CN115968972A - 一种复合富硒微生物饲料添加剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种复合富硒微生物饲料添加剂及其应用。本发明利用干酪乳杆菌ATCC393可以高效还原***盐并合成纳米硒，不仅毒性低，而且能够被机体高效地吸收和利用，此外，还能发挥有机硒、无机硒特有的功能；本发明选择的干酪乳杆菌和罗伊氏粘液乳杆菌均属于益生菌，具有增强机体免疫力、促进肠道消化***健康、帮助吸收营养成分等益生活性，在补硒的同时，利用乳酸菌的益生性，来增强机体免疫力、促进肠道消化。由实验结果可知，本发明提供的组合物提高了断奶仔猪的生长性能，增强仔猪的免疫能力和抗氧化能力，降低了腹泻率和料重比，提高了仔猪养殖经济效益。

Description

一种复合富硒微生物饲料添加剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种复合富硒微生物饲料添加剂、富硒微生物饲料及其应用。

背景技术

“仔猪早期断奶综合征”是制约规模化养猪业发展的瓶颈问题。断奶应激导致的氧化应激会引起仔猪肠道损伤，增加疾病的易感性，影响生长发育，甚至导致疾病和死亡的发生，造成重大经济损失。使用抗生素进行防治是畜牧业中的普遍举措，然而，其大量使用甚至滥用导致细菌耐药性、畜产品药物残留、过敏中毒反应等危害日益严重。

硒是动物必需的微量元素，具有众多生物学功能。然而，目前饲料中硒的主要添加形式为***钠(Na₂SeO₃)，其毒性作用强、生物利用率低、易造成环境污染，这无疑给“绿色养殖业”带来挑战。因此，开发安全、优质的硒营养性饲料添加剂极为迫切。纳米硒(SeNPs)是一种新型、高效的补硒制剂。然而现在纳米硒主要由物理和化学方法合成，这些方法需要高温、酸性pH和苛刻的化学试剂等条件，上述方法存在的不安全因素限制其在医学、食品和饲料等领域的推广应用。相较于耗能且易产生危害环境的副产物的物理和化学方法，使用生物学方法合成纳米硒，已被公认为一种安全、高效、低成本和环保的技术。许多微生物可以通过同化或异化代谢或解毒作用将***盐还原为毒性小的纳米硒。尽管大部分微生物对***盐有一定的耐受性并可以转化***盐生成纳米硒，但其安全性尚未得到充分验证。因此，有必要从非致病性、功能已知、应用广泛的菌株中筛选出具有***盐还原能力的菌株，并制备一种可以解决当前仔猪断奶应激阶段养殖所面临的仔猪腹泻、死亡率高等问题的饲料添加剂。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种复合富硒微生物饲料添加剂及其应用。本发明提供的组合物可以解决现有饲料中硒添加剂存在毒性作用强、生物利用率低和环境污染大的问题，可以提高仔猪免疫力和抗氧化性能，促进仔猪生长，降低腹泻率和死亡率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种复合富硒微生物饲料添加剂，所述组合物包括利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 393合成的纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)；

