CN116286436B - 一株类布氏乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一株类布氏乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法，该类布氏乳杆菌，于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022951，分类命名为类布氏乳杆菌LPB‑4，拉丁文学名为Lactobacillus parabuchneri LPB‑4。本发明还包括所述类布氏乳杆菌的应用、所述类布氏乳杆菌制成的微生态制剂和所述微生态制剂的制备方法。本发明类布氏乳杆菌LPB‑4，对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、欧文氏菌、温和气单胞菌等多种淡水鱼类病原菌的抑菌效果良好；将类布氏乳杆菌LPB‑4作为饲料添加剂饲喂鱼类，能够改善鱼体的生长性能，增强鱼体对病原菌的抵抗力。
Description
技术领域
本发明涉及一株类布氏乳杆菌，具体涉及一株类布氏乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法。
背景技术
水产养殖业作为一种向人们提供营养需求的关键产业在近年来发展迅速，已成为我国重要的支柱产业之一。然而，由于高密度、集约化的养殖模式，极易导致残饵和养殖动物***物堆积，从而造成水环境稳态和功能结构破坏，致使多种鱼类细菌性病害频发，严重影响水产养殖业的可持续发展。当前水产养殖病害具有种类多、防控难和致死率高等特点，常使用抗生素、疫苗、中草药作为防控的主要手段。但是过度使用抗生素会导致抗性基因水平转移，增加病原菌的耐药性，同时污染水生环境。疫苗也存在保护效率易受抗原位点干扰，研发成本较高，耗时较长等问题，很难及时应对新型病原微生物引发的流行病害。目前国内对中草药防治鱼病的药用机理研究尚不成熟，对其使用剂量的把控不精确，很容易引起毒副反应。而且中草药的特异性较差，药用效果不稳定，价格昂贵，很难进行产业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株类布氏乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法，所述类布氏乳杆菌对多种鱼类致病菌具有较好的拮抗作用，所述微生态制剂可用于抑制鱼类致病菌。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一株类布氏乳杆菌，其分类命名为类布氏乳杆菌LPB-4，拉丁文学名为Lactobacillus parabuchneri LPB-4，于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心(简称“CCTCC”)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022951。
本发明之类布氏乳杆菌LPB-4的16S rRNA序列如序列表SEQ ID№1所示。经16SrRNA基因序列测定鉴定为类布氏乳杆菌。
本发明类布氏乳杆菌的应用，作为鱼类致病菌拮抗菌。
本发明类布氏乳杆菌，可制成微生态制剂使用。这样使用较为方便。
优选地，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。
优选地，所述微生态制剂用于水产养殖。
优选地，所述水产养殖的动物为淡水鱼；更优选草鱼、鲤鱼或鲤鱼。
本发明微生态制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)接种活化：将类布氏乳杆菌LPB-4接种于斜面固体MRS培养基上，挑取单克隆菌落到MRS液体培养基中进行发酵培养，收集发酵种子液；
(2)第一次扩大培养：将步骤(1)所得的发酵种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行第一次扩大培养，得扩大培养液I；
(3)第二次扩大培养：将步骤(2)所得扩大培养液I接种到装有发酵培养基的发酵罐，进行第二次扩大培养，得扩大培养液II；
(4)浓缩收集：收集步骤(3)所得的扩大培养液II，浓缩，得到液体制剂；
固体制剂是是通过将所述液体制剂或扩大培养液II喷雾干燥所得。
优选地，步骤(2)中，发酵种子液接种到发酵罐时，接种量为1～2％。
优选地，步骤(3)中，所述扩大培养液I的接种量是培养基体积的10～15％。
