CN104004231A - 一种生物大分子互穿网络水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种生物大分子互穿网络水凝胶及其制备方法，是两种酶催化交联形成的互穿网络水凝胶，一个是引入酚羟基的多糖大分子通过氧化酶和过氧化氢催化酚羟基氧化交联形成多糖大分子网络，另一个是蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化肽键交联形成蛋白质或多肽大分子网络。上述两个网络互相贯穿，没有化学键结合，形成一种新型的互穿网络水凝胶。该水凝胶未使用化学交联剂，具有优异的生物相容性和力学性能，可以是干态或湿态膜状、多孔海绵状、纤维状，可以用作接触镜、药物释放载体、组织工程支架或组织修复材料。

Description

一种生物大分子互穿网络水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明是由两种不同的酶催化生物大分子交联形成的互穿网络水凝胶及其制备方法，属于生物医用高分子材料领域。

背景技术

水凝胶是一种能够在水中溶胀、保持大量水分而又不溶解于水的三维网状聚合物，在与血液、体液及人体组织相接触时表现出良好的生物相容性。水凝胶比其它任何合成生物材料都接近活体组织，在性质上类似于细胞外基质部分，吸水后可减少对周围组织的摩擦和机械作用，显著改善材料的生物学性能。故水凝胶在组织工程和再生医学方面具有极大的应用潜力。

互穿网络(IPN)水凝胶是由两种或两种以上聚合物通过网络互穿而形成的具有独特性能的聚合物。在互穿网络水凝胶中，两个组分网络之间没有化学键合相，各个聚合物都保持各自的特性；同时，两种网络互穿相互影响，有协同增强力学性能的作用。因此制备互穿网络水凝胶是一种提高水凝胶强度的有效方法。国内外对IPN生物医用材料的研究已有多年探索，通常采用化学交联方法得到IPN水凝胶。由于化学交联剂或引发剂对细胞有毒，制备的IPN水凝胶用于人体有潜在的毒性，限制了互穿网络水凝胶在生物医用方面的应用。

互穿网络水凝胶还可以采用物理交联方式，如疏水作用、氢键作用、离子交联等，虽不引入新的化学物质但难以获得均匀一致的、理想的交联度，或者交联点可能在生理体液中易于解体。

谷氨酰胺转氨酶(mTG)能催化蛋白或多肽或含有氨基酸残基的分子上的谷氨酰胺残基与和赖氨酸残基侧链上的ε-胺基反应，相互间交联形成大分子水凝胶网络。辣根过氧化物酶(HRP)是以铁卟啉为辅基的酶，在有H₂O₂存在时能催化酚类、胺类及其取代物聚合，多糖大分子链上存在着大量的氨基或羧基，可通过碳二亚胺介导的偶联反应引入酚羟基的结构，引入酚羟基的多糖大分子通过辣根过氧化物酶催化酚羟基氧化交联形成大分子水凝胶。

单个酶催化交联制备的水凝胶已有报道，但是水凝胶强度通常比较低，用作生物医用材料有一定难度。

因此，有必要开发强度高、生物相容性好的互穿网络水凝胶材料。

发明内容

技术问题：为了克服水凝胶力学强度差以及常用化学交联剂或引发剂残留于体系中引起的细胞毒性、生物相容性降低的缺点，本发明提供了一种生物大分子互穿网络水凝胶及其应用，该互穿网络水凝胶具有优异的力学性能，良好的生物相容性，克服了化学交联剂带来的毒性缺点，又可解决物理交联效果不佳的问题。

技术方案：一种生物大分子互穿网络水凝胶，包括：

1)键合引入酚羟基的多糖大分子通过酚羟基在氧化酶催化作用下氧化交联形成的多糖大分子网络；

2)蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化形成肽键交联的蛋白质或多肽网络；

上述两个网络之间互相贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽网络的含量为水凝胶干重总质量的0.5％-99.5％，多糖大分子网络的含量为水凝胶干重总质量的0.5％-99.5％。

所述多糖大分子是透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、***胶、琼脂多糖、多聚果糖、甘露聚糖、半乳聚糖、结冷胶、瓜尔胶、海藻酸、硫酸乙酰肝素、淀粉及其衍生物中的任意一种或多种。

所述键合引入酚羟基具体是指多糖大分子通过酯键或酰胺键结合酪胺、酪氨酸、多巴胺、高香草酸、没食子酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸中的任一种得到。

