CN103910886B - 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 - Google Patents
半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103910886B CN103910886B CN201410110610.7A CN201410110610A CN103910886B CN 103910886 B CN103910886 B CN 103910886B CN 201410110610 A CN201410110610 A CN 201410110610A CN 103910886 B CN103910886 B CN 103910886B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compound
- reaction
- hyaluronic acid
- halfcystine
- conjugates
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 CC(C)(C)OC(N1C(C)(C)SCC1C(*)=O)=O Chemical compound CC(C)(C)OC(N1C(C)(C)SCC1C(*)=O)=O 0.000 description 4
- ZTVXWWUBFQHRNP-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)OC(N1C(C)(C)SCC1C(C)=O)=O Chemical compound CC(C)(C)OC(N1C(C)(C)SCC1C(C)=O)=O ZTVXWWUBFQHRNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYZNHPUWNUGYOV-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)OC(N1C(C)(C)SCC1C(O)=O)=O Chemical compound CC(C)(C)OC(N1C(C)(C)SCC1C(O)=O)=O MYZNHPUWNUGYOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APQPRKLAWCIJEK-UHFFFAOYSA-O NCCSSCC[NH3+] Chemical compound NCCSSCC[NH3+] APQPRKLAWCIJEK-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。该方法是通过修饰透明质酸的羟基，得到具有稳定醚键的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，在此反应过程中引入了四丁基氢氧化铵这种新方法增加了透明质酸的溶解度并且提高了反应效率，所得到的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物具有巯基活性基团，不但增加了透明质酸的粘附性，还可继续功能化，且本发明运用所制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过自然化学连接反应或迈克尔加成反应生成了可注射原位形成的水凝胶，经流变学研究具有良好的流变学性质，并且凝胶性能可控，在生物医药领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法，以及其在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用，属于生物医药领域。
背景技术
水凝胶(Hydrogel)是亲水性的聚合物的网状结构，可以吸收和保留大量的水分，在水溶液中高度膨胀，具有良好的生物相容性。它们在医药生物领域广泛地应用于外科封闭剂和粘合剂、药物释放、组织填充、组织修复和组织工程。水凝胶被用于创伤敷料时与人体组织直接接触，可防止体外微生物感染，有效地防止体液的损失，促进伤口愈合，还能将药物包裹在水凝胶中，药物即可透过凝胶缓慢释放到受伤部位。例如有文献研究用藻酸钙纤维制成的Sorbalgon水凝胶，用于创伤敷料促进创面愈合【HajekM，SedlarikKM，Advantagesofalginatebandagesforcoverageofextensiveandpoorlyhealingwounds，RozhiChir，1992，71(324):152】。也有文献报导水凝胶被用于药物释放的载体，即将药物包裹在水凝胶内，通过注射或者移植入生物体后，维持长时间缓慢可控的释放出药物，长时间发挥药物作用，例如Miyata等制备了抗原-抗体敏感性水凝胶，用于药物释放载体，起到特异性药物缓释的作用。【SchmedlenRH，MastersKS，WestJL.Photocrosslindablepolyvinylalcohol-jydrogelsthatcanbemodifiedwithcelladhisionpeptidesforuseintissueengineering.Biomaterials，2002，23:4325】。同时由于水凝胶优良的物理性质与生物学特性，还可应用于美容、皮肤移植是皮片的固、腹腔手术后防止粘连以及颅腔手术的封闭等方面，此方面的应用研究越来越受学者们的关注。
虽然其在医药中的应用取得了巨大的进展，发展满足临床需要的在温和条件下不使用有毒试剂的可注射原位形成的共价交链的水凝胶仍然面临着挑战。大部分在组织工程方面的应用的主要缺陷就是需要外科手术。然而，可注射原位形成的水凝胶则具有显著的优势：不经过手术而通过针管注射，以最小程度地对机体组织侵入，能填充任意形状的缺损，且能与治疗药物混合，起到药物缓释的作用。
在生物界，硫酯类化合物(Thioesters)是广泛存在的中间体，比如乙酰辅酶A。在酶的催化下，硫酯类化合物参与生物体内重要成分的合成，比如多肽激素和脂类。在体外，硫酯类化合物与一级氨类化合物的化学反应相对地不活泼。然而，人们发现，硫酯类化合物和N-末端半光氨酸的化合物在生理条件下(磷酸盐缓冲溶液，pH7-9)混合后，半光氨酸的巯基和硫酯类化合物的硫醇发生交换，形成一个五圆环的中间体后自发地重排，产生一个新的酰胺键，称为自然化学连接(NativeChemicalLigation，NCL)。这个化学反应已用于多肽，蛋白质，酶类的人工合成，也用于多肽自组装产生重复序列的多肽。有报道是使用NCL反应把短多肽自主装的水凝胶通过延长多肽长度而增加了预先组装多肽水凝胶的硬度，也有文献中用NCL反应把分枝的聚乙二醇结合物交链形成共价交链的水凝胶。作为水凝胶共价交链的方法，NCL有几个明显的优点：①具有化学选择性，硫脂只与半胱氨酸、或N-末端半光氨酸的化合物反应形成新的酰胺键，不受其他硫醇和巯基存在的干扰；②在温和的条件下，不使用催化剂、引发剂等可能有毒的化合物而高效反应；③与其它使用巯基的化学连接反应形成的水凝胶不同，自然化学连接反应在形成新的酰胺键的同时，还在骨架上产生一个巯基基团。那么，这个巯基可以根据不同的目的用来进一步在骨架上功能化水凝胶。而且，巯基化(硫醇化)的聚合物具有更好的生物黏附性。④另外，硫脂结构中的硫醇在NCL反应时释放到溶液中，那么，在设计硫脂的时候，有可能把这个硫醇设计为巯基化的药物和细胞生长因子的前体，从而在水凝胶形成的同时，释放这些药物和生长因子到水凝胶中。因此，利用NCL反应的特点和优点得到的可注射原位形成的共价交链的水凝胶具有显著的优越性。例如：有文献以聚乙二醇为主体，末端硫酯或半胱氨酸功能化，通过自然化学连接反应得到聚乙二醇水凝胶【Bi-HuangHu,JingSu,andPhillipB.Messersmith，Hydrogelscross-linkedbynativechemicalligation，Biomacromolecules2009,10,2194-2200】。
透明质酸(Hyaluronicacid,HA)广泛分布于人体各部位，为关节腔滑液的主要成分，为软骨基质的成分之一，它在关节间减少组织间的磨擦，发挥润滑作用。HA是一种直链的高分子多糖类聚合物，由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸双糖单位组成。在细胞外基质中，透明质酸通过与细胞和其他成分特异和非特异的结合，发挥着重要的组织作用，比如，透明质酸是细胞表面受体CD44的配体，而CD44受体参与多种细胞过程，比如细胞黏附、细胞迁移和增值。由于其重要的生理作用，机体或创面直接注射透明质酸后可明显减轻并消除组织的炎症反应，促进创面与伤口愈合。但是，由于透明质酸在体内快速地被清除，这样的缓解作用也是短暂的，所以可注射原位形成的共价交联的透明质酸水凝胶就显示出了它的优越性。
