CN115926211A - 交联剂、凝胶中间体及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种交联剂及其在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途，还公开一种凝胶中间体及其在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。利用本申请的交联剂、凝胶中间体制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶的工艺简单、透析时间短、能耗低、不产生副产物，利用本申请的交联剂、凝胶中间体制备的注射用黏附性透明质酸钠凝胶，具有良好的机械性能，易于注射，与组织结合力强，不会发生明显组织内位移，且生物相容性良好。

Description

交联剂、凝胶中间体及其用途

本案是申请日为2021年1月12日，发明名称为一种注射用黏附性透明质酸钠凝胶及其制备方法，申请号为CN202110038748.0的案件的分案申请。

技术领域

本申请属于交联透明质酸技术领域。具体涉及一种交联剂及其用途和凝胶中间体及其用途。

背景技术

透明质酸是天然高分子多糖，是细胞外基质的组成之一，生物相容性优越，且具有良好的保湿性，被称为优良的天然保湿因子，已被广泛地用于医美、组织工程、再生医学和医疗器械等领域。目前注射用透明质酸钠凝胶多为BDDE作为交联剂的透明质酸钠凝胶，使用BEED交联过程简单，适合工业化生产，且体内代谢路径清晰安全，因而被广泛采用。

目前使用的注射用透明质酸钠凝胶，主要为以BDDE为交联剂，透明质酸钠为原料交联得到的凝胶，其与体内组织之间无相互作用，不会与组织之间形成紧密的结合；同时，当注射到嘴唇、眼角等易于活动的部位时，由于机械力的拉扯，会破坏凝胶结构，并且在力的作用下，凝胶会发生滑移，转移到组织中不易受力的部位，影响了注射凝胶对于特定部位的填充、美容功能。

现有技术中，Krum Kafedjiiski等人的文献“Synthesis and in vitroevaluation ofthiolated hyaluronic acid for mucoadhesive drug delivery”中公开了一种透明质酸与半胱氨酸乙酯交联产物，在活化剂EDAC和NHS存在的情况下，HA和半胱氨酸乙酯酰胺键共价接枝，形成HA-Cys，其巯基含量高，因此，凝胶黏附性强。再在氧气条件下进行交联反应，形成一种具有黏附性的透明质酸凝胶。但是此反应在后处理过程中需要经过长时间透析除去活化剂和未参与反应的胱氨酸乙酯，反应过程复杂，不利于进行注射填充。

发明内容

为解决上述注射用透明质酸钠凝胶与组织之间亲和力不强的问题，本申请提供了一种制备可注射用黏附性透明质酸钠凝胶的交联剂和凝胶中间体，本申请制备的透明质酸钠凝胶，其不仅具有良好的黏弹性，同时具有优良的组织黏附性，可有效防止其注射到体内后发生位移，而且，本申请制备的注射用透明质酸钠凝胶仍保持良好的生物相容性。

本申请的具体技术方案如下：

1、一种注射用黏附性透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：

合成交联剂A：合成含有二硫键的交联剂A；

交联：将透明质酸钠与所述交联剂A以及交联剂B进行反应得到凝胶L；

制备凝胶M：使用谷胱甘肽处理所述凝胶L得到凝胶M；

处理凝胶M：将凝胶M进行透析，得到所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

2、根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述合成交联剂A步骤中，以胱氨酸和1,4-丁二醇二缩水甘油醚为原料，在碱性条件下反应，生成结构式为

的交联剂A；

优选地，所述合成交联剂A步骤中，所述胱氨酸与所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚的物质的量之比为1:2～3，优选为1:2.3；

优选地，所述合成交联剂A步骤中，所述交联剂A的合成温度为10～30℃。

3、根据项1或2所述的制备方法，其特征在于，所述交联步骤中，所述交联剂A与所述透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.03～0.075:1。

4、根据项1～3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述交联步骤中，所述交联剂B为1,4-丁二醇二缩水甘油醚或类乙二醇类化合物

优选地，所述交联步骤中，所述交联剂B与所述透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.03～0.075:1；

优选地，所述交联步骤中，所述交联剂A与所述交联剂B的物质的量之比为0.5～1:1。

5、根据项1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述交联步骤中，将所述透明质酸钠与所述交联剂A以及所述交联剂B在pH>9的条件下进行反应得到所述凝胶L；

