CN117500535A - 用丝心蛋白交联多糖以及所获得材料的用途 - Google Patents

用丝心蛋白交联多糖以及所获得材料的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种用于制备交联材料的方法，其包括形成将一个或多个丝心蛋白部分与一个或多个多糖部分缀合的酰胺键。本发明进一步涉及一种能够从这种方法获得的交联材料以及一种包含所述获得的交联材料的可注射组合物。所述交联材料可以是水凝胶和/或超级丰盈剂，并且可以用于美容和药物应用中。

Description

用丝心蛋白交联多糖以及所获得材料的用途
技术领域
本发明涉及一种用于制备交联材料的方法，其包括形成将一个或多个丝心蛋白部分与一个或多个多糖部分缀合的酰胺键。本发明进一步涉及一种可从这种方法获得的交联材料以及一种包含所获得的交联材料的可注射组合物。所述交联材料可以是水凝胶和/或超级丰盈剂，并且可以用于美容和药物应用中。
背景技术
面部和身体重塑越来越受关注。例如，填充面部和/或身体的皱纹、皮肤年轻化、***重建或增大、或其他类型的软组织增大通常是感兴趣的。为了避免外科手术干预的需要，已经开发或正在开发许多可以注射到皮下或皮肤深层内的软组织填充物。
软组织填充物通常是凝胶，诸如水凝胶。使用这种软组织填充物，特别是皮肤填充物的从业者通常期望此类填充物在感兴趣的条件下施用时不会引起毒性或免疫副作用，显示出良好的生物相容性，可以无负担地注射，并且基于天然材料。伴随地，填充物应保留在空间限定的区域中，并且在生物***中具有足够的稳定性，诸如当被注射时。
本领域中用于软组织填充的材料是透明质酸(HA)。如WO 2017/162676中所述，透明质酸本身已被描述为潜在的填充物。WO 2020/127407中还描述了交联的透明质酸水凝胶。透明质酸具有良好的生物可接受性。然而，一个显著的缺点是这种基于透明质酸的材料的生物降解相对较快，并且填充材料不适于长期解决方案。它在其所施用的受试者中具有有限的寿命，通常小于所期望的几个月的最小范围。当透明质酸在体内快速降解时，粘度不期望地快速降低，并且填充效果不会足够持久。
此外，基于透明质酸的填充物的可储存性和保质期通常是有限的。包含未改性透明质酸的储存产品通常倾向于部分降解。然后，粘度降低，并且然后施用的这种储存的且因此部分降解的产品在施用受试者中具有甚至更短的寿命。
因此，需要提供具有改善的生物稳定性的其他填充材料。WO 2020/247887中还描述了包含丝心蛋白片段和其他成分诸如透明质酸的药物组合物。此类共混物不具有所期望的特性。例如，稳定性相当有限。所获得的材料没有显示出一定程度的稳定性，这是许多美容和治疗用途所期望的。因此，已经尝试通过借助于合成交联剂使丝素蛋白与透明质酸交联来进一步改善材料特性。
在填充的情况下使用的另一种分子实体是丝素蛋白。这是一种具有良好生物相容性的可注射材料。它具有相当好的稳定性，但填充特性差。然而，发现纯的丝心蛋白不具有最佳的胶凝特性。因此，人们认为通过将丝素蛋白与弹力蛋白诸如弹性蛋白混合来改善皮肤填充物的特性(参见US 8,288,347)。
试图是通过简单地将丝素蛋白与未结合的透明质酸混合来改善材料特性。US 8,288,347提到将交联的透明质酸与含丝心蛋白的混合物混合。这里，透明质酸和丝心蛋白是未结合的。
已经考虑了通过连接聚合物链的接头将透明质酸与丝素蛋白缀合。US2014/0315828描述了一种经由多环氧化物或多胺交联剂交联未改性的透明质酸和丝心蛋白的方法。US2014/0315828关注于包含小尺寸颗粒的凝胶的制备。例如，US2014/0315828教导了多胺接头六亚甲基二胺(HMDA)，特别是基于环氧化物的接头丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。US-A 2018/0055971也教导了使用多胺接头诸如赖氨酸甲酯HMDA以及环氧化物接头诸如BDDE进行缀合。WO 2020/132331教导了一种包含丝素蛋白、透明质酸和聚乙二醇(PEG)的组织填充物，其中经由接头部分获得交联。
据教导，接头可以例如选自聚环氧接头、二环氧接头、聚环氧-PEG、二环氧-PEG、聚缩水甘油-PEG、二缩水甘油-PEG、聚丙烯酸酯PEG、二丙烯酸酯PEG、1,4-双(2,3-环氧丙氧基)丁烷、1,4-双缩水甘油氧基丁烷、二乙烯砜(DVS)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、UV光、戊二醛、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)、1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO)、双碳二亚胺(BCDI)、季戊四醇缩水甘油醚(PETGE)、己二酸二酰肼(ADH)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、己二胺(HMDA)、l-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、碳二亚胺、及其任何组合。WO 2015/149941教导了经由BDDE接头将透明质酸与肝素原连接。KR-A 2020/0036664教导了使用甲基丙烯酰基和光引发剂诸如芳基次膦酸锂进行透明质酸和丝心蛋白的光致交联。
然而，获得的含有这种接头结构的尺寸稳定的水凝胶包含不期望的互连接头部分，其通常是非天然来源的。
通常，接头部分本身是化学反应性的，诸如基于环氧化物的接头丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。这种未反应或半反应的二价接头的残留物可能是有害的，并限制了材料的可用性。此类反应性接头有最大的可施用量，因此，出于安全原因，也可以使用此类反应性接头制备填充材料。
例如，一个或甚至两个环氧基团仍可能存在并与细胞反应。这可能是有害的。可施用的最大量是有限的。当施用于有需要的受试者并在所述受试者中降解时，可能生成异生素和不可降解或难降解的代谢物。这通常是不期望的，尤其是在美容和药物用途中。因此，期望避免此类异生素接头部分。
Piluso等人(European Polymer Journal,2018,100:77-85)描述了用于官能化明胶水凝胶形成的顺序炔-叠氮化物环加成。Piluso等人教导明胶可以用各种部分，优选小分子官能化。可以形成水凝胶。Piluso等人教导丙炔酸可以通过碳二亚胺活化剂缀合，随后可以经由二价接头形成凝胶。因此可以避免反应性接头。然而，此方法相当复杂，并且需要几个费力的步骤和有毒试剂。CN-A 111440340描述了一种用于获得丝素蛋白-透明质酸钠交联网络的相当复杂的多步骤方法。丝素蛋白通过与酪氨酸酶和过氧化氢接触而被部分消化。透明质酸盐与乙磺酸的衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化剂反应。在第三步中，将两种已经反应的溶液相互混合。这样的步骤相当费力。此外，使用了不期望的反应性成分，诸如N-羟基琥珀酰亚胺，并且当残留物残留在所获得的水凝胶中时，可能产生有害影响。
WO 2019/175036提供了一种用于组织再生的多孔生物材料。此申请教导了丝心蛋白部分与甲酰透明质酸的反应。因此，在丝心蛋白部分和透明质酸之间获得了直接的连接，而没有在它们之间引入接头部分。这种方法的缺点是使用了相当活泼的甲酰透明质酸，并且形成了自然界中很少发现的亚胺基团。教导了所述反应，包括使用冷冻-干燥和干燥步骤的反应。
发明内容
鉴于以上所述，对于制备基于生物的材料的有效方法仍存在未满足的需求，所述方法仅需要较低的程序性工作，这避免将异生素接头部分引入水凝胶中，并使有毒试剂的残留最小化。还期望获得酰胺键并避免需要甲酰基的中间体形成。特别期望的是提供用于面部和身体重塑的可注射水凝胶(例如，可用作超级丰盈剂)的方法。
令人惊讶的是，已经发现具有有益特性的基于生物的材料可以从包括以下的方法获得，用形成活化作用的活化剂使包含伯氨基残基的丝心蛋白部分与包含羧酸残基或其盐的多糖部分反应，从而形成酰胺键。
本发明的第一方面涉及一种用于制备交联材料的方法，所述方法包括：
(i)使以下组分相互接触：
(A)一个或多个包含伯氨基残基或其盐的丝心蛋白部分，
(B)一个或多个包含羧酸残基或其盐的多糖部分，
(C)一种或多种活化剂，其引起羧酸残基与氨基残基的反应，从而形成酰胺键，和
(D)一种或多种溶剂；以及
(ii)使至少一些羧酸残基与至少一些伯氨基残基反应以形成酰胺键，从而使所述一个或多个丝心蛋白部分与所述一个或多个多糖部分共价缀合；以及
(iii)任选地纯化从步骤(ii)获得的交联材料。
已经发现这种交联材料具有意想不到的有益特性。已经发现，可从本发明的方法获得的交联材料具有长期稳定性。即使在高温下温育时，粘度也普遍地保持数周。同样，酶降解性也期望地减少。令人惊讶地发现，可以避免如在现有大鼠中常用的异生素接头结构。本发明的交联材料可以基本上由氨基酸部分和多糖部分组成，它们也可以在自然界中发现。在水性环境中，获得的交联材料可以形成水凝胶。
它还可以用于模拟细胞外基质，并且因此可以诱导细胞增殖和/或细胞迁移。它可以很好地用作可以被细胞填充的填充物(例如，皮肤填充物)。本发明的交联材料可以具有良好的剪切变稀特性。优选地，它具有触变性。因此，它优选地在受压时粘度较小。因此，它可以被很好地注射，同时在其目标区域仍相当粘稠(例如，当在皮下区域施用时)。需要相对较低的挤压力。具有高粘度和低挤压力的凝胶是可获得的。它可以任选地用作超级丰盈剂。
本发明的方法可以在没有过度负担的情况下以相对较低的努力进行。没有发现润滑相。
与现有技术中描述的程序相比，所要求保护的方法是特别有益的，因为除了溶剂之外，它仅需要三种离析物(原材料)，即一个或多个丝心蛋白部分、一个或多个多糖部分和一种或多种活化剂。不需要另外的组分，诸如接头。
异生素接头结构(例如像BDDE)的缺失可以使较高量的材料施用于受试者，例如皮下注射。此外，施用后它可以在受试者体内具有持久性。