共价交链的透明质酸的水凝胶主要是通过其羧基的反应制备可以发生交链的衍生物得到透明质酸水凝胶。例如：有文献是修饰透明质酸的羧基，得到通过酰胺键结合并且末端有游离巯基的透明质酸结合物，再通过与聚乙二醇衍生物交联形成可注射的透明质酸水凝胶【XiaoZhengShu,YanchunLiu,FabioS.Palumbo,YiLuo,GlennD.Prestwich，Insitucrosslinkablehyaluronanhydrogelsfortissueengineering，Biomaterials2004,25,1339–1348】。也有文献通过己二酸二酰肼修饰，并且加入EDC与HOBt作为耦合剂与催化剂，修饰透明质酸的羧基，得到透明质酸结合物再通过交联形成透明质酸凝胶【YoonYeo,ChristopherB.Highley,EvangeliaBellas,TaichiIto,RobertMarini，RobertLanger,DanielS.Kohane，Insitucross-linkablehyaluronicacidhydrogelspreventpost-operativeabdominaladhesionsinarabbitmodel，Biomaterials2006,27,4698-4705】。也有通过与透明质酸的羟基反应形成水凝胶的交链化学反应，交链化合物主要是1，4-丁二醇二缩水甘油醚，聚乙二醇二缩水甘油醚和二乙烯基砜，也有先用缩水甘油醚和透明质酸的羟基反应，再进行光聚合反应形成水凝胶。例如：中国专利申请201010250802.X《一种大分子光交联剂制备透明质酸凝胶的方法》，其用透明质酸为主体，大分子光交联剂为交联剂，在紫外光的照射下制备透明质酸水凝胶。再例如：中国专利申请03156633.2《一种透明质酸凝胶及其制备方法》与中国专利申请200610024700.X《一种交联透明质酸凝胶制剂及其制备工艺》分别用缩水甘油醚与二乙烯基砜对透明质酸的羟基进行交联反应，得到透明质酸凝胶。并且也有文献通过光照反应修饰透明质酸的羟基，得到通过酯键连接的透明质酸修饰物，再通过交联反应得到透明质酸水凝胶【JimmyMergy,AudreyFournier,EmilieHachet,RachelAuz_ely-Velty，Modificationofpolysaccharidesviathiol-enechemistry:aversatileroutetofunctionalbiomaterials.J.Polym.Sci.PartA:Polym.Chem.2012,50，4019–3028】。这些交联的透明质酸保留在体内的时间都有明显延长。
存在于人体内具有重要生理功能的透明质酸经过交链后形成的水凝胶应该是比较理想的生物材料，它克服了天然透明质酸半衰期短的缺点。但是，通过透明质酸的羧基制备的交链的水凝胶，可能会产生一些副作用。细胞CD44受体据认为是通过透明质酸的负电荷与透明质酸作用【Morra,M.,Engineeringofbiomaterialssurfacesbyhyaluronan,Biomacromolecules2005,6:1205-1223.】。而减少透明质酸的负电荷则会影响细胞CD44受体与透明质酸的作用，从而会降低细胞修复损伤的能力【MBHerrera,B.B.,SBruno，LMorando1,GMauriello-Romanazzi,FSanavio3,IStamenkovic,LBianconeandGCamussi,ExogenousmesenchymalstemcellslocalizetothekidneybymeansofCD44followingacutetubularinjury,KidneyInt.2007,72:430-441.】。而通过其羟基反应得到透明质酸水凝胶往往需要通过光照反应或是用其他方法已经预先形成的水凝胶，这样就不能实现原位注射。因此，本发明以透明质酸为原料，通过其羟基反应(不改变其负电荷)，制备具有良好生物相容性、能够通过自然化学连接反应得到的可原位注射的共价交联透明质酸水凝胶具有显著地优越性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
本发明的另一目的在于提供一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的合成方法。
本发明的再一目的在于提供半胱氨酸功能化的透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，其结构式为：
n为0～30，x为200～3000。一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，包括以下步骤：
1)取结构式为的化合物1为原料，在丙酮加热回流条件下，发生环化反应，生成结构式为的化合物2；
2)将化合物2与二碳酸二叔丁酯反应，生成氨基被叔丁氧羰基(Boc)保护的结构式为的化合物3；
3)将化合物3与N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺条件下，发生酯化反应，生成结构式为的化合物4；
4)将化合物4与胱胺在碱性条件下，发生酰化反应，生成结构式为的化合物5；
5)将化合物5的二硫键还原，生成结构式为的化合物6；
6)将化合物6与聚乙二醇类化合物在碱性条件下，发生环氧乙烷的开环反应，生成结构式为的化合物7；
7)将化合物7与透明质酸在四丁基氢氧化铵条件下，发生环氧乙烷开环反应，生成结构式为的化合物8；
8)将化合物8脱去叔丁氧羰基(Boc)保护基，再于减压浓缩条件下，发生开环反应，生成结构式为的化合物9，即半胱氨酸功能化的透明质酸结合物；其中，n为0～30，x为200～3000。
进一步的，一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其制备方法具体包括以下步骤：
1)化合物2的制备：取化合物1半胱氨酸盐酸盐，加入干燥丙酮回流2～10h，减压浓缩至不多于总反应液体积三分之一的体积，放入冰箱不少于0.5h，析出结晶，过滤取滤渣，得到化合物2，其中丙酮与化合物1的体积质量比不小于20；
2)化合物3的制备：把化合物2用乙腈溶解，加入二碳酸二叔丁酯，混匀后逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，15℃～37℃搅拌反应24～72h，减压浓缩溶剂，再加入***或环己烷继续减压浓缩，再加入***或环己烷，用硅藻土过滤，滤液依次用0.01～0.1mol/LHCl溶液、H2O、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物3，其中二碳酸二叔丁酯、N,N-二异丙基乙胺的物质的量独立为化合物2的1.1～3倍；
3)化合物4的制备：将化合物3和N-羟基琥珀酰亚胺用四氢呋喃溶解，0～4℃冰浴，往其中滴加N,N'-二环己基碳二亚胺的四氢呋喃溶液，混合均匀后反应3～12h，至反应液用薄层色谱检测反应完全，放入0～4℃冰箱静置0.5～12h，过滤取滤液，经减压浓缩溶剂，异丙醇重结晶，得到化合物4，其中N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺的物质的量独立为化合物2的1.05～1.5倍；
4)化合物5的制备：用水溶解摩尔量相当于化合物4摩尔量0.525～0.6倍的胱胺二盐酸盐，用水溶解摩尔量相当于胱胺二盐酸盐摩尔量4倍的碳酸钠，滴加在胱胺二盐酸盐水溶液中，冰浴，搅拌均匀；用四氢呋喃溶解化合物4，滴加入上述反应液中，15℃～37℃反应6～24h，直至薄层色谱检测反应完全；减压浓缩溶剂，调节pH为3～7，再用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，有机相用0.01～0.1mol/LHCl溶液、H2O、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物5；
5)化合物6的制备：将化合物5的乙醇溶液中，再加入0.5～1.0倍体积的水，冰浴搅拌均匀，再缓慢加入硼氢化钠，待不再有气泡冒出，置于15～37℃搅拌反应4～12h，至薄层色谱检测反应完全，再加入相对反应液体积2～4倍的水终止反应；调节pH为3～5，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，加压浓缩得到化合物6，其中，硼氢化钠的物质的量为化合物5的5～10倍；
