CN109554356B - 一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂及其应用，有效解决霉菌毒素生物降解剂的生产，及降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T‑2毒素，实现在仔猪和肉鸡霉变饲料中的应用问题，由质量比：葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1︰1～9制成；葡萄糖氧化酶为粉末状饲料添加剂葡萄糖氧化酶，酶活力≥2000 u/g和酶活力≥5000 u/g，或液体饲料添加剂葡萄糖氧化酶，酶活力≥10000 u/mL；将酿酒酵母yk18在平板种子培养基上活化，以v/v计2%转接于含液体发酵培养基中培养，再按v/v计5%加入液体发酵培养基，得到酿酒酵母yk18液体发酵培养液，然后固体培养基密封培养，风干。本发明方法简单，易生产制备，降解剂的酶活力强，是霉菌毒素生物降解剂上的创新。

Description

一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂及其 应用

技术领域

本发明涉及微生物，特别是一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂及其应用。

背景技术

霉菌毒素污染给饲料工业、畜牧业带来了巨大经济损失，严重威胁人类动物源食品安全。世界卫生组织估测，全球约有25％的农作物受到霉菌毒素污染，2％以上不能食用，造成经济损失接近1万亿美元/年。国家粮食局调研发现，我国谷物霉菌毒素阳性率90％以上，因霉变造成的粮食产后损失每年高达2100万吨(占粮食总产量4.2％)，直接经济损失约为180～240亿元/年，间接损失超过1000亿元/年。

霉菌毒素(Mcyotoxin)是霉菌在生长过程中产生的有毒的次级代谢产物。霉菌毒素广泛存在于谷物、粮食和饲料原料中。主要的霉菌毒素包括黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)、单端抱霉烯族毒素(Trichothecenes，主要有T-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇NEO和呕吐毒素DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素(Ochratoxin A，OTA)及烟曲霉毒素(Fumonisins)等。有效控制和解决霉菌毒素对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有非常重要的意义。

霉菌毒素去除和降解方法有传统的物理化学方法、吸附剂吸附法及生物降解法。传统的物理化学方法存在效果不稳定、营养成分损失大以及难以规模化生产和广泛推广应用等缺点。吸附剂吸附法是目前应用较多的方法，但吸附剂吸附法主要对黄曲霉毒素具有较好的吸附作用，对玉米赤霉烯酮和呕吐毒素等霉菌毒素几乎没有吸附效果，且吸附剂大多会影响饲料中维生素和微量元素等营养成分对动物的消化吸收。

霉菌毒素生物降解技术通过微生物本身及其代谢产生的物质与毒素作用，能够达到破坏霉菌毒素毒性基团的效果，并且该技术还具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境没有污染等特点和优势，成为近年来业界关注的热点。

生物技术降解霉菌毒素主要有生物转化型、酶解型及吸附型等三种途径。生物转化型是通过筛选某些微生物，利用其代谢过程中生物转化作用，使霉菌毒素遭到破坏或转变为低毒或无毒的物质。酶解型是利用某些特殊的生物酶降解或分解霉菌毒素，使其转变为低毒或无毒的物质。吸附型是利用某些对霉菌毒素具有吸附功能的特殊生物材料吸附霉菌毒素，使其不对或减轻对动物造成危害。

生物降解技术要想实现规模化应用，仍然面临许多急待解决的难题。就目前来看，中国对霉菌毒素生物降解的研究还主要侧重于对降解单一毒素菌株的筛选及解毒能力的研究，而对于筛选出高活性同时降解多种霉菌毒素的菌株研究却很少。由于生物酶来源的特殊性、作用的专一性和应用条件苛刻性等，对霉菌毒素降解酶及其在实际生产应用的研究也很少。筛选能高效降解多种霉菌毒素的微生物，研发能高效降解霉菌毒素的生物酶制剂是成功控制霉菌毒素的关键，也是霉菌毒素生物降解技术研究领域重要突破点和发展方向。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂及其应用，可有效解决霉菌毒素生物降解剂的生产，及降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素，实现在仔猪和肉鸡霉变饲料中的应用问题。

本发明解决的技术方案是，一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，由质量比：葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1︰1～9混合均匀制成；

