

仔猪

600

56

0

100.00％

0.00％

甘肃民乐

仔猪

8000

532

496

36

93.23％

7.67％

陕西杨凌

仔猪

4000

121

106+14*

3

87.60％

2.47％

河南明权

仔猪

6000

476

452

24

94.96％

5.04％

备注：其中14头灌服3天发现没有明显改善，后与抗生素联合治疗，其中11头康复，3头死亡。但在统计中，没有按照康复猪数目计算。

Claims

1.一株约氏乳杆菌（ Lactobacillus johnsonii ） GHZ10a，于2019 年 9 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:18472。

2.权利要求1所述的约氏乳杆菌在制备仔猪、羔羊、犊牛饲料中的应用。

3.权利要求1所述的约氏乳杆菌在制备治疗仔猪、羔羊、犊牛腹泻药物中的应用。