6)化合物7的制备：往聚乙二醇类化合物的乙腈溶液中加入碳酸氢钠的水溶液，15～37℃搅拌均匀，通氩气，再往其中滴加化合物6的乙腈溶液，滴加完后通氩气，反应液中乙腈：水的体积比为(2:3)～(3:2)，封口，15～37℃搅拌反应6～24h，直至薄层色谱检测反应完全、Ellamn试剂显色不显黄色为止，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相用水洗后干燥，过滤取滤液，减压浓缩得到化合物7，其中，碳酸氢钠、化合物6的物质的量分别为聚乙二醇类化合物的1～2倍、1.1～1.5倍；
7)化合物8的制备：称取其分子量为10万～100万的透明质酸，加入四丁基氢氧化铵水溶液，得到透明质酸反应液，其中透明质酸反应液质量浓度为5％～20％，分1～4次加入化合物7的乙腈溶液，15～37℃搅拌反应6～72h，用0.01～1mol/LHCl溶液中和反应液，透析，冻干，饱和氯化钠乙醇溶液洗涤，干燥，得到化合物8，其中，四丁基氢氧化铵、化合物7的物质的量分别为透明质酸伯醇基的0.5～2倍、0.5～10倍，乙腈体积为四丁基氢氧化铵水溶液的0.5～2.5倍；
8)化合物9的制备：将化合物8加入体积百分数为80～100％的三氟乙酸水溶液中，使化合物8的浓度为5～20g/L，15～37℃搅拌反应3～6h，减压浓缩，加入体积浓度为45～55％的乙醇溶液，30～40℃减压浓缩3～10次，用Ellman试剂检测显黄色后，用饱和氯化钠乙醇溶液析出产物，洗涤干净，干燥，得到产物化合物9，即半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
进一步的，上述步骤4)和5)中所述调节pH的调节剂为体积浓度为0.1％～2％HCl溶液。
进一步的，上述步骤7)中所述透析用到的透析液为质量百分数0.1～1.5％氯化钠和体积百分数30～80％乙醇的水溶液，至少透析48小时，至少换透析液4次。
一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。
进一步的，上述应用具体为可注射原位形成的水凝胶由半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过迈克尔加成反应或自然化学连接反应生成。
进一步的，上述聚乙二醇结合物选自结构式为的聚乙二醇丙烯酸酯结合物、结构式为的聚乙二醇硫酯结合物中一种，其中m为50～500，y为2～8，即聚乙二醇结合物支链的个数为2～8，R基团选自中一种。
进一步的，上述聚乙二醇硫酯结合物选自3-巯基丙酸乙酯与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、N-乙酰-L-半胱氨酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-巯基乙烷磺酸钠与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、4-巯基苯基乙酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-二甲氨基乙硫醇与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合中一种，其中聚乙二醇硫酯结合物的聚合度为50～500，支链个数为2～8。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新型的半胱氨酸透明质酸结合物及其制备方法，该透明质酸衍生物具有末端半胱氨酸，即使通过自然化学连接的方法形成水凝胶后仍保持着末端游离巯基，所以可以根据不同的目的进一步在骨架上功能化，而且巯基化(硫醇化)的聚合物具有更好的生物黏附性，扩大了透明质酸的应用，为生物医药领域提供了一种理想的透明质酸衍生物；并且由该半胱氨酸透明质酸结合物制备得到的可注射原位形成的共价交联透明质酸水凝胶可实现可注射且在生理条件下原位形成，是生物材料领域的重大突破，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中步骤1)合成的中间体的核磁共振氢谱图；
图2为实施例1中步骤2)合成的中间体的核磁共振氢谱图；
图3为实施例1中步骤3)合成的中间体的核磁共振氢谱图；
图4为实施例1中步骤4)合成的中间体的核磁共振氢谱图；
图5为实施例1中步骤6)合成的中间体的UPLC-MS谱图；；
图6为实施例1中步骤7)合成的中间体的核磁共振氢谱图；
图7为实施例1中步骤8)合成的终产物半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的核磁共振氢谱图；
图8为实施例4中步骤1)合成的中间体EMPSA的核磁共振氢谱图；
图9为实施例4中步骤1)合成的中间体四分支聚乙二醇硫酯结合物的核磁共振氢谱图；
图10为半胱氨酸吸光度的标准曲线；
图11为实施例4制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图，储存模量G′和损耗模量G″；
图12为实施例4制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描细节图；
图13为实施例4制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学频率扫描图；
图14为实施例4制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学应力扫描图；
图15为实施例5制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图；
图16为实施例5制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学频率扫描图；
图17为实施例5制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学应力扫描图；
图18为实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图；
图19为实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学频率扫描图；
图20为实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学应力扫描图；
图21为实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图；
图22为实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学频率扫描图；
图23为实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学应力扫描图。
具体实施方式
可注射的原位形成共价交联的透明质酸水凝胶的制备方法：
(1)半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备
合成路线如下所示：
结合上述合成路线，具体描述半胱氨酸修饰的透明质酸复合物的合成步骤：
①化合物2的制备：取化合物1半胱氨酸盐酸盐，至少加入相对于化合物1质量20倍体积(体积/质量)的干燥丙酮回流2～10h，减压浓缩至不多于总反应液体积三分之一体积，放入冰箱不少于0.5h，析出结晶，布氏漏斗过滤，得到化合物2，其化学结构式见合成路线中的化合物2；
②化合物3的制备：把化合物2用乙腈溶解，加入摩尔量相当于化合物2的摩尔量1.1～3倍的二碳酸二叔丁酯，混匀后逐滴加入摩尔量相当于化合物2的摩尔量1.1～3倍的N,N-二异丙基乙胺，15℃～37℃搅拌反应24～72h，减压浓缩溶剂，再加入***或环己烷继续减压浓缩，再加入***或环己烷，用硅藻土过滤，滤液用0.01～0.1mol/LHCl溶液、H2O、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物3，其化学结构式见合成路线中的化合物3；
③化合物4的制备：将化合物3和摩尔量相当于化合物3的摩尔量1.05～1.5倍的N-羟基琥珀酰亚胺用四氢呋喃溶解，0℃～4℃冰浴，将摩尔量相当于化合物3摩尔量的1.05～1.5倍的N,N'-二环己基碳二亚胺用四氢呋喃溶解，滴加在反应液中，反应3～12h，至反应液用薄层色谱检测不再变化，放入0～4℃冰箱静置0.5～12h，过滤取滤液，减压浓缩溶剂，异丙醇重结晶，得到化合物4，其化学结构式见合成路线中的化合物4；
④化合物5的制备：用水溶解摩尔量相当于化合物4摩尔量0.525～0.6倍的胱胺二盐酸盐，用水溶解摩尔量相当于胱胺二盐酸盐摩尔量4倍的碳酸钠，滴加在胱胺二盐酸盐水溶液中，冰浴，搅拌均匀；用四氢呋喃溶解化合物4，滴加入上述反应液中，15℃～37℃反应6～24h，直至TLC检测反应完全；减压浓缩溶剂，用体积浓度为0.1％～2％HCl溶液酸化至pH3～7，再用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，有机相用0.01～0.1mol/LHCl溶液、H2O、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物5；其化学结构式见合成路线中的化合物5；
