CN115975846B - 一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法，该沙阿霉素链霉菌于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2022952，分类命名为沙阿霉素链霉菌S1‑6，拉丁文学名为Streptomyces zaomyceticus S1‑6。本发明还包括所述沙阿霉素链霉菌的应用、所述沙阿霉素链霉菌制成的微生态制剂和所述微生态制剂的制备方法。本发明菌株对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等多种淡水鱼类病原菌的抑菌效果良好；能够在鱼体内生存、定殖，并且对鱼类没有伤害；作为饲料添加剂添加到饲料中饲喂鱼类，能够增强鱼体免疫力，增强鱼体对病原菌的抵抗力。

Description

一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一株沙阿霉素链霉菌，具体涉及一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法。

背景技术

近些年我国水产养殖业发展趋势直线上升，其规模也在不断地扩大，收益也不断地增加，但是由于滥用乱用渔药及饲料等不科学合理的行为，水产养殖尤其是鱼类养殖出现各种各样的病害，传染迅速而又一发不可收拾，这使得水产养殖业收益急剧下降。

对于鱼类细菌性疾病的防治，目前主要是以抗生素疗法为主，抗生素不仅可以治疗疾病，还可以促进鱼的生长，但是抗生素一旦用量过度就会产生很多副作用，尤其是在草鱼的养殖过程中盲目增加抗生素的投入量，会导致草鱼体内病原细菌增强对抗生素的耐药性，甚至彻底对抗生素免疫。耐药性病原菌的出现不仅增加了养殖成本，而且也加大了防治水产病害的难度，一旦这些耐药病原菌流入市场就会威胁人类的健康安全。在养殖过程中抗生素药物极有可能残留在水产品体内，而消费者长期食用后会使抗生素药物在自身体内积累，进而危害人体健康。

微生态制剂是目前最具有前景和可持续性的用来防治草鱼细菌性疾病的一类制剂，相比于抗生素及其他制剂来说，它具有无毒副作用、无药物残留、制作成本低、防治效果佳、绿色环保不污染环境等特点。

但是，目前在水产养殖中能起到较好效果的微生态制剂种类少，使用范围窄，防治效果也欠理想，还需要更进一步的深入研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法；所述沙阿霉素链霉菌及其微生态制剂对多种鱼类致病菌具有较好的拮抗作用，能够抵抗多种鱼类细菌性疾病感染。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一株沙阿霉素链霉菌，其分类命名为沙阿霉素链霉菌S1-6，拉丁文学名为Streptomyces zaomyceticus S1-6，于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称“CCTCC”)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022952。

本发明之沙阿霉素链霉菌S1-6筛选自河北秦皇岛市的土壤。本发明之沙阿霉素链霉菌S1-6的16S rRNA序列如序列表SEQ ID№1所示。

本发明沙阿霉素链霉菌的应用，作为鱼类致病菌拮抗菌。

本发明沙阿霉素链霉菌，可制成微生态制剂使用。

优选地，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

优选地，所述微生态制剂用于水产养殖。

优选地，所述水产养殖的动物为淡水鱼；更优选为鲫鱼、草鱼或鲤鱼。

本发明微生态制剂的制备方法，包括下列步骤：

(1)接种活化：将沙阿霉素链霉菌S1-6斜面菌种转接到摇瓶种子活化培养基上活化，得种子液；

(2)第一次扩大培养：将步骤(1)所得的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，得扩大培养液I；

(3)第二次扩大培养：将步骤(2)所得扩大培养液I接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养，得扩大培养液II；

(4)浓缩收集：收集步骤(3)所得的扩大培养液II，进行浓缩，得液体制剂；

固体制剂是通过将所述液体制剂用陶瓷膜过滤，收集滤液，滤液喷雾干燥所得。

优选地，步骤(1)中，所述摇瓶种子活化培养基为Am6液体培养基。

优选地，步骤(1)中，所述活化的条件为：温度28～30℃，摇床转速100～150rpm/min。

优选地，步骤(2)中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的1～2％。

优选地，步骤(2)中，第一次扩大培养所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：可溶性淀粉1～3g/L，葡萄糖0.5～2g/L，CaCO₃ 0.2～0.5g/L，酵母浸膏0.1～0.5g/L，细菌学蛋白胨0.2～0.6g/L。

