CN114437964B - 一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用，涉及微生物。提供海洋来源的一株贝莱斯株芽孢杆菌Bacillus velezensis LHZY6‑14，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62117。Bacillus velezensis LHZY6‑14菌落形态特征为菌体呈杆状，单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大，属贝莱斯芽孢杆菌，革兰氏阳性；其DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，Bacillus velezensis LHZY6‑14可作为益生菌添加在对虾养殖水体中。还提供贝莱斯芽孢杆菌的发酵液及代谢产物，可抑制水产养殖中病原菌，提高水产养殖动物存活率。

Description

一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体是涉及拮抗副溶血弧菌等病原菌的一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用。

背景技术

芽孢杆菌(Bacillus spp.)作为生防细菌，已广泛应用于农作物、畜、禽、水产动物的病害防控，也是当今微生物生态防控的研究热点(杨胜清.贝莱斯芽孢杆菌S6的鉴定、发酵条件优化及其生防作用研究[D].长春:吉林农业大学硕士学位论文,2017)。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，因其能够产生多种次级代谢产物，并且具有广谱抑菌活性和促生长作用，被广泛应用于动植物病害的生物防治(迟惠荣.多花黄精叶枯病病原菌鉴定及贝莱斯芽胞杆菌防病促生效果研究[D].浙江大学,2019)。贝莱斯芽孢杆菌可以分泌产生多种抗菌物质，如脂肽类物质、抗菌蛋白、聚酮化合物等(张德锋,高艳侠,王亚军,刘春,石存斌.贝莱斯芽孢杆菌的分类、拮抗功能及其应用研究进展[J].微生物学通报,2020,47(11):3634-3649)。

随着我国水产养殖业的快速发展，高密度的水产养殖模式带来巨大经济效益的同时也带来水产养殖病害问题。虾养殖业的发展伴随着传染病的周期性爆发，除已知病原体流行外，新的病原体不断出现(孙建富，张依琳，程,等.辽宁省海洋增殖业发展的问题及对策研究[J].农业经济与管理,2013,(02):87～91.)。2019年，“玻璃苗”病影响凡纳滨对虾6-12日龄幼虫，在出现异常个体后24-48小时内死亡率超过90％，典型的大体临床体征包括消化道空，肝胰脏苍白或无色，导致病变动物呈半透明外观，研究表明其致病因子为副溶血弧菌VP-HL(Yang Feng,Xu Limei,Huang Wanzhen,Li Fang.Highly lethal Vibrioparahaemolyticus strains cause acute mortality in Penaeus vannamei post-larvae[J].Aquaculture,2022,548(1):1-11)。研究发现，贝莱斯芽孢杆菌在抑制副溶血弧菌，改善水质，提高对虾自身抵抗力方面具有良好效用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供海洋来源的一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用。

本发明提供一株贝莱斯株芽孢杆菌，该贝莱斯株芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(Guangdong Microbial CultureCollection Center,简称GDMCC)，其命名为贝莱斯株芽孢杆菌LHZY6-14(Bacillusvelezensis LHZY6-14)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：62117，保藏时间为2021年12月10日，保藏单位的地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编510070。

所述贝莱斯株芽孢杆菌LHZY6-14(Bacillus velezensis LHZY6-14)是从漳州九龙江口红树林沉积物中分离纯化获得，菌株LHZY6-14在2216E固体培养基28℃培养15h，菌落形态特征为菌体呈杆状，0.4～0.6μm×0.9-4.0μm，单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大，属贝莱斯芽孢杆菌，革兰氏阳性。

菌株Bacillus velezensis LHZY6-14生长的条件为：温度15～45℃，pH 3～12。

所述贝莱斯株芽孢杆菌LHZY6-14(Bacillus velezensis LHZY6-14)的DNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，对该菌株进行16S rDNA序列测定，得到长度为1392bp的基因序列片段，序列注册号为OL990396，在EZ网站上进行对比，鉴定其为贝莱斯株芽孢杆菌Bacillusvelezensis。

所述Bacillus velezensis LHZY6-14可在对虾养殖中的应用，所述应用是将Bacillus velezensis LHZY6-14作为益生菌添加在对虾养殖水体中。