所述的葡萄糖氧化酶为粉末状饲料添加剂葡萄糖氧化酶，酶活力≥2000u/g和酶活力≥5000u/g，或液体饲料添加剂葡萄糖氧化酶，酶活力≥10000u/mL；葡萄糖氧化酶的酶活力定义为在pH为6.0，温度为30℃的有氧条件下，每分钟催化1μmol的β-D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量即为一个葡萄糖氧化酶酶活性单位(U)；

所述的酿酒酵母yk18为2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述的酿酒酵母yk18发酵培养物的制备方法是：

a、生产菌种的制备：将低温保存的酿酒酵母yk18在平板种子培养基上活化，挑取单菌接种于含液体发酵培养基的试管中，32℃，200r/min摇床培养24小时后，以v/v计的2％转接于含液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18发酵培养种子液；

b、液体深层有氧发酵：在1000ml的三角瓶加入液体发酵培养基300ml,按v/v计的5％添加量加入液体发酵种子液15ml,32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18液体发酵培养液；

c、固体无氧发酵：在1000ml的三角瓶中加入固体发酵培养基200g，按质量比3％的添加量将酿酒酵母yk18液体发酵培养液6g加到含固体培养基的三角瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封瓶口，放于32℃恒温培养箱中培养48h，均匀散于瓷盘中，室温风干，粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×10⁸个/g，即为酿酒酵母yk18发酵培养物；

所述的种子平板培养基是：将10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml溶解于水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，调pH值6.5，制成斜面或平板培养基；

所述的种子液体培养基是：将酵母膏10g和蛋白胨20g溶解在900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml含20g葡萄糖灭菌溶液，调pH值6.5；

所述的液体发酵培养基是：称取麦芽汁培养基(市售)130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min；

所述的固体发酵培养基是：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基干物质的总质量添加3％硫酸铵，加水使培养基含水量达到68％，pH值6.5，121℃灭菌60mi；所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0％，其中麸皮：粗蛋白≥15.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％；玉米芯粉：粗蛋白≥2.2％，粗纤维﹤29.7％，粗灰分﹤6.0％；玉米粉：粗蛋白≥10.0％，粗纤维﹤9.0％，粗灰分﹤6.0％；豆粕粉：粗蛋白≥44.0％，粗纤维﹤5.0％，粗灰分﹤6.0％。

本发明含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂可有效用于高效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素，实现含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂在仔猪和肉鸡霉变饲料中的应用，方法简单，易生产制备，降解剂的酶活力强，葡萄糖氧化酶活力≥1000u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，是霉菌毒素生物降解剂应用上的创新，有显著的经济和社会效益。

具体实施方式

以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。

实施例1

本发明在具体实施中，一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，由质量比的葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1∶1混合均匀，经检测，葡萄糖氧化酶活力≥1000u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，即成霉菌毒素生物降解剂。

实施例2

本发明在具体实施中，一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，由质量比的葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1∶4混合均匀，经检测，葡萄糖氧化酶活力≥1000u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，即成霉菌毒素生物降解剂。

实施例3

本发明在具体实施中，一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，由质量比的葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1∶9制成，先将酿酒酵母yk18发酵培养物倒入混合机中，再将葡萄糖氧化酶喷洒到酿酒酵母yk18发酵培养物的表面，开机混合20分钟，待充分混合均匀后取样检测，当质量水分含量大于10％，在60℃温度条件下，干燥至含水量不大于10％，经检测，葡萄糖氧化酶活力≥1000u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，即成霉菌毒素生物降解剂。

由上述可以看出，本发明的目的是提供一种霉菌毒素生物降解剂，可有效降解黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素。

本发明所提供的霉菌毒素生物降解剂，包括下述主要成分：葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物。酿酒酵母yk18发酵培养物含酿酒酵母yk18活菌、酿酒酵母细胞壁及酿酒酵母发酵培养基。其中葡萄糖氧化酶酶活力≥1000u/g，酿酒酵母yk18活菌数≥1.0×10⁸个/g。

本发明涉及的葡萄糖氧化酶为市售饲料添加剂产品，分固体粉末状和液体两种剂型。

葡萄糖氧化酶是一类氧化酶制剂，主要成分为β-D葡萄糖氧化还原酶，辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸(维生素B2)，其作用是在细胞呼吸代谢中催化物质氧化还原反应。具有极强的解毒功能、抑菌作用、抗氧化效果，无任何毒副作用。产品被我国农业部批准为允许使用的饲料添加剂。