优选地，步骤(2)中，所述第一次扩大培养的溶氧量40～50％。

优选地，步骤(2)中，所述第一次扩大培养的温度28～30℃。

优选地，步骤(2)中，所述第一次扩大培养的时间为48～72h。

优选地，步骤(2)中，培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。

优选地，步骤(3)中，所述扩大培养液I的接种量是培养基体积的10～15％。

优选地，步骤(3)中，所述发酵培养基的溶剂为水，配方为：葡萄糖5～12g/L，细菌学蛋白胨3～5g/L，可溶性淀粉15～25g/L，酵母浸膏3～6g/L，CaCO₃ 2～5g/L。

优选地，步骤(3)中，所述培养的溶氧量40～50％。

优选地，步骤(3)中，所述培养的温度28～30℃。

优选地，步骤(3)中，所述培养的时间为72～96h。

优选地，步骤(3)中，培养过程中使用发酵消泡剂，以避免起泡。

本发明菌株发酵液中抑菌活性物质具有较好的中高温、酸碱、紫外照射及蛋白酶稳定性，在实际生产应用中较为稳定；对淡水鱼类病原菌的抑制效果显著，还能够促进鱼类生长，提高鱼类对病原菌的免疫能力。通过微生态制剂，可简洁方便地将沙阿霉素链霉菌S1-6添加到需要使用的环境中，如将微生态制剂掺入饲料或加入水体环境中等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明菌株对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等多种淡水鱼类病原菌的抑菌效果显著，其中对异常嗜糖气单胞菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达23.70毫米；

(2)本发明沙阿霉素链霉菌S1-6能够在鱼体内生存、定殖，并且对鱼类没有伤害；

(3)将本发明沙阿霉素链霉菌S1-6作为饲料添加剂添加到饲料中饲喂鱼类，能够增强鱼体免疫力，增强鱼体对病原菌的抵抗力；作为饲料添加剂饲喂草鱼后，草鱼中免疫相关基因TNF-α的表达量在脾脏中显著上调；C3的表达量在肾脏和脾脏中的表达量中显著上调；IL-8的表达量在肾脏、脾脏以及肠道中显著上调；LSZ的表达量在肝脏、肾脏及脾脏中明显增加；Keap1的表达量在肝脏和肾脏中显著上调；

(4)将沙阿霉素链霉菌S1-6或沙阿霉素链霉菌S1-6制成的微生态制剂掺入饲料中饲喂鱼类，可以显著促进鱼类生长。

(5)将沙阿霉素链霉菌S1-6通过发酵制备成微生态制剂的方法较为简便，生产成本较低，同时还能有效降低抗生素滥用所导致的药物残留、致病菌耐药等风险。

微生物保藏情况说明

本发明之沙阿霉素链霉菌S1-6(Streptomyces zaomyceticus S1-6)，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学)，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2022952。

附图说明

图1是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6对鱼类病原菌的抑菌效果图。

图2是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6形态学特征观察图。

图3是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6的16S rDNA序列构建***发育树图。

图4是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6抑菌活性物质与温度影响的分析图。

图5是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6抑菌活性物质与酸碱度影响的分析图。

图6是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6抑菌活性物质与紫外照射影响的分析图。

图7是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6抑菌活性物质与蛋白酶影响的分析图。

图8是小动物活体成像***观察本发明沙阿霉素链霉菌S3标记菌株在草鱼体内的定殖分布图。

图9是小动物活体成像***观察本发明沙阿霉素链霉菌S1-6对草鱼的保护力图。

图10是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼血清酸性磷酸酶酶活的影响分析结果图。

图11是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼血清碱性磷酸酶酶活的影响分析结果图。

图12是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼血清超氧化物歧化酶酶活的影响分析结果图。

图13是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼血清溶菌酶酶活的影响分析结果图。

图14是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼血清过氧化氢酶酶活的影响分析结果图。

图15是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼肝脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图。

