CN108004183A - 一株具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的沙阿霉素链霉菌及应用 - Google Patents

一株具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的沙阿霉素链霉菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株处理大豆种子后具诱导大豆产生对大豆胞囊线虫抗性的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的培养方法及其应用。本发明涉及的放线菌菌株Snea182已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。将菌株按常规液体发酵培养后，可以用该菌的代谢产物，开发出处理大豆种子的种子处理剂，经过处理的大豆种子可以诱导大豆产生对大豆胞囊线虫的抗性。本发明的沙阿霉素链霉菌Snea182代谢物处理大豆种子后可以诱导大豆对苗期第一代胞囊线虫产生明显的抗性，对大豆胞囊线虫胞囊的形成有明显的抑制作用，是很有潜力的生防菌，为防治大豆胞囊线虫病开辟了新思路。

Description

一株具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的沙阿霉素链霉菌及应用
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种具诱导大豆抗大豆胞囊线虫的沙阿霉素链霉菌及应用。
背景技术：
大豆胞囊线虫病(Soybean Cyst Nematode，SCN)，又称大豆黄萎病、火龙秧子，是制约大豆生产的重要病害。该病害具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、休眠体(胞囊)存活时间长等特点，是一种极难防治的土传病害。该病害一般使大豆减产10％～30％，严重地块可达70％～80％，比任何一种单一病害所造成的危害都大。大豆胞囊线虫病每年给世界大豆造成的产量损失达900 万吨以上，经济损失达55亿美元。特别是黑龙江省作为中国大豆主产区，大约 6.5×105公顷的大豆面积遭受大豆胞囊线虫的危害。通过种植抗病品种，化学防治，改变耕作方式以及合理的管理方式对大豆胞囊线虫病都能起到一定的防治作用，但是都有一定的局限性。近些年来，生物防治越来越受到重视，从微生物的代谢产物中分离具有抗线虫活性物质已成为最具有潜力的防治途径之一。
大豆胞囊线虫的生防因子有很多，包括真菌、细菌、病毒和原生动物等。放线菌作为抗生素的重要产生菌，被用以筛选具有杀线虫活性的菌株，目前国际上广泛用于防治昆虫、螨类和线虫的阿维菌素就是一种放线菌的代谢产物。放线菌与真菌和细菌一样，是植物寄生线虫的重要天敌生物之一，在自然界中调节着线虫的种群数量，而且放线菌产生的次生代谢产物具有丰富的结构多样性，因此放线菌作为线虫的生防因子展现出巨大的潜力。沙阿霉素链霉菌易于繁殖，适应环境能力强，对人畜无毒，具有很强的环境适应性和环境友好性，在生物防治中起着重要的作用，具有很大的开发利用价值。相关研究表明沙阿霉素链霉菌有促生和生防作用，而沙阿霉素链霉菌对大豆胞囊线虫病的防治还尚未有报道。
针对生产上存在这一问题，通过***筛选获得一株放线菌，利用该菌或该菌的代谢产物处理大豆种子，可诱导大豆在种子萌发和生长期间产生对大豆胞囊线虫的抗性，从而解决了大豆胞囊线虫病的问题。
发明内容：
本发明的目的是选择一株菌株对大豆种子处理后可以诱导苗期大豆对胞囊线虫产生明显的抗性，将菌株按常规液体发酵培养后，可以用该菌的代谢产物，开发出处理大豆种子的种子处理剂，经过处理的大豆种子可以诱导大豆产生对大豆胞囊线虫的抗性。
本发明筛选获得的一株放线菌菌株是沙阿霉素链霉菌(Streptomyceszaomyceticus)Snea182，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号中国科学院微生物研究所；保藏日期： 2016年10月26日；保藏登记入册的编号:CGMCC No.13155。沙阿霉素链霉菌 (Streptomyces zaomyceticus)Snea182是从中国黑龙江省黑河市爱辉区西峰山乡 大豆田中筛选出的一株对大豆具有强诱导活性的放线菌菌株。
本发明通过研究发现，土壤放线菌有很多株放线菌都具有一定的诱导大豆抗胞囊线虫的能力，从这些放线菌中筛选出一株性状相对较好的菌株——沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182进行了进一步的研究。
本发明还涉及用于诱导大豆产生抗胞囊线虫抗性的放线菌代谢物，其是由本发明的放线菌菌株沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182经过常规的液体发酵培养后获得。
本发明的放线菌菌株沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182 是通过培养皿培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：
1.培养皿培养
培养基配方为高氏一号培养基：可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、 K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-20g、pH 7.2-7.4、蒸馏水1000mL。