优选地，所述交联步骤中，所述透明质酸钠的分子量为300～800kDa。

6、根据项1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备凝胶M步骤中，所述谷胱甘肽浓度为10～30mmol/L。

7、根据项1～6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备凝胶M步骤中，所述凝胶L在含有谷胱甘肽的碱性或中性的缓冲液中进行透析，得到所述凝胶M；

优选地，所述处理凝胶M步骤中，将所述凝胶M在pH为7.2～7.7的缓冲液中进行透析，得到所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

优选地，所述处理凝胶M步骤中，所述透析时间为6～72h。

8、根据项1～7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述处理凝胶M步骤中，将所述凝胶M进行透析，然后加入麻醉剂，优选为酯类或酰胺类局部麻醉剂，得到所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

9、一种注射用黏附性透明质酸钠凝胶，其特征在于，其包含具有式(I)所示结构的化合物；

优选地，a为4～1117，b为4～1117，c为65～5211；

更优选地，a为44～298，b为45～298，c为655～1390。

10、根据项9所述的透明质酸钠凝胶，其特征在于，其是利用项1～8中任一项所述的方法制备得到的。

11、一种交联剂，其特征在于，其结构式为

12、项11所述的交联剂在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。

13、一种凝胶中间体，其特征在于，其包含具有下式所示结构的化合物：

14、根据项13所述的凝胶中间体，其特征在于，a为4～1117，b为4～1117，c为65～5211。

15、根据项14所述的凝胶中间体，其特征在于，a为44～298，b为45～298，c为655～1390。

16、项13～15中任一项所述的凝胶中间体在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。

发明的效果

本申请采用含有二硫键的环氧交联剂A以及1,4-丁二醇二缩水甘油醚或类乙二醇类化合物

与透明质酸钠进行交联，再使用谷胱甘肽进行处理，并进一步限定各反应物质之间的物质的量之比，得到的注射用黏附性透明质酸钠凝胶，具有良好的机械性能，易于注射，与组织结合力强，不会发生明显组织内位移，且生物相容性良好。本申请的制备工艺简单，透析时间短，能耗低，不产生副产物，无污染，易于产业化生产。

附图说明

图1为本申请的注射用黏附性透明质酸钠凝胶黏附性测试方法示意图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本申请的具体实施方式。需要说明的是，在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

一方面，本申请提供一种交联剂，其特征在于，其结构式为

在一个具体实施方式中，所述交联剂通过下述步骤合成：以胱氨酸

和1,4-丁二醇二缩水甘油醚

为原料，在碱性条件下发生环氧化合物的开环反应，生成结构式为

的交联剂。

另一方面，本申请还提供一种上述交联剂在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。

一方面，本申请提供一种凝胶中间体，其特征在于，其包含具有下式所示结构的化合物：

在一个具体实施方式中，所述凝胶中间体中，a选自4～1117，例如可为4、10、44、50、100、200、250、298、300、400、500、600、700、800、900、1000、1110、1117等，b选自4～1117，例如可为4、10、44、50、100、200、250、298、300、400、500、600、700、800、900、1000、1110、1117等，c选自65～5211，例如可为65、100、300、600、655、1000、1390、2000、3000、4000、5000、5211等。

在一个具体实施方式中，所述凝胶中间体中，a选自44～298，b选自44～298，c选自655～1390。

在一个具体实施方式中，所述凝胶中间体通过下述步骤合成：将透明质酸钠与所述结构式为

的交联剂以及1,4-丁二醇二缩水甘油醚或类乙二醇类化合物

进行反应得到所述凝胶中间体，n例如可为1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45等。

又一方面，本申请还提供前述任一种凝胶中间体在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。

一方面，本申请提供一种注射用黏附性透明质酸钠凝胶的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：

合成交联剂A：合成含有二硫键的交联剂A；

交联：将透明质酸钠与所述交联剂A以及交联剂B进行反应得到凝胶L；

制备凝胶M：使用谷胱甘肽处理所述凝胶L得到凝胶M；

处理凝胶M：将凝胶M进行透析，得到所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

本申请中的“谷胱甘肽”(GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫***功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为其活性基团，可与二硫键发生氧化还原反应，将二硫键还原为自由巯基，自身形成氧化型谷胱甘肽。