葡萄糖氧化酶不是一般意义上的消化酶或水解酶，作为催化剂主要参与体内葡萄糖氧化还原反应。对于霉菌及霉菌毒素有超强作用，原理在于：葡萄糖氧化酶对于产生霉菌毒素的黄曲霉、青霉、黑根霉等，具有强抑制作用。葡萄糖氧化酶参与体内氧化还原反应，加速动物代谢器官的代谢速度，对霉菌毒素有较强的解毒功效。葡萄糖氧化酶的辅基对黄曲霉毒素B1的功能性原子组具有强力破坏作用，对霉菌及霉菌毒素中毒有理想预防和治疗效果。

作为绿色安全的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶进入动物胃肠道，可使动物的消化道更易形成厌氧环境，促使厌氧有益菌的增殖，可起到酸化剂和益生菌的作用。通过消除肠道病菌生存环境，抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌的生长繁殖。通过提高巨噬细胞活性从而提高机体免疫力。葡萄糖氧化酶具有抗氧化作用，能清除自由基，保持肠道上皮细胞的完整，可以阻挡大量病原体的侵入。葡萄糖氧化酶有利于各种消化酶保持活性，有助于饲料的消化吸收，改善饲料适口性，在动物出现拒食、厌食、消化不良时可以使动物迅速恢复正常采食。

上述酿酒酵母yk18发酵培养物由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)yk18发酵培养所得。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae yk18于2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。系申请号201811370464.6《一种降解霉菌毒素的菌株yk18及其应用》发明专利的保藏菌株。

本发明以酿酒酵母yk18作为发酵菌株，在液体深层有氧发酵的基础上结合固体无氧发酵单位体积的活菌数产出量比液态发酵高，固体发酵培养物中代谢产物更加丰富，发酵培养基含水量低，不需要废水处理，环境污染少的优势，进行酿酒酵母菌固体发酵培养。在发酵培养过程中，通过酿酒酵母自溶技术处理，使得一部分酿酒酵母菌有效破碎和酵母细胞物质彻底释放并溶入培养基中，经低温干燥处理得到富含酿酒酵母活菌、酿酒酵母细胞壁和酿酒酵母发酵培养基的酿酒酵母yk18发酵培养物。

本发明酿酒酵yk18活菌在动物胃肠道内对霉菌有抑制作用，对霉菌毒素有降解作用。动物胃肠道内寄生了大量的微生物，这些微生物在合适的营养底物下能够保持正常的生长代谢，这将有利于维护各菌系之间的代谢平衡并为动物胃肠道消化吸收功能提供一个良好的微生态环境，使得日粮中的各种养分在胃肠道内能被充分吸收和利用，实现养殖效益的最大化。酿酒酵母yk18为兼性厌氧菌，在动物体内生长繁殖，能消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，并代谢产生乳酸等有机酸，从而有利于乳酸菌等有益菌的生长，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长，可改善胃肠道环境和菌群结构，促进胃肠道对营养物质的消化、吸收和利用。厌氧环境同时可以降低好氧菌对蛋白质的分解，降低动物体内胺和氨的浓度。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽都是重要的抗氧化剂和自由基消除剂。酵母菌体内的超氧化物歧化酶(SOD)可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。谷胱甘肽在酵母细胞内含量较高，可消除自由基，能起到强有力的保护作用。谷胱甘肽还具有整合解毒作用，能与体内的霉菌毒素等有毒有害的物质相结合，并促进其排出体外，起到中和解毒作用。

本发明酿酒酵母yk18的细胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白和几丁质组成，对霉菌毒素具有很强的吸附性。酿酒酵母细胞壁对霉菌毒素的吸附能力主要是由于酵母细胞壁的特殊结构对霉菌毒素产生吸附力。酿酒酵母细胞壁的解毒机理就是细胞壁的葡聚糖和甘露聚糖捕获霉菌毒素，从而阻止动物胃肠道对霉菌毒素的吸收，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响。酵母细胞壁作为一种生物活性物质，一方面对霉菌毒素具有降解、分解和吸附作用，另一方面作为免疫促进剂，通过激发和增强机体免疫力，改善动物健康，减轻霉菌毒素对动物生产性能的影响。