由于避免了反应性基团，本发明的可获得的交联材料可以具有长的保质期和可储存性。它也是相对热稳定的。
具体实施方式
如在本发明的上下文中所使用的，术语“丝心蛋白部分”可以在最广泛的意义上理解为本领域已知的丝心蛋白的任何部分。
在优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分具有至少1kDa、至少5kDa、至少至少10kDa、至少100kDa、或至少200kDa或更高的重均分子量。优选地，所述一个或多个丝心蛋白部分是总分子量(Mw)为至少5kDa(5000道尔顿，5千道尔顿)，更优选至少10kDa(10000道尔顿)，甚至更优选至少100kDa，特别是至少200kDa或更高的各聚合部分或聚合部分的复合物。在一个实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分具有10至400kDa的重均分子量。
在优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分具有不超过2000kDa、不超过1000kDa、不超过750kDa、不超过500kDa、不超过250kDa、不超过200kDa、或不超过150kDa的平均重量。
在优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分具有至少5kDa、在5至1000kDa范围内、在5至400kDa范围内、在10至400kDa范围内、或在100至150kDa范围内的重均分子量。在优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分具有在10至400kDa范围内的重均分子量。在另一个优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分具有在100至150kDa范围内的重均分子量。
在特别优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分中的至少一个，特别是所述一个或多个丝心蛋白部分的全部，可以具有50至400kDa的重均分子量。例如，所述一个或多个丝心蛋白部分可以具有10至100kDa、50至150kDa、100至150kDa、75至200kDa、100至250kDa、或200至400kDa的重均分子量。
在优选的实施方式中，丝心蛋白部分具有至少两种不同的重均分子量，各自包含伯氨基残基或其盐。换句话说，丝心蛋白部分还可以是不同重均分子量的丝心蛋白部分的混合物。在优选的实施方式中，丝心蛋白部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个丝心蛋白部分具有，优选地至少两个丝心蛋白部分均具有，特别是所有丝心蛋白部分各自具有在5至1000kDa范围内、在5至400kDa范围内、在10至400kDa范围内、在100至150kDa范围内、在10至100kDa范围内、在50至150kDa范围内、在100至150kDa范围内、在75至200kDa范围内、在100至250kDa范围内、或在200至400kDa范围内的分子量。在优选的实施方式中，丝心蛋白部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个丝心蛋白部分具有，优选地至少两个丝心蛋白部分均具有，特别是所有丝心蛋白部分各自具有在50至400kDa范围内的分子量。
如贯穿本发明所使用的，分子量(Mw)优选地是所表征物质的重均分子量。每个丝心蛋白部分都可以具有一种或多种全长丝心蛋白多肽和/或一种或多种丝心蛋白多肽或者其两种或更多种的复合物的一个或多个骨架(酰胺/蛋白质骨架)。
优选地，丝心蛋白部分包含全长丝心蛋白多肽的至少一个骨架，特别是(基本上)由一种或多种全长丝心蛋白多肽的一个或多个骨架组成。换句话说，丝心蛋白部分优选地来源于天然存在的丝心蛋白。
如本文所用，酰胺键在最广泛意义上是可理解的。通常，酰胺键具有结构-NH-CO-或其互变异构体结构。丝心蛋白部分和多糖部分之间形成的酰胺键可以具有任何手性。在一个实施方式中，它是外消旋混合物。
在优选的实施方式中，所述一个或多个丝心蛋白部分是丝素蛋白部分，更优选与天然昆虫或蜘蛛丝素蛋白部分具有至少80％序列同源性的丝素蛋白部分。在优选的实施方式中，丝心蛋白是丝素蛋白。在可替代的优选实施方式中，丝心蛋白是与一种或多种天然存在的丝素蛋白多肽具有至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％序列同源性(特别是同一性)的多肽或者两种或更多种多肽的复合物。丝素蛋白还可以包括其截短形式。丝素蛋白可以是蚕(家蚕(Bombyx mori))丝心蛋白和昆虫或蜘蛛丝素蛋白。
本发明上下文中的术语“部分(mioety)”可以在最广泛的意义上理解为任何分子结构。
部分可以是包含相应结构或由相应结构组成的化合物，或者可以形成更大化学实体的一部分，例如像本发明的交联材料。例如，丝心蛋白部分可以是丝心蛋白或包含丝心蛋白的化学实体。丝心蛋白部分可以任选地包含多于一个彼此缀合的丝心蛋白骨架。任选地，一个或多个丝心蛋白骨架可以结合一个或多个其他结构，诸如特别是所述一个或多个多糖部分。应当理解，术语“丝心蛋白部分”还可以包括其盐和经修饰形式。
根据本发明，所述一个或多个丝心蛋白部分中的至少一部分包含伯氨基残基或其盐。例如，氨基可以形成所述一个或多个丝心蛋白部分的赖氨酰残基的一部分。优选地，所述一个或多个丝心蛋白部分中的至少一部分包含一个或多个赖氨酰残基，其可以任选地与多糖部分结合。
如在本发明的上下文中所使用的，术语“丝心蛋白”可以在最广泛的意义上理解为本领域已知的任何丝心蛋白。丝心蛋白可以从商业供应商处获得(例如，美国的AdvancedBioMatrix(例如，产品号5154-20ML)；意大利的CareSilk(例如，产品号CSK10-1051))或者可以从天然来源或通过基因工程(也称为：生物发酵、生物技术手段)或合成工程来制备。例如，它可以是家蚕的丝心蛋白，或者可替代地，是选自柞蚕属(Antheraea)、小字大蚕蛾属(Cricula)、Sami属、Gonometa属和Nephila属(例如，络新妇蛛(Nephila clavipes))物种的物种，或者是与前述物种之一或其截短形式具有至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、甚至更优选至少98％序列同源性(特别是同一性)的同源物。应当理解，还可以使用不同丝心蛋白的混合物。
在优选的实施方式中，丝心蛋白是((基本上)完全的)蚕(家蚕)丝心蛋白。在特别优选的实施方式中，丝心蛋白是可获得的或从家蚕获得的蚕丝心蛋白。蚕丝心蛋白可以从蚕茧中获得。从蚕中获得丝的方法是本领域熟知的。例如，可以将蚕茧在水溶液中煮约30min(分钟)。任选地，水溶液可以包含约0.02M Na2CO3。可以用水或水性缓冲液漂洗茧以提取丝胶蛋白，并且可以将提取的丝心蛋白溶解在水性缓冲液中。可用于此目的的盐可以示例性地包括溴化锂、硫氰酸锂、硝酸钙及其混合物。任选地，可以将提取的丝心蛋白溶解在约9-12M的溴化锂溶液中。
可以通过任何方式(例如，透析)除去盐。在优选的实施方式中，蚕茧的其他组分已经(基本上)被除去，例如像丝胶。因此，优选至少50重量％、更优选至少75重量％、甚至更优选至少80重量％、特别是至少90重量％的蚕茧中最初含有的丝胶已被除去。丝素蛋白可以是I型、II型或III型丝素蛋白或者其两种或更多种的混合物。优选地，丝心蛋白是或包含I型丝素蛋白。丝心蛋白可以具有如本领域所述的特性，诸如US2014/315828中所述。
可替代地，一种或多种丝心蛋白多肽(包括蚕丝心蛋白多肽和完整的蚕丝心蛋白)还可以通过基因工程获得。遗传工程化丝心蛋白可以例如从细菌、昆虫细胞、蜘蛛细胞、酵母、哺乳动物细胞、转基因动物或转基因植物中获得。
所述一个或多个丝心蛋白部分可以在任何条件下储存。例如，所述一个或多个丝心蛋白部分可以储存在冷冻机或液化气中，例如在-15℃至-200℃的温度范围内。例如，所述一个或多个丝心蛋白部分可以储存在大约-80℃下或液氮中(即，大约-196℃下)。所述一个或多个丝心蛋白部分可以以粉末或水溶液(例如，以范围为10至100mg/ml(例如大约50mg/ml)的浓度)的干燥状态储存。当解冻预先冷冻的固体丝心蛋白或丝心蛋白溶液时，优选地，所述一个或多个丝心蛋白部分可以任选地被保护免受空气影响。
如在本发明的上下文中所使用的，术语“多糖部分”可以在最广泛的意义上理解为本领域已知的包含羧酸残基或其盐的多糖的任何部分。如在本发明的上下文中所使用的，术语“多糖”可以在最广泛的意义上理解为本领域中的任何多糖。根据本发明，至少一个多糖部分包含至少一个羧酸残基或其盐。优选地，所述一个或多个多糖部分进一步包含羟基。多糖可以是可以被修饰的天然存在的多糖，也可以是合成多糖。在这种情况下，多糖可以是分支的或非分支的。应当理解，术语“多糖部分”还可以包括其盐和经修饰形式。在优选的实施方式中，多糖没有被氧化。
优选地，至少一个多糖部分是重均分子量(Mw)为至少1kDa(1000Da)、更优选至少5kDa、甚至更优选至少10kDa、甚至更优选至少50kDa、甚至更优选至少100kDa、甚至更优选至少200kDa、甚至更优选至少300kDa或更高的聚合部分。优选地，所述一个或多个多糖部分具有在10至10000kDa范围内的重均分子量(Mw)。在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分具有至少50kDa，特别是在50至4000kDa范围内的重均分子量。更优选地，所述一个或多个多糖部分具有在100至10000kDa范围内的重均分子量。在一个实施方式中，所述至少一个多糖部分是特性粘度为1.0至3.3m3/kg(20℃，1013hPa，水)的聚合部分。