本申请中的“透析”是指小分子透过凝胶本体扩散到水(或缓冲液)的原理，将未与透明质酸反应的交联剂除去的分离纯化技术。

本申请中的“黏附性”是指凝胶与组织的亲合能力，如图1所示，其通过将新鲜猪皮固定于载玻片上，带有皮下组织的猪皮内侧向外，再取成品凝胶均匀涂抹于猪皮内侧组织上，将两块负载凝胶的载玻片搭接静置一段时间后，负重砝码，使用秒表计时两块载玻片完全分离的时间，由上述分离时间来表征黏附性。

本申请的制备方法，首先合成一个交联剂A，再利用该交联剂A和交联剂B与透明质酸钠进行交联反应，通过两步反应分别控制各反应中的原料比例，使得确定最终的注射用黏附性透明质酸钠凝胶的交联度的同时，还能确保注射用黏附性透明质酸钠凝胶的黏附性，可有效防止注射到体内后发生位移，且具有良好的生物相容性。采用本申请的制备方法进行黏附性透明质酸钠凝胶制备，在可赋予凝胶黏附特性的同时，不需要经过长时间的透析除去活化剂和未参与反应的物质，也不存在副产物，反应过程简单，透析时间短，制备工艺时间短，有利于进行工业化生产。现有技术使用半胱氨酸对透明质酸进行修饰，此过程需要用到大量活化剂，后处理过程中需要对其进行去除，所需透析时间较长，且也无法确保最终能引入巯基至透明质酸钠凝胶中赋予凝胶黏附性。本申请所合成的交联剂A，其与透明质酸反应机理与1,4-丁二醇二缩水甘油醚相同，均为环氧基团与透明质酸中活性羟基发生开环反应，因此合成步骤简单、高效，产品产率高。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述合成交联剂A步骤中，以胱氨酸

和1,4-丁二醇二缩水甘油醚

为原料，在碱性条件下发生环氧化合物的开环反应，生成结构式为

的交联剂A；所述交联步骤中，所述交联剂B为1,4-丁二醇二缩水甘油醚或类乙二醇类化合物

n例如可为1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20、25、30、35、40、45等。

交联剂A的合成技术路线如下所示：

凝胶L及M的合成技术路线如下所示，本申请的黏附性透明质酸钠凝胶即由下述合成技术路线得到：

本申请中的“胱氨酸”是一种含二硫键的氨基酸，可与谷胱甘肽等还原剂发生氧化还原反应形成自由巯基。

本申请中的“1,4-丁二醇二缩水甘油醚”(BDDE)为含1,4-丁二醚链的环氧树脂，属水溶性环氧树脂，黄色透明液体，环氧值0.63～0.74，黏度15～20mPa·s，其由1,4-丁二醇与环氧氯丙烷缩聚制得。

在该具体实施方式中，可以通过交联以及制备凝胶M的步骤来控制最终的注射用黏附性透明质酸钠凝胶中巯基的含量，确保达到应用所需的凝胶的黏附性。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述合成交联剂A步骤中，所述胱氨酸与所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚的物质的量之比为1:2～3，例如可为1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.5、1:2.7、1:2.9、1:3等，优选为1:2.3。将胱氨酸与所述1,4-丁二醇二缩水甘油醚的物质的量之比控制在上述范围内，制得的交联剂A纯度较高。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述合成交联剂A步骤中，所述交联剂A的合成温度为10～30℃，例如可为10℃、12℃、14℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述交联步骤中，所述交联剂A与所述透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.03～0.075:1，例如可为0.03:1、0.035:1、0.04:1、0.045:1、0.05:1、0.055:1、0.06:1、0.065:1、0.07:1、0.075:1等。

本申请的“透明质酸钠重复单元”是指透明质酸钠中由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的二糖重复单元。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述交联步骤中，所述交联剂B与所述透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.03～0.075:1，例如可为0.03:1、0.035:1、0.04:1、0.045:1、0.05:1、0.055:1、0.06:1、0.065:1、0.07:1、0.075:1等；