所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的质量比为(1～1.5)：(1～1.5)；

所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的活菌数≥1×10⁹CFU/g。

优选的，所述罗伊氏粘液乳杆菌包括保藏编号为CICC 6118的罗伊氏粘液乳杆菌。

优选的，所述纳米硒由包括以下步骤的方法制备得到：

将干酪乳杆菌ATCC 393的种子液接种到MRS液体培养基中，培养至对数期，得到菌液；

将所述菌液和***钠混合，厌氧培养48～60h，得到富硒发酵液；

将所述富硒发酵液进行第一离心，得到菌体沉淀；所述第一离心的转速为3000～5000rpm；所述第一离心时间为10～15min；

将所述菌体沉淀依次进行溶菌酶处理和超声破碎，得到破碎液；

将所述破碎液进行第二离心，得到含纳米硒的沉淀物；所述第二离心的转速为3000～5000rpm；所述第二离心时间为10～15min；

将所述含纳米硒的沉淀物重悬后，加入二氧化硅至终浓度为150～200g/L，烘干后，得到所述纳米硒。

优选的，所述***钠在混合后的菌液中的浓度为3～4mmol/L。

优选的，所述溶菌酶处理的温度为35～37℃，处理的时间为2～4h。

优选的，所述超声破碎的条件包括：一个周期为破碎5s，停8s；总时间为1～2h。

本发明还提供了一种富硒微生物饲料，所述富硒微生物饲料包括上述技术方案所述的复合富硒微生物饲料添加剂和基础饲料。

优选的，所述复合富硒微生物饲料添加剂和基础饲料的质量比为(0.05～0.1)：100。

本发明还提供了上述技术方案所述的复合富硒微生物饲料添加剂或上述技术方案所述的富硒微生物饲料在提高动物生长性能、提高动物免疫力和提高动物抗氧化能力中的一种或多种方面中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的复合富硒微生物饲料添加剂或上述技术方案所述的富硒微生物饲料在制备降低动物腹泻率和/或降低动物肠道屏障功能障碍的产品中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种复合富硒微生物饲料添加剂，所述组合物包括利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 393合成的纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)；所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的质量比为(1～1.5)：(1～1.5)；所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的活菌数≥1×10⁹CFU/g。本发明利用干酪乳杆菌ATCC 393可以高效还原***盐并合成纳米硒，相比于物理和化学方法合成，生物合成的纳米硒不仅毒性低，而且能够被机体高效地吸收和利用，此外，还能发挥有机硒、无机硒特有的功能，如抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用；本发明选择的干酪乳杆菌和罗伊氏粘液乳杆菌均属于益生菌，具有增强机体免疫力、促进肠道消化***健康、帮助吸收营养成分等益生活性，在补硒的同时，利用乳酸菌的益生性，来增强机体免疫力、促进肠道消化。由实验结果可知，本发明提供的组合物提高了断奶仔猪的生长性能，增强仔猪的免疫能力和抗氧化能力，降低了腹泻率和料重比，提高了仔猪养殖经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为复合富硒微生物饲料添加剂中干酪乳杆菌合成纳米硒条件优化；

图2为复合富硒微生物饲料添加剂实物图；

图3为复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪血清生化指标的影响；

图4为复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪肠道屏障功能的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种复合富硒微生物饲料添加剂，所述组合物包括利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 393合成的纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)；

所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的质量比为(1～1.5)：(1～1.5)；

所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的活菌数≥1×10⁹CFU/g。

以质量份计，本发明所述组合物包括1～1.5份纳米硒，优选为1份。

本发明所述纳米硒优选由包括以下步骤的方法制备得到：

将干酪乳杆菌ATCC 393的种子液接种到MRS液体培养基中，培养至对数期，得到菌液；

将所述菌液和***钠混合，厌氧培养48～60h，得到富硒发酵液；

将所述富硒发酵液进行第一离心，得到菌体沉淀；所述第一离心的转速为3000～5000rpm；所述第一离心时间为10～15min；

将所述菌体沉淀依次进行溶菌酶处理和超声破碎，得到破碎液；

将所述破碎液进行第二离心，得到含纳米硒的沉淀物；所述第二离心的转速为3000～5000rpm；所述第二离心时间为10～15min；

将所述含纳米硒的沉淀物重悬后，加入二氧化硅至终浓度为150～200g/L，烘干后，得到所述纳米硒。

本发明将干酪乳杆菌ATCC 393的种子液接种到MRS液体培养基中，培养至对数期，得到菌液。在本发明中，所述干酪乳杆菌ATCC 393优选购自美国菌种保藏中心(ATCC)。

在本发明中，所述干酪乳杆菌ATCC 393的种子液的制备方法优选包括：

将干酪乳杆菌ATCC 393在MRS固体培养基上进行活化培养，得到单菌落；

将所述单菌落接种到MRS液体培养基中，35～37℃静置培养24h，得到所述种子液。

在本发明中，所述种子液和MRS液体培养基的体积比优选为(3～5)：100，更优选为5：100；接种种子液后，所述培养的温度优选为35～37℃，更优选为37℃；所述培养的时间优选为12h，即培养12h后进入对数期，得到所述菌液。