优选地，步骤(2)和步骤(3)中，所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：蛋白胨8～12g/L，牛肉粉7～10g/L，酵母粉3～5g/L，葡萄糖18～25g/L，磷酸氢二钾1.5～3g/L，柠檬酸氢二铵1～3g/L，乙酸钠4～6g/L，硫酸镁0.1～0.3g/L，硫酸锰0.03～0.05g/L，吐温80 0.5～2g/L。
优选地，第一次扩大培养和第二次扩大培养为厌氧发酵，温度为35～37℃；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
本发明之类布氏乳杆菌LPB-4筛选自甘肃省天水湖鱼塘底泥土壤。该菌株发酵液中抑菌活性物质具高温及蛋白酶稳定性，在实际生产应用中较为稳定；对淡水鱼类病原菌具有较好的的抗菌作用，能够改善鱼类生长，提高鱼类的抗病性能。通过微生态制剂，可简洁方便地将类布氏乳杆菌LPB-4添加到需要使用的环境中，如将微生态制剂掺入饲料或加入水体环境中等。
本发明有益效果：
(1)本发明类布氏乳杆菌LPB-4，对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、欧文氏菌、温和气单胞菌等多种淡水鱼类病原菌的抑菌效果显著；
(2)类布氏乳杆菌LPB-4发酵液性质稳定，腹腔注射该菌株可在鱼体内抑制维氏气单胞菌的生长；
(3)将类布氏乳杆菌LPB-4作为饲料添加剂饲喂鱼类，能够改善鱼体的生长性能，增强鱼体对病原菌的抵抗力；
(4)将类布氏乳杆菌制备成微生态制剂的方法简便，生产成本较低，同时还能有效降低抗生素滥用所导致的药物残留、致病菌耐药等风险，具有良好的应用前景。
微生物保藏情况说明
本发明之类布氏乳杆菌，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC NO： M 2022951；分类命名为：类布氏乳杆菌LPB-4；拉丁学名：Lactobacillus parabuchneri LPB-4。
附图说明
图1是本发明类布氏乳杆菌LPB-4对鱼类病原菌的抑菌效果图，PL为磷酸缓冲盐对照，MRS为乳酸菌培养基对照，LPB为类布氏乳杆菌LPB-4发酵上清；
图2是本发明类布氏乳杆菌LPB-4形态学特征观察图，a：菌株LPB-4的平板菌落形态特征；b：菌株LPB-4的相差显微镜观察(1000×)；c：菌株LPB-4 的革兰氏染色观察(1000×)；d：菌株LPB-4扫描电镜观察(20000×)；e：菌株 LPB-4扫描电镜观察(10000×)；
图3是本发明类布氏乳杆菌LPB-4的16S rDNA序列构建***发育树图；
图4是本发明类布氏乳杆菌LPB-4抑菌活性物质理化性质分析图，a：胰蛋白酶(trypsin)和蛋白酶K(protease K)处理的LPB-4发酵液；b：40℃-100℃处理的LPB-4发酵液；
图5是本发明小动物活体成像***观察类布氏乳杆菌LPB-4对草鱼的保护力图；
图6是本发明类布氏乳杆菌LPB-4制备的微生态制剂对草鱼血清免疫相关酶活的影响分析结果图，a：酸性磷酸酶酶活；b：碱性磷酸酶酶活；c：谷胱甘肽过氧化物酶活；d：溶菌酶酶活；
图7是本发明类布氏乳杆菌LPB-4制备的微生态制剂对草鱼免疫相关基因表达的影响分析结果图，a：肝脏；b：肾脏；c：脾脏。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明之类布氏乳杆菌的鉴定和研究如下。
(一)类布氏乳杆菌LPB-4的筛选以及抑菌谱的测定试验
将来自甘肃省天水湖的土样于无菌水中充分混匀，梯度稀释后涂布于MRS 固体平板上，37℃厌氧培养2天，观察菌株生长状态并挑取乳酸杆菌样单克隆进行纯化，以鱼类病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌 (Aeromonas caviae)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、欧文氏菌(Erwiniaspp.)、厦门希瓦氏菌(Shewanella xiamenensis)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloide)杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)为指示菌，使用牛津杯法检测发酵上清液对上述病原菌的抑菌活性(参见图1)。发现本发明者筛选所得类布氏乳杆菌对以上8种鱼类病原菌均具有良好抑菌效果，其中对维氏气单胞菌的抑菌效果最强，平均抑菌圈直径达到22.85mm，推定这是一株新型类布氏乳杆菌，命名为类布氏乳杆菌 LPB-4。