所述蛋白质是明胶、胶原、丝素蛋白、玉米蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、粘蛋白、糖蛋白中的一种或多种。

所述氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酰胺残基。

所述氧化酶是过氧化物酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、嗜热菌蛋白酶、磷酸酯酶中的任一种。

所述转移酶是谷氨酰胺转氨酶、凝血酶中任一种。

所述的水凝胶中还含有添加剂，该添加剂是细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、甾体激素、***、药物或无机盐中的一种或多种的混合物，添加剂的含量为水凝胶总质量的0.01％-3％。

一种制备所述的生物大分子互穿网络水凝胶的方法，步骤为：

1)制备含有酚羟基的多糖大分子；具体制法见实施例1～4；

2)以含有酚羟基的多糖大分子和蛋白质或含有氨基酸残基的多肽为反应原料在氧化酶、转移酶和过氧化氢的催化下制备生物大分子互穿网络水凝胶。其中，键合引入酚羟基的多糖大分子通过酚羟基在氧化酶催化作用下氧化交联形成多糖大分子网络；蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化形成肽键交联的蛋白质或多肽网络。

有益效果：

1、本发明在多糖大分子链上引入酚羟基通过氧化酶催化酚羟基氧化交联和蛋白或含有赖氨酸和谷氨酰胺残基的多肽通过转移酶催化肽键交联构成互穿网络水凝胶，两个网络协同作用提高了水凝胶的力学强度。

3、本发明所用的原材料是来自于天然界的生物大分子或多肽，得到的互穿网络水凝胶具有优异的生物相容性。

4、本发明采用两种酶催化交联制备互穿网络水凝胶的方法既克服了化学交联剂带来的毒性，又解决了物理交联剂效果不佳的缺点。

5、本发明的互穿网络水凝胶可以加工成干态或湿态膜状、多孔海绵状、纤维状，可以用作组织工程支架或组织修复材料。

6、本发明的互穿网络水凝胶可以含有细胞生长因子、维生素、甾体激素、药物或无机盐的一种或多种作为添加剂，赋予该水凝胶各种生物医学功能。

7、本发明的生物大分子互穿网络水凝胶用作接触镜，具有优异的抗脱水性能和佩戴舒适性。

附图说明

图1是多糖大分子引入酚羟基后的结构简图。

图2是引入酚羟基的多糖大分子的酶催化交联机理简图。

图3是蛋白质或多肽大分子的酶催化交联机理简图。

图4是引入酚羟基的多糖大分子和蛋白或多肽大分子形成互穿网络水凝胶的简图。

图5是实施例1制备的壳聚糖-对羟基苯丙酸¹H NMR图谱。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

本发明生物大分子互穿网络水凝胶是采用两种不同的酶催化交联形成的生物大分子互穿网络水凝胶，该互穿网络水凝胶具有优良的生物相容性和力学强度，可用于细胞、组织培养，作为组织工程支架或组织修复材料，可以制成膜状、三维多孔状，或纤维状等，可用作接触镜。

本发明的一种生物大分子互穿网络水凝胶，该互穿网络水凝胶包括：1)键合引入酚羟基的多糖大分子通过酚羟基在氧化酶催化作用下交联形成的多糖大分子网络；2)蛋白质或含有赖氨酸和谷氨酰胺残基的多肽通过转移酶催化交联形成的蛋白质或多肽大分子网络；上述两个网络之间互相贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽或合成大分子网络的含量为水凝胶干重总质量的0.5％-99.5％，多糖大分子网络的含量为水凝胶干重总质量的0.5％-99.5％。

所述多糖是透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、***胶、琼脂多糖、多聚果糖、甘露聚糖、半乳聚糖、结冷胶、瓜尔胶、海藻酸、硫酸乙酰肝素、淀粉、及其衍生物中的一种或多种。

多糖大分子链上引入的酚羟基结构可以是通过酯键或酰胺键结合的酪胺、酪氨酸、多巴胺、高香草酸、没食子酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸的一种。

所述蛋白是明胶、胶原、丝素蛋白、玉米蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、粘蛋白、糖蛋白中的一种或多种。

所述氧化酶是过氧化物酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、嗜热菌蛋白酶、磷酸酯酶。所述转移酶是谷氨酰胺转氨酶(TG)、谷氨酰胺转氨同工酶、凝血酶。谷氨酰胺转氨酶可以是来自于组织的，也可以是微生物发酵制备，记为mTG。