得到菌液后，本发明将所述菌液和***钠混合，厌氧培养48～60h，得到富硒发酵液。在本发明中，所述厌氧培养的时间为48～60h，优选为48h。

在本发明中，所述***钠在混合后的菌液中的浓度优选为3～4mmol/L，更优选为4mmol/L；所述厌氧培养的温度优选为35～37℃，更优选为37℃。

本发明选择在干酪乳杆菌的对数生长期(12h)时，加入3～4mM的***钠进行富硒发酵，在该发酵条件下，干酪乳杆菌的转化率最高，转化率为95％。

得到富硒发酵液后，本发明将所述富硒发酵液进行第一离心，得到菌体沉淀；所述第一离心的转速为3000～5000rpm，优选为4000rpm；所述第一离心时间为10～15min，优选为10min。

在本发明中，所述第一离心的温度优选为4℃。

本发明选择适宜的离心条件，不仅可以菌体完全沉淀下来，而且可以方便后期收集菌体，简化了流程和降低了工艺难度。

得到菌体沉淀后，本发明优选将菌体沉淀重悬于无菌水中，得到菌悬液。在本发明中，所述菌体沉淀和无菌水的质量体积比优选为10g：50mL。

得到菌悬液后，本发明将所述菌悬也依次进行溶菌酶处理和超声破碎，得到破碎液。

在本发明中，所述溶菌酶处理优选包括：将菌悬液和溶菌酶混合，在35～37℃水浴中处理2～4h，得到溶菌液；所述溶菌酶和菌悬液的体积比优选为(10～20)mg：1mL，更优选为20mg：1mL；所述水浴处理的温度优选为35～37℃，更优选为37℃；所述水浴处理的时间优选为2～4h，更优选为4h。

本发明所述溶菌酶优选购自北京索莱宝科技有限公司，货号为L8120。

得到溶菌液后，本发明将所述溶菌液进行超声破碎，得到破碎液。

在本发明中，所述超声破碎的仪器优选包括超声破碎仪；所述超声破碎的功率优选为250～350W，更优选为300W：所述超声破碎的一个周期优选为破碎5s，停8s，即超声破碎仪开5s，停8s，循环至破碎结束；从开始破碎到破碎结束的总时间优选为1～2h。

本发明通过提高破碎时长，从而提高破碎效率，可以更有效的将纳米硒从菌体内分离出来，提高纳米硒得率。

得到破碎液后，本发明将所述破碎液进行第二离心，得到含纳米硒的沉淀物；所述第二离心的转速为3000～5000rpm，优选为4000rpm；所述第二离心时间为10～15min，优选为10min。在本发明中，所述第二离心的温度优选为4℃。

本发明选择适宜的第二离心条件，不仅可以含纳米硒的沉淀物完全沉淀下来，而且可以方便后期收集含纳米硒的沉淀物，简化了流程和降低了工艺难度。

得到含纳米硒的沉淀物后，本发明将所述含纳米硒的沉淀物重悬后，加入二氧化硅至终浓度为150～200g/L，优选为200g/L，烘干后，得到所述纳米硒。

在本发明中，所述重悬含纳米硒的沉淀物的溶剂优选包括无菌水；所述含纳米硒的沉淀物和无菌水的质量体积比优选为10g：50mL。

在本发明中，所述烘干后，优选将烘干后的纳米硒进行研磨，得到得到所述纳米硒。

本发明经破碎后，将纳米硒从菌体内暴露出来，得到含有菌体和纳米硒的混合物(即含纳米硒的沉淀物)，通过加入适量的二氧化硅后，将二者制备为干酪乳酸杆菌-纳米硒，是一种既含益生菌，又含纳米硒的复合物(即本发明所述的纳米硒)。