在特别优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分中的至少一个，特别是所述一个或多个多糖部分的全部，可以具有1500至3500kDa(1.5和3.5MDa)的重均分子量。更优选地，它可以具有在100至5000kDa、200至2000kDa、250至1500kDa、300至1000kDa、400至900kDa或500至900kDa范围内的重均分子量。
在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含一种或多种类型的糖酸部分或其盐。
在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含一种或多种类型的糖酸部分或其盐，其中所述一种或多种类型的糖酸部分选自：
(B1)一个或多个糖醛酸(uronic acid)部分，特别是选自葡萄糖醛酸部分、半乳糖醛酸部分、艾杜糖醛酸部分，及其两种或更多种的组合；
(B2)一个或多个醛糖酸(aldonic acid)部分，特别是选自甘油酸部分、木糖酸部分、葡萄糖酸部分、抗坏血酸部分，及其两种或更多种的组合；
(B3)一个或多个酮糖酸(ulosonic aicd)部分，特别是选自神经氨酸部分、酮脱氧辛酮糖酸部分及其组合；和/或
(B4)一个或多个醛糖二酸(aldaric acid)部分，特别是选自酒石酸部分、内消旋半乳糖二酸部分、葡糖二酸部分，及其两种或更多种的组合。
在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含糖醛酸部分。在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含葡萄糖醛酸部分。在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含D-葡萄糖醛酸部分。
在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含D-糖部分或由其组成。在可替代实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含L-糖部分或由其组成。在可替代实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含D-糖部分和L-糖部分的组合或由所述组合组成。例如，在这样的组合中，可以包含糖部分的外消旋混合物，或者特定的糖部分是D-糖部分，而其他是L-糖部分。
在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含一个或多个糖胺聚糖部分或由其组成。在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分选自透明质酸(HA)部分、肝素原部分、肝素、硫酸软骨素及其两种或更多种的混合物。在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含透明质酸、肝素原、硫酸软骨素和羧甲基纤维素或由其组成。此类包含羧酸基团的多糖也是可商购获得的(例如，来自法国雅沃内的HTL生物技术公司(HTLBiotechnology,Javene,France))。
在优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分包含一个或多个透明质酸部分或由其组成。
在优选的实施方式中，本发明的交联材料是凝胶。在优选的实施方式中，本发明的交联材料是多糖/丝心蛋白凝胶。在优选的实施方式中，本发明的交联材料是透明质酸/丝心蛋白凝胶(HA/丝心蛋白凝胶)。
透明质酸(也称为：HA、透明质酸盐或透明质酸)可以在最广泛的意义上理解为本领域中的任何透明质酸。它可以是含有透明质酸部分(也称为透明质酸单元)的多糖部分，参考多糖中糖类部分的总含量，优选地包含至少50mol％的透明质酸部分，更优选至少75mol％、甚至更优选至少80mol％、甚至更优选至少90mol％的透明质酸部分。透明质酸可以任选地包含一个或多个除透明质酸之外的糖类部分。透明质酸可以任选地被部分修饰。例如，它可以是部分氧化的，并且可以带有醛基和/或可以是交联的。此类修饰例如在WO2020/127407中有所描述。
在优选的实施方式中，透明质酸是一种天然糖胺聚糖，由V-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸的连接重复单元([α-1,4-D-葡萄糖醛酸-β-1,3-N-乙酰基-D-葡糖胺]n)组成。因此，透明质酸的重复单元可以是如下示例：
可以如WO 2017/162676中所述地使用透明质酸。在本发明的上下文中，还可以使用诸如WO 2020/127407中描述的交联和任选修饰的透明质酸作为透明质酸。
在本发明的上下文中，透明质酸的重均分子量(Mw)优选地为至少1kDa(1000Da)、更优选至少5kDa、甚至更优选至少10kDa、甚至更优选至少50kDa、甚至更优选至少100kDa、甚至更优选至少200kDa、甚至更优选至少300kDa或更高。在本发明的上下文中，透明质酸的重均分子量(Mw)优选地在10至10000kDa、更优选100至10000kDa、或100至5000kDa的范围内。在更优选的实施方式中，透明质酸具有在50至4000kDa范围内的重均分子量(Mw)。更优选地，透明质酸具有在100至3500kDa、200至2000kDa、250至1500kDa、300至1000kDa、400至900kDa或500至900kDa范围内的重均分子量。
在特别优选的实施方式中，所述一个或多个多糖部分中的至少一个是一个或多个透明质酸部分，其中所述一个或多个透明质酸部分中的至少一个，特别是所述一个或多个透明质酸的全部，可以具有1500至3500kDa的重均分子量。
肝素原可以在最广泛的意义上理解为任何肝素原。在优选的实施方式中，它可以是诸如WO 2015/149941中描述的。肝素原(HEP)是属于糖胺聚糖(GAG)多糖家族的生物聚合物。
在人体内，它是肝素和硫酸肝素生物合成的中间产物。肝素原的结构与透明质酸(HA)的结构高度相似，因为它具有与透明质酸相同的单糖组分糖，并且与HA的不同之处仅仅在于HA中葡萄糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)之间的β-(1,3)糖苷键被HEP中的β-(1,4)糖苷键替代，并且HA中N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcUA)之间的β-(1,4)糖苷键被HEP中的α-(1,4)糖苷键替代：
GlcUA-β-(1-4)-[GlcNAc-α-(1-4)-GlcUA-β-(1-4)]n-GlcNAc HEP
通常，肝素原具有优异的生物相容性。肝素原带有大量负电荷和羟基，并且因此是高度亲水的，这增加了组织相容性。此外，由于肝素原聚合物即使在修饰后仍包含天然硫酸乙酰肝素和肝素聚合物中存在的片段的事实，肝素原通常是非免疫原性的(例如，不诱导抗体)。此外，由于肝素原和透明质酸之间的结构相似性，可以在官能团上进行相同的化学修饰，包括氧化成醛，如已知对透明质酸那样。在本发明上下文中使用的肝素原聚合物的分子量(Mw)可以具有任何分子量。
在优选的实施方式中，多糖部分(组分b)，特别是透明质酸部分，具有至少两种不同的分子量，各自包含伯氨基残基或其盐。换句话说，多糖部分还可以是不同分子量的多糖部分的混合物。在优选的实施方式中，多糖部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个多糖部分具有，优选地至少两个多糖部分，特别是所有多糖部分各自具有在10至10000kDa范围内、在100至10000kDa范围内、或在100至5000kDa范围内、在100至3500kDa范围内、在200至2000kDa范围内、在250至1500kDa范围内、在300至1000kDa范围内、在400至900kDa范围内、或在500至900kDa范围内的分子量。
在优选的实施方式中，多糖部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个多糖部分具有，优选地至少两个多糖部分，特别是所有多糖部分各自具有在1500至3500kDa范围内的分子量。
在优选的实施方式中，多糖部分包含至少两个具有至少两种不同分子量的透明质酸部分或由其组成，并且至少一个透明质酸部分具有，优选地至少两个透明质酸部分均具有，特别是所有透明质酸部分各自具有在10至10000kDa范围内、在100至10000kDa范围内、或在100至5000kDa范围内、在100至3500kDa范围内、在200至2000kDa范围内、在250至1500kDa范围内、在300至1000kDa范围内、在400至900kDa范围内、或在500至900kDa范围内的分子量。在优选的实施方式中，多糖部分包含至少两个具有至少两种不同分子量的透明质酸部分或由其组成，并且至少一个透明质酸部分具有，优选地至少两个透明质酸部分均具有，特别是所有透明质酸部分各自具有在1500至3500kDa范围内的分子量。
一个或多个丝心蛋白部分(组分A)的总质量与一个或多个多糖部分(组分B)的总质量之间的(质量)比可以是任何比率。当期望特别高的水/缓冲液吸光度时，可以质量过量地使用多糖部分。当期望特别高的稳定性时，可以更大质量过量地使用丝心蛋白部分。优选地，A:B的(质量)比在1:100至100:1.1的范围内。
在优选的实施方式中，一个或多个丝心蛋白部分(A)与一个或多个多糖部分(B)之间的质量比A:B在5:1至1:20的范围内，优选地在1:1至1:10的范围内，特别是在1:1至1:5的范围内。
例如，一个或多个丝心蛋白部分(A)与一个或多个多糖部分(B)之间的质量比A:B可以在1:9至2:1、1:8至1.5:1、1:7至1:1、1:6至1:1、1:5至1:1、1:4至1:1、1:3至1:1、1:2至1:1、或1:1.5至1:1的范围内。
在优选的实施方式中，丝心蛋白部分具有至少两种不同的分子量，其各自包含伯氨基残基或其盐，并且多糖部分，特别是透明质酸部分具有至少两种不同的分子量，其各自包含伯氨基残基或其盐。