⑤化合物6的制备：把化合物5用乙醇溶解后加入体积的0.5～1.0倍的水，冰浴搅拌均匀，缓慢加入摩尔量相当于化合物5摩尔量5～10倍的硼氢化钠，待不再有气泡冒出，置于15～37℃搅拌反应4～12h，待薄层色谱检测反应液不再有变化，加入相对于反应液体积2～4倍体积水终止反应；用0.01-1mol/LHCl溶液酸化反应液为pH3～5，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，加压浓缩得到化合物6，其化学结构式见合成路线中的化合物6；
⑥化合物7的制备：把聚乙二醇类化合物用乙腈溶解，用水溶解摩尔量相当于聚乙二醇类化合物摩尔量1～2倍的碳酸氢钠并加入其中，15～37℃搅拌均匀，通氩气，将摩尔量相当于聚乙二醇类化合物摩尔量1.1～1.5倍的化合物6用乙腈溶解，滴加入反应液中，滴加完后通氩气，反应液中乙腈：水的体积比为(2:3)～(3:2)，封口，15～37℃搅拌反应6～24h，反应至薄层色谱检测、Ellamn试剂显色不显黄色为止，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相用水洗后干燥，过滤取滤液，减压浓缩得到化合物7，其化学结构式见合成路线中的化合物；
⑦化合物8的制备：称取其分子量为10万～100万的透明质酸(HA)，加入摩尔量相当于透明质酸伯醇基摩尔量的0.5～2倍四丁基氢氧化铵水溶液，得到透明质酸反应液，其中透明质酸反应液质量浓度为5％～20％，用体积为四丁基氢氧化铵水溶液0.5～2.5倍的乙腈溶解摩尔量相当于透明质酸伯醇基摩尔量0.5～10倍的化合物7，分1～4批加入上述反应液中，15～37℃搅拌反应6～72h，用0.01～1mol/LHCl溶液中和反应液，透析，冻干，饱和氯化钠乙醇溶液洗涤，干燥，得到化合物8，其化学结构式见合成路线中的化合物8；
其中的透析时所用透析液为0.1％-1.5％氯化钠的30％-80％乙醇溶液(即含有质量百分数为0.1％-1.5％氯化钠和体积百分数为30％-80％乙醇的水溶液)透析至少48小时，换透析液至少四次；
⑧化合物9的制备：把化合物8用体积百分数为80～100％的三氟乙酸水溶液，使化合物8的浓度为5～20g/L，15～37℃搅拌反应3～6h，减压浓缩，加入体积浓度为45～55％的乙醇溶液，30～40℃减压浓缩3～10次，用Ellman试剂检测显黄色后，用饱和氯化钠乙醇溶液析出产物，洗数次，干燥，得到产物化合物9，即半胱氨酸透明质酸结合物，其化学结构式见合成路线中的化合物9。
(2)聚乙二醇结合物的准备
聚乙二醇结合物优选为结构式为的聚乙二醇丙烯酸酯结合物、结构式为的聚乙二醇硫酯结合物中一种，其中m为50～500，y为2～8，即聚乙二醇结合物支链的个数为2～8，R基团选自中一种。
其中，聚乙二醇硫酯结合物优选为3-巯基丙酸乙酯与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、N-乙酰-L-半胱氨酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-巯基乙烷磺酸钠与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、4-巯基苯基乙酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-二甲氨基乙硫醇与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合中一种，其中聚乙二醇硫酯结合物的聚合度为50～500，支链的个数为2～8。
(3)可注射原位形成的水凝胶的制备
将化合物9与聚乙二醇结合物通过迈克尔加成反应或自然化学连接反应即可获得可注射原位形成的水凝胶，具体操作为：使化合物9与聚乙二醇结合物在5％(m/v)NaHCO3水溶液或pH为7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，20℃～37℃至反应完全，即可。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1：半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备
1)Apc的制备：取10g半胱氨酸盐酸盐加入1000mL干燥丙酮回流6h，减压浓缩至约200mL，放入冰箱过夜，析出结晶，布氏漏斗过滤，得到中间体白色结晶Apc(化合物2)质量11g，产率为88％，其核磁共振氢谱如图1所示。
2)Boc-Apc的制备：把10.9g(55mmol)化合物2用250mL乙腈溶解，加入16g(73mmol)二碳酸二叔丁酯，混匀后逐滴加入12.8g(99mmol)N,N-二异丙基乙胺，28℃搅拌反应48h。减压浓缩溶剂，再加入***或环己烷继续减压浓缩，再加入***或环己烷，用硅藻土过滤，滤液用0.01mol/LHCl溶液、H2O各洗3次，饱和NaCl洗1次，无水硫酸镁干燥2小时，减压浓缩，得到中间体Boc-Apc(化合物3)质量为6g，产率为40％，其核磁共振氢谱如图2所示。
3)Boc-Apc-OSU的制备：把3g(11.5mmol)化合物3与1.45g(12.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺用30mL四氢呋喃溶解，0℃冰浴，2.6g(12.6mmol)N,N'-二环己基碳二亚胺用30mL四氢呋喃溶解，滴加在反应液中，反应6h，薄层色谱检测反应液不再变化，放入冰箱静置0.5h，过滤，滤液减压浓缩溶剂，异丙醇重结晶，得到中间体白色晶体Boc-Apc-OSU(化合物4)质量为3.7g，产率为90.42％。
4)Boc-Apc-cys的制备：用20mL超纯水溶解2.24g(9.94mmol)半胱氨酸二盐酸盐，再用10mL超纯水溶解4.2g碳酸钠，滴加在半胱氨酸二盐酸盐水溶液中，冰浴，搅拌。用60mL四氢呋喃溶解化合物4，滴加入上述反应液中，28℃反应12h，薄层色谱检测反应完全。减压浓缩溶剂，用质量百分数为2％HCl溶液酸化至pH5，再用乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯相用0.01mol/LHCl溶液、H2O各洗三次，饱和NaCl洗一次，无水硫酸镁干燥2小时，减压浓缩，得到中间体透明油状物Boc-Apc-cys(化合物5)质量为5.7g，产率为94.4％。
5)Boc-Apc-SH的制备：将6.37g(10mmol)化合物5用30mL乙醇溶解后，加入30ml超纯水，冰浴搅拌，缓慢加入3.8g(100mmol)硼氢化钠，待不再有气泡冒出，28℃搅拌反应6h，薄层色谱检测反应液不再有变化，加入150mL超纯水终止反应。用1mol/LHCl溶液酸化反应液pH＝3，二氯甲烷萃取3次，合并的二氯甲烷相水洗3次，通氩气，封口无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩得到中间体透明油状物Boc-Apc-SH(化合物6)质量为8.38g，产率为99.8％。
6)Boc-Apc-环氧乙烷的制备：把1.84mL(10mmol)1,4-丁二醇二缩水甘油醚用5ml乙腈溶解，用30mL超纯水溶解840mg(10mmol)碳酸氢钠加入其中，28℃搅拌，通氩气，将3.52g(11mmol)化合物6用15mL乙腈溶解，滴加入上述反应液中，滴加完后通氩气，封口，28℃搅拌反应12h，薄层色谱检测、Ellamn试剂显色不显黄色，停止反应，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷萃取水相3次，合并有的二氯甲烷相，用水洗3次后，无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩得到中间体透明油状物Boc-Apc-环氧乙烷(化合物7)质量为5.15g，产率98.6％。
7)Boc-Apc-HA的制备：称取500mg(1.3055mmol伯醇基)分子量为10万的透明质酸，加入1.35mL25％(质量/体积)的四丁基氢氧化铵水溶液，再加入1.15mL超纯水，得到透明质酸反应液，用1.5mL乙腈溶解1.37g化合物7加入上述反应液中，28℃搅拌反应12h，再用1.5mL乙腈溶解1.37g化合物7加入上述反应液中，28℃搅拌反应24h，反应总时间为36h，反应结束后用0.1mol/LHCl溶液中和反应液，用(质量百分数)0.9％氯化钠的(体积百分数)50％乙醇的水溶液透析48h，换透析液四次，最后一次用超纯水透析，冻干，得到中间体Boc-Apc-HA(化合物8)。