所述益生菌添加的方式为活菌，所述益生菌可作为养殖水体添加剂。

本发明还提供所述贝莱斯芽孢杆菌的发酵液及代谢产物。

贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14接种至2216E液体培养基中，于28℃、150rpm条件下培养72h，得发酵液。

所述贝莱斯芽孢杆菌及其发酵液和代谢产物可在水产养殖中应用，所述应用具体为抑制水产养殖中病原菌，提高水产养殖动物存活率。

所述水产养殖中病原菌包括但不限于副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等。

与现有技术相比，本发明具有如下突出的优点和技术效果：

研究发现，对虾“玻璃苗”病原菌为副溶血弧菌，并且该菌具有很强的致病毒力。与副溶血弧菌模式菌株比较，该“玻璃苗”病原菌副溶血弧菌具有更强毒力和更广的耐药性，本发明针对此病原菌及时开展抗菌研究，获得具有抗“玻璃苗”病原菌副溶血弧菌的益生菌。

本发明将贝莱斯芽孢杆菌菌株用于对虾养殖中，此贝莱斯芽孢杆菌及其发酵液和代谢产物能够显著抑制对虾“玻璃苗”病原菌副溶血弧菌，提高对虾等类似水产养殖动物存活率，具有较好的生产应用前景，可应用于对虾养殖，特别是虾苗的育苗养殖阶段。

附图说明

图1为菌株LHZY6-1发酵液抑制副溶血弧菌VP-HL效果图；

图2为菌株LHZY6-1提取的抗菌粗蛋白抑制副溶血弧菌VP-HL效果图；

图3为菌株LHZY6-1作为益生菌剂投放于感染副溶血弧菌VP-HL对虾养殖盆中的对虾存活率图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌分离纯化及鉴定

将漳州市九龙江口红树林沉积物样品涂布MA平板，28℃培养48h。从平板中挑取单菌落进行纯化，获得纯菌并编号LHZY6-14。观察上述菌株的菌落形态和菌株形态，菌株LHZY6-14在2216E固体培养基28℃培养15h，菌落形态特征为菌体呈杆状，0.4～0.6μm×0.9～4.0μm，单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大，属贝莱斯芽孢杆菌，革兰氏阳性。

对菌株LHZY6-14进行生理生化特征试验，生理生化特性如表1所示。对该菌株进行16S rDNA序列测定，得到长度为1392bp的基因序列片段，序列注册号为OL990396，在EZ网站上进行对比，鉴定其为Bacillus velezensis。

根据菌株LHZY6-14的形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性比对结果，鉴定菌株LHZY6-14为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。其生理生化特征如下表所示：

表1 菌株LHZY6-14 API 20E实验结果

表2 菌株LHZY6-14 API 20NE实验结果

表3 菌株LHZY6-14 API ZYM实验结果

实施例2贝莱斯芽孢杆菌菌株的生长条件的测定

适宜生长pH值的测定：将活化培养好的贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14调成约OD＝0.4浓度的菌悬液，吸取5μL加入盛有不同初始pH值2216E液体培养基的96孔板中，28℃、150rpm条件下培养7天，以2216E液体培养液作空白，在波长630nm处定时测定菌悬液的光密度，得出贝莱斯芽孢杆菌适宜的pH值生长范围为3～12。

适宜生长温度的测定：将活化培养好的贝莱斯芽孢杆菌调成约OD＝0.4浓度的菌悬液，后混匀取5μL均匀滴于2216E固体培养基，分别在4℃、15℃、28℃、35℃、45℃、60℃、和80℃条件下培养24h，观察菌落生长状况，得出贝莱斯芽孢杆菌适宜的温度生长范围为15～45℃。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌药敏实验

取上述贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14于2216E固体培养基28℃培养15h，无菌海水稀释为菌悬液，取100μL均匀涂布于2216E固体培养基，无菌镊子取氨卡西林等21种抗生素圆片均匀置于琼脂平板上，28℃培养15h后取出观察、记录结果如下：