本发明酿酒酵母yk18发酵培养基是一种含有酿酒酵母菌赖以生长的培养基经酵母培养和生物转化的产品。它营养丰富，含有维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸，适口性好。酿酒酵母菌代谢能产生多种酶，降解饲料中的抗营养因子，降低肠道内食糜粘度，促进胃肠对营养物质的消化、吸收和利用，提高饲料利用率。酵母细胞富含畜禽生长需要的多种营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素和激素等。蛋白质含量达到45％～60％，可以和大豆蛋白相媲美；氨基酸组成合理，动物必需的8种氨基酸含量均很高，尤其是赖氨酸、色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等几种重要的必需氨基酸含量较高，因此对赖氨酸含量较低的谷物是非常有效的补充物；富含B族维生素如烟酸、胆碱、核黄素、泛酸、叶酸等，一直被认为是天然B族维生素的丰富来源，VB2以结合形式存在，动物体对其吸收率可达60％以上，是一种理想的VB2补充源；含有丰富的矿物质(6％～9％)，如钾、镁、磷、铁、锌、锰等；以及含核酸(6％～8％)、生理活性物质(1％～2％)等，为动物提供多种营养成分。此外，酵母培养基中含有未知生长因子，具有促生长作用。

本发明由葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物创制的霉菌毒素生物降解剂可有效降解饲料原料和饲料产品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素的毒性，又可将降解后的低毒或无毒的物质吸附起来，随动物代谢排出体外，彻底消除或减轻霉菌毒素对动物的危害。

要说明的是，上述给出的仅是实施例，是用于说明本发明的具体实施方式，而不是用于限制本发明的保护范围，根据本发明的思路和原则，还可以有许多变形，凡是采用等同、等效替换手段所做出的本质上与本发明相同的技术方案或本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

本发明经实验和实际应用，效果非常好，有关实验资料如下：

实验1霉菌毒素生物降解剂对仔猪霉变饲料和生产性能的影响实验

1.材料和方法

1.1试验动物

本试验于2018年4月9日—2018年5月13日在河南省诸美种猪育种集团有限公司进行，试验期为35天。试验仔猪由河南省诸美种猪育种集团有限公司提供的杜长大仔猪，选取20窝杜长大仔猪，随机分为2组，每组10窝，7日龄饲喂开食料，21日龄断奶，仔猪料为常规饲料，由本场自配。试验组添加0.2％的霉菌毒素生物降解剂。对照组和试验组仔猪均采取高床饲养，试验期间进行有关资料的记录与收集，包括：初生重，7日龄、21日龄、35日龄窝重，仔猪腹泻头数，饲料采食量等。

1.2霉菌毒素生物降解剂

葡萄糖氧化酶酶活力≥1000u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g。

1.3试验日粮

试验的基础日粮配方见表1。基础日粮被霉菌毒素污染，经检测含黄曲霉毒素B120μg/kg、玉米赤霉烯酮180μg/kg、呕吐毒素1600μg/kg、T-2毒素600μg/kg，分别超过国标100％、20％、60％、20％。

表1试验仔猪日粮配方及营养水平(％)

日粮原料组成	对照组日粮	实验组日粮
			玉米	53.50	53.50
膨化大豆	15.00	15.00
			豆粕	15.00	15.00
进口鱼粉	6.00	6.00
			乳清粉	5.00	5.00
豆油	2.00	2.00
			赖氨酸	0.15	0.15
蛋氨酸	0.15	0.15
			磷酸氢钙	1.00	1.00
石粉	0.90	0.70
			霉菌毒素生物降解剂	0.00	0.20
食盐	0.30	0.30
			预混料	1.00	1.00
合计	100.00	100.00
			消化能(MJ/kg)	10.46	10.46
粗蛋白	20.00	20.00
			赖氨酸	1.21	1.21
蛋氨酸+胱氨酸	0.67	0.67
			钙	0.82	0.82
总磷	0.65	0.65

注：1％预混料每千克含铜420mg,铁5000mg，锌6000mg，锰1000mg，维生素A180000IU,维生素D₃25000IU,维生素E5000IU,维生素K₃160mg,维生素B₂500mg。消化能为计算值，其余均为实测值。