图16是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼肾脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图。

图17是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼脾脏中免疫相关基因表达的影响分析结果图。

图18是本发明沙阿霉素链霉菌S1-6制备的微生态制剂对草鱼肠道中免疫相关基因表达的影响分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

(一)沙阿霉素链霉菌S1-6的筛选以及抑菌谱的测定试验

将来自河北秦皇岛市的土样于无菌水中充分混匀，梯度稀释后涂布于高氏平板上，30℃培养5天，观察菌株生长状态并挑取放线菌样单克隆接种至新的培养基上，对挑取菌株进行纯化，以鱼类病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)、异常嗜糖气单胞菌(Aeromonas allosaccharophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、欧文氏菌(Erwinia spp.)、厦门希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloide)为指示菌，使用打孔法检测发酵上清液对上述病原菌的抑菌活性(参见图1)，发现本发明者筛选所得沙阿霉素链霉菌对以上9种鱼类病原菌具有良好抑菌效果，抑菌圈直径不低于14毫米，其中对异常嗜糖气单胞菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直径达23.70毫米。推定这是一株新型沙阿霉素链霉菌，命名为沙阿霉素链霉菌S1-6。

(二)沙阿霉素链霉菌S1-6的细胞形态学特征

菌株S1-6在高氏一号平板上菌落孢子呈不透明状态，且为白色，孢子边缘整齐，颗粒状散点分布，孢子生长较为丰富菌落与培养基结合较紧，不易挑起。菌株为革兰氏阳性菌。在扫描电子显微镜下观察到S1-6菌体菌丝体发达，菌丝细长，菌丝体较发达，弯曲螺旋缠绕，分支也较多(参见图2)。可见，菌株S1-6所表现出的形态学特征符合放线菌菌落和菌体的典型特征。

(三)沙阿霉素链霉菌S1-6的16S rRNA基因鉴定

将S1-6菌株接种至液体高氏培养基中，30℃，120转/分培养4天，收集菌体，使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)提取菌株S1-6的基因组DNA，利用16S rRNA基因扩增引物。

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

以上述引物扩增16S rRNA基因序列，序列预期长度约1500bp。PCR使用的具体参数见表1和表2。

表1 PCR反应体系

表2 PCR扩增循环

16S rRNA基因PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，将扩增成功的产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。

菌株S1-6的16S rRNA基因序列经测序显示长度为1434bp，扩增测序结果在NCBI上经过BLAST比对分析，于软件MEGA X采用邻接法构建该菌株的***发育树(参见图3)。与Streptomyces zaomyceticus strain QMA47距离最近。

(四)沙阿霉素链霉菌S1-6抑菌活性物质的理化性质分析

(1)热稳定性

将菌株S1-6接种到Am6培养基中，28℃，120转/分振荡培养72小时后，13000转/分离心10分钟，将得到的上清液分为4组，每组取1毫升，分别放入20℃、40℃、60℃、75℃水浴锅中水浴处理1小时并恢复成室温，设置对照组(发酵上清液无处理)，以嗜水气单胞菌为指示菌进行抑菌实验，在30℃条件下正置培养24h，观察各个组的抑菌变化。结果显示，菌株S1-6在20℃处理后与对照组(无处理)相比抑菌活性几乎无差别，而经过40℃、60℃、65℃、70℃处理后的发酵液抑菌活性略低于对照组，这可能是因为菌株S1-6在发酵培养过程中产生的抑菌物质对高温较为敏感，但总体而言，经过高温处理后依然可以起到较好的抑菌效果(测试结果参见图4)。