表4 菌株LHZY6-14药敏实验结果

实施例4贝莱斯芽孢杆菌厌氧实验

取贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14于2216E固体培养基28℃培养15h，无菌海水稀释为菌悬液，取10μL均匀点置于2216E固体培养基，后密封放于厌氧袋，28℃培养120h，后观察该贝莱斯芽孢杆菌长出明显菌落，鉴于培养基板块可能残存氧气，贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14在微好氧的情况下也能生存。

实施例5贝莱斯芽孢杆菌对副溶血弧菌VP-HL的拮抗效果

在超净工作台中，取副溶血弧菌接种至2216E液体培养基，28℃、150rpm条件下活化培养培养12h得种子液，后取100μL种子液接种于2216E固体培养基，28℃培养15h后备用；取贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14并接种至2216E液体培养基中，于28℃、150rpm条件下培养72h，得发酵液备用；制副溶血弧菌菌VP-HL悬液，调至OD₆₀₀＝1，取100μL制作抑菌板，打孔后，孔内添加100μL上述菌株制得的发酵液，28℃、10h后观察抑菌圈直径。

实验结果：

表5 菌株LHZY6-14抑菌实验结果

抑菌圈图片如图1所示.

实施例6贝莱斯芽孢杆菌抑菌活性物质提取

在超净工作台中，将贝莱斯芽孢杆菌LHZY6-14接种至2216E液体培养基中，于28℃、150rpm条件下培养72h，得发酵液；后进行硫酸铵饱和度为70％的硫酸铵沉淀，4℃过夜沉淀，10000rpm、4℃、离心20分钟，收集沉淀；沉淀于3000Da透析袋中透析至纳氏试剂检测不再变黄为止，后冷冻干燥得抗菌粗蛋白。

在超净工作台中制副溶血弧菌VP-HL菌悬液，调至OD＝1，取100μL制作抑菌板，打孔后，孔内添加100μL上述四株芽孢杆菌主要抑菌物质为蛋白类，抑菌图片如图2所示；

实施例7对虾养殖中贝莱斯芽孢杆菌抑制副溶血弧菌。

实验分3个时期：暂养期、益生菌处理期、副溶血弧菌感染期。

对虾随机分四组，分别为阳性对照组、阴性对照组、实验组，每组3个重复且每组25尾对虾；

暂养期：分组后稳定培养4天，注定时定量投喂及饲养环境的稳定；

益生菌处理期:阳性对照组和阴性对照组均不添加益生菌，实验组添加LHZY6-14益生菌发酵液，每种益生菌菌液在水体中终浓度为3×10⁵cfu/mL，益生菌处理期持续三天，每天定时计数存活对虾；

副溶血弧菌感染期：阳性对照组和实验组添加新鲜副溶血弧菌VP-HL发酵液，副溶血弧菌VP-HL发酵液在水体中终浓度为5×10⁴cfu/mL，阴性对照组不添加新鲜副溶血弧菌VP-HL菌液，定时计数存活对虾，对虾存活率统计结果如图3所示；

根据数据分析，实验组对虾死亡速度明显慢于阳性对照组，且攻毒7d后，实验组对虾存活率76％，阳性对照组对虾存活率20％，因此，菌株LHZY6-14发酵液能够有效抑制副溶血弧菌VP-HL。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1391

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 2

gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 60

agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt 120

tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag 180

ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 240

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 300

caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa 360

agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct 420

aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 480

ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag 540

cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga 600

gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 660

gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 720

gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc 780

ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa 840

ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 900

cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct 960

tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg 1020

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct 1080

aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1140

ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag 1200

gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt 1260

gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1320

tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct 1380

tttaggagcc a 1391

Claims (4)

1.一株贝莱斯株芽孢杆菌，其特征在于该贝莱斯株芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为贝莱斯株芽孢杆菌（Bacillus velezensis）LHZY6-14，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：62117，保藏时间为2021年12月10日。

2.如权利要求 1所述Bacillus velezensis LHZY6-14作为益生菌在制备对虾养殖水体添加剂中应用。

3.如权利要求1所述一株贝莱斯株芽孢杆菌的发酵液。

4.如权利要求3所述一株贝莱斯株芽孢杆菌的发酵液在制备抑制对虾养殖中副溶血弧菌且提高水产养殖对虾存活率的养殖水体添加剂中的应用。

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