由于纳米硒在饲料中的添加量极少，通过加入二氧化硅可以提高在饲料中的添加量；另外，二氧化硅可以分散纳米硒，防止结块，使纳米硒在饲料中的分布更均匀，提高饲料的稳定性和品质；此外，相较于冷冻干燥和喷雾干燥，加入二氧化硅进行烘干处理，具有便利和节约能源的优势。

以纳米硒的质量份计，本发明所述组合物包括1～1.5份罗伊氏粘液乳杆菌，优选为1份。

在本发明中，所述罗伊氏粘液乳杆菌优选包括保藏编号为CICC 6118的罗伊氏粘液乳杆菌。本发明所述罗伊氏粘液乳杆菌优选购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。本发明所述保藏编号为CICC 6118的罗伊氏粘液乳杆菌是一株来源于猪的肠内的益生菌，安全性更高。

在本发明中，所述罗伊氏粘液乳杆菌的制备方法优选包括：

将罗伊氏粘液乳杆菌菌株在MRS固体培养基上进行活化培养，得到单菌落；

将所述单菌落接种到MRS液体培养基中，35～37℃静置培养24h，得到罗伊氏粘液乳杆菌种子液；

将所述罗伊氏粘液乳杆菌种子液以3～5％的接种量，接种到MRS液体培养基中，35～37℃静置培养48～60h，得到罗伊氏粘液乳杆菌菌液；

将所述罗伊氏粘液乳杆菌菌液与奶粉和海藻糖混合后，进行冻干处理，得到所述罗伊氏粘液乳杆菌。

在本发明中，所述罗伊氏粘液乳杆菌菌液与奶粉和海藻糖比例优选为100mL：(20～25)g：(8～10)g；更优选为100mL：25g：10g。

本发明还提供了一种富硒微生物饲料，所述富硒微生物饲料包括上述技术方案所述的组合物和基础饲料。

在本发明中，所述组合物和基础饲料的质量比优选为(0.05～0.1)：100，更优选为0.05：100。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物或上述技术方案所述的富硒微生物饲料在提高动物生长性能、提高动物免疫力和提高动物抗氧化能力中的一种或多种方面中的应用。在本发明中，所述动物优选包括仔猪，更优选为断奶仔猪。

本发明还提供了上述技术方案所述的组合物或上述技术方案所述的富硒微生物饲料在制备降低动物腹泻率和/或降低动物肠道屏障功能障碍的产品中的应用。在本发明中，所述动物优选包括仔猪，更优选为断奶仔猪。

本发明发现在仔猪日粮中添加本发明的组合物可显著提高仔猪的平均日增重和日均采食量，降低腹泻率和料重比，并通过促进肠道绒毛发育完善，增强肠道抗氧化能力，调节菌群结构及其代谢物，进而缓解断奶仔猪肠道氧化应激及炎症，提高仔猪生长性能。

通过检测仔猪血清生化指标，本发明发现在仔猪日粮中添加本发明的组合物显著提高了仔猪血清中白蛋白含量，说明添加此组合物提高了仔猪对蛋白的利用率，促进了自身蛋白质的合成，提高了其生长性能。

通过检测与肠道屏障功能障碍相关的生物标志物，本发明发现在仔猪日粮中添加本发明的组合物显著降低仔猪血清中D-乳酸含量及二胺氧化酶的活性，说明添加此组合物以保护仔猪免受由断奶应激引起的肠道屏障功能障碍。

通过检测肠道和血清中炎症因子含量，本发明发现在仔猪日粮中添加本发明的复组合物显著降低了白介素-1β、白介素-18、肿瘤坏死因子-α等促炎因子含量，提高了转化生长因子-β和分泌性免疫球蛋白A的含量。以上结果说明日粮中添加本发明的组合物可以有效调节仔猪的免疫功能，提高机体抗病力。

通过检测仔猪抗氧化能力，本发明发现在仔猪日粮中添加本发明的组合物显著降低了空肠组织中丙二醛的含量，丙二醛是机体发生氧化应激时的生物标志物。此外，本发明提供的组合物显著提高了空肠组织总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶活性，同时该饲料添加剂也提高了谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶等含硒抗氧化酶的含量，说明日粮中添加本发明的组合物可以有效提高仔猪抗氧化功能。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种复合富硒微生物饲料添加剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