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述交联剂A与所述交联剂B的物质的量之比为0.5～1:1，例如可为0.5:1、0.55:1、0.6:1、0.65:1、0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.85:1、0.9:1、0.95:1、1:1等。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述交联步骤中，将所述透明质酸钠与所述交联剂A以及所述交联剂B在pH>9(例如可为9.1、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14等)的条件下进行交联反应得到所述凝胶L，所述透明质酸钠的分子量为300～800kDa，例如可为300kDa、350kDa、400kDa、500kDa、700kDa、800kDa等，透明质酸分子量太低，交联后形成的凝胶力学强度低，起不到填充的作用；分子量太高，交联形成的凝胶力学强度高，但其黏度也高，不易进行注射。因此本发明选择上述范围内的透明质酸。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述交联步骤中，将所述透明质酸钠溶于质量分数为1.0％～1.5％的NaOH溶液中，得到透明质酸钠溶液，将所述交联剂A和所述交联剂B混合后加入到所述透明质酸钠溶液中，于25～55℃中进行交联反应7～9小时，得到所述凝胶L。在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述交联步骤后，所述制备凝胶M步骤前，还包括破碎步骤：将所述凝胶L使用机械力破碎，过筛，得到微粒状凝胶A；所述制备凝胶M步骤中，使用谷胱甘肽处理所述微粒状凝胶A得到所述凝胶M。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述制备凝胶M步骤中，所述凝胶L在含有谷胱甘肽的碱性或中性的缓冲液中进行透析，得到所述凝胶M。谷胱甘肽可将交联剂A中二硫键还原为巯基，使得最终凝胶具有黏附性，具体操作为：将凝胶L转移至侧壁具有网孔及侧盖的桶中，加入一定量的含有谷胱甘肽的缓冲液，低速搅拌持续6-8h后，将侧盖打开，透析液透过网孔流走，凝胶L保留在桶中，继续加入新鲜缓冲液再次透析，整个透析过程持续6-72h，所述谷胱甘肽浓度为10～30mmol，例如可为10mmol、13mmol、15mmol、17mmol、20mmol、23mmol、25mmol、27mmol、30mmol等，优选为15mmol。在该具体实施方式中，所述缓冲液可为磷酸盐缓冲液等。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述处理凝胶M步骤中，将所述凝胶M在pH为7.2～7.7的缓冲液中进行透析，得到所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶。所述pH例如可为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7等，优选为7.4。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述制备凝胶M步骤中，所述透析时间为6～72h，例如可为6h、12h、24h、48h、60h、72h等，优选为24～48h；所述处理凝胶M步骤中，所述透析时间为6～72h，例如可为6h、12h、24h、48h、60h、72h等，优选为24～48h。

在一个具体实施方式中，本申请的制备方法，所述制备凝胶M步骤中，所述凝胶L在含有谷胱甘肽的碱性或中性的缓冲液中进行透析，然后加入酯类或酰胺类局部麻醉剂，再过50～70目的筛网，后灌装于注射器中，于115～125℃湿热灭菌15～20分钟，得到所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

本申请中的“局部麻醉剂”在化学结构上由三部分组成，即芳香族环、中间链和胺基团，中间链可为酯链或酰胺链。根据中间链的结构，可将局部麻醉剂分为两类：第一类为酯类局部麻醉剂，结构中具有-COO-基团，属于这一类的局部麻醉剂有普鲁卡因、丁卡因等；第二类为酰胺类局部麻醉剂，结构中具有-CONH-基团，属于这一类的局部麻醉剂有利多卡因、布比卡因等。

另一方面，本申请还提供一种前述任一项所述的制备方法所制备得到的注射用黏附性透明质酸钠凝胶，其具有如下式(I)所示的结构。

再一方面，本申请还提供一种注射用黏附性透明质酸钠凝胶，其特征在于，其包含具有式(I)所示结构的化合物。

在一个具体实施方式中，所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶，其中，a选自4～1117，例如可为4、10、44、50、100、200、250、298、300、400、500、600、700、800、900、1000、1110、1117等，b选自4～1117，例如可为4、10、44、50、100、200、250、298、300、400、500、600、700、800、900、1000、1110、1117等，c选自65～5211，例如可为65、100、300、600、655、1000、1390、2000、3000、4000、5000、5211等。

在一个具体实施方式中，所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶，其中，a选自44～298，b选自44～298，c选自655～1390。

在一个具体实施方式中，所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶，制备所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶所用的透明质酸钠的分子量为300～800kDa。