(2)酸碱耐受性

将菌株S1-6菌株接种至液体AM6培养基中，28℃，120转/分培养72小时，分别取发酵液于pH分别调为1、3、5、7、9、10，处理1小时之后，再将发酵上清液pH调回7，并设置对照组(发酵上清液无处理)，以嗜水气单胞菌为指示菌进行抑菌实验，在30℃条件下正置培养24小时，观察各个组的抑菌变化。结果显示，菌株S1-6的发酵液在pH＝3、5处理组处理后与对照组(原始pH为5.8)相比抑菌活性几乎无差别，而经过pH＝1处理组处理后的发酵液抑菌活性最强，抑菌圈直径达到了26.50mm，其中经过pH＝7处理组处理后的发酵液抑菌活性略高于对照组，当pH大于7后，经过处理的发酵液抑菌活性随着pH值的增大而有所降低，但依然可以起到较好的抑菌效果(测试结果参见图5)。

(3)紫外光耐受性

将菌株S1-6菌株接种至液体AM6培养基中，30℃，120转/分培养72小时，取发酵液于紫外灯下照射，时间分别为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时，将嗜水气单胞菌作为病原指示菌，以嗜水气单胞菌为指示菌进行抑菌实验，在30℃条件下正置培养24小时，观察各个组的抑菌变化。结果显示，菌株S1-6发酵液经过紫外线照射1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时这6个组处理后与对照组(无处理)相比抑菌活性几乎无差别，表明菌株S1-6在生长代谢过程中产生的抑菌物质对紫外线照射并不敏感，具有很强的紫外稳定性(测试结果参见图6)。

(4)蛋白酶耐受性

将菌株S1-6菌株接种至液体AM6培养基中，30℃，120转/分培养72小时，分别使用蛋白酶K、胰蛋白酶于37℃处理1小时，以嗜水气单胞菌为指示菌进行抑菌实验，在30℃条件下正置培养24小时，观察各个组的抑菌变化。结果显示，菌株S1-6发酵液经过蛋白酶K 56℃水浴处理1小时及胰蛋白酶37℃水浴处理1小时后与对照组(无处理)相比，抑菌活性略低于对照组，但其抑菌活性并没有完全丧失(测试结果参见图7)。

因此，在本研究中对菌株S1-6发酵液的热稳定性等理化性质进行了试验测定，发现菌株S1-6发酵液具有较强的热稳定性、耐酸性，而且菌株S1-6发酵液并不受紫外照射的影响，所以菌株S1-6符合益生菌良好稳定性的要求。

(五)沙阿霉素链霉菌S1-6微生态制剂的制备

(1)接种活化：将沙阿霉素链霉菌S1-6斜面菌种转接到摇瓶种子活化培养基上活化，得种子液，种子活化培养基为Am6液体培养基；所述活化培养条件为：温度28℃，摇床转速120转/分；

(2)第一次扩大培养：将步骤(1)所得的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，得第一次扩大培养的培养液，种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的2％，培养基的配方为可溶性淀粉2克/升，葡萄糖1克/升，CaCO₃ 0.2克/升，酵母浸膏0.2克/升，细菌学蛋白胨0.5克/升，培养的溶氧量50％；所述第一次扩大培养的温度28℃；所述第一次扩大培养的时间为56小时；

(3)第二次扩大培养：将步骤(2)所得的第一次扩大培养的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养，得扩大培养发酵产物，第二次扩大培养的种子液接种量是培养基体积的10％；所述发酵培养基的配方为葡萄糖8克/升，细菌学蛋白胨4克/升，可溶性淀粉20克/升，酵母浸膏5克/升，CaCO₃ 3克/升；