(二)类布氏乳杆菌LPB-4的细胞形态学特征
菌株LPB-4在MRS平板上呈乳白色圆形菌落，大小均一、不透明，菌落呈光滑型表面。菌株为革兰氏阳性菌。在扫描电子显微镜下观察到LPB-4菌体呈短杆状，两端呈椭圆状(参见图2)。以上结果均表明菌株LPB-4符合典型乳杆菌属的形态特征。
(三)类布氏乳杆菌LPB-4的16S rRNA基因鉴定
将LPB-4菌株接种至液体MRS培养基中，37℃，厌氧静置培养1天，收集菌体，使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)提取菌株LPB-4的基因组DNA，利用16S rRNA基因扩增引物。
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
以上述引物扩增16S rRNA基因序列，序列预期长度约1500bp。
PCR反应体系(20μL)：无菌双蒸水，14微升；10×Buffer，2微升；dNTP， 1.6微升；Bf-R(10微摩尔/升)，0.6微升；Bf-F(10微摩尔/升)，0.6微升；基因组模板，1微升；PrimerSTAR DNA聚合酶(Takara)，0.2微升；
PCR反应程序：95℃预变性5分钟；30个循环：95℃，45秒；55℃，45秒； 72℃，1.5分钟；72℃，10分钟。
16S rRNA基因PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，将扩增成功的产物送上海生工生物工程有限公司测序。
菌株LPB-4的16S rRNA基因序列经测序显示长度为1482bp，扩增测序结果在NCBI上经过BLAST比对分析，于软件MEGA 6.06采用邻接法构建该菌株的***发育树(参见图3)。与Lactobacillus parabuchneri(类布氏乳杆菌)strain JCM 12493距离最近。
(四)类布氏乳杆菌LPB-4抑菌活性物质的理化性质分析
(1)热稳定性
将菌株LPB-4接种至液体MRS培养基中，厌氧条件下培养2天，取发酵液离心过滤后，分别置于40℃、60℃、80℃、100℃的温度条件下恒温水浴1小时，将维氏气单胞菌作为指示菌，利用牛津杯法检测发酵上清液经过不同温度处理后的抑菌活性，结果显示温度升高并不影响发酵上清液对维氏气单胞菌的抑菌活性 (参见图4)。
(2)蛋白酶耐受性
将LPB-4菌株接种至液体MRS培养基中，厌氧条件下培养2天，分别使用蛋白酶K、胰蛋白酶处理1小时，将维氏气单胞菌作为病原指示菌，使用牛津杯法检测发酵上清液经过不同蛋白酶处理后的抑菌活性，结果显示发酵液上清在胰蛋白酶和蛋白酶K的作用下对维氏气单胞菌的拮抗作用并未受到影响(参见图4)。
(五)类布氏乳杆菌LPB-4微生态制剂的制备
(1)接种活化：类布氏乳杆菌LPB-4接种于斜面固体MRS培养基上，挑取单克隆到MRS液体培养基中进行发酵培养，收集发酵种子液。
(2)第一次扩大培养：将(1)中活化好的种子液按1％的接种量接种到发酵罐中进行第一次扩大培养；发酵培养基配方为：蛋白胨10克/升，牛肉粉8克 /升，酵母粉4克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸氢二铵2克 /升，乙酸钠5克/升，硫酸镁0.2克/升，硫酸锰0.04克/升，吐温80 1克/升；厌氧条件下培养，温度为35℃，实时在线补加消泡剂；
(3)第二次扩大培养：将(2)中扩大培养的种子液按10％的接种量接种到装有75％的发酵培养基的500升发酵罐中，发酵培养基配方同步骤(2)所述发酵培养基配方；培养条件为：整个培养过程在线监控，厌氧条件，温度35℃，培养40小时，实时在线补加消泡剂；
(4)浓缩收集：放罐后，收集发酵产物，浓缩，得到微生态液体菌剂，或经喷雾干燥，得到微生态固体制剂。
(六)类布氏乳杆菌LPB-4在鱼类养殖中的应用
实例1：类布氏乳杆菌LPB-4在草体内的保护力