8)半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备：把化合物8用80％(体积百分数)的三氟乙酸-水溶液28℃搅拌反应3h，使化合物8的浓度为5～15g/L，减压浓缩，加入乙醇：水＝1:1(体积比)35℃减压浓缩10次，用Ellman试剂检测显黄色，用饱和氯化钠乙醇溶液析出产物，洗3次，干燥，得到化合物9，即半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
实施例2:半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备
实施例2的制备方法与实施例1一样，除了将实施例1中的步骤6)替换为：
Boc-Apc-PEG-500的制备：把5.26g(10mmol)分子量为500的聚乙二醇(PEG-500)用5ml乙腈溶解，用30mL超纯水溶解840mg(10mmol)碳酸氢钠加入其中，28℃搅拌，通氩气，将3.52g(11mmol)化合物6用15mL乙腈溶解，滴加入上述反应液中，滴加完后通氩气，封口，28℃搅拌反应12h，薄层色谱检测、Ellamn试剂显色不显黄色，停止反应，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷萃取水相3次，合并有的二氯甲烷相用水洗3次后，无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩得到透明油状物化合物7质量为6.03g，产率71.3％；然后将Boc-Apc-PEG-500用于实施例1中步骤7)和8)的反应，即可获得半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
实施例3:半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备
实施例3的制备方法与实施例1一样，除了将实施例1中的步骤6)替换为：
Boc-Apc-PEG-1000的制备：把10g(10mmol)分子量为1000的聚乙二醇(PEG-1000)用40ml乙腈溶解，用30mL超纯水溶解840mg(10mmol)碳酸氢钠加入其中，28℃搅拌，通氩气，将3.52g(11mmol)化合物6用10mL乙腈溶解，滴加入上述反应液中，滴加完后为调反应液至澄清状态，又加入40mL纯水，通氩气，封口，28℃搅拌反应15h，薄层色谱检测、Ellamn试剂显色不显黄色，停止反应，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷萃取水相3次，合并有的二氯甲烷相，用水洗3次后，无水硫酸镁干燥2小时，过滤，减压浓缩得到透明油状物化合物7质量为10.86g，产率82.3％；然后将Boc-Apc-PEG-1000用于实施例1中步骤7)和8)的反应，即可获得半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
实施例4：可注射原位形成的水凝胶的制备
1)制备四分支聚乙二醇硫酯结合物4-arm-PEG-EMP：
制备EMPSA：称取琥珀酸酐2.0g(20mmol)和4-二甲氨基吡啶122mg(DMAP，1mmol)溶解于25mL乙腈：丙酮＝9:1溶剂***中，加入3-巯基丙酸乙酯2.95g(EMP，22mmol)，并向反应液中通入氩气，搅拌反应过夜，减压浓缩后溶解50mL乙酸乙酯中，分别用30mL0.1mol/L盐酸溶液和水萃取3次，无水硫酸镁干燥后2h后蒸干得到白色固体，即EMPSA(EMP-琥珀酸酐结合物)，其核磁共振氢谱如图8所示。
制备4-arm-PEG-EMP：分别称取分子量为10000的四分支聚乙二醇胺1g(4-arm-PEG，0.4mmol)、0.234gEMPSA(1mmol)和0.221g(1mmol)苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)置于一小瓶中，加入2mL二氯甲烷溶解，再加入0.348mL(2mmol)N,N'-二环己基碳二亚胺剧烈震荡5分钟，完全混匀，搅拌反应2小时，薄层色谱检测用酸性茚三酮试液显色，反应完全后，除去溶剂，加入50mL甲醇溶解后，置于-20℃冰箱中析出白色固体后，迅速置于-10℃下离心机中离心，倾去液体，重复该纯化步骤3次后，干燥，得到白色固体，即得四分支聚乙二醇硫酯结合物4-arm-PEG-EMP，其结构式为m约为220，平均分子量约为10000，其核磁共振氢谱如图9所示。
2)称取10mg实施例1制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物用100μL5％(m/v)碳酸氢钠溶液(pH8.0)溶解，称取1mg4-arm-PEG-EMP用100μL5％(m/v)碳酸氢钠溶液(pH8.0)溶解，两溶液混合，迅速混匀，28℃3min内形成透明质酸水凝胶，即可注射原位形成的水凝胶。
实施例5：可注射原位形成的水凝胶的制备
称取10mg实施例1制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物用100μL5％(m/v)碳酸氢钠溶液溶解，称取2mg直链聚乙二醇硫酯结合物(结构式为m约为220，平均分子量约为10000)用100μL5％(m/v)碳酸氢钠溶液溶解，两溶液混合，迅速混匀，28℃3min内形成透明质酸水凝胶，即可注射原位形成的水凝胶。
实施例6：可注射原位形成的水凝胶的制备
实施例6的制备方法与实施例4一样，除了将实施例4中的步骤2)替换为：
称取10mg实施例1制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物用100μLpH7.2磷酸盐缓冲液，称取2mg4-arm-PEG-EMP用100μLpH7.2磷酸盐缓冲液溶解，两溶液混合，迅速混匀，28℃3min内形成透明质酸水凝胶，即可注射原位形成的水凝胶。
实施例7：可注射原位形成的水凝胶的制备
称取10mg实施例1制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物用100μL5％(m/v)碳酸氢钠溶液溶解，称取1mg分子量为10k的四分支聚乙二醇丙烯酸酯结合物(结构式为m约为220，平均分子量约为10000)用100μL5％(m/v)碳酸氢钠溶液(pH8.0)溶解，两溶液混合混匀，28℃3min内形成透明质酸水凝胶，即可注射原位形成的水凝胶。
下面对实施例中制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物、可注射原位形成的水凝胶的制备作进一步的效果检测。
一、质谱检测
取实施例1、4中的目标产物半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及各中间体进行核磁共振氢谱检测或UPLC-MS检测，检测图谱如图1～10所示，通过图谱分析得知制备得到的各中间体和终产物均为期望合成的目标产物。
图1为实施例1中步骤1)合成的中间体Apc的核磁共振氢谱图，对图中信号进行分析归属：1HNMR(600MHz,MeOD),δH4.78(1H,t,J＝8.4Hz,-CH-COOH),δH3.46(1H,dd,J＝12.0Hz,8.4Hz,-CH 2-SH),δH3.32(1H,dd,J＝12.0Hz,7.8Hz,-CH 2-SH),δH1.61(3H,s,-C-CH 3),δH1.60(3H,s,-C-CH 3)，说明该中间体为目标中间产物Apc。
图2为实施例1中步骤2)合成的中间体的核磁共振氢谱图，对图中信号进行分析归属：1HNMR(600MHz,DMSO),δH12.74(1H,brs,-COOH),δH4.74(1H,dd,J＝8.4Hz,5.4Hz,-CH-COOH),δH3.36(1H,d,J＝12.0Hz,-CH 2-SH),δH3.04(1H,d,J＝12.0Hz,-CH 2-SH),δH1.75(3H,s,-C-CH 3),δH1.73(3H,s,-C-CH 3),1.42(3H,s,ter-butyl),δH1.35(6H,s,ter-butyl)，说明该中间体为目标中间产物Boc-Apc。
图3为实施例1中步骤3)合成的中间体的核磁共振氢谱图，对图中信号进行分析归属：1HNMR(600MHz,CDCl3),δH5.11(1H,d，J＝6.0，-CH-CH2-),δH3.43(1H,d,J＝12.0Hz,-CH 2-S-),δH3.30(1H,d,J＝12.0Hz,-CH 2-S-)，δH2.82(4H,t,J＝6.6Hz,-CO-CH 2-CH 2-CO-),δH1.87(3H,s,-C-CH 3),δH1.79(3H,s,-C-CH 3),1.48(3H,s,ter-butyl),δH1.45(6H,s,ter-butyl)，说明该中间体为目标中间产物Boc-Apc-OSU。