纳米硒合成条件优化：

为确定干酪乳杆菌对***盐的还原效率和纳米硒的合成效率，将干酪乳酸杆菌ATCC 393单菌落接种到MRS液体培养基培养中，37℃静置培养12h后调整至OD₆₀₀＝0.6，并按1％接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃条件进行培养。

然后，在干酪乳杆菌ATCC 393的不同生长阶段(迟缓期：培养3h，指数期：培养12h，稳定期：培养27h)加入不同浓度(0mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM和16mM)的***钠。加入***钠后，定期(6h、12h、18h、24h、36h、48h和72h)收集细菌培养上清液，并通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测培养基中的硒含量。根据培养前后硒浓度差计算干酪乳杆菌对***钠的生物转化率。结果如图1和表1～3所示。

表1迟缓期加入不同浓度***钠在不同时间的***盐浓度(mM)

	6h	12h	18h	24h	36h	48h	72h
								0.5mM	0.456	0.415	0.369	0.342	0.310	0.287	0.250
1mM	0.870	0.776	0.758	0.773	0.718	0.611	0.537
								2mM	1.853	1.759	1.591	1.532	1.315	1.278	1.269
4mM	3.562	3.376	3.020	2.843	2.443	2.320	2.290
								8mM	7.058	7.028	6.917	6.351	6.209	6.076	5.614
16mM	15.348	14.441	14.290	13.832	12.288	11.768	11.783

表2指数期加入不同浓度***钠在不同时间的***盐浓度(mM)

	6h	12h	18h	24h	36h	48h	72h
								0.5mM	0.416	0.331	0.267	0.258	0.209	0.123	0.068
1mM	0.861	0.708	0.510	0.352	0.276	0.195	0.085
								2mM	1.765	1.512	1.362	0.946	0.470	0.194	0.150
4mM	3.438	3.187	2.712	1.995	0.664	0.397	0.209
								8mM	7.010	6.595	5.436	4.767	4.202	3.427	2.722
16mM	15.282	14.679	13.945	13.548	12.915	11.964	11.552

表3稳定期加入不同浓度***钠在不同时间的***盐浓度(mM)

	6h	12h	18h	24h	36h	48h	72h
								0.5mM	0.447	0.406	0.363	0.285	0.234	0.163	0.117
1mM	0.905	0.827	0.769	0.643	0.568	0.393	0.312
								2mM	1.900	1.806	1.737	1.575	1.462	1.333	1.210
4mM	3.659	3.460	3.128	3.046	2.864	2.825	2.441
								8mM	7.530	7.154	6.886	6.278	5.978	5.580	5.643
16mM	15.391	15.139	14.558	13.876	13.505	11.478	11.173

由图1和表1～3可知，在干酪乳杆菌的对数生长期(12h)时，加入4mM的***钠进行富硒发酵，在该发酵条件下，干酪乳杆菌的转化率最高，转化率为95％。

实施例2

一种复合富硒微生物饲料添加剂，由以下制备方法制备得到：

1、干酪乳酸杆菌纳米硒的制备：

(1)菌株活化：用MRS固体培养基对干酪乳酸杆菌ATCC 393进行活化培养，MRS固体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母浸膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温80 0.1％，琼脂2％，pH 6.4；将干酪乳酸杆菌划线接种于MRS固体培养基，于37℃厌氧培养48h。

(2)种子培养：将挑取的干酪乳酸杆菌ATCC 393的单菌落用MRS液体培养基培养，MRS液体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母浸膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温800.1％，pH 6.4；37℃静置培养24h，得到发酵种子液。

(3)厌氧富硒培养：将步骤2中得到的干酪乳酸杆菌ATCC 393发酵种子液以5％的接种量，接入MRS液体培养基培养。37℃静置培养12h后，待其进入对数生长期，向发酵培养基中加入终浓度为4mM的***钠，继续37℃静置厌氧培养48h，得到富硒发酵液。