将大小一致的健康草鱼随机分为3组，每组20尾，饲喂7天使其适应环境。实验中使用曝气2天的水，水温控制在25℃，采用腹腔注射的方法将浓度为1×108菌落形成单位/毫升(cfu/mL)的LPB-4菌株发酵液(属于一种微生态制剂)和 AvX005菌液分别注射到草鱼体内，PBS(-)为阴性对照，连续观察14天后记录每组死亡情况；选取大小一致健康草鱼随机分为2组，每组10尾，设置重复，在实验前进行饥饿驯化2天。将浓度为1×108cfu/mL的红色荧光标记菌株 AvX005mCherry通过腹腔注射的方式注入草鱼体内，每尾注射200微升，每隔1天进行一次利用小动物成像***观察(参见图5)，连续观察7天。然后注射菌体浓度为1×108菌落形成单位/毫升的LPB-4菌液，观察LPB-4对AvX005mCherry在草鱼体内的拮抗效果，每隔1天拍摄一次，连续观察7天。
结果显示，利用腹腔注射的方法在草鱼体内注射LPB-4菌液后，记录其生活状态和死亡情况，结果如表1所示，注射LPB-4菌液的草鱼生长状况较好，未出现死亡，而注射维氏气单胞菌AvX005的对照组则出现大量死亡的情况，草鱼死亡率达到90％，表明LPB-4菌株不会影响草鱼生存，安全性高。
表1动物安全性试验
将AvX005mCherry注射到草鱼体内每隔1天使用小动物成像***进行观察，在攻毒第1天开始草鱼鳃部、鳍部、腹部和尾部均检测到明显的荧光信号，随着时间的推移，体内荧光信号逐渐增强，向内脏所在的区域转移，在第5天开始遍布全身。在攻毒后开始向实验组注射1×108菌落形成单位/毫升(cfu/mL)的LPB-4 菌液，观察到对照组红色荧光信号没有明显减少，并且遍布草鱼体腔内，而治疗组随着时间的延长可以观察到红色荧光信号有明显的降低，表明LPB-4菌株可在草鱼体内抵抗维氏气单胞菌的感染和增殖(参见图5)。
实例2：类布氏乳杆菌LPB-4对草鱼生长及抗病性的影响
选取大小一致的健康草鱼，随机分为1个对照组和1个实验组，每组45尾，并设置重复。实验前首先饲喂7天，进行驯化使草鱼适应实验环境，使用曝气2 天的水，水温控制在25℃。实验采用饲喂法，将LPB-4菌株的浓度调整为1×108菌落形成单位/毫升(cfu/mL)混入饲料混匀，对照组的草鱼饲喂普通饲料，投喂量约为草鱼体重的2％，连续饲喂30天，每天投喂两次。
(1)类布氏乳杆菌LPB-4对草鱼生长性能的影响
试验用草鱼在饲喂开始的第1天和第30天分别进行称重，记录其初始体重 (Wi)和终体重(Wf)，使用以下公式计算体重增长率(WGR)、比生长速率(SGR)、饲料效率(FE)和成活率(SR)：WGR＝((Wf-Wi)/Wi)×100％；SGR＝((lnWf-lnWi) /饲喂时间)×100％；FE＝((Wf-Wi)/饲喂总量)×100％；SR＝(实验最终鱼尾数/实验开始鱼尾数)×100％。(参见表2)。
表2草鱼生长性能参数
注：同一行的不同上标表示显著差异(a，p>0.05；b，p<0.05)
(2)类布氏乳杆菌LPB-4对草鱼血清非特异性免疫指标的影响
LPB-4菌株添加到饲料中饲喂草鱼30天，随后测定草鱼血清中酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和溶菌酶(LZM) 的酶活性。(参见图6)，发现经LPB-4饲喂后，ACP没有显著性差异，AKP、 LZM酶活均有显著提高，GSH-PX活性高于对照组，但是没有显著性差异。AKP 和LZM可形成水解酶体系清除体内病原菌，其中AKP能提高物质转运的速率，增强非特异免疫功能。GSH-PX能有效减少过氧化氢对机体的损伤。该结果说明饲喂LPB-4菌株后能使草鱼非特异性免疫增强，能够提高草鱼对外界病原和体内病原的抵抗和清除能力。
(3)类布氏乳杆菌LPB-4对草鱼组织中免疫相关基因表达的影响
LPB-4菌株添加到饲料中饲喂草鱼30天，分析草鱼肝、肾和脾脏中免疫相关基因的表达水平(参见图7)，发现LPB-4菌株饲喂组IgM(免疫球蛋白M)、 C3(β2球蛋白)、Nrf-2(核调节因子)和Keap-1(kelch样ECH关联蛋白1) 在肝脏和肾脏中的表达水平显著提高，而促炎因子IL-1β的表达量无显著变化，在脾脏中仅C3和Keap-1的表达量显著上调，表明LPB-4菌株可以增强草鱼免疫组织特异性免疫力。
(4)类布氏乳杆菌LPB-4对草鱼的保护性试验
将LPB-4菌株添加到饲料中饲喂草鱼30天后，使用维氏气单胞菌攻毒并连续观察并记录14天内各组草鱼的死亡情况(参见表3)。发现对照组草鱼在攻毒后14天后的存活率为22.86％，而LPB-4饲喂组第4天开始死亡，在14天后的存活率为54.77％，未攻毒的PBS注射组存活率达99％，排除环境干扰因素，由结果可知饲喂含有LPB-4菌株的草鱼的存活率显著高于对照组。因此饲喂类布氏乳杆菌LPB-4可以提高草鱼感染维氏气单胞菌的存活率，增强草鱼的抗病功效。
表3 LPB-4菌株对草鱼的保护性实验
Claims (14)