图4实施例1中步骤4)合成的中间体的核磁共振氢谱图；，对图中信号进行分析归属：1HNMR(600MHz,DMSO),δH7.97(2H,brs,-CONH-),δH4.57(2H,brs,-CH-CONH-),δH3.42(2H,m,-CONH-CH 2-),δH3.34(2H,d,J＝10.8Hz,-CH 2-SH),δH3.28(2H,m,-CONH-CH 2-),δH2.94(2H,d,J＝10.8Hz,-CH 2-SH),δH2.79(4H,brs,-CH 2-S-S-),δH1.77(6H,s,-C-CH 3),δH1.70(6H,s,-C-CH 3),δH1.34(18H,brs,ter-butyl)，说明该中间体为目标中间产物Boc-Apc-cys。
图5实施例1中步骤6)合成的中间体的UPLC-MS图(超高效液相色谱串联质谱法)，对图中信号进行分析归属：经过检测超高效液相紫外图谱中有三个峰，再结合质谱分析它们分别是time＝5.5min时的峰为产物化合物7的峰，约占50％；time＝7.5min时出的峰为1,4-丁二醇二缩水甘油醚两端都与化合物6反应得到的副产物(副产物1)约占30％；time＝9.5min时出现的峰为化合物6自身氧化得到具有二硫键的氧化产物(副产物2)约占20％。质谱中荷质比为545.24为产物化合物7【M+Na】峰，荷质比为865.37为副产物1的【M1+Na】峰，荷质比为661.22为副产物2的【M2–2H+Na】峰，说明该中间体为目标中间产物Boc-Apc-环氧乙烷(化合物7)。
图6是实施例1中步骤7)合成的中间体的核磁共振氢谱图；，对图中信号进行分析归属，在δH1.34ppm处出现叔丁氧羰基信号，所以可判断该该中间体为目标中间产物Boc-Apc-HA，但Boc-Apc-HA分子量较大，核磁共振检测时会有少量的误差，所以该核磁共振氢谱只能判断此中间体为Boc-Apc-HA，但其修饰率仍需紫外分光光度法进一步检测。
图7为半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的核磁共振氢谱图，对图中信号进行分析归属：在可间体Boc-Apc-HA的核磁共振氢谱的基础之上在δH1.34ppm处的叔丁氧羰基信号消失，可判断该化合物为目标产物半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
图8为实施例4中步骤1)合成的中间体EMPSA(EMP-琥珀酸酐结合物)的核磁共振氢谱图，对图中信号进行分析归属：1HNMR(600MHz，CDCl3)，δH9.91(s,br),4.13(2H，q，J＝7.2Hz,-CH 2 -CH3)，3.12(2H，t，J＝7.2Hz,-S-CH 2-)，2.87(2H，t，J＝7.2Hz，-S-CO-CH 2-)，2.68(2H,t,J＝7.2Hz,-S-CH2-CH 2-),2.60(2H,t,J＝7.2Hz,-CH 2-COOH)，1.24(3H，t，J＝7.2Hz，-CH2-CH 3)，说明该中间体为目标中间产物EMPSA(EMP-琥珀酸酐结合物)。
图9为实施例4中步骤1)合成的中间体4-arm-PEG-EMP的核磁共振氢谱图，对图中信号进行分析归属：1HNMR(600MHz,CDCl3),δH4.15(2H,q,J＝7.0Hz,-CH 2 -CH3-),δH3.79-3.41(m,,-O-CH 2 -CH2-O-),δH3.12(2H,t,J＝7.0Hz,-S-CH 2 -),δH2.92(2H,t,J＝7.0Hz,-S-CO-CH 2 -),δH2.61(2H,t,J＝7.0Hz,-S-CH 2 -CH 2 -),δH2.52(2H,t,J＝7.0Hz,-CH 2-COOH),δH1.26(3H,t,J＝7.0Hz,-CH 2-CH3-)，说明该中间体为目标中间产物4-arm-PEG-EMP。
二、半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的修饰率检测
半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的修饰率的测定方法为紫外分光光度法，通过Ellman试剂检测末端半胱氨酸透明质酸的巯基含量计算出修饰率。首先制作半胱氨酸标准曲线，再用紫外分光光度法测定样品吸光度，计算出巯基含量，最终得出修饰率。
1)制作标准曲线：
缓冲液的配置：称取0.254gNaH2PO4,与10.162gNa2HPO4混合后加入148.896mg的EDTA(乙二胺四乙酸)，配制为500mL。
Ellman试剂溶液：在1ml缓冲液中加入4mgEllman试剂。
表1半胱氨酸标准溶液的配制
| 标准试剂 | 缓冲溶液体积 | 半胱氨酸量 | 最终浓度 |
| A | 100mL | 26.34mg | 1.5mmol/L |
| B | 5mL | 25mL标准试剂溶液A | 1.25mmol/L |
| C | 10mL | 20mL标准试剂溶液A | 1.0mmol/L14 --> |
| D | 15mL | 15mL标准试剂溶液A | 0.75mmol/L |
| E | 20mL | 10mL标准试剂溶液A | 0.5mmol/L |
| F | 25mL | 5mL标准试剂溶液A | 0.25mmol/L |
| G | 30mL | 0mL标准试剂溶液A | 0mmol/L(空白) |
测量按表1配制的半胱氨酸标准溶液的吸光度(如表2所示)，并制作标准曲线如图10所示，得标准曲线方程为y＝0.1692x-0.0001，R2＝0.9994。
表2半胱氨酸标准溶液吸光度
2)测量实施例1制备半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的修饰率
配制样品溶液：称取10.5毫克实施例1制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物(含0.0274mmol伯醇羟基)用缓冲液溶解并定容至5mL；
配制空白对照溶液：称取10.5mg透明质酸(含0.0274mmol伯醇羟基)用缓冲液溶解并定容至5mL；
取试管，分别在每只试管内加入50μLEllman试剂和2.5mL磷酸钠缓冲溶液，在各试管内，加入50μL标准溶液、或待测样品，混合均匀，在室温放置15分钟，以溶液G为空白，测试样品时用透明质酸溶液做空白，于波长412nm处测定半胱氨酸标准液与待测样品的吸光度值(A)，如表3所示。
表3半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的吸光度
利用标准曲线和测得的样品溶液吸收度，计算样品中巯基的含量。
带入标准曲线计算：0.0385＝0.1692x-0.0001，得出修饰率为3.5％(巯基数相对于HA中双糖单位数)，理论上即可与硫酯化合物形成流变学性能较好的凝胶。
三、流变学测试
对实施例4～7制备的可注射原位形成的水凝胶分别进行流变学测试，流变学参数设置为：扫描模式：振荡；转子：PP25；取点频率：1/20秒；测试温度：20℃。时间扫描：频率(f)为1赫兹，应力(Strain)为1％，恒定时间取点。频率扫描：频率(f)为10～0.01赫兹，应力(Strain)为1％，6点/是个数量级，共取19个点，NotimeSetting。应力扫描：频率(f)为1赫兹，应力(Strain)为0.1％～100％，6点/是个数量级，共取19个点，NotimeSetting。
实施例4制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图如图11所示、时间扫描细节图如图12所示、频率扫描图如图13所示、应力扫描图如图14所示。从图11与图12可以看出时间为150s左右，G’(储存模量，storagemodulus)与G”(损失模量，lossmodulus)出现交点，此点为凝胶点，即水凝胶形成的时间点，凝胶点后G’>G”，说明在150s左右时水凝胶形成，随着时间的增加，G’处于上升趋势，最终渐渐达到平衡，说明凝胶反应已经反应完全；图13为频率扫描图，频率扫描图为时间扫描图显示G’不在变化为止，即凝胶反应完全，随着频率的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质；图14为应力扫描图，应力扫描图为频率扫描图检测完毕后检测，随着应力的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质。