在一个具体实施方式中，所述注射用黏附性透明质酸钠凝胶为混合物，其包含两个以上式(I)所示结构的不同的化合物。

利用本申请的制备方法，可以通过调整步骤(1)中胱氨酸与1，4-丁二醇二缩水甘油醚的物质的量之比，提高得到的交联剂A的量，本申请的方法所制备得到的注射用黏附性透明质酸钠凝胶黏附性高，使用如前所述的黏附性表征方法，最终得到的两块载玻片完全分离的时间在1分15秒以上，最高可达2分24秒，且可通过调整交联剂B的种类、交联剂A与透明质酸钠重复单元的物质的量之比、交联剂B与透明质酸钠重复单元的物质的量之比、交联剂A与交联剂B的物质的量之比控制得到的凝胶产品的黏附性。

本申请得到的黏附性透明质酸凝胶不仅可用于美容填充，也可通过调整透明质酸组成、交联方式、交联度等条件制备得到可用于有组织黏附需求的医美、组织粘合、药物负载、组织工程和损伤修复等领域，可通过提高材料的组织黏附性实现与相应组织更稳定的结合，可有效减少运动对于植入材料位移的影响。

以下利用实施例对本申请做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例

实施例1

(1)将0.042mol胱氨酸与0.084mol1，4-丁二醇二缩水甘油醚在100mL、0.1mol/L的NaOH溶液中混合，于20℃水浴搅拌反应8小时，分离提纯得到0.035mol含有二硫键的环氧交联剂

(2)将939.0g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.33mol)溶于100mL、质量分数为1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液，将交联剂A和BDDE混合后加入到透明质酸钠溶液中，于30℃中交联反应8小时，得到交联的凝胶L，其中，交联剂A与BDDE的物质的量之比为0.5:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.045:1；

(3)将步骤(2)得到的凝胶L使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶A；

(4)将微粒状凝胶A使用10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析6小时，得到凝胶M；

(5)将凝胶M使用pH为7.4的磷酸缓冲液透析24小时，得到凝胶N，调控所述凝胶N中透明质酸钠的含量为25mg/mL，再过60目的筛网，灌装于注射器中，于121℃湿热灭菌15分钟，得到注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

按照下述方法，通过测定两块载玻片完全分离的时间来表征本实施例的透明质酸钠凝胶的黏附性：如图1所示，将25×25mm的新鲜猪皮固定于75×25mm的载玻片上，带有皮下组织的猪皮内侧向外，再取通过本技术制备的成品凝胶0.5mL均匀涂抹于猪皮内侧组织上，将两块负载凝胶的载玻片搭接静置2小时后，负重5g砝码，使用秒表计时两块载玻片完全分离的时间，分离时间为1分21秒。分离时间越长，黏附性越高。

实施例2

(1)将0.042mol胱氨酸与0.084mol1，4-丁二醇二缩水甘油醚在100mL、0.1mol/L的NaOH溶液中混合，于10℃水浴搅拌反应8小时，分离提纯得到0.035mol含有二硫键的环氧交联剂

(2)将471.5g透明质酸钠(分子量300kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为1.17mol)溶于100mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液，将交联剂A和BDDE混合后加入到透明质酸钠溶液中，于25℃中交联反应8小时，得到交联的凝胶L，其中，交联剂A与BDDE的物质的量之比为1:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.06:1；

(3)将步骤(2)得到的凝胶L使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶A；

(4)将微粒状凝胶A使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析6小时，得到所述凝胶M；

(5)将所述凝胶M使用pH为7.4的磷酸缓冲液透析24小时，得到凝胶N，调控所述凝胶N中透明质酸钠的含量为25mg/mL，再过60目的筛网，灌装于注射器中，于121℃湿热灭菌20分钟，得到注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为2分钟6秒。

实施例3

(1)将0.042mol胱氨酸与0.0966mol1，4-丁二醇二缩水甘油醚在100mL、0.1mol/L的NaOH溶液中混合，于30℃水浴搅拌反应8小时，分离提纯得到0.039mol含有二硫键的环氧交联剂A

由于胱氨酸与BDDE的物质的量之比为1:2.3，所以本实施例分离提纯得到的交联剂A的物质的量较实施例1高。

(2)将1047.8g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.6mol)溶于100mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液，将交联剂A和BDDE混合后加入到透明质酸钠溶液中，于55℃中保湿反应8小时，得到交联的凝胶L，其中，交联剂A与BDDE的物质的量之比为0.5:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸的物质的量之比为0.045:1；