(4)浓缩收集：收集步骤(3)所得的扩大培养液，进行浓缩，得微生态液体菌剂；或者将微生态液体菌剂用陶瓷膜过滤，收集滤液，将滤液喷雾干燥，得微生态菌体粉剂。

(六)沙阿霉素链霉菌S1-6在鱼类养殖中的应用

a.沙阿霉素链霉菌S1-6在草鱼体内的定殖及保护力

选取大小一致的健康草鱼，随机分为1个对照组和1个实验组，每组10尾，并设置重复。实验前首先饲喂7天，进行驯化使草鱼适应实验环境，实验中使用曝气48小时的水，水温控制在25℃左右，对照组的草鱼饲喂基础饲料，用接种环刮取适量菌株S1-6EGFP的孢子接种到发酵培养基中，28℃，120转/分培养72小时，12000转/分离心10分钟，得到菌体沉淀(属于一种微生态制剂)。实验分为两组，每组含35尾重量在30克左右的草鱼，以菌拌饲料的方式获得混合饲料，每天饲喂草鱼一次，每次投喂的饲料重量是草鱼初始体重的2％，以饲喂正常饲料的草鱼为对照组，每天饲喂一次。每隔2天将草鱼放入小动物活体成像***(IVIS)中进行荧光信号的观察(参见图8)。14天后对试验组和对照组中的草鱼注射100微升，浓度为1×10⁶菌落形成单位/毫升(cfu/mL)的A.h^mCherry菌株进行侵染，每隔1天观察其死亡情况及荧光信号情况，观察周期为7天(参见图9)。

在喂养菌株S1-6^EGFP 1天后就可以检测到荧光信号，从图中可以看出，随着饲喂时间的延长，荧光信号也随之增强，在连续观察13天后，荧光并没有减弱现象而且草鱼生长状况良好，说明菌株S1-6^EGFP能够在草鱼鳃部及肠道中稳定定殖、增殖和分布，且对草鱼没有毒性。13天后用病原菌A.h^mCherry对两组草鱼进行侵染，可以看出试验组草鱼中A.h^mCherry的荧光信号明显比对照组弱，说明菌株S1-6^EGFP可以抑制草鱼体内A.h^mCherry的生长，提高草鱼对病原菌的抵抗力(参见图8和图9)。

b.沙阿霉素链霉菌S1-6对草鱼生长及抗病性的影响

选取体重为32克左右的草鱼，每35尾分为一组。首先提前对养殖箱中的水进行曝气处理，饲喂草鱼7天正常的饲料，对草鱼进行驯化。驯化完毕后，对照组的草鱼继续饲喂正常的饲料，而试验组的草鱼开始分别饲喂拌有浓度为1×10⁷菌落形成单位/克(cfu/g)和1×10⁹cfu/g的S1-6菌株的饲料，实验进行30天后，每组随机选取5尾草鱼取其尾鳍静脉血约1毫升并-4℃过夜沉淀处理；采集试验组与对照组肝脏、肾脏、脾脏及肠道组织，于-80℃超低温冰箱保存备用。

(1)沙阿霉素链霉菌S1-6对草鱼生长性能的影响

试验用草鱼分别在实验第1天和第30天进行称重。体重增长率(WGR)，饲料系数(FC)和存活率(SR)的计算公式如下：SR(％)＝100％×(草鱼终存活数量)/(草鱼初存活数量)；WGR(％)＝100％×(Wt-W0)/W0；FC＝F/(Wt-W0)(参见表1)。

表3草鱼生长性能参数

注：Ⅰ：对照组；II：10⁹cfu/g；Ⅲ：10⁷cfu/g(同一列不同上标表示显著差异，a，p>0.05；b，p<0.05)

(2)沙阿霉素链霉菌S1-6对草鱼血清非特异性免疫指标的影响

S1-6菌株添加到饲料中饲喂草鱼30天，分析草鱼血清中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(参见图10-图14)。研究发现，经含有S1-6菌株添加的饲料饲喂后，试验组草鱼过氧化氢酶等5种酶的酶活表达均强于对照组，由此说明投喂菌株S1-6能提高草鱼SOD、AKP等非特异性免疫指标的活性，从而提高鱼体的免疫水平，使草鱼更好地适应外界环境，对鱼体的免疫防御起着重大的作用。