实施例5制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图如图15所示、频率扫描图如图16所示、应力扫描图如图17所示。从图15可以看出时间为2000s左右，G’与G”出现交点，此点为凝胶点，即水凝胶形成的时间点，凝胶点后G’>G”，说明在2000s左右时水凝胶形成，随着时间的增加，G’处于上升趋势，最终渐渐达到平衡，说明凝胶反应已经反应完全；图16为频率扫描图，频率扫描图为时间扫描图显示G’不在变化为止，即凝胶反应完全，随着频率的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质；图17为应力扫描图，应力扫描图为频率扫描图检测完毕后检测，随着应力的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质。
实施例6制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图如图18所示、频率扫描图如图19所示、应力扫描图如图20所示。从图18可以看出时间为3000s左右，G’与G”出现交点，此点为凝胶点，即水凝胶形成的时间点，凝胶点后G’>G”，说明在3000s左右时水凝胶形成，随着时间的增加，G’处于上升趋势，最终渐渐达到平衡，说明凝胶反应已经反应完全；图19为频率扫描图，频率扫描图为时间扫描图显示G’不在变化为止，即凝胶反应完全，随着频率的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质；图20为应力扫描图，应力扫描图为频率扫描图检测完毕后检测，随着应力的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质。
实施例7制备的可注射原位形成的水凝胶的流变学时间扫描图如图21所示、频率扫描图如图22所示、应力扫描图如图23所示。从图21可以看出，开始测试时已经出现G’>G”，并且G’平衡，说明此反应发生很快，在把半胱氨酸功能化的透明质酸结合物溶液与聚乙二醇丙烯酸酯结合物溶液混合后立即形成水凝胶，并且反应完全。图22为频率扫描图，频率扫描图为时间扫描图显示G’不在变化为止，即凝胶反应完全，随着频率的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质；图23为应力扫描图，应力扫描图为频率扫描图检测完毕后检测，随着应力的变化，G’一直处于平衡状态，没有巨大波动，说明该水凝胶具有很好的流变学性质。
通过实施例4、实施例5、实施例6、实施例7的流变学图谱对比得出以下结论：
1)实施例4是半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与四分支聚乙二醇硫酯结合物形成水凝胶，实施例7半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与四分支聚乙二醇丙烯酸酯结合物形成水凝胶，这两个实施例凝胶形成条件完全相同，唯一不同的是聚乙二醇结合物的反应基团不同，实施例4反应机理是自然化学连接反应，实施例7反应机理为迈克尔加成，从他们时间扫描图对比看出实施例4的凝胶点为150s，实施例7开始检测凝胶已经反应完全，说明实施例7迈克尔加成形成凝胶反应较实施例4自然化学连接反应形成凝胶更快。
2)实施例4是半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与四分支聚乙二醇硫酯结合物形成水凝胶，实施例5是半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与直链聚乙二醇硫酯结合物形成水凝胶，这两个实施例凝胶形成条件完全相同，唯一不同的是聚乙二醇硫酯结合物的支链个数不同，从他们时间扫描图对比看出实施例4的凝胶点为150s，实施例5凝胶点为2000s，说明半胱氨酸功能化的透明质酸结合物在与聚乙二醇硫酯结合物反应形成水凝胶时，支链链较多的反应较快；从他们的频率扫描图与应力扫描图可看出实施例4所得到的水凝胶的模量(G’)较高，说明四分支的聚乙二醇硫酯结合物较直链聚乙二醇硫酯结合物所形成的凝胶模量较高。
3)实施例4与实施例6均是半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与四分支聚乙二醇硫酯结合物形成水凝胶，这两个实施例凝胶形成条件完全相同，唯一不同的是反应过程中所用缓冲液的pH不同，实施例4所用缓冲液pH8.0高于实施例6缓冲液pH7.2，从他们时间扫描图对比看出实施例4的凝胶点为150s，实施例6凝胶点为3000s，说明凝胶反应过程中所用缓冲液在权利要求范围内pH越高，凝胶反应越快。
4)实施例4、实施例5、实施例6、实施例7制备的可注射原位形成的水凝胶r频率扫描图与应力扫描图均反应出本发明所制备的水凝胶具有良好的流变学性质。
所以可以通过对缓冲液pH的控制，以及选择不同的聚乙二醇结合物，不同分支的聚乙二醇硫酯结合物，得到不同凝胶点与不同模量的水凝胶，可满足不同的需求。
综上所述，实施例4～7说明本发明制备的水凝胶是在5％NaHCO3水溶液或磷酸盐缓冲液中形成，形成条件温和，可认为该条件为生理条件；通过相应的流变学测试结果可看出，凝胶是在半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物的水溶液混合后在一定时间内形成水凝胶，所以可把半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物的水溶液通过针管注射至缺陷部位，在一定的时间内原位形成水凝胶，故本发明可实现可注射且在生理条件下原位形成共价交联透明质酸水凝胶，是生物材料领域的重大突破，具有良好的应用前景。
Claims (9)
1.一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，其结构式为：
n为0～30，x为200～3000。
2.权利要求1所述一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取结构式为的化合物1为原料，在丙酮加热回流条件下，发生环化反应，生成结构式为的化合物2；
2)将化合物2与二碳酸二叔丁酯反应，生成氨基被叔丁氧羰基(Boc)保护的结构式为的化合物3；
3)将化合物3与N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺条件下，发生酯化反应，生成结构式为的化合物4；
4)将化合物4与胱胺在碱性条件下，发生酰化反应，生成结构式为的化合物5；
5)将化合物5的二硫键还原，生成结构式为的化合物6；
6)将化合物6与聚乙二醇类化合物在碱性条件下，发生环氧乙烷的开环反应，生成结构式为的化合物7；
7)将化合物7与透明质酸在四丁基氢氧化铵条件下，发生环氧乙烷开环反应，生成结构式为的化合物8；
8)将化合物8脱去叔丁氧羰基(Boc)保护基，再于减压浓缩条件下，发生开环反应，生成结构式为的化合物9，即半胱氨酸功能化的透明质酸结合物；其中，n为0～30，x为200～3000。
3.根据权利要求1所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于：其制备方法具体包括以下步骤：
1)化合物2的制备：取化合物1半胱氨酸盐酸盐，加入干燥丙酮回流2～10h，减压浓缩至不多于总反应液体积三分之一的体积，放入冰箱不少于0.5h，析出结晶，过滤取滤渣，得到化合物2，其中丙酮与化合物1的体积质量比不小于20；
2)化合物3的制备：把化合物2用乙腈溶解，加入二碳酸二叔丁酯，混匀后逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，15℃～37℃搅拌反应24～72h，减压浓缩溶剂，再加入***或环己烷继续减压浓缩，再加入***或环己烷，用硅藻土过滤，滤液依次用0.01～0.1mol/LHCl溶液、H2O、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物3，其中二碳酸二叔丁酯、N,N-二异丙基乙胺的物质的量独立为化合物2的1.1～3倍；
3)化合物4的制备：将化合物3和N-羟基琥珀酰亚胺用四氢呋喃溶解，0～4℃冰浴，往其中滴加N,N'-二环己基碳二亚胺的四氢呋喃溶液，混合均匀后反应3～12h，至反应液用薄层色谱检测反应完全，放入0～4℃冰箱静置0.5～12h，过滤取滤液，经减压浓缩溶剂，异丙醇重结晶，得到化合物4，其中N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺的物质的量独立为化合物2的1.05～1.5倍；