1.4样品的采集

1.4.1饲料

试验和对照组饲料分别取样，风干后粉碎，过80目筛，制成分析样品500g，保存于干燥器中，置于阴凉干燥处，备用。

1.4.2粪样

试验期间第21天、第35天以组为单位收集猪粪样品，早晚分别手持塑料盆直接于仔猪***处收集新鲜粪样，以组为单位充分混匀，在60℃烘箱内烘干。用植物样品粉碎机粉碎，过80目筛，制成分析样品500g，装入样品袋，置于阴凉干燥处，备用。

1.5数据处理与统计分析

应用Excel对实验数据进行预处理，再用SPSS进行单因素方差分析，并用LSD进行多重比较。

2.试验结果分析

2.1.霉菌毒素生物降解剂对仔猪日粮霉菌毒素的降解效果

2.1.1霉菌毒素的检测

2.1.1.1仪器设备

511酶标分析仪(上海第一分析仪器厂)，震荡器(北京长安科学仪器厂)，样品粉碎机，微量移液器，量筒、容量瓶等。

2.1.1.2试剂

黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW022.02)，玉米赤霉烯酮酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW055.01)，呕吐毒素酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW070.01)，T2毒素检测试剂盒ELISA酶联免疫试剂盒(长沙安迪生物科技有限公司，96T)。试剂盒提供的试剂：标准溶液、抗体溶液、酶标物、显色液、终止液、浓缩洗涤液、空白对照。自备物品：氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、蒸馏水。

2.1.1.3样品中霉菌毒素的检测

饲料和粪样样品中的黄曲霉毒素B1含量的测定，参照AFB1酶联免疫试剂盒说明书进行；玉米赤霉烯酮含量的测定，参照ZEN酶联免疫试剂盒说明书进行；呕吐毒素含量的测定，参照DON酶联免疫试剂盒说明书进行；T-2毒素含量的测定，参照T-2酶联免疫试剂盒说明书进行。猪粪样品中霉菌毒素的含量见表2。

表2猪粪样品中霉菌毒素的含量(单位：μg/kg％)

注：A,B同列比较，上标无字母相同者示差异显著(P＜0.01)。

2.1.2结果与分析

在仔猪霉变饲料日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组猪粪样品中黄曲霉毒素B1降解率为41.5％，添加0.2％霉菌毒素生物降解剂组猪粪样品中黄曲霉毒素B1降解率为85.0％，添加霉菌毒素生物降解剂降解黄曲霉毒素B1效果显著。

在仔猪霉变饲料日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组猪粪样品中玉米赤霉烯酮降解率为59.2％，添加0.2％霉菌毒素生物降解剂组猪粪样品中玉米赤霉烯酮降解率为82.5％，添加霉菌毒素生物降解剂降解玉米赤霉烯酮效果显著。

在仔猪霉变饲料日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组猪粪样品中呕吐毒素降解率为64.9％，添加0.2％霉菌毒素生物降解剂组猪粪样品中呕吐毒素降解率为84.1％，添加霉菌毒素生物降解剂降解呕吐毒素效果显著。

在仔猪霉变饲料日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组猪粪样品中T-2毒素降解率为84.3％，添加0.2％霉菌毒素生物降解剂组猪粪样品中T-2毒素降解率为97.3％，添加霉菌毒素生物降解剂降解T-2毒素效果显著。

2.2霉菌毒素生物降解剂对仔猪增重的影响

试验结果见表3。从试验开始到试验结束，试验组仔猪的初生重、7日龄、21日龄、35日龄平均体重与对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)，就其各试验时间段平均日增重比较，添加霉菌毒素生物降解剂组仔猪在断奶前采食量少而导致日增重有低于对照组的趋势(243.60±21.83对248.00±45.25，P＞0.05)。断奶后经过断奶、免疫、去势的应激，添加霉菌毒素生物降解剂组的试验猪表现出高于对照组的趋势(试验组146.85±35.07，对照组142.17±46.80，P＞0.05)。

表3霉菌毒素生物降解剂对仔猪生长性能的影响(头、kg、g)

项目	对照组	试验组
			带仔头数	11.65±1.03	10.78±1.63
初生重	1.26±0.17	1.40±0.61
			7日龄重	2.35±0.31	2.41±0.31
21日龄重	5.90±0.71	5.97±0.54
			35日龄重	7.82±0.61	7.96±0.77
0-7日增重	139.83±42.46	140.49±27.36
			8-21日增重	248.00±45.25	243.60±21.83
22-35日增重	142.17±46.80	146.85±35.07
			8-35日增重	196.08±22.35	196.27±21.89
0-35日增重	185.85±21.30	186.14±20.21