本发明的一种生物大分子互穿网络水凝胶还含有添加剂，该添加剂是细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、甾体激素、***、药物或无机盐的一种或多种的混合物，添加剂的含量为水凝胶总质量的0.01％-3％。

本发明的一种生物大分子互穿网络水凝胶可以是湿态或干态的膜状、纤维状、多孔海绵状，用作角膜接触镜、药物释放载体、组织工程支架或组织修复材料。

一种制备所述的生物大分子互穿网络水凝胶的方法，步骤为：

1)制备含有酚羟基的多糖大分子；具体制法见实施例1～4；

2)以含有酚羟基的多糖大分子和蛋白质或含有氨基酸残基的多肽为反应原料在氧化酶、转移酶和过氧化氢的催化下制备生物大分子互穿网络水凝胶；键合引入酚羟基的多糖大分子通过酚羟基在氧化酶催化作用下氧化交联形成多糖大分子网络；蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化形成肽键交联的蛋白质或多肽网络。

实施例1

壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)的制备

称取水溶性壳聚糖(0.88g，5mmol)溶于150ml去离子水中，用磁力搅拌器恒温搅拌至完全溶解。称取对羟基苯丙酸(1.66g，10mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(2.73g，15mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1.72g，15mmol)溶于100ml的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)水溶液中，其中DMF:水(3:2，V:V)，室温活化1h(pH＝4.7)，将活化液加入到壳聚糖溶液中，室温搅拌过夜。反应液移入透析袋中蒸馏水透析3天，透析液调pH析出产物，真空干燥得到产物键合对羟基苯丙酸的壳聚糖，以下标为壳聚糖-对羟基苯丙酸0.7g，产率80％。经¹H NMR测定产物中对羟基苯丙酸的取代度为15％，如图5所示。

实施例2

透明质酸-酪胺(HA-Tyr)的制备

称取透明质酸(2g，5mmol)溶于100ml去离子水中，用磁力搅拌器恒温搅拌至完全溶解。称取酪胺(1.68g，10mmol)，EDC·HCl(2.73g，15mmol)，NHS(1.72g，15mmol)溶于100ml的蒸馏水中，室温活化1h(pH＝4.7)，将活化液加入到透明质酸溶液中，室温搅拌过夜。反应液移入透析袋中蒸馏水透析3天，透析液调pH析出产物，真空干燥得到产物键合酪胺的透明质酸，以下标为透明质酸-酪胺。

实施例3

肝素-酪胺(Hep-Tyr)的制备

称取肝素(0.5g)溶于100ml去离子水中，用磁力搅拌器恒温搅拌至完全溶解。称取酪胺(1.68g，10mmol)，EDC·HCl(2.73g，15mmol)，NHS(1.72g，15mmol)溶于100ml的蒸馏水中，室温活化1h(pH＝4.7)，将活化液加入到肝素溶液中，室温搅拌过夜。反应液移入透析袋中蒸馏水透析3天，透析液调pH析出产物，真空干燥得到产物键合酪胺的肝素，以下标为肝素-酪胺。

实施例4

海藻酸-多巴胺(Alg-Dopa)的制备

称取海藻酸(2g，5mmol)溶于200ml去离子水中，用磁力搅拌器恒温搅拌至完全溶解。称多巴胺(2g，10mmol)，EDC·HCl(2.73g，15mmol)，NHS(1.72g，15mmol)溶于100ml的蒸馏水中，室温活化1h(pH＝4.7)，将活化液加入到海藻酸溶液中，室温搅拌过夜。反应液移入透析袋中蒸馏水透析3天，透析液调pH析出产物，真空干燥得到产物键合多巴胺的海藻酸，以下标为海藻酸-多巴胺。

实施例5

称取0.1g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的CHPA水溶液，称取1g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的CHPA和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的过氧化氢(H₂O₂)，快速均匀混合，置于柱状模具中，于40℃下反应交联40min，得到膜状生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶。明胶通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，CHPA通过辣根过氧化物酶氧化酚羟基交联得到多糖大分子网络。

实施例6

称取0.1g海藻酸-多巴胺(Alg-Dopa)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的Alg-Dopa水溶液，称取1g明胶加入到上述Alg-Dopa水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的Alg-Dopa和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于柱状模具中，于40℃下反应交联40min，得到膜状生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/Alg-Dopa互穿网络水凝胶。明胶通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，Alg-Dopa通过辣根过氧化物酶交联得到多糖大分子网络。