(3)将步骤(2)得到的凝胶L使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶A；

(4)将微粒状凝胶A使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析6小时，得到所述凝胶M；

(5)将所述凝胶M使用pH为7.4的磷酸缓冲液透析12小时，得到凝胶N，调控所述凝胶N中透明质酸钠的含量为25mg/mL，再过60目的筛网，灌装于注射器中，于121℃湿热灭菌20分钟，得到注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为1分20秒。

实施例4

(1)将0.021mol胱氨酸与0.084mol1，4-丁二醇二缩水甘油醚在100mL、0.1mol/L的NaOH溶液中混合，于30℃水浴搅拌反应8小时，分离提纯得到0.004mol含有二硫键的环氧交联剂A

由于胱氨酸与BDDE的物质的量之比为1:4，所以本实施例分离提纯得到的交联剂A的物质的量极低。

(2)将72.5g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为0.178mol)溶于100mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液，将交联剂A和BDDE混合后加入到透明质酸钠溶液中，于55℃中保湿反应8小时，得到交联的凝胶L，其中，交联剂A与BDDE的物质的量之比为1:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.045:1；

(3)将步骤(2)得到的凝胶L使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶A；

(4)将微粒状凝胶A使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析6小时，得到所述凝胶M；

(5)将所述凝胶M使用pH为7.4的磷酸缓冲液透析12小时，得到凝胶N，调控所述凝胶N中透明质酸钠的含量为25mg/mL，再过60目的筛网，灌装于注射器中，于121℃湿热灭菌20分钟，得到注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为1分21秒。

实施例5

(1)将0.042mol胱氨酸与0.084mol1，4-丁二醇二缩水甘油醚在100mL、0.1mol/L的NaOH溶液中混合，于30℃水浴搅拌反应8小时，分离提纯得到0.035mol含有二硫键的环氧交联剂A

(2)将939.0g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.33mol)溶于100mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液，将交联剂A和交联剂B

(n＝11)混合后加入到透明质酸钠溶液中，于55℃中交联反应8小时，得到交联的凝胶L，其中，交联剂A与交联剂B的物质的量之比为0.5:1，交联剂A和交联剂B的总物质的量与透明质酸钠的物质的量之比为0.045:1；

(3)将步骤(2)得到的凝胶L使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶A；

(4)将微粒状凝胶A使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析6小时，得到所述凝胶M；

(5)将所述凝胶M使用pH为7.4的磷酸缓冲液透析12小时，得到凝胶N，调控所述凝胶N中透明质酸钠的含量为25mg/mL，再过60目的筛网，灌装于注射器中，于121℃湿热灭菌20分钟，得到注射用黏附性透明质酸钠凝胶。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为1分27秒。

实施例6

本实施例与实施例1的区别在于，透明质酸钠重复单元的物质的量为1.75mol，交联剂A与BDDE的物质的量之比为1:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.04:1。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为1分4秒。

实施例7

本实施例与实施例2的区别在于，透明质酸钠重复单元的物质的量为0.58mol，交联剂A与BDDE的物质的量之比为2:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.09:1。为保证所有二硫键均被还原为巯基，使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析时间需延长至48小时。

参照实施例2黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为2分17秒。

实施例8

本实施例与实施例7的区别在于，交联剂A与BDDE的物质的量之比为0.4:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.21:1。为保证所有二硫键均被还原为巯基，使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析时间需延长至48小时。

参照实施例7黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为2分13秒。

实施例9

本实施例与实施例7的区别在于，交联剂A与BDDE的物质的量之比为0.4:1，交联剂A和BDDE的总物质的量与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.28:1。为保证所有二硫键均被还原为巯基，使用含10mmol谷胱甘肽的pH为8的磷酸缓冲液透析时间需延长至48小时。