2.3霉菌毒素生物降解剂对仔猪料肉比的影响

由表4所示，添加霉菌毒素生物降解剂组与对照组日增重差异不明显，但添加霉菌毒素生物降解剂组8-21日龄采食量比对照组减少了55.7％(P＜0.05)，22-35日龄采食量比对照组减少了29.6％(P＜0.05)，8-35日龄饲料采食量比对照组减少了25.4％(P＜0.05)。饲喂霉菌毒素生物降解剂组8-21日龄料肉比比对照组降低了52.9％(P＜0.05)，22-35日龄料肉比比对照组降低了44.0％(P＜0.05)，8-35日龄料肉比比对照组降低了25.5％(P＜0.05)，可见霉菌毒素生物降解剂具有明显的提高仔猪饲料利用率的优势，这对于养猪行业具有直接的经济效益。

表4霉菌毒素生物降解剂对仔猪饲料利用率的影响(g、％)

注：a,b同列比较，上标无字母相同者表示差异显著(P＜0.05)

2.4霉菌毒素生物降解剂对仔猪腹泻的影响

试验仔猪腹泻发生情况见表5。0到7天，试验组仔猪的总腹泻率比对照组高1.43个百分点(高18.62％，P＞0.05)；8日龄至21日龄断奶期间，霉菌毒素生物降解剂组腹泻比对照组低0.45个百分点(低36.29％,P＞0.05)；断奶后2周内，试验组仔猪的腹泻率更是比对照组低了0.82个百分点(低136.67％,P＜0.01)；试验期内，霉菌毒素生物降解剂组腹泻比对照组低0.23个百分点(低7.8％,P＞0.05)。霉菌毒素生物降解剂具有明显提高仔猪的抗病性能。

表5霉菌毒素生物降解剂对仔猪腹泻的影响

组别	0-7天	8-21天	22-35天	0-21天	0-35天
						对照组	6.25	1.69	1.42<sup>A</sup>	4.25	3.18
试验组	7.68	1.24	0.60<sup>B</sup>	4.44	2.95
						差异	1.43	-0.45	-0.82	0.19	-0.23
％	18.62	-36.29	-136.67	4.28	-7.8

注：A,B同列比较，上标无字母相同者示差异显著(P＜0.01)。

3.结论

在仔猪的霉变饲料的日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组猪粪样品中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素平均降解率分别为41.5％、59.2％、64.9％、84.3％，添加0.2％霉菌毒素生物降解剂组猪粪样品中霉菌毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T-2毒素平均降解率分别为85.0％、82.5％、84.1％、97.3％，添加霉菌毒素生物降解剂降解霉菌毒素效果显著。

试验期间，添加霉菌毒素生物降解剂组仔猪在断奶前采食量少而导致日增重有低于对照组的趋势。断奶后经过断奶、免疫、去势的应激，添加霉菌毒素生物降解剂组的试验猪表现出高于对照组的趋势。霉菌毒素生物降解剂具有明显的提高仔猪饲料利用率，直接增加养猪行业的经济效益。试验期间，霉菌毒素生物降解剂显著降低了仔猪的发病率，明显增强了仔猪的抗病性能。

实验2霉菌毒素生物降解剂对肉鸡日粮霉菌毒素的降解效果

1.材料与方法

1.1试验时间和地点

试验2018年9月20日至2018年10月31日在河南武陟尚武养殖场进行。

1.2试验动物与实验设计

选取1日龄健康AA肉鸡600羽，随机分成2组，每组3个重复，每个重复100羽。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮中含0.1％霉菌毒素生物降解剂。基础日粮被霉菌毒素污染，经检测基础日粮含黄曲霉毒素B1 30μg/kg、玉米赤霉烯酮600μg/kg、呕吐毒素4500μg/kg、T-2毒素550μg/kg，分别超过国标50％、20％、50％、10％。