实施例7

称取0.1g透明质酸-酪胺(HA-Tyr)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的HA-Tyr水溶液，称取1g明胶加入到上述HA-Tyr水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的HA-Tyr和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于柱状模具中，于40℃下反应交联40min，得到膜状生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/HA-Tyr互穿网络水凝胶。明胶通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，HA-Tyr通过辣根过氧化物酶氧化酚羟基交联得到多糖大分子网络。

实施例8

称取0.1g肝素-酪胺(Hep-Tyr)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的Hep-Tyr水溶液，称取1g明胶加入到上述Hep-Tyr水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的Hep-Tyr和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于柱状模具中，于40℃下反应交联40min，得到柱状生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/Hep-Tyr互穿网络水凝胶。明胶通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，Hep-Tyr通过辣根过氧化物酶交联得到多糖大分子网络。

实施例9

称取0.1g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的CHPA水溶液，称取1g玉米蛋白加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的CHPA和玉米蛋白水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于模具中，于40℃下反应交联40min，得到生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的玉米蛋白/CHPA互穿网络水凝胶。玉米蛋白通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，CHPA通过辣根过氧化物酶氧化酚羟基交联得到多糖大分子网络。

实施例10

称取0.1g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到CHPA水溶液，称取1g含有赖氨酸和谷氨酰胺小分子肽加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡。加入0.5ml浓度为50U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，快速均匀混合，至于模具中，于40℃下反应交联40min，得到生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的多肽/CHPA互穿网络水凝胶，小分子肽通过谷氨酰胺转氨酶交联得到多肽大分子网络，CHPA通过辣根过氧化物酶氧化酚羟基交联得到多糖大分子网络。

实施例11

称取0.1g透明质酸-酪胺(HA-Tyr)溶解在10m蒸馏水中得到1％的HA-Tyr水溶液，称取1g明胶加入到上述HA-Tyr水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的HA-Tyr和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的酪氨酸酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于模具中，于40℃下反应交联40min，得到生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/HA-Tyr互穿网络水凝胶，明胶通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，HA-Tyr通过辣根过氧化物酶交联得到多糖大分子网络。

实施例12

称取0.1g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到CHPA水溶液，称取1g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的CHPA和明胶水溶液。

加入0.25ml浓度为200U/ml的凝血酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于模具中，于40℃下反应交联40min，得到生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶，明胶通过凝血酶交联得到蛋白大分子网络，CHPA通过辣根过氧化物酶交联得到多糖大分子网络。

实施例13

称取0.1g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到CHPA水溶液，称取1g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的CHPA和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的漆酶，快速均匀混合，至于模具中，于40℃下反应交联40min，得到生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶，明胶通过谷氨酰胺转氨酶交联得到蛋白大分子网络，CHPA通过漆酶交联得到多糖大分子网络。

实施例14

称取0.2g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在20ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝5.4)中得到CHPA水溶液，称取2g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡后，加入0.2ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶快速均匀混合，得到均匀混合的CHPA和明胶水溶液。

在40℃将上述混合液用微量注射泵以50ml/h的速度注射到含谷氨酰胺转氨酶浓度为15U/ml、H₂O₂浓度为0.8mM的水溶液中，于40℃下反应交联40min，得到纤维状互穿网络水凝胶。反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶纤维。

实施例15

称取0.2g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在20ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝5.4)中得到1％的CHPA水溶液，称取2g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解后，另加入2000IU重组人表皮生长因子，搅拌均匀，静置消泡，得到含有重组人表皮生长因子的CHPA和明胶水溶液。

加入1ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.2ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.12ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于柱状磨具中，于40℃下反应交联40min，得到膜状互穿网络水凝胶。反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，得到两种不同酶催化交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶。将上述水凝胶进一步经气体发泡，真空冷冻干燥，得到明胶/CHPA互穿网络多孔状材料，可作为药物释放***材料。

实施例16

称取0.1g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(PH＝5.4)中得到CHPA水溶液，加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶均匀混合。称取1g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡后，加入0.2ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶和0.12ml浓度为8mM的H₂O₂均匀混合。上述两种混合液快速均匀混合后，注入角膜接触镜模具中，于40℃下反应交联40min，得到互穿网络水凝胶角膜接触镜。反复水洗该水凝胶接触镜，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其保存在蒸馏水中，即得两种不同酶催化交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶角膜接触镜。