在优选的实施方式中：
(a)丝心蛋白部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个丝心蛋白部分具有，优选地至少两个丝心蛋白部分均具有，特别是所有丝心蛋白部分各自具有在5至1000kDa范围内、在5至400kDa范围内、在10至400kDa范围内、在100至150kDa范围内、在10至100kDa范围内、在50至150kDa范围内、在100至150kDa范围内、在75至200kDa范围内、在100至250kDa范围内、或在200至400kDa范围内的分子量；以及
(b)透明质酸部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个透明质酸部分具有，优选地至少两个透明质酸部分均具有，特别是所有透明质酸部分各自具有在10至10000kDa范围内、在100至10000kDa范围内、或在100至5000kDa范围内、在100至3500kDa范围内、在200至2000kDa范围内、在250至1500kDa范围内、在300至1000kDa范围内、在400至900kDa范围内、或在500至900kDa范围内的分子量。
在优选的实施方式中：
(a)丝心蛋白部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个丝心蛋白部分具有，优选地至少两个丝心蛋白部分均具有，特别是所有丝心蛋白部分各自具有在5至1000kDa范围内、在50至400kDa范围内的分子量；以及
(b)透明质酸部分具有至少两种不同的分子量，并且至少一个透明质酸部分具有，优选地至少两个透明质酸部分均具有，特别是所有透明质酸部分各自具有在1500至3500kDa范围内的分子量。
如在本发明的上下文中所使用的，活化剂可以是引起羧酸残基与氨基残基反应从而形成酰胺键的任何化合物。应当理解，这主要意指活化剂是一种化合物，其引起所述一个或多个多糖部分的羧酸残基与所述一个或多个丝心蛋白部分的氨基残基的反应，从而形成酰胺键。
在优选的实施方式中，所述一种或多种活化剂选自由以下组成的组：
(C1)一种或多种基于三嗪的活化剂，特别是选自4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM)、其盐和/或2-氯-4,6,-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)及其组合；
(C2)一种或多种碳二亚胺活化剂，特别是选自N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，及其两种或更多种的组合；以及
(C3)其组合。
根据本发明，活化剂通常不共价包含在交联材料中。因此，它通常可以任选地通过任何方式(例如像洗涤、过滤等)从本发明的交联材料中除去。
在优选的实施方式中，基于三嗪的活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM)或其盐，优选地它是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐，DMTMM的盐优选地是其中抗衡离子是美容和/或药学上可接受的阴离子的盐，例如像氯化物、乙酸盐、碳酸氢盐(碳酸氢盐)，或两种或更多种阴离子的混合物。
在优选的实施方式中，基于三嗪的活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物。
在优选的实施方式中，碳二亚胺活化剂是N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
在优选的实施方式中，活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM)或其盐。优选地，它是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐，特别是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(CAS号3945-69-5)。
DMTMM被认为具有相对较低且基本上可忽略的毒性，在通常使用的量下无致癌性、无致突变性、且无致畸/生殖毒性。因此，它特别适用于制备软组织填充物，诸如皮肤或***填充物。
当使用DMTMM作为活化剂时，4-甲基吗啉(NMM)和/或4,6-二甲氧基-1,3-5-三嗪-2-醇(DMT)可能作为一种或多种降解产物形成。
在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于其包括通过过滤、洗涤和/或透析，特别是错流过滤、渗滤和/或死端过滤来纯化交联材料的步骤(iii)。
应当理解，过滤可以是错流过滤、死端过滤或两者的组合。过滤可以通过任何方式进行。在过滤的情况下，过滤器可以具有适于纯化交联材料的任何孔径，即优选地截留交联材料并允许反应物和任选的未反应的多糖和/或丝心蛋白通过。任选地，孔径可以在5nm至2μm的范围内，更特别地，孔径为30nm至600nm，更特别地，孔径为80nm至300nm，特别地，孔径为5nm至60nm。过滤器可以是任何材料，例如像陶瓷、金属、聚合物材料、或其组合。
任选地，过滤可以是动态过滤，例如像描述于WO 2020/030629中。因此，步骤(iii)可以任选地包括交联材料的动态过滤，任选地包括以下步骤：
a)将交联材料转移到配备有一个或多个半透性过滤盘的动态过滤装置中，并渗滤凝胶，包括以下步骤：
i)通过施加201/min至5001/min范围内的转速和0.5至6巴范围内的超压，将交联材料浓缩至预定浓度；或者将交联材料直接泵入动态过滤装置的处理室中；
ii)通过施加201/min至5001/min范围内的转速和0.5至6巴范围内的超压，进行渗滤以减少不需要的分子；
b)任选地向交联材料中添加包含非交联材料和水的混合物。
在一个实施方式中，动态过滤装置配备有1至10个半透性过滤盘。在DCF中，可以使用任何转速和压力，例如像在201/min至5001/min范围内的转速，和在0.5至3巴范围内的压力。在DCF中，可以使用任何浓度，例如像10至70mg/g。
任选地，在进行通过过滤、洗涤和/或透析来纯化交联材料的步骤(iii)之前、期间或之后，可以添加一种或多种其他组分(例如，一种或多种局部麻醉剂(例如，如下所述，例如像利多卡因)、一种或多种细胞增殖因子、一种或多种染料，及其两种或更多种的组合)。
步骤(iii)可以在适于此目的的任何时间进行。任选地，步骤(ii)可以进行1min至1周或更长时间、2min至5天、3min至4天、5min至72小时、5min至24小时、10min至12小时、30min至6小时、1小时至5小时、或2至4小时。
步骤(iii)可以在适于此目的的任何温度下进行，例如像在0℃至100℃、4℃至95℃、10℃至70℃、15℃至30℃、18℃至25℃、20℃至70℃、20℃至40℃或60℃至70℃下。
在本发明的实施方式中，错流过滤(也称为：错流过滤)是动态错流过滤(DCF)。因此，在一个实施方式中，所述方法的特征可以进一步在于其包括通过DCF纯化交联材料的步骤(iii)。这在下面举例说明。任选地，DCF可以是诸如WO 2020/030629中描述的。
在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于步骤(i)和(ii)在单个批次中进行。
在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于步骤(i)在5℃至90℃、特别是18℃至30℃范围内的温度下，更特别是在环境条件(例如，通常为18℃至25℃)下进行。在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于步骤(ii)在5℃至90℃、特别是18℃至30℃范围内的温度下，更特别是在环境条件(例如，通常为18℃至25℃)下进行。在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于，到目前为止，步骤(iii)在5℃至90℃、特别是18℃至30℃范围内的温度下，更特别是在环境条件(例如，通常为18℃至25℃)下进行。
在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于步骤(i)和(ii)以及任选的步骤(iii)在5℃至90℃、特别是18℃至30℃范围内的温度下进行。在优选的实施方式中，这些步骤在环境条件(例如，通常为18℃至25℃)下进行。例如，步骤(i)和/或(ii)和/或步骤(iii)可以在大约18℃、大约19℃、大约20℃、大约21℃、大约22℃、大约23℃、大约24℃、大约25℃、大约26℃、大约27℃、大约28℃、大约29℃或大约30℃的温度下进行。
步骤(i)和(ii)以及任选的步骤(iii)可以在任何压力下进行。例如，压力可以是环境压力(例如，通常大约970至1100hPa的外部压力)。
使组分相互接触的步骤(i)可以通过任何方式进行。在优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于步骤(i)包括混合组分，即所述一个或多个丝心蛋白部分(作为组分A)、所述一个或多个多糖部分(作为组分B)、所述一种或多种活化剂(作为组分C)和一种或多种溶剂(作为组分D)，以及任选的一种或多种其他组分。这种混合可以通过任何方式进行，例如像通过搅拌和/或摇动。
在优选的实施方式中，在没有所述一个或多个丝心蛋白部分(作为组分A)的第一步中，将所述一个或多个多糖部分(作为组分B)和所述一种或多种活化剂(作为组分C)溶解在一种或多种溶剂(作为组分D)中，并温育。
这可以激活多糖部分的羧基。温育可以进行足以达到此目的的任何时间。在优选的实施方式中，在第一个子步骤中，将所述一个或多个多糖部分溶解在所述一种或多种溶剂中，并且在随后的子步骤中，添加所述一种或多种活化剂，一起代表活化步骤。