(3)沙阿霉素链霉菌S1-6对草鱼组织中免疫相关基因表达的影响

S1-6菌株添加到饲料中饲喂草鱼30天，分析草鱼肝、肾、肠道和脾脏中免疫相关基因的表达水平(参见图15-图18)。研究发现，与对照组相比，试验组中TNF-α的表达量在脾脏中显著上调；C3的表达量在肾脏和脾脏中的表达量中显著上调；IL-8的表达量在肾脏、脾脏以及肠道中显著上调；LSZ的表达量在肝脏、肾脏及脾脏中明显增加；Keap1的表达量在肝脏和肾脏中显著上调；随着菌体在饲料中所占比例的不同，上调幅度也不相同。该结果说明，通过菌株S1-6的饲喂，S1-6饲喂组的草鱼各组织的相关抗氧化因子及免疫因子相较于对照组来说均有不同程度地提高，说明菌株S1-6可以提高草鱼特异性免疫的能力，提高草鱼的免疫力。

(4)沙阿霉素链霉菌S1-6对草鱼的保护性试验

将S1-6菌株添加到饲料中饲喂草鱼30天后，使用嗜水气单胞菌攻毒后，连续观察并记录7天内各组草鱼的生活状态和死亡情况(参见表2)。研究发现，喂养基础饲料的对照组草鱼在攻毒后5天时存活率为0，而S1-6菌株添加量为1×10⁷cfu/g和1×10⁹cfu/g组的实验组的草鱼存活率显著高于对照组，分别为60％和80％。

表2 S1-6菌株对草鱼的保护性实验

Claims (10)

1. 一株沙阿霉素链霉菌，其特征在于，其分类命名为沙阿霉素链霉菌（Streptomyces zaomyceticus ）S1-6，于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022952。

2.如权利要求1所述的沙阿霉素链霉菌制成的微生态制剂。

3.根据权利要求2所述的微生态制剂，其特征在于，为液体制剂或固体制剂；用于水产养殖。

4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼。

5.一种如权利要求2~4之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）接种活化：将沙阿霉素链霉菌S1-6斜面菌种转接到摇瓶种子活化培养基上活化，得种子液；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所得的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行扩大培养，得扩大培养液I；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所得扩大培养液I接种到装有发酵培养基的发酵罐中，再次进行培养，得扩大培养液II；

（4）浓缩收集：收集步骤（3）所得的扩大培养液II，进行浓缩，得液体制剂；

固体制剂是通过将所述液体制剂用陶瓷膜过滤，收集滤液，滤液喷雾干燥所得。

6.根据权利要求5所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述摇瓶种子活化培养基为Am6液体培养基；所述活化的条件为：温度28～30℃，摇床转速100～150rpm/min。

7.根据权利要求5或6所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述种子液接种到发酵罐中的接种量是培养基体积的1～2%；第一次扩大培养所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：可溶性淀粉1~3 g/L，葡萄糖0.5~2 g/L，CaCO₃ 0.2~0.5 g/L，酵母浸膏0.1~0.5 g/L，细菌学蛋白胨0.2~0.6 g/L。

8.根据权利要求5或6所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述第一次扩大培养的溶氧量40~50%；所述第一次扩大培养的温度28～30 ℃；所述第一次扩大培养的时间为48～72 h；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。

9.根据权利要求7所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述第一次扩大培养的溶氧量40~50%；所述第一次扩大培养的温度28～30 ℃；所述第一次扩大培养的时间为48～72 h；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。

10.根据权利要求5或6所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述扩大培养液I的接种量是培养基体积的10～15%；所述发酵培养基的溶剂为水，配方为：葡萄糖5~12 g/L，细菌学蛋白胨3~5 g/L，可溶性淀粉15~25 g/L，酵母浸膏3~6 g/L，CaCO₃ 2~5 g/L；所述培养的溶氧量40~50%；所述培养的温度28～30 ℃；所述培养的时间为72～96 h；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。