参照实施例7黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为2分24秒。

将实施例1～9的参数和效果数据总结于下表1中：

表1

由表1中的数据可以看出，交联剂A与透明质酸钠重复单元的物质的量之比对透明质酸钠凝胶的黏附性影响最大，交联剂B与透明质酸钠重复单元的物质的量之比对透明质酸钠凝胶的黏附性影响较大。实施例2的交联剂A与透明质酸钠重复单元的物质的量之比在本申请范围内，且优于实施例1、3和4，所以实施2的黏附性明显优于实施例1、3、4和5。实施例6与实施例4相比，实施例6的交联剂A与透明质酸钠重复单元的物质的量之比，以及交联剂B与透明质酸钠重复单元的物质的量之比均小于实施例4，因此实施例4的黏附性优于实施例6。对于实施例7～9，由于实施例7～9的交联剂A与透明质酸钠重复单元的物质的量之比明显大于其它实施例，实施例8～9的交联剂B与透明质酸钠重复单元的物质的量之比明显大于其它实施例，因此，实施例7～9的黏附性稍优于实施例2。

对比例1

(1)将939.0g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.33mol)溶于80mL水溶液中，搅拌溶解完全后，得到透明质酸钠溶液，加入与透明质酸钠分子中羧基等物质的量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应活化8小时，随后加入胱氨酸，持续搅拌反应8小时，得交联凝胶，其中，胱氨酸与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.035:1；

(2)将步骤(1)得到的交联凝胶使用10L去离子水浸泡8次，每次浸泡6小时，每次浸泡结束后，将浸泡后的废液重新换成10L去离子水。

(3)将步骤(2)得到的凝胶使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶；

(4)将微粒状凝胶使用含10mmol谷胱甘肽pH为8的磷酸缓冲液透析6小时，由于交联剂胱氨酸中二硫键全部被谷胱甘肽还原成自由巯基，因此微粒状凝胶网络瓦解，成为溶液。

通过本方案得不到具有黏附性的透明质酸钠凝胶。

对比例2

(1)将939.0g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.33mol)溶于80mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液，将BDDE加入到透明质酸钠溶液中，于30℃中交联反应8小时，得交联凝胶，其中，BDDE与透明质酸钠重复单元的物质的量之比为0.07:1；

(2)将步骤(1)得到的交联凝胶使用机械力破碎，过60目筛网，得微粒状凝胶；

(3)将微粒状凝胶使用pH为7.4的磷酸缓冲液透析24小时，调控微粒状凝胶中透明质酸钠的含量为25mg/mL；

(4)将步骤(3)中得到的凝胶微粒过60目的筛网，灌装于注射器中，于121℃湿热灭菌18分钟，得透明质酸钠凝胶。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为9秒。通过此方法制备的透明质酸钠凝胶黏附性较低。

对比例3

将939.0g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.33mol)溶于100mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，将0.035mol胱氨酸和0.14molBDDE混合后加入到透明质酸钠溶液中，于30℃中交联反应8小时，得透明质酸钠凝胶。

参照实施例1黏附性表征方法，得到两块载玻片完全分离的时间为33秒。

通过这种方式制备透明质酸凝胶，交联剂BDDE不但会与透明质酸钠反应，同时也会与胱氨酸反应，但不能保证两种反应的比例，最终不能保证胱氨酸引入到透明质酸钠凝胶中的量，无法确保最终能引入巯基至透明质酸钠凝胶中赋予凝胶黏附性。

对比例4

将939.0g透明质酸钠(分子量800kDa，透明质酸钠重复单元的物质的量为2.33mol)溶于100mL、1.5％的NaOH溶液中，搅拌溶解，将0.07mol半胱氨酸和0.14molBDDE混合后加入到透明质酸钠溶液中，于30℃中交联反应8小时，得到透明质酸钠凝胶。

通过这种方式制备透明质酸钠凝胶，在反应过程中，BDDE不但会与透明质酸钠反应，同时也会与半胱氨酸中的氨基和巯基反应，一方面不能确定交联凝胶的交联度，另一方面，BDDE与半胱氨酸中巯基反应后，无法得到具有黏附性的透明质酸凝胶。

将对比例1～4的参数数据总结于下表2中：

表2

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种交联剂，其特征在于，其结构式为

2.权利要求1所述的交联剂在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。

3.一种凝胶中间体，其特征在于，其包含具有下式所示结构的化合物：

4.根据权利要求3所述的凝胶中间体，其特征在于，a为4～1117，b为4～1117，c为65～5211。

5.根据权利要求4所述的凝胶中间体，其特征在于，a为44～298，b为45～298，c为655～1390。

6.权利要求3～5中任一项所述的凝胶中间体在制备注射用黏附性透明质酸钠凝胶中的用途。

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