示例性地，这种活化步骤可以进行5分钟至24小时、10分钟至12小时、30分钟至6小时、45分钟至5小时、45分钟至4小时、或1至3小时。示例性地，这种活化步骤可以在任何温度下进行，例如像在0℃至100℃、4℃至95℃、10℃至70℃、15℃至30℃、18℃至25℃、20℃至70℃、20℃至40℃或60℃至70℃下，特别是在环境温度(例如，通常为18℃至25℃)下。例如，在10℃至25℃、特别是18℃至22℃的温度下，温育可以是1分钟至24小时，特别是30分钟至2小时或1至3小时在这样的温育后，可以添加所述一个或多个丝心蛋白部分(作为组分A)。这可以进一步温育以进行本发明方法的步骤(ii)。步骤(ii)可以使用任何合适的溶剂(诸如水或水性缓冲液)进行。任选地，可以在反应步骤中搅拌溶液。
因此，在优选的实施方式中，所述方法的步骤(i)包括以下子步骤：
(ia)使下列组分相互接触：
(B)一个或多个包含羧酸残基或其盐的多糖部分，
(C)一种或多种活化剂，其引起羧酸残基与氨基残基的反应，从而形成酰胺键，和
(D)一种或多种溶剂，
优选地，其中首先将所述一个或多个多糖部分(B)溶解在所述一种或多种溶剂(D)中，随后添加所述一种或多种活化剂(C)；
(ib)使至少一些羧酸残基与一种或多种活化剂反应，从而形成一个或多个活化的多糖部分(也称为：多糖-活化剂缀合物)；以及
(ic)向子步骤(ib)的活化多糖部分中添加：
(A)一个或多个包含伯氨基残基或其盐的丝心蛋白部分。
在另一个优选的实施方式中，将组分A、B、C和D以及任选的一种或多种其他组分同时全部混合。
步骤(ii)可以进行任何合适的反应时间。例如，反应时间可以在1分钟至7天、优选5分钟至2天、更优选10分钟至24小时的范围内。例如，反应时间可以在15分钟至24小时、或30分钟至12小时、或45分钟至6小时、或1小时至4小时的范围内。
在优选的实施方式中，所述方法包括：
(i)使以下组分相互接触：
(A)一个或多个重均分子量为至少5kDa的丝素蛋白部分，其包含伯氨基残基或其盐，
(B)一个或多个重均分子量为至少50kDa的透明质酸部分，其包含羧酸残基或其盐，
(C)一种或多种引起羧酸残基与氨基残基反应从而形成酰胺键的基于三嗪的活化剂，特别是其中活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉或其盐；以及
(D)一种或多种溶剂；以及
(ii)使至少一些羧酸残基与至少一些伯氨基残基反应以形成酰胺键，从而使所述一个或多个丝素蛋白部分与所述一个或多个透明质酸共价缀合；以及
(iii)任选地纯化从步骤(ii)获得的交联材料。
可以使用可用作本发明方法的组分D的任何溶剂。在优选的实施方式中，使用极性溶剂。在优选的实施方式中，使用质子溶剂。在优选的实施方式中，使用质子极性溶剂。
在优选的实施方式中，参考溶剂的总质量，可用作组分D的溶剂包含大于50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％、或甚至100重量％的一种或多种选自以下的组分：
水；
一种或多种醇，优选一种或多种C1-C5醇，更优选一种或多种选自以下的C1-C5醇：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇(1-丁醇)、仲丁醇(2-丁醇)异丁醇、(2-甲基丙-1-醇)、叔丁醇(2-甲基丙醇)、戊-1-醇、2-甲基丁-1-醇、3-甲基丁-1-醇、2,2-二甲基丙-1-醇、戊-2-醇、3-甲基丁-2-醇、戊-3-醇和/或2-甲基丁-2-醇，及其两种或更多种的组合，特别是甲醇和/或乙醇；
一种或多种伯胺，特别是一种或多种C1-C5胺；
一种或多种碳酸，优选一种或多种选自以下的C1-C5碳酸：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、缬草酸、异缬草酸，特别是甲酸和/或乙酸；
一种或多种伯或仲酰胺，优选一种或多种C1-C5酰胺，特别是甲酰胺；
一种或多种亚砜，优选一种或多种C1-C5酰胺，特别是二甲基亚砜(DMSO)；
及其两种或更多种的组合。
在优选的实施方式中，使用水性溶剂，即参考溶剂的总质量，包含大于50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％、或甚至100重量％的水含量的溶剂。在本发明的一个实施方式中，除了水之外，水性缓冲液还包含一种或多种选自以下的组分：一种或多种醇(特别是一种或多种C1-C5醇，例如像甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇(1-丁醇)、仲丁醇(2-丁醇)异丁醇、(2-甲基丙-1-醇)、叔丁醇(2-甲基丙醇)、戊-1-醇、2-甲基丁-1-醇、3-甲基丁-1-醇、2,2-二甲基丙-1-醇、戊-2-醇、3-甲基丁-2-醇、戊-3-醇和/或2-甲基丁-2-醇)、一种或多种伯胺(特别是一种或多种C1-C5胺)、一种或多种碳酸(特别是一种或多种C1-C5碳酸，例如像甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、缬草酸、异缬草酸)、一种或多种伯或仲酰胺(特别是一种或多种C1-C5酰胺，例如像甲酰胺)、一种或多种亚砜(特别是一种或多种C1-C5酰胺，例如像二甲基亚砜(DMSO))、一种或多种无机或有机阳离子(特别是一种或多种分子量小于1000Da的无机或有机阳离子，特别是碱金属阳离子或碱土金属阳离子、其他金属阳离子、质子、铵阳离子等)、一种或多种无机或有机阴离子(特别是一种或多种分子量小于1000Da的无机或有机阴离子，特别是氯、硫酸盐等)、一种或多种硅酸盐，及其两种或更多种的组合。
在优选的实施方式中，将水或水性缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Tris缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸缓冲液等)用作溶剂。在优选的实施方式中，使用水醇溶剂，例如像水与乙醇、甲醇、丙醇、丁醇和/或戊醇的混合物。在优选的实施方式中，将水用作溶剂D。
如本文所用的水可以在最广泛的意义上理解。优选地，水是去离子水、蒸馏水或自来水，特别是去离子水或蒸馏水。
如上所指出，在优选的实施方式中，所述方法的步骤(i)包括以下子步骤：
(ia)使下列组分相互接触：
(B)一个或多个重均分子量为至少50kDa的透明质酸部分，其包含羧酸残基或其盐，
(C)一种或多种引起羧酸残基与氨基残基反应从而形成酰胺键的基于三嗪的活化剂，特别是其中活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉或其盐；
(D)一种或多种溶剂，
优选地，其中首先将所述一个或多个透明质酸部分(B)溶解在所述一种或多种溶剂(D)中，随后添加所述一种或多种基于三嗪的活化剂(C)；
(ib)使至少一些羧酸残基与一种或多种基于三嗪的活化剂反应，从而形成一个或多个活化的透明质酸部分(也称为：透明质酸-活化剂缀合物)；以及
(ic)向子步骤(ib)的活化透明质酸部分中添加：
(A)一个或多个重均分子量为至少5kDa的丝素蛋白部分，其包含伯氨基残基或其盐。
在本发明的实施方式中，本发明的方法包括以下(优选顺序的)步骤：
将多糖(优选透明质酸，特别是透明质酸钠盐)溶解在水或缓冲液中；
向多糖溶液中添加活化剂(优选DMTMM)；
允许活化(优选持续几个小时，例如在18℃至22℃的温度下)；
向活化的多糖中添加丝心蛋白溶液；
搅拌并允许交联材料的形成(优选持续几个小时，例如在18℃至22℃的温度下)；
纯化交联的材料(例如，例如通过过滤和/或透析，例如在18℃-22℃的温度下，除去DMTMM及其降解产物)；
任选地添加麻醉剂(例如，利多卡因)；以及
任选地灭菌。
本发明的另一方面涉及一种可从本发明的方法获得的交联材料。
应当理解，如在本发明方法的上下文中给出的定义和优选实施方式在经适当修改后适用于本发明的交联材料。
在本发明的实施方式中，已经通过使用DMTMM作为活化剂制备了交联材料。在本发明的实施方式中，交联材料，特别是在最终纯化之前，包含DMTMM、4-甲基吗啉(NMM)和/或4,6-二甲氧基-1,3-5-三嗪-2-醇(DMT)。在本发明的实施方式中，交联材料，特别是在最终纯化之前，包含NMM和/或DMT。在本发明的实施方式中，交联材料，特别是在最终纯化之前，参考交联材料(凝胶)的总重量，包含至多0.1重量％、优选0.01至1000ppm、0.1至100ppm、或1至10ppm的NMM和/或DMT。
本发明的另一方面涉及一种交联材料，其包含以下或由其组成：
(A)一个或多个重均分子量为至少5kDa的丝心蛋白部分，和
(B)一个或多个重均分子量为至少50kDa的透明质酸部分，
其中所述一个或多个丝心蛋白部分经由酰胺键与所述一个或多个透明质酸部分共价缀合，而没有互连的接头结构。
如本文所用，术语“没有互连的接头结构”可以在最广泛的意义上理解为没有另外的不是来源于(也称为：不存在于)丝心蛋白部分或多糖部分(例如，透明质酸部分)的化学部分被引入经由酰胺键将一个或多个丝心蛋白部分与一个或多个透明质酸部分共价缀合的化学结构中。换句话说，酰胺键优选地由包含源自丝心蛋白(例如，赖氨酸侧链)的氮原子和包含源自多糖部分(例如，透明质酸部分)的碳原子形成。
在优选的实施方式中，交联材料的特征进一步在于其不包含酰亚胺基团。在优选的实施方式中，交联材料的特征进一步在于其不包含亚胺基团。在优选的实施方式中，交联材料的特征进一步在于其不包含环氧基团。在优选的实施方式中，交联材料的特征进一步在于其不包含异生素接头部分基团。
在优选的实施方式中，交联材料的特征进一步在于其不包含：
(a)酰亚胺基团；
(b)亚胺基团；
(c)环氧基团；和/或
(d)异生素接头部分，
将一个或多个丝心蛋白部分与一个或多个多糖部分互连。
在优选的实施方式中，交联材料的特征进一步在于其不包含：