实施例17

称取0.2g壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)溶解在20ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的CHPA水溶液，称取2g明胶加入到上述CHPA水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的CHPA和明胶水溶液。

加入1ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.2ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.12ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于柱状磨具中，于40℃下反应交联40min，得到膜状互穿网络水凝胶。反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，进一步经液氮冷冻干燥，得到两种不同酶催化交联的明胶/CHPA多孔海绵状生物大分子互穿网络水凝胶，可作为组织工程支架、组织修复材料。

实施例18

制备明胶浓度为10％，壳聚糖-对羟基苯丙酸(CHPA)含量分别为0％，0.5％，1％，1.5％的明胶/CHPA混合溶液，加入TG酶、HRP酶、H₂O₂使终浓度分别为10U/mL、5U/mL、0.15mM。按表1中的组成混合加入到模具中，于40℃下反应交联40min，即得两种酶催化交联的互穿网络水凝胶。

表1.明胶/CHPA互穿网络水凝胶的组成

样本	明胶(mg/mL)	壳聚糖-对羟基苯丙酸(mg/mL)
			明胶	100	0
G-C1	100	5
			G-C2	100	10
G-C3	100	15

明胶/CHPA互穿网络水凝胶的压缩和拉伸力学测试结果表明，互穿网络水凝胶的力学性能显著增强，且随着CHPA含量的增加，拉伸和压缩强度都增加，明胶水凝胶的拉伸强度和压缩强度分别为0.189MPa和2.05MPa，而G-C3互穿网络水凝胶的拉伸强度和压缩强度分别为0.66MPa和4.01MPa，分别是明胶水凝胶的3.5倍和2倍，断裂伸长率最高达到211％。

将mTG酶交联的明胶水凝胶、HRP酶交联的CHPA水凝胶、mTG/HRP交联的明胶/CHPA互穿网络水凝胶放在PBS溶液中浸泡24h，CHPA水凝胶呈胀烂状，而明胶/CHPA互穿网络水凝胶拉伸强度无明显下降。

实施例19

明胶/CHPA水凝胶交联过程进行流变学测试(组成如表1)。明胶在mTG酶作用下40℃交联，25min内10％的明胶弹性模量G’从0.01Pa增加到1116Pa；说明明胶在mTG酶的作用下其分子链上的谷氨酰胺残基和赖氨酸残基共价交联，形成了交联的网络。

含0.5％CHPA的10％明胶溶液在40℃交联。含有0.5％CHPA的明胶粘性模量是纯明胶的3倍(25.4Pa vs9.24Pa)，表明CHPA含量的增加导致水凝胶的粘性模量显著增大，明显改变了其溶液性质。25min后凝胶的弹性模量G’和纯明胶的相似(1116Pa，1032Pa)，表明CHPA不影响明胶交联网络的形成，不属于明胶网络的构成成分，CHPA在明胶网络中保持溶液状态。这种水凝胶网络称为半互穿网络。

分别含0.5％，1％，1.5％CHPA的10％明胶溶液和mTG/HRP酶、H₂O₂在40℃下温浴。25min内弹性模量G’随着CHPA浓度的增加而明显增大(1675Pa，2847Pa和3372Pa)，粘性模量G”随着CHPA浓度的增加也明显增大(28.68Pa，66.23Pa和143.8Pa)，表明HRP酶在H₂O₂存在时参与体系交联，明显提高了水凝胶的弹性性质和粘性性质。得到了明胶/CHPA互穿网络水凝胶。

实施例20

明胶/CHPA互穿网络水凝胶体外酶降解研究

水凝胶(组成如表1)制成圆柱状样本冻干称重，其质量记为W₀，放入培养皿中，加入含木瓜蛋白酶的PBS5ml，37℃、80rpm摇床振荡，分别在2h，4h，6h，8h,10h时间点取出若干样品，蒸馏水冲洗，冻干称重，其质量记为W_t。每组3个平行样本，求取平均值。计算残余率。结果显示，随着CHPA浓度的增大降解速率减小，表明两种酶催化交联的互穿网络水凝胶的抗降解性优于单酶催化交联的明胶半互穿网络水凝胶。

实施例21

明胶/CHPA互穿网络水凝胶生物学性能评价

细胞毒性试验：水凝胶(组成如表1)紫外灭菌2h后用DMEM培养基浸提过夜，浸提液培养L929细胞，MTT法测定细胞的相对增值率。结果显示，第1天的细胞相对增值率都在85％以上，第3、5天的细胞增值率都在95％以上，表明明胶/CHPA互穿网络水凝胶具有优良的生物相容性。