2.液体发酵培养
其中液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、 KNO31g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、pH 7.2-7.4、蒸馏水 1000mL。
将菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r·min-1～180r·min-1、发酵5-7d，优选7d。
液体发酵的菌种可以通过大型发酵罐进行规模生产，其产品为发酵液或发酵液的制成品。
本发明还涉及一种大豆种子处理剂，其包含有效量的本发明所述的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182本身或其代谢物作为有效活性成分。
本发明的沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182或其代谢物具有对大豆的诱导活性，可用于大豆的种子处理，处理后的大豆对大豆胞囊线虫的胞囊形成具有很好的抑制作用，解决了大豆胞囊线虫病的难题。
具体实施方式：
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。
实施例1：沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的培养
首先对沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行大豆诱导活性试验，确定其对大豆的诱导作用。
将沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的菌体接种到培养基上，培养基配方为高氏一号培养基，即成分：可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.01g、琼脂15-20g、pH 7.2-7.4、蒸馏水1000mL，25℃培养2d-3d。
再将菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，培养基配方为：以重量百分比计，可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、 MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO40.01g、pH 7.2-7.4、蒸馏水1000mL。发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1～180r·min-1、发酵时间5-7d。形成的发酵液或发酵液的制成品可以直接或间接处理大豆种子。被处理的大豆种子可以减轻由于大豆胞囊线虫病害所造成的危害。
实施例2：沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的发酵
基本同实施例1，不同之处是将液体培养的菌种接种到1000L的发酵罐进行发酵，在25℃下培养，pH为7.2，发酵7d。
实施例3：沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182诱导大豆***抗性的验证
利用裂根试验设计(split-root system)探讨了菌株Snea182对大豆胞囊线虫的诱导***抗性。裂根试验中的挑战根系和应答根系彼此在空间上完全隔离，应答根系中的Snea182发酵液与大豆胞囊线虫没有直接接触，菌株对线虫的控制作用完全依赖于其对植株的诱导抗性。该测定方法可靠，已被广泛应用于生防微生物对土传病害的***诱导抗性研究。
1.制备试验用制剂
按前述液体发酵培养方法制备沙阿霉素链霉菌Snea182的发酵液，待备用。
2.制备试验用线虫
大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)：大豆胞囊线虫3号生理小种取自黑龙江省农业科学院黑河分院试验基地。采用改良淘洗-过筛法从采取的土样中分离胞囊，在体视镜下挑取新鲜、饱满、成熟、均一的胞囊。胞囊先用0.5％次氯酸钠溶液消毒3min，再用无菌水冲洗5次，放在含有少量无菌水的培养皿里，25℃恒温箱中培养，浅盘孵化15天后得到2龄幼虫，将2龄幼虫悬浮液调节到200 头/ml。
3.制备试验用种子
黑河43：由黑龙江省农业科学院黑河分院提供。
4.种子处理方法
将大豆种子先用5％次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗5次。
5.试验方法
采用温室盆栽处理，取无大豆胞囊线虫的土和沙，在干热灭菌锅中165℃，2h灭菌，然后以V(土)：V(沙)为2：1的比例混匀装入16×16cm塑料钵中。每钵中播种3粒黑河43种子，待豆苗长至两片子叶时，每钵留1株。将豆苗取出并洗净，根系分为均等的两部分。取3个同样大小的塑料钵，成“品”字形放置，底部的塑料钵分别放于2个16cm直径的盘托中。在顶部的塑料钵底部开 2条1cm×2cm，幼苗置于顶部的塑料钵中，使分开的根系分别通过2个裂缝到达下部的两个塑料钵的土壤中，在底部两个塑料钵中生长的根系分别为挑战根系和应答根系，3个钵中装入土壤基质固定植株。***置于温室(25℃、14h光照)，在挑战根系的塑料钵中2cm表土以下接种Snea182发酵液10ml，接种Snea182发酵液1周后接种10ml J2悬浮液到应答根系。以无菌水为对照，共2 个处理，3次重复。35d后调查应答根系钵中的土中的胞囊量和根内的大豆胞囊线虫总数。