(a)酰亚胺基团；
(b)亚胺基团；
(c)环氧基团；和
(d)异生素接头部分。
本发明的另一方面涉及一种可注射组合物，其包含本发明的交联材料和液体或粘性载剂以及任选的其他组分，优选地其中交联材料是水凝胶和/或超级丰盈剂。
应当理解，如在本发明方法和交联材料的上下文中给出的定义和优选实施方式在经适当修改后适用于本发明的可注射组合物。
在优选的实施方式中，本发明的交联材料和/或可注射组合物可用作软组织填充物，特别是皮肤填充物或***填充物。
包含在可注射组合物中的根据本发明的液体或粘性载剂可以是任何可注射载剂。通常，液体或粘性载剂是药学上和/或美容上可接受的载剂，因此，在本发明的意义上，当施用于哺乳动物时，所述载体对哺乳动物，特别是人是无毒的。液体或粘性载剂可以优选地包含一种或多种溶剂或由其组成，例如像水、水性缓冲液(例如，盐水或磷酸盐缓冲盐水)、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、植物油、石蜡油或其组合。更优选地，液体或粘性载剂包含不致热的等渗缓冲液(更特别地，生理盐水溶液或缓冲的生理盐水溶液)或由其组成。
任选存在的另外的组分可以是任何组分。例如，这种另外的组分可以选自一种或多种局部麻醉剂、一种或多种细胞增殖因子、一种或多种染料，及其两种或更多种的组合。
此类另外的组分可以在任何时候添加，诸如在纯化交联材料之前、期间或之后。例如，可以在进行纯化步骤(iii)的过程中添加一种或多种另外的组分。在本发明的另一个实施方式中，可以将一种或多种另外的组分添加到制备的和任选纯化的交联材料中。
局部麻醉剂可以使注射到个体中更舒适。细胞增殖因子可以改善细胞侵入本发明的施用的交联材料中。染料可以改善注射的定位(例如，药学上可接受的荧光染料，如荧光素或罗丹明)，或者可以改善原本发白的交联材料的不可见性(例如，通过使其变成肉色)。还可以添加任何其他药物活性化合物。然后，本发明的交联材料还可以用作延迟形式用于施用。
在本文中使用的合适的局部麻醉剂包括但不限于：氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米洛卡因(amylocaine)、奥布卡因(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、贝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布他卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、甲氯卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡铁卡因(carticaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、己基苯酰爱康因(cocaethylene)、***(***e)、环美卡因(cyclomethycaine)、二丁卡因(dibucaine)、二甲异喹(dimethysoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、地哌冬(diperodon)、双环胺(dycyclonine)、去水芽子碱(ecgonidine)、芽子碱(ecgonine)、氯乙烷、依替卡因(etidocaine)、β-优卡因(beta-eucaine)、尤普罗辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、海克卡因(hexylcaine)、羟丁卡因(hydroxytetracaine)、对氨基苯甲酸异丁酯(isobutyl p-aminobenzoate)、甲磺酸亮氨卡因(leucinocaine mesylate)、左沙屈尔(levoxadrol)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、美普卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、氯甲烷、麦替卡因(myrtecaine)、纳伊卡因(naepaine)、奥他卡因(octacaine)、奥索卡因(orthocaine)、羟乙卡因(oxethazaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、非那卡因(phenacaine)、苯酚、哌罗卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚乙二醇单十二醚(polidocanol)、丙吗卡因(pramoxine)、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、丙美卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、假***(psuedo***e)、吡咯卡因(pyrrocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇、丁卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉敏(zolamine)、及其盐。本文还可以使用两种或更多种上述麻醉剂的组合，例如利多卡因和一种或多种其他“卡因”麻醉剂如丙胺卡因的组合。
取决于本发明的交联材料和可注射组合物的预期用途，它可以以不同的包装提供。它可以在适于此目的的任何条件下储存，例如像在环境温度(例如，18℃至30℃，优选18℃至25℃)下、在冰箱中(例如，在0℃至15℃，优选3℃至10℃下)、在冷冻机中(例如，-30℃至0℃，优选-25℃至-10℃)、在深度冷冻机中(例如，-100℃至-300℃，优选-90℃至-55℃)、在液氮中、在干冰上，或者甚至一种或多种液态惰性气体中。例如，它可以在小瓶、注射器中提供。它可以经由注射(例如，经由注射器或滴管)施用于受试者。它可以以干燥状态、氢气、含有其他非水溶剂的凝胶和/或悬浮液、乳液、胶体或溶液的形式储存。
可以通过任何方式进行施用。在优选的实施方式中，施用是经由针头施用。在优选的实施方式中，施用是经由注射器施用，特别是经由注射器的皮内或皮下施用。施用可以是手动施用、使用机械泵施用或者甚至是自动施用。例如，Syringe One***可以用于施用。
本发明的交联材料以及本发明的可注射组合物可以用于任何目的。任选地，本发明的交联材料以及本发明的可注射组合物可以用于美容和/或治疗用途。可注射组合物可以是填充物，特别是软组织填充物，例如像软组织填充物，特别是皮肤填充物或***填充物。
如本文所用，术语“填充物”可以在最广泛的意义上理解为可以用于填充空腔或用作软组织填充物的任何试剂，优选软组织填充物。软组织填充物可以在最广泛的意义上理解为设计用于增加软组织缺损区域体积的材料。填充物可以施用于任何位置且通过任何类型的注射，并且可以适用于美容/麻醉应用以及用于治疗目的。填充剂通常可以是增加、替代或增大皮肤下体积的任何组合物，从而导致例如平滑皮肤皱纹、增大嘴唇、改善皮肤外观或治疗疤痕。它通常用于真皮区域，诸如表皮下或皮下组织上，并且因此可以皮下注射、皮下地注射或皮内注射，或一些组合注射。
本发明意义范围内的可注射组合物可以在正常条件和常压下通过注射器施用(从注射器中分配)。此外，本发明的填充物组合物优选地(基本上)是无菌的。优选地，可注射组合物适于注射入哺乳动物，特别是人。
本发明还涉及根据本发明的可注射组合物作为填充物(诸如软组织填充物，特别是皮肤填充物或***填充物)的用途。它可以被用作超级丰盈剂。在这种情况下，它可以被用作水凝胶。
本发明还涉及根据本发明的可注射组合物用于美容应用的用途。更优选地，本发明还涉及根据本发明的可注射组合物用于美容应用(包括面部和身体重塑以及年轻化)的用途。
因此，本发明的另一方面涉及本发明的可注射组合物用于美容应用的用途，所述美容应用包括面部和身体重塑以及年轻化，优选地包括填充皱纹、改善面部线条、***重建或增大、皮肤年轻化、臀部增大、颧骨重塑、软组织增大、填充面部皱纹、改善眉间线条、改善鼻唇沟、改善木偶纹、改善颊连合、改善唇周皱纹、改善鱼尾纹、改善眉毛、颧骨和颊脂垫的皮下支持、改善泪沟、改善鼻子外观、嘴唇增大、脸颊增大、口腔区域增大、眶下区域增大、解决面部不对称、改善下颌轮廓、下巴增大，或其两种或更多种的组合。
应当理解，如在本发明方法、交联材料和可注射组合物的上下文中给出的定义和优选实施方式在经适当修改后适用于本发明的用途。
在优选的实施方式中，本发明涉及本发明的可注射组合物用于减少面部褶皱的用途。
在一个实施方式中，本发明的用途可以是美容用途，优选非治疗用途。本发明的用途可以由美容、美容专业人员或健康护理专业人员进行。
在优选的实施方式中，本发明的可注射组合物的用途是用于改善皮肤质量、治疗细纹、治疗深纹或体积修复，或者作为***或臀部增大的超级丰盈填充物。
这种用途可以是治疗和/或美容用途。因此，换句话说，本发明涉及一种根据本发明的用于以下的方法中的可注射组合物：面部和身体重塑以及年轻化，优选地包括填充皱纹、改善面部线条、***重建或增大、皮肤年轻化、臀部增大、颧骨重塑、软组织增大、填充面部皱纹、改善眉间线条、改善鼻唇沟、改善木偶纹、改善颊连合、改善唇周皱纹、改善鱼尾纹、改善眉毛、颧骨和颊脂垫的皮下支持、改善泪沟、改善鼻子外观、嘴唇增大、脸颊增大、口腔区域增大、眶下区域增大、解决面部不对称、改善下颌轮廓、下巴增大，或其两种或更多种的组合。
本发明还涉及一种面部和身体重塑以及年轻化(优选地包括上述特定用途)的方法，所述方法包括施用根据本发明的可注射组合物。
换句话说，本发明还涉及一种用于以下的方法：面部和身体重塑以及年轻化，优选地包括填充皱纹、改善面部线条、***重建或增大、皮肤年轻化、臀部增大、颧骨重塑、软组织增大、填充面部皱纹、改善眉间线条、改善鼻唇沟、改善木偶纹、改善颊连合、改善唇周皱纹、改善鱼尾纹、改善眉毛、颧骨和颊脂垫的皮下支持、改善泪沟、改善鼻子外观、嘴唇增大、脸颊增大、口腔区域增大、眶下区域增大、解决面部不对称、改善下颌轮廓、下巴增大，或其两种或更多种的组合，其中将足够量根据本发明的可注射组合物施用于有需要的受试者。