(4)干酪乳酸杆菌纳米硒制备：收集干酪乳酸杆菌ATCC 393富硒发酵液，于高速冷冻离心机，4000rpm，4℃离心10min，弃上清，将菌体重悬于无菌水；加入溶菌酶，使其终浓度为20mg/mL，混匀后于37℃水浴4h；使用超声破碎仪破碎菌体，破碎条件：300W，开5s、停8s，2h；破碎后，将破碎液于高速冷冻离心机，4000rpm，4℃离心10min，弃上清；将沉淀重悬于无菌水中，加入20％二氧化硅(W/V)，充分混匀后，置于37℃烘箱烘干，使其水分蒸发；经烘干后的样本，经研磨机充分研磨后，即可得到干酪乳酸杆菌纳米硒。

2、罗伊氏粘液乳杆菌的制备：

(1)菌株活化：用MRS固体培养基对罗伊氏粘液乳杆菌进行活化培养，MRS固体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母浸膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温80 0.1％，琼脂2％，pH 6.4；将罗伊氏粘液乳杆菌划线接种于MRS固体培养基，于37℃厌氧培养48h。

(2)种子培养：将挑取的罗伊氏粘液乳杆菌的单菌落用MRS液体培养基培养，MRS液体培养基配方如下：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母浸膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.06％，一水硫酸锰0.025％，吐温800.1％，pH 6.4；37℃静置培养24h，得到发酵种子液。

(3)发酵罐扩大培养：将步骤2中得到的罗伊氏粘液乳杆菌发酵种子液以5％的接种量，分别接入到含MRS液体培养基的发酵罐中扩大培养，37℃静置培养48h。

(4)活菌制备：收集上述发酵产物，按照质量百分含量的组分分别加入25％奶粉和10％海藻糖等冻干保护剂，充分混合后，进行冷冻喷雾干燥，得到罗伊氏粘液乳杆菌活菌。

3、将干酪乳酸杆菌纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌按照质量比1：1混合，制成复合富硒微生物饲料添加剂(即所述组合物)(图2)。

应用例1

1.试验设计

按照每组仔猪平均体重相近的原则，将21天断奶仔猪随机分为两组，分别为对照组和复合富硒微生物饲料添加剂组，并打上耳标。基础日粮营养水平达到NRC(2012)断奶仔猪营养需要，其中对照组饲喂含***钠的基础日粮；所述***钠和基础日粮的质量比为0.3mg：1kg；所述***钠购买自美国西格玛奥德里奇公司，货号为214485；

复合富硒微生物饲料添加剂组饲喂富硒微生物饲料；所述富硒微生物饲料由基础日粮和实施例2制备的复合富硒微生物饲料添加剂组成；所述复合富硒微生物饲料添加剂和基础日粮的质量比为0.6mg：1kg(即每kg富硒微生物饲料含0.3mg实施例2制备的纳米硒和0.3mg实施例2制备的罗伊氏粘液乳杆菌的活菌)；

两组实验的日粮，除全价饲料中硒的添加形式和活菌添加有所不同外，所用的基础料均相同。实验在广东省农业科学院动物科学研究所的仔猪饲养间开展，试验周期为14天。

2.检测指标与方法

2.1生长性能

整个实验周期内，记录仔猪初始体重、实验末重、每日采食量，并计算平均日增重、平均日采食量、饲料转化率等指标，计算公式如下：平均日增重(g)＝(实验末重-初始体重)/14天；饲料转化率(g/g)＝平均日采食量/平均日增重。

2.2腹泻率统计

腹泻评定依据：无腹泻，粪便外观正常、呈圆柱形；轻微腹泻，粪便为软边、但尚成形；中度腹泻，粪便较黏腻，不成形，有较多水分；重度腹泻，粪便呈液态状，不成形，有较高水分含量。如出现中度及重度腹泻，则被记录。腹泻率＝试验期腹泻仔猪头次/(试验仔猪头数×试验天数)×100％。