5.1土壤中胞囊的分离与计数：每个土样称取200cc(即用1000mL烧杯盛水 800mL，加土至1000mL)，采用淘洗—过筛—贝曼漏斗法收集胞囊，在体视解剖镜下记录胞囊的数量。
5.2根内线虫的染色与计数：将根系用流水清洗干净，称根鲜重，然后用次氯酸钠—酸性品红染色法进行根内线虫的染色，在体视显微镜下观察记录根内线虫数量，并折成每克根鲜重线虫的数量。
5.3防治效果计算
6试验结果
测定显示，Snea182能够诱导大豆产生对大豆胞囊线虫很强的抗性。菌株 Snea182在挑战根系中接种后，应答根系中大豆胞囊线虫的入侵显著降低，应答根系土中胞囊数量显著减少。应答根系大豆胞囊线虫入侵降低52.42％，土中胞囊减少61.35％(表1)。
表1Snea182接种挑战根系后应答根系中入侵线虫和土中胞囊总数
注：35d后的调查结果，数字后字母为Duncan’s新复极差测验结果，不同大小写英文字母分别表示差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。
实施例4：沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)Snea182的田间防治大豆胞囊线虫病效果试验
使用发酵液原液，按1：100的比例处理包衣大豆种子，晾干后，将处理过的大豆种子正常播种在大豆胞囊线虫病块地，经过Snea182代谢物处理大豆种子后可以诱导苗期大豆对胞囊线虫产生明显的抗性，对大豆胞囊线虫胞囊的形成有明显的抑制作用，是很有潜力的生防菌，为防治大豆胞囊线虫病开辟了新思路。
1.制备试验用制剂
按前述液体发酵培养方法制备沙阿霉素链霉菌Snea182的发酵液，待备用。
2.制备试验用种子
黑河43：由黑龙江省农业科学院黑河分院提供。
合丰50：由黑龙江省农业科学院大庆分院提供。
3.种子处理方法
将大豆种子先用5％次氯酸钠溶液表面消毒5min，再用无菌水冲洗5次。将制备好的发酵液采用1％的种子量进行种子包衣处理，待晾干后备用。
4.试验方法
采用田间自然发病土壤接种大豆。分别在黑龙江省黑河市和黑龙江省大庆市两地进行5次重复试验。大豆田均为重茬大豆田，黑河试验基地重茬6年，田间胞囊量为40个胞囊/100ml土壤，大庆试验基地重茬6年以上，田间胞囊量为55个胞囊/100ml土壤。田间小区设计为3个处理，5次重复，共15个小区，随机区组排列，每小区5垄，垄长5米，过道1米，每垄播种100粒，小区边缘设保护行。以未经过包衣的大豆种子和液体培养液包衣的大豆种子为对照，在大豆播种后35d，待大豆胞囊线虫生长发育突破大豆根表后，每个小区随机取 20株苗，去掉表土(0-5cm)后将植株连根挖出，保持根系的完整，调查单株大豆根系胞囊着生量，计算胞囊抑制率。
5.试验结果
对Snea182菌株处理的大豆，在大豆胞囊线虫显囊期调查根系胞囊着生情况，Snea182放线菌菌株包衣处理后的大豆苗对大豆胞囊线虫的胞囊形成了明显的抑制作用，由表2可知，Snea182在大庆和黑河的抑制率分别达到了59.77％、 40.06％，包衣处理后的大豆在黑河和大庆两地处理的结果有一定差异，这可能与不同地区大豆胞囊线虫生理小种的差别有关。
表2Snea182菌株包衣处理大豆种子对大豆根系胞囊形成的影响
注：35d后的调查结果，数字后字母为Duncan’s新复极差测验结果，
不同大小写英文字母分别表示差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05)。
上述实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一株处理大豆种子后具有诱导大豆抗大豆胞囊线虫的放线菌菌株，其特征在于：该菌株为沙阿霉素链霉菌(Streptomyces zaomyceticus)，已于2016年10月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13155。
2.权利要求1所述的放线菌菌株的液体发酵方法，其特征在于：液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，pH 7.2-7.4，水1000mL，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1～180r·min-1、发酵时间7d。
3.根据权利要求2所述的液体发酵方法，其特征在于：所述的发酵时间为7d。
4.具有诱导大豆产生抗大豆胞囊线虫抗性的发酵液原液的制备方法，其特征在于：是由权利要求1所述的放线菌菌株经过液体发酵后形成的，液体发酵培养基配方为：以重量百分比计，可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，pH 7.2-7.4，水1000mL，发酵温度为25-28℃，摇床转速150r·min-1～180r·min-1、发酵时间7d。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的发酵时间为7d。
6.一种大豆种子处理剂，其特征在于，包含有效量的根据权利要求2所述的液体发酵方法中所形成的发酵液原液，用于诱导大豆产生对大豆胞囊线虫的抗性。
7.权利要求2所述液体发酵方法中形成的发酵液原液在诱导大豆抗大豆胞囊线虫中的应用。
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