如本文所用，受试者(也称为：个体)可以是任何动物，通常是哺乳动物，优选家养哺乳动物或人。特别优选地，个体是人。经治疗的人还可以被指定为患者，与他/她的健康状况无关。
重塑可以出于美容的目的进行，或者可以在例如像由事故或外科手术干预造成的组织损失后进行。例如，面部的一部分可能因事故而受伤。另一方面，可以通过皮下填充颧骨区域来突出颧骨。可以通过手术切除***或其一部分。另一方面，***重建或增大还可能具有审美的原因。
优选地，本发明的可注射组合物可以通过注射，诸如通过皮下或皮内注射，以有效量施用于个体。在优选的实施方式中，在此用途的背景下，可注射组合物是填充物。在更优选的实施方式中，在此用途的背景下，可注射组合物是填充物，特别是超级丰盈剂，并且所述用途包括在感兴趣的组织中，特别是皮下或皮内施用包含本发明的交联材料的组合物。例如，可注射组合物可以使用连续穿刺技术进行皮内或皮下注射。有效量是指足以实现有益的或期望的美容(审美)或治疗结果的(可注射)软组织填充物组合物的量。
在特别优选的实施方式中，在此用途的背景下，可注射组合物是一种填充物，其可以是超级丰盈剂，特别是软组织填充物，并且所述用途包括皮下或皮内施用包含本发明的交联材料的组合物。对于这些用途，根据本发明的交联材料是特别有益的，因为所述交联材料在水性环境(诸如体液)中相当稳定，并且由于其结构和特征能够侵入细胞。
本发明的另一方面涉及根据本发明的交联材料或可注射组合物，其用于有需要的个体的组织再生方法中。
换句话说，本发明还涉及一种用于再生有需要的个体的组织的方法，所述方法包括向有需要的个体施用根据本发明的交联材料或可注射组合物。出于治疗和/或美容目的，可以对有需要的个体进行组织再生。
应当理解，如在上述交联材料、方法和可注射组合物的上下文中给出的定义和优选实施方式在经适当修改后适用于再生个体组织的用途。
要再生的组织可以是任何组织。在一个优选的实施方式中，所述组织是软组织。在更优选的实施方式中，所述组织是选自真皮组织(包括真皮和皮下组织)和***的软组织。然后，所述方法可以用于重塑和年轻化，包括如上所述的用途。在本发明的另一个优选实施方式中，所述组织是关节(关节)组织。任选地，对于此用途，交联材料可以包含一种或多种刺激相应组织增殖的细胞增殖因子。
在可替代的优选实施方式中，所述组织是骨组织。然后，本发明的交联材料可以在骨组织打算生长的位置施用，例如像在骨折的间隙中或用于骨的伸长。任选地，对于此用途，交联材料可以包含一种或多种刺激骨细胞增殖的细胞增殖因子。
取决于具体用途，本领域技术人员将使用根据本发明的微粒交联材料，或者将使用根据本发明的交联材料块。
对于上述治疗和美容用途，根据本发明的交联材料是特别有益的，因为所述交联材料在水性环境(诸如体液)中相当稳定，并且由于其交联结构和表面特征能够侵入细胞。
如上所指出，本发明的交联材料是通过在将一个或多个丝心蛋白部分与一个或多个多糖部分缀合时获得的本发明的材料获得的。这种缀合物本身也具有意想不到的有益特性。
如本文所用，术语“大约”和“约”可以理解为包括相应数值的最大+/-10％偏差的范围。应当理解，也明确公开了具体值。
还应当理解，所述范围包括作为包含整个舍入范围的通常舍入值提供的数值。例如，“1mg”的范围包括从0.50至1.49mg的范围。
然而，本发明的数值也更详细地公开了一个或多个数量级的更详细的值。因此，例如，“1mg”也可以包括“1.0mg”的具体公开。
实施例和权利要求说明了本发明的实施方式。
实施例
材料与方法
原材料
透明质酸，不同的特性粘度(法国雅沃内的HTL生物技术公司)；
来自蚕的丝心蛋白的5％水溶液(意大利莱切的CareSilk有限公司(CareSilks.r.l.s.,Lecce,Italia))；
4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)(德国达姆施塔特的西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich,Darmstadt,Germany))；
水(脱盐水的内部***)；
盐酸利多卡因(美国夏洛特的雅宝公司(Albemarle Corp.,Charlotte,USA))
除非另有说明，否则所有的合成和测量都在环境条件(即，环境温度(诸如18℃-25℃，特别是大约20℃)和环境/大气压)下进行。
挤压力(EF)
使用仪器-TA.XT加Texture分析仪(英国萨里的Stable Micro Systems有限公司(Stable Micro Systems Ltd.,Surrey,UK))测量挤压力(EF)。将配备有30G TSK针头的注射器(荷兰奥斯特韦克的TSK Laboratory Europe公司(TSK Laboratory Europe,Oisterwijk,The Netherlands))放入仪器中，然后所述仪器以0.21mm/s(大约1.26cm/min)的恒定速度以30mm的距离按压注射器柱塞。记录通过针头压出注射器内容物所需的力，计算平均值，并将其记录为挤压力。
流变学
使用带有锥板(CP50-1，直径为50mm)几何形状的仪器-Anton Paar MCR 302(奥地利格拉茨的安东帕有限公司(Anton Paar GmbH,Graz,Austria))测量流变性。以0.1Hz至10Hz的频率扫描，在振荡模式下进行测量，在25℃下的恒定变形为0.1％。将1Hz下的储能模量(G')和损耗因子(tanδ)报告为测量结果。
实施例1-交联材料的制备以及润滑相的量对材料特性的影响
将特性粘度为2.8m3/kg的透明质酸(HA)(4.6g，对应于4.0g干聚合物)溶解在200g水中(聚合物浓度为20mg/g)。添加DMTMM(3.3g，对应于2.8g干材料-1当量关于HA的量)并将混合物搅拌1小时。此后，添加100mL丝心蛋白溶液(浓度为20mg/g，HA/丝心蛋白重量比为2/1)：将混合物搅拌2小时，然后停止搅拌。第二天，使用动态错流过滤(DCF Andritz，膜d＝152mm(奥地利格拉茨的安德里茨公司(Andritz AG,Graz,Austria)))和5mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液在室温下纯化交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)。然后将纯化的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)与不同量的润滑相(润滑相的浓度为30mg/g)混合。最后，将交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)填充到1mL注射器(Syringe One)中，并在127℃下灭菌8分钟。结果描述于下表1中。
表1.所获得的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)的特性。所有给定值均为两次测定的平均值
使用以下公式计算G'降低：
G'降低＝(灭菌之前1Hz下的G'-灭菌之后1Hz下的G')/灭菌之前1Hz下的G'
可以向凝胶中添加润滑相以减小挤压力，然而，在根据本发明的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)的情况下，润滑相令人惊讶地没有引起挤压力的减小。因此，可以制备没有润滑相的其他材料。
发现不含润滑相的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)可以具有与可商购获得的交联透明质酸产品Belotero Volume Lidocaine(瑞士普朗莱瓦特斯的Anteis S.A.公司(Anteis S.A.,Plan-les-Ouates,Switzerland))相比可比较或甚至更高的G'。虽然本文示例的HA/丝心蛋白凝胶之一在灭菌后具有大约278Pa的G'(Fib01A)，但可比较的透明质酸产品Belotero Volume Lidocaine具有大约270Pa的G'。但发现通过30G TSK针头的挤压力(EF)明显较低。所研究的HA/丝心蛋白凝胶具有大约12N的挤压力(EF)，而交联透明质酸(Belotero Volume Lidocaine)具有大约22N的挤压力(EF)。这可以支持HA/丝心蛋白凝胶可以提供类似的提升效果，如可商购获得的交联透明质酸产品Belotero VolumeLidocaine(因为相似的G')，同时为从业者提供甚至更好的注射性能。
此外，在这组实验中，交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)的G'在灭菌之后降低10％-25％，这显著低于对照实验(纯非交联透明质酸)情况下78％的G'降低。结果也示出于上表1中。
实施例2-交联材料的制备以及HA/丝心蛋白比率对材料特性的影响
将特性粘度为2.8m3/kg的透明质酸(HA)(3.5g，对应于3.0g干聚合物)溶解在150g水中(聚合物浓度为20mg/g)。添加DMTMM(2.5g，对应于2.1g干材料-1当量关于HA的量)并将混合物搅拌1小时。此后，添加150mL丝心蛋白溶液(浓度为20mg/g，HA/丝心蛋白重量比为1/1)。将混合物搅拌2小时，然后停止搅拌。第二天，使用动态错流过滤(DCF Andritz，膜d＝152mm(奥地利格拉茨的安德里茨公司))和5mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液在室温下纯化交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)。没有添加润滑相。最后，将交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)填充到1mL注射器(Syringe One)中，并在127℃下灭菌8分钟。结果描述于下表2中。