2.3血清生化指标

将采集的仔猪血液置于37℃水浴锅中2h，待血液凝固后，4℃，3500rpm离心10min，取上清即为血清。采用OLYMPUS AU400全自动生化分析仪测定血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、血尿素氮、乳酸脱氢酶、白蛋白、碱性磷酸酶和肌酐含量。

2.4肠道屏障功能损伤生物标志物检测

二胺氧化酶是一种存在于小肠黏膜的细胞内酶，认为是清除内源性和外源性组胺的前线酶。肠道屏障功能受损时，二胺氧化酶释放入血，外周血二胺氧化酶含量升高，检测血清中二胺氧化酶酶活可特异性评估肠道屏障损伤程度。D-乳酸是肠道固有细菌的代谢产物，肠道屏障功能受损时，肠道通透性增加，肠道细菌产生的大量D-乳酸透过受损的肠黏膜进入血循环。血清中D-乳酸水平可作为评估肠道屏障损伤程度的指标。具体测定方法参照相应测定试剂盒说明书。

2.5炎症因子检测

利用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法测定血清及空肠中白介素-1β、白介素-10、白介素-18、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β和分泌性免疫球蛋白A的含量。具体测定方法参照各试剂盒说明书。

2.6抗氧化能力检测

仔猪空肠组织中总抗氧化能力、丙二醛、总超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白氧化还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化相关指标测定参考对应试剂盒说明书。

3.实验结果

3.1复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪生长性能及腹泻的影响

结果如表4所示，与对照组相比，富合富硒微生物饲料添加剂组显著提高了仔猪的实验末重、平均日增重和日均采食量，分别提高了13.16％、30.42％和41.09％，同时，降低仔猪腹泻率和料重比，分别降低了51.10％和32.20％。

表4复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪生长性能及腹泻的影响

项目	对照组	试验组
			初始体重(kg)	5.23±0.11	5.22±0.14
实验末重(kg)	9.27±0.25	10.49±0.63*
			平均日增重(g)	288.6±22.45	376.4±42.47*
日均采食量(g)	334.75	472.31*
			料重比	1.77	1.20
腹泻率(％)	30.96	15.14

*表示两组数据间差异显著(p＜0.05)。

3.2复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪血清生化指标的影响

结果如表5、图3所示，复合富硒微生物饲料添加剂显著提高了仔猪血清中白蛋白含量，说明该饲料添加剂提高了仔猪对蛋白的利用率，促进了自身蛋白质的合成，提高了其生长性能。

表5复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪血清生化指标的影响

**表示两组数据间差异极显著(p＜0.01)。

3.3复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

结果如表6、图4所示，与对照组相比，复合富硒微生物饲料添加剂显著降低仔猪血清中D-乳酸含量及二胺氧化酶的活性，说明添加此饲料添加剂可以保护仔猪免受由断奶应激引起的肠道屏障功能障碍。

表6复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪肠道屏障功能的影响

*表示两组数据间差异显著(p＜0.05)。

3.4复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪免疫机能影响

通过检测仔猪空肠和血清中炎症因子含量(表7、表8)，结果发现复合富硒微生物饲料添加剂显著降低了空肠组织中白介素-1β、白介素-18、肿瘤坏死因子-α和血清中白介素-18等促炎因子含量，提高了血清和空肠组织中转化生长因子-β和分泌性免疫球蛋白A的含量，其在炎症反应中起重要作用。以上结果说明日粮中添加本发明的饲料添加剂可以有效调节仔猪的免疫功能，提高机体抗病力。

表7复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪免疫机能影响(血清)

*表示两组数据间差异显著(p＜0.05)。

表8复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪免疫机能影响(空肠组织)

*表示两组数据间差异显著(p＜0.05)，**表示两组数据间差异显著(p＜0.01)。

3.5复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪抗氧化能力的影响

检测仔猪抗氧化能力(表9)发现，与对照组相比，复合富硒微生物饲料添加剂显著降低了仔猪空肠中丙二醛的含量，提高了空肠组织总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶活性，同时也提高了谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶等含硒抗氧化酶的含量，说明日粮中添加本发明的饲料添加剂可以有效提高仔猪抗氧化功能。