1. 一株类布氏乳杆菌，其特征在于，其分类命名为类布氏乳杆菌（Lactobacillus parabuchneri）LPB-4，于2022年6月23日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022951。
2.如权利要求1所述的类布氏乳杆菌的应用，其特征在于，作为鱼类致病菌拮抗菌。
3.如权利要求1所述的类布氏乳杆菌制成的微生态制剂。
4.根据权利要求3所述的微生态制剂，其特征在于，为液体制剂或固体制剂；用于水产养殖。
5.根据权利要求4所述的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼。
6.根据权利要求5所述的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为草鱼或鲤鱼。
7.一种如权利要求3~6之一所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）接种活化：将类布氏乳杆菌LPB-4接种于斜面固体MRS培养基上，挑取单克隆菌落到MRS液体培养基中进行发酵培养，收集发酵种子液；
（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所得的发酵种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中进行第一次扩大培养，得扩大培养液I；
（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所得扩大培养液I接种到装有发酵培养基的发酵罐，进行第二次扩大培养，得扩大培养液II；
（4）浓缩收集：收集步骤（3）所得的扩大培养液II，浓缩，得到液体制剂；
固体制剂是通过将所述液体制剂或扩大培养液II喷雾干燥所得。
8.根据权利要求7所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵种子液接种到发酵罐时，接种量为1～2%。
9.根据权利要求7或8所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述扩大培养液I的接种量是培养基体积的10～15%。
10.根据权利要求7或8所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中，所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：蛋白胨8~12 g/L，牛肉粉7~10 g/L，酵母粉3~5 g/L，葡萄糖18~25 g/L，磷酸氢二钾1.5~3 g/L，柠檬酸氢二铵1~3 g/L，乙酸钠4~6 g/L，硫酸镁0.1~0.3 g/L，硫酸锰0.03~0.05 g/L，吐温80 0.5~2 g/L。
11.根据权利要求9所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中，所用发酵培养基的溶剂为水，配方为：蛋白胨8~12 g/L，牛肉粉7~10 g/L，酵母粉3~5 g/L，葡萄糖18~25 g/L，磷酸氢二钾1.5~3 g/L，柠檬酸氢二铵1~3 g/L，乙酸钠4~6 g/L，硫酸镁0.1~0.3 g/L，硫酸锰0.03~0.05 g/L，吐温80 0.5~2 g/L。
12.根据权利要求7或8所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，第一次扩大培养和第二次扩大培养为厌氧发酵，温度为35～37℃；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
13.根据权利要求9所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，第一次扩大培养和第二次扩大培养为厌氧发酵，温度为35～37℃；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
14.根据权利要求10所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于，第一次扩大培养和第二次扩大培养为厌氧发酵，温度为35～37℃；培养过程中使用发酵消泡剂避免起泡。
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