细胞粘附试验：水凝胶紫外灭菌2h，用培养基浸湿4h。接种10⁵/ml的L929细胞于水凝胶膜上，在37℃，5％CO₂培养箱中培养5天。结果显示，细胞呈梭形且水凝胶膜表面紧密粘附，随着培养时间增加，细胞不断***增殖、迁移，第5天时细胞几乎长满水凝胶膜表面，相互紧挨形成密密麻麻的网状。

将培养细胞5天后的水凝胶膜取出，戊二醛固定，冻干后扫描电镜观察。结果显示，细胞呈单个梭状或团状紧密粘附在凝胶膜表面，可见生长状况良好。生物学评价结果表明胶/CHPA互穿网络水凝胶具有优异的细胞亲和性。

实施例22

称取0.1g肝素-酪胺(Hep-Tyr)溶解在10ml的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.4)中得到1％的Hep-Tyr水溶液，称取1g明胶加入到上述Hep-Tyr水溶液中，40℃水浴加热溶解，静置消泡，得到均匀混合的Hep-Tyr和明胶水溶液。

加入0.5ml浓度为100U/ml的谷氨酰胺转氨酶，0.1ml浓度为500U/ml的辣根过氧化物酶，加入0.06ml浓度为25mM的H₂O₂，快速均匀混合，至于柱状模具中，于40℃下反应交联40min，得到柱状生物大分子互穿网络水凝胶。

反复水洗该水凝胶，去除残留的H₂O₂、醋酸、醋酸钠后，将其浸泡在含有细胞生长因子的溶液中，得到两种不同酶催化交联的含有生长因子的明胶/Hep-Tyr互穿网络水凝胶。

Claims (10)

1.一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，包括：

1)键合引入酚羟基的多糖大分子通过酚羟基在氧化酶催化作用下氧化交联形成的多糖大分子网络；

2)蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化形成肽键交联的蛋白质或多肽网络；

上述两个网络之间互相贯穿，没有化学键结合，其中蛋白或多肽网络的含量为水凝胶干重总质量的0.5％-99.5％，多糖大分子网络的含量为水凝胶干重总质量的0.5％-99.5％。

2.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述多糖大分子是透明质酸、葡聚糖、壳聚糖、硫酸软骨素、肝素、***胶、琼脂多糖、多聚果糖、甘露聚糖、半乳聚糖、结冷胶、瓜尔胶、海藻酸、硫酸乙酰肝素、淀粉及其衍生物中的任意一种或多种。

3.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述键合引入酚羟基具体是指多糖大分子通过酯键或酰胺键结合酪胺、酪氨酸、多巴胺、高香草酸、没食子酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸中的任一种得到。

4.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述蛋白质是明胶、胶原、丝素蛋白、玉米蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、粘蛋白、糖蛋白中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酰胺残基。

6.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述氧化酶是过氧化物酶、辣根过氧化物酶、酪氨酸酶、漆酶、嗜热菌蛋白酶、磷酸酯酶中的任一种。

7.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述转移酶是谷氨酰胺转氨酶、凝血酶中任一种。

8.根据权利要求1所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶，其特征在于，所述的水凝胶中还含有添加剂，该添加剂是细胞生长因子、骨形成蛋白、维生素、胰岛素、甾体激素、***、药物或无机盐中的一种或多种的混合物，添加剂的含量为水凝胶总质量的0.01％-3％。

9.权利要求1～8任一所述的一种生物大分子互穿网络水凝胶以湿态或干态的膜状、纤维状、多孔海绵状，用于角膜接触镜、药物释放载体、组织工程支架或组织修复材料。

10.一种制备权利要求1～8任一所述的生物大分子互穿网络水凝胶的方法，其特征在于，步骤为：

1)制备含有酚羟基的多糖大分子；

2)以含有酚羟基的多糖大分子和蛋白质或含有氨基酸残基的多肽为反应原料在氧化酶、转移酶和过氧化氢的催化下制备生物大分子互穿网络水凝胶；键合引入酚羟基的多糖大分子通过酚羟基在氧化酶催化作用下氧化交联形成多糖大分子网络；蛋白质或含有氨基酸残基的多肽通过转移酶催化形成肽键交联的蛋白质或多肽网络。