1.3霉菌毒素生物降解剂

葡萄糖氧化酶酶活力≥1000u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g。

1.4试验日粮及饲料管理

基础日粮配方及成分含量如表1。试验鸡采用层叠笼饲养，自由饮水，自由采食，24小时连续光照，并按常规程序进行严格免疫。

表1试验基础日粮配方及养分含量

5％预混料	5	5
			营养水平(％)	/	/
ME(Mcal/kg)	12.12	12.54
			Cp	21	19
Ca	0.9	0.85
			Ap	0.48	0.43
Lys	0.98	0.88
			Met+Cys	0.77	0.67

注：试验组5％预混料含氨基酸、微量元素、维生素、霉菌毒素生物降解剂等。

1.5样品的采集

1.5.1饲料

试验和对照组饲料分别取样，风干后粉碎，过80目筛，制成分析样品500g，保存于干燥器中，置于阴凉干燥处，备用。

1.5.2粪样

试验期间第21天、第42天以组为单位收集鸡粪样品。早晚分别收集新鲜粪样，以组为单位充分混匀，在60℃烘箱内烘干。用植物样品粉碎机粉碎，过80目筛，制成分析样品500g，装入样品袋，置于阴凉干燥处，备用。

2.试验结果分析

2.1.霉菌毒素生物降解剂对肉鸡日粮霉菌毒素的降解效果

2.1.1霉菌毒素的检测

2.1.1.1仪器设备

511酶标分析仪(上海第一分析仪器厂)，震荡器(北京长安科学仪器厂)，样品粉碎机，微量移液器，量筒、容量瓶等。

2.1.1.2试剂

黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW022.02)，玉米赤霉烯酮酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW055.01)，呕吐毒素酶联免疫试剂盒(北京维德维康生物技术有限公司，KITW070.01)，T2毒素检测试剂盒ELISA酶联免疫试剂盒(长沙安迪生物科技有限公司，96T)。试剂盒提供的试剂：标准溶液、抗体溶液、酶标物、显色液、终止液、浓缩洗涤液、空白对照。自备物品：氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、蒸馏水。

2.1.1.3样品中霉菌毒素的检测

饲料和粪样样品中的黄曲霉毒素B1含量的测定，参照AFB1酶联免疫试剂盒说明书进行；玉米赤霉烯酮含量的测定，参照ZEN酶联免疫试剂盒说明书进行；呕吐毒素含量的测定，参照DON酶联免疫试剂盒说明书进行；T-2毒素含量的测定，参照T-2酶联免疫试剂盒说明书进行。肉鸡粪样品中霉菌毒素的含量见表2。

表2肉鸡粪样品中霉菌毒素的含量(单位：μg/kg％)

2.1.2结果与分析

在肉鸡的霉变饲料的日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组鸡粪黄曲霉毒素B1降解率为52.0％，添加0.1％霉菌毒素生物降解剂组鸡粪样品中黄曲霉毒素B1降解率为91.0％，添加霉菌毒素生物降解剂降解黄曲霉毒素B1效果显著。

在肉鸡的霉变饲料的日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组鸡粪玉米赤霉烯酮降解率为79.8％，添加0.1％霉菌毒素生物降解剂组鸡粪样品中玉米赤霉烯酮降解率为97.6％，添加霉菌毒素生物降解剂降解玉米赤霉烯酮效果显著。

在肉鸡的霉变饲料的日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组鸡粪呕吐毒素降解率为64.1％，添加0.1％霉菌毒素生物降解剂组鸡粪样品中呕吐毒素降解率为89.9％，添加霉菌毒素生物降解剂降解呕吐毒素效果显著。

在肉鸡的霉变饲料的日粮中添加霉菌毒素生物降解剂，对照组鸡粪T-2毒素降解率为66.7％，添加0.1％霉菌毒素生物降解剂组鸡粪样品中T-2毒素降解率为93.6％，添加霉菌毒素生物降解剂降解T-2毒素效果显著。

以上充分表明，本发明制备方法易操作，生产效率高，所得产品霉菌毒素生物降解剂葡萄糖氧化酶酶活力≥1000u/g，酿酒酵母yk18活菌数高，可高达1.0×10⁸个/g以上，对黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素的降解率可高达82％以上，有效用于仔猪和肉鸡霉变饲料，保证仔猪和肉鸡的健康生长，有显著的经济和社会效益。

Claims (5)

1.一种含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，其特征在于，是由质量比：葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1︰1～9混合均匀制成，霉菌毒素生物降解剂中葡萄糖氧化酶活力≥1000 u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g；