表2.所获得的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)的特性。所有给定值均为两次测定的平均值
发现交联材料中丝心蛋白量的增加导致具有更高G'的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)。
值得注意的是，这种交联材料具有较低的挤压力(尽管它具有较高的G')。对此的解释可能是丝心蛋白的触变性(剪切变稀)行为。可以获得具有较高且可调的G'和较低且可调的挤出力的交联材料。
实施例3-交联材料的制备以及透明质酸(HA)的特性粘度(IV)对材料特性的影响
将特性粘度为1.5m3/kg的透明质酸(HA)(3.5g，对应于3.0g干聚合物)溶解在150g水中(聚合物浓度为20mg/g)。添加DMTMM(2.5g，对应于2.1g干材料-1当量关于HA的量)并将混合物搅拌1小时。此后，添加150mL丝心蛋白溶液(浓度为20mg/g，HA/丝心蛋白重量比为1/1)。将混合物搅拌2小时，然后停止搅拌。第二天，使用动态错流过滤(DCF ANDRITZ，膜d＝152mm(奥地利格拉茨的安德里茨公司))和5mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液在室温下纯化交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)。没有添加润滑相。最后，将交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)填充到1mL注射器(Syringe One)中，并在127℃下灭菌8分钟。结果描述于下表3中。
表3.所获得的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)的特性。所有给定值均为两次测定的平均值
实施例4-HA/丝心蛋白凝胶的酶促降解
为了研究交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)是否还可以用作可逆填充物，用来自绵羊睾丸的透明质酸酶处理所述材料。即，经由差别加权称量大约0.50g凝胶，并将其置于Anton Paar MCR 302流变仪(奥地利格拉茨的安东帕有限公司)的CP50-1(锥板)***的板上。将含有50U透明质酸酶的150μLWFI的均匀水溶液添加到所述板上的水凝胶顶部。将透明质酸酶水凝胶混合物通过例如，移液管尖端手动匀浆大约10秒。此后，在37℃下以振荡模式在0.1％的变形和1Hz的频率下进行测量。测量持续时间为60分钟，记录速度为1点/分钟。
由非交联HA制备的凝胶降解最快。此后，是由交联HA组成的凝胶(瑞士普朗莱瓦特斯的Anteis S.A.公司)和含有丝心蛋白的凝胶降解最慢。这可能表明与典型HA交联凝胶相比，含有丝心蛋白的凝胶寿命延长。结果描述于下表4中。
表4.水凝胶(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)的酶促降解。所有给定值均为两次测定的平均值
使用以下公式计算G'降低：
G'降低＝(处理之前1Hz下的G'-用透明质酸酶处理之后1Hz下的G'(在10min时))/处理之前1Hz下的G'
实施例5-加速稳定性研究
为了测试稳定性，将批次Fib05(参见上文)与利多卡因混合(以制备新批次：Fib05L)并置于40℃(加速条件)下的气候室中。通过在不同时间点(第4、8和12周)测量凝胶的流变特性和挤压力(使用30G TSK针头)进行表征。所有测量均一式三份进行。结果描述于以下表5中。
表5.在40℃和75％相对湿度下温育，所获得的交联材料(此处示例为HA/丝心蛋白凝胶)随时间的特性
发现交联材料(在此示例为HA/丝心蛋白凝胶)随时间是相对稳定的。即使在40℃和75％相对湿度下12周后，也没有发现明显的特性退化或劣化。
总之，发现本发明的交联材料可以非常好和有效地制备，任选地在单个批次中，没有负担。所述材料具有良好的可注射特性，并且似乎具有剪切变稀/触变性特性。所述材料具有相对高的粘度和相对高的生物/酶稳定性。这些特性使得本发明的交联材料特别可用作软组织填充物，诸如皮肤或***填充物。所述材料可储存性好，并具有相对高的保存期限。

Claims (15)

1.一种用于制备交联材料的方法，所述方法包括：
(i)使以下组分相互接触：
(A)一个或多个包含伯氨基残基或其盐的丝心蛋白部分，
(B)一个或多个包含羧酸残基或其盐的多糖部分，
(C)一种或多种活化剂，其引起羧酸残基与氨基残基的反应，从而形成酰胺键，和
(D)一种或多种溶剂；以及
(ii)使至少一些所述羧酸残基与至少一些所述伯氨基残基反应以形成酰胺键，从而使所述一个或多个丝心蛋白部分与所述一个或多个多糖部分共价缀合；以及
(iii)任选地纯化从步骤(ii)获得的所述交联材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个丝心蛋白部分具有至少5kDa、在5至1000kDa范围内、在5至400kDa范围内、在10至400kDa范围内、或在100至150kDa范围内的重均分子量，优选地其中所述一个或多个丝心蛋白部分是丝素蛋白部分，更优选与天然昆虫或蜘蛛丝素蛋白部分具有至少80％序列同源性的丝素蛋白部分。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述一个或多个多糖部分包含透明质酸、肝素原、硫酸软骨素和羧甲基纤维素，或由其组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个多糖部分包含一个或多个透明质酸部分或由其组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述一个或多个多糖部分具有至少50kDa，特别是在50至4000kDa范围内的重均分子量。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述一个或多个丝心蛋白部分(A)与所述一个或多个多糖部分(B)之间的质量比A:B在5:1至1:20的范围内，优选地在1:1至1:10的范围内，特别是在1:1至1:5的范围内。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种活化剂选自由以下组成的组：
(C1)一种或多种基于三嗪的活化剂，特别是选自由4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉、其盐和/或2-氯-4,6,-二甲氧基-1,3,5-三嗪及其组合组成的组；
(C2)一种或多种碳二亚胺活化剂，特别是选自由N,N'-二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺，及其两种或更多种的组合组成的组；以及
(C3)其组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉或其盐，特别是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法的特征进一步在于：
(a)其包括通过过滤、洗涤和/或透析，特别是错流过滤、渗滤和/或死端过滤来纯化所述交联材料的步骤(iii)；
(b)步骤(i)和(ii)在单个批次中进行；和/或
(c)步骤(i)和(ii)以及任选的步骤(iii)在5℃至90℃、特别是18℃至30℃范围内的温度下进行。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(i)使以下组分相互接触：
(A)一个或多个重均分子量为至少5kDa的丝素蛋白部分，其包含伯氨基残基或其盐，
(B)一个或多个重均分子量为至少50kDa的透明质酸部分，其包含羧酸残基或其盐，
(C)一种或多种促进作用从而形成酰胺键的基于三嗪的活化剂，特别是其中所述活化剂是4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉或其盐；以及
(D)一种或多种溶剂；以及
(ii)使至少一些所述羧酸残基与至少一些所述伯氨基残基反应以形成酰胺键，从而使所述一个或多个丝素蛋白部分与所述一个或多个透明质酸共价缀合；以及
(iii)任选地纯化从步骤(ii)获得的所述交联材料。
11.一种交联材料，其能够由根据权利要求1至10中任一项所述的方法获得。
12.一种交联材料，其包含以下或由其组成：
(A)一个或多个重均分子量为至少5kDa的丝心蛋白部分，和
(B)一个或多个重均分子量为至少50kDa的透明质酸部分，
其中所述一个或多个丝心蛋白部分经由酰胺键与所述一个或多个透明质酸部分共价缀合，而没有互连的接头结构。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的交联材料，其中所述交联材料的特征进一步在于其不包含：
(a)酰亚胺基团；
(b)亚胺基团；
(c)环氧基团；和
(d)异生素接头部分。
14.一种可注射组合物，其包含根据权利要求10至12中任一项所述的交联材料和液体或粘性载剂以及任选的其他组分，优选地其中所述交联材料是水凝胶和/或超级丰盈剂。
15.根据权利要求14所述的可注射组合物用于美容应用的用途，所述美容应用包括面部和身体重塑以及年轻化，优选地包括填充皱纹、改善面部线条、***重建或增大、皮肤年轻化、臀部增大、颧骨重塑、软组织增大、填充面部皱纹、改善眉间线条、改善鼻唇沟、改善木偶纹、改善颊连合、改善唇周皱纹、改善鱼尾纹、改善眉毛、颧骨和颊脂垫的皮下支持、改善泪沟、改善鼻子外观、嘴唇增大、脸颊增大、口腔区域增大、眶下区域增大、解决面部不对称、改善下颌轮廓、下巴增大，或其两种或更多种的组合。
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