表9复合富硒微生物饲料添加剂对断奶仔猪抗氧化能力影响

项目	对照组	试验组
			丙二醛(微摩尔/毫克蛋白)	5.29±0.12	<![CDATA[4.12±0.11<sup>*</sup>]]>
总抗氧化能力(微摩尔/毫克蛋白)	0.78±0.05	<![CDATA[1.10±0.15<sup>**</sup>]]>
			总超氧化物歧化酶(U/毫克蛋白)	45.35±12.34	<![CDATA[55.47±5.42<sup>*</sup>]]>
硫氧还蛋白氧化还原酶(U/毫克蛋白)	20.48±3.47	<![CDATA[32.45±7.45<sup>*</sup>]]>
			谷胱甘肽过氧化物酶(mU/毫克蛋白)	32.45±7.11	<![CDATA[49.14±8.21<sup>*</sup>]]>

*表示两组数据间差异显著(p＜0.05)，**表示两组数据间差异显著(p＜0.01)。

综上所述，本发明的复合富硒微生物饲料添加剂及其使用方法可以显著提高仔猪的平均日增重，降低料重比和腹泻率，并通过增强机体的免疫力和抗氧化能力，进而缓解断奶应激，提高仔猪生长性能。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种复合富硒微生物饲料添加剂，其特征在于，所述组合物包括利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC 393合成的纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)；

所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的质量比为(1～1.5)：(1～1.5)；

所述纳米硒和罗伊氏粘液乳杆菌的活菌数≥1×10⁹CFU/g。

2.根据权利要求1所述的复合富硒微生物饲料添加剂，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌包括保藏编号为CICC 6118的罗伊氏粘液乳杆菌。

3.根据权利要求1所述的复合富硒微生物饲料添加剂，其特征在于，所述纳米硒由包括以下步骤的方法制备得到：

将干酪乳杆菌ATCC 393的种子液接种到MRS液体培养基中，培养至对数期，得到菌液；

将所述菌液和***钠混合，厌氧培养48～60h，得到富硒发酵液；

将所述富硒发酵液进行第一离心，得到菌体沉淀；所述第一离心的转速为3000～5000rpm；所述第一离心时间为10～15min；

将所述菌体沉淀依次进行溶菌酶处理和超声破碎，得到破碎液；

将所述破碎液进行第二离心，得到含纳米硒的沉淀物；所述第二离心的转速为3000～5000rpm；所述第二离心时间为10～15min；

将所述含纳米硒的沉淀物重悬后，加入二氧化硅至终浓度为150～200g/L，烘干后，得到所述纳米硒。

4.根据权利要求3所述的复合富硒微生物饲料添加剂，其特征在于，所述***钠在混合后的菌液中的浓度为3～4mmol/L。

5.根据权利要求3所述的复合富硒微生物饲料添加剂，其特征在于，所述溶菌酶处理的温度为35～37℃，处理的时间为2～4h。

6.根据权利要求3所述的复合富硒微生物饲料添加剂，其特征在于，所述超声破碎的条件包括：一个周期为破碎5s，停8s；总时间为1～2h。

7.一种富硒微生物饲料，其特征在于，所述富硒微生物饲料包括权利要求1～6任一项所述的复合富硒微生物饲料添加剂和基础饲料。

8.根据权利要求7所述的富硒微生物饲料，其特征在于，所述复合富硒微生物饲料添加剂和基础饲料的质量比为(0.05～0.1)：100。

9.权利要求1～6任一项所述的复合富硒微生物饲料添加剂或权利要求7或8所述的富硒微生物饲料在提高动物生长性能、提高动物免疫力和提高动物抗氧化能力中的一种或多种方面中的应用。

10.权利要求1～6任一项所述的复合富硒微生物饲料添加剂或权利要求7或8所述的富硒微生物饲料在制备降低动物腹泻率和/或降低动物肠道屏障功能障碍的产品中的应用。

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