所述的葡萄糖氧化酶为粉末状饲料添加剂葡萄糖氧化酶，酶活力≥5000 u/g，或液体饲料添加剂葡萄糖氧化酶，酶活力≥10000 u/mL；葡萄糖氧化酶的酶活力定义为在pH为6.0，温度为30℃的有氧条件下，每分钟催化1μmol的β-D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量即为一个葡萄糖氧化酶酶活性单位（U）；

所述的酿酒酵母yk18为2018年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：16598的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述的酿酒酵母yk18发酵培养物的制备方法是：

a、生产菌种的制备：将低温保存的酿酒酵母yk18在平板种子培养基上活化，挑取单菌接种于含液体发酵培养基的试管中，32℃，200r/min摇床培养24小时后，以v/v计的2%转接于含液体发酵培养基的500ml的三角瓶中，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18发酵培养种子液；

b、液体深层有氧发酵：在1000ml的三角瓶加入液体发酵培养基300ml，按v/v计的5%添加量加入液体发酵种子液15mL，32℃，200r/min摇床培养24h，得到酿酒酵母yk18液体发酵培养液；

c、固体无氧发酵：在1000ml的三角瓶中加入固体发酵培养基200g，按质量比3％的添加量将酿酒酵母yk18液体发酵培养液6g加到含固体培养基的三角瓶中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，密封瓶口，放于32℃恒温培养箱中培养48h，均匀散于瓷盘中，室温风干，粉碎过60-80目筛，经检测含酿酒酵母活菌≥2.5×10⁸个/g，即为酿酒酵母yk18发酵培养物；

所述的种子平板培养基是：将10g酵母膏和20g蛋白胨于900ml溶解于水中，加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，加入100ml 含20g葡萄糖灭菌溶液，调pH值6.5，制成斜面或平板培养基；

所述的种子液体培养基是： 将酵母膏10g和蛋白胨20g溶解在900ml水中，121℃灭菌20min，加入100ml 含20g葡萄糖灭菌溶液，调pH值6.5；

所述的液体发酵培养基是：称取麦芽汁培养基130.1g，加入蒸馏水或去离子水1000ml，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃灭菌20min；

所述的固体发酵培养基是：按质量配比麸皮∶玉米芯粉∶玉米粉∶豆粕粉＝4﹕2﹕2﹕2,按培养基干物质的总质量添加3%硫酸铵，加水使培养基含水量达到68%，pH值6.5，121℃灭菌60mi；所述的麸皮、玉米芯粉、玉米粉、豆粕粉均过80目筛，含水量﹤10.0%，其中麸皮：粗蛋白≥15.0%，粗纤维﹤9.0%，粗灰分﹤6.0%；玉米芯粉：粗蛋白≥2.2%，粗纤维﹤29.7%，粗灰分﹤6.0%；玉米粉：粗蛋白≥10.0%，粗纤维﹤9.0%，粗灰分﹤6.0%；豆粕粉：粗蛋白≥44.0%，粗纤维﹤5.0%，粗灰分﹤6.0%。

2.根据权利要求1所述的含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，其特征在于，由质量比的葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1∶1混合均匀，经检测，葡萄糖氧化酶活力≥1000 u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，即成霉菌毒素生物降解剂。

3.根据权利要求1所述的含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，其特征在于，由质量比的葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1∶4混合均匀，经检测，葡萄糖氧化酶活力≥1000 u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，即成霉菌毒素生物降解剂。

4.根据权利要求1所述的含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂，其特征在于，由质量比的葡萄糖氧化酶和酿酒酵母yk18发酵培养物1∶9制成，先将酿酒酵母yk18发酵培养物倒入混合机中，再将葡萄糖氧化酶喷洒到酿酒酵母yk18发酵培养物的表面，开机混合20分钟，待充分混合均匀后取样检测，当质量水分含量大于10%，在60℃温度条件下，干燥至含水量不大于10%，经检测，葡萄糖氧化酶活力≥1000 u/g，酿酒酵母活菌数≥1.0×10⁸个/g，即成霉菌毒素生物降解剂。

5.权利要求1～4任一项所述的含葡萄糖氧化酶和酿酒酵母的霉菌毒素生物降解剂在高效降解仔猪和肉鸡霉变饲料中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和T-2毒素中的应用。