4)化合物5的制备：用水溶解摩尔量相当于化合物4摩尔量0.525～0.6倍的胱胺二盐酸盐，用水溶解摩尔量相当于胱胺二盐酸盐摩尔量4倍的碳酸钠，滴加在胱胺二盐酸盐水溶液中，冰浴，搅拌均匀；用四氢呋喃溶解化合物4，滴加入上述反应液中，15℃～37℃反应6～24h，直至薄层色谱检测反应完全；减压浓缩溶剂，调节pH为3～7，再用乙酸乙酯或二氯甲烷萃取，有机相用0.01～0.1mol/LHCl溶液、H2O、饱和NaCl萃取，干燥，减压浓缩，得到化合物5；
5)化合物6的制备：将化合物5的乙醇溶液中，再加入0.5～1.0倍体积的水，冰浴搅拌均匀，再缓慢加入硼氢化钠，待不再有气泡冒出，置于15～37℃搅拌反应4～12h，至薄层色谱检测反应完全，再加入相对反应液体积2～4倍的水终止反应；调节pH为3～5，二氯甲烷萃取，水洗，通氩气，封口干燥，过滤，加压浓缩得到化合物6，其中，硼氢化钠的物质的量为化合物5的5～10倍；
6)化合物7的制备：往聚乙二醇类化合物的乙腈溶液中加入碳酸氢钠的水溶液，15～37℃搅拌均匀，通氩气，再往其中滴加化合物6的乙腈溶液，滴加完后通氩气，反应液中乙腈：水的体积比为2:3～3:2，封口，15～37℃搅拌反应6～24h，直至薄层色谱检测反应完全、Ellamn试剂显色不显黄色为止，减压浓缩溶剂，用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，有机相用水洗后干燥，过滤取滤液，减压浓缩得到化合物7，其中，碳酸氢钠、化合物6的物质的量分别为聚乙二醇类化合物的1～2倍、1.1～1.5倍；
7)化合物8的制备：称取其分子量为10万～100万的透明质酸，加入四丁基氢氧化铵水溶液，得到透明质酸反应液，其中透明质酸反应液质量浓度为5％～20％，分1～4次加入化合物7的乙腈溶液，15～37℃搅拌反应6～72h，用0.01～1mol/LHCl溶液中和反应液，透析，冻干，饱和氯化钠乙醇溶液洗涤，干燥，得到化合物8，其中，四丁基氢氧化铵、化合物7的物质的量分别为透明质酸伯醇基的0.5～2倍、0.5～10倍，乙腈体积为四丁基氢氧化铵水溶液的0.5～2.5倍；
8)化合物9的制备：将化合物8加入体积百分数为80～100％的三氟乙酸水溶液中，使化合物8的浓度为5～20g/L，15～37℃搅拌反应3～6h，减压浓缩，加入体积浓度为45～55％的乙醇溶液，30～40℃减压浓缩3～10次，用Ellman试剂检测显黄色后，用饱和氯化钠乙醇溶液析出产物，洗涤干净，干燥，得到产物化合物9，即半胱氨酸功能化的透明质酸结合物。
4.根据权利要求3所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于：步骤4)和5)中所述调节pH的调节剂为体积浓度为0.1％～2％HCl溶液。
5.根据权利要求3所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物的制备方法，其特征在于：步骤7)中所述透析用到的透析液为质量百分数0.1～1.5％氯化钠和体积百分数30～80％乙醇的水溶液，至少透析48小时，至少换透析液4次。
6.权利要求1所述的一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其具体的应用为可注射原位形成的水凝胶由权利要求1所述的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过迈克尔加成反应或自然化学连接反应生成。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的聚乙二醇结合物选自结构式为的聚乙二醇丙烯酸酯结合物、结构式为的聚乙二醇硫酯结合物中一种，其中m为50～500，y为2～4，即聚乙二醇结合物支链的个数为2～4，R基团选自 中一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的聚乙二醇硫酯结合物选自3-巯基丙酸乙酯与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、N-乙酰-L-半胱氨酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-巯基乙烷磺酸钠与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、4-巯基苯基乙酸与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合物、2-二甲氨基乙硫醇与聚乙二醇形成的聚乙二醇硫酯结合中一种，其中聚乙二醇硫酯结合物的聚合度为50～500，支链个数为2～4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410110610.7A CN103910886B (zh) | 2014-03-24 | 2014-03-24 | 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410110610.7A CN103910886B (zh) | 2014-03-24 | 2014-03-24 | 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103910886A CN103910886A (zh) | 2014-07-09 |
| CN103910886B true CN103910886B (zh) | 2016-04-06 |
Family
ID=51036927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410110610.7A Active CN103910886B (zh) | 2014-03-24 | 2014-03-24 | 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103910886B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106478841A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-03-08 | 海南大学 | 通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102336699B1 (ko) * | 2015-02-23 | 2021-12-08 | 주식회사 파마리서치 | 소듐 2-메르캅토에탄 설포네이트를 함유하는 히알루론산의 분해억제제 및 이를 포함하는 조성물 |
| CN106432548B (zh) * | 2016-09-20 | 2019-02-19 | 海南大学 | 基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征 |
| WO2019046834A1 (en) * | 2017-09-01 | 2019-03-07 | Pmidg, Llc | FUNCTIONALIZED AND RETICULATED POLYMERS |
| CN109793917B (zh) * | 2019-02-11 | 2020-10-09 | 海南建科药业有限公司 | 一种预防结直肠手术后吻合口瘘的凝胶的制备方法 |
| CN112842929A (zh) * | 2019-11-27 | 2021-05-28 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种巯基化透明质酸及其制备方法和应用 |
| CN112587475B (zh) * | 2020-12-18 | 2022-09-13 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种载药凝胶及其制备方法 |
| CN115926211A (zh) * | 2021-01-12 | 2023-04-07 | 华熙生物科技股份有限公司 | 交联剂、凝胶中间体及其用途 |
| CN115703846B (zh) * | 2022-10-19 | 2023-05-12 | 常州百瑞吉生物医药有限公司 | 一种透明质酸衍生物的纯化方法 |
| CN117723682B (zh) * | 2023-11-20 | 2024-06-11 | 山东丰金美业科技有限公司 | 一种交联透明质酸或其盐凝胶交联度的检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102227448A (zh) * | 2008-11-28 | 2011-10-26 | 巴勒莫大学 | 生产透明质酸官能化衍生物的方法及透明质酸官能化衍生物的水凝胶的形成 |
-
2014
- 2014-03-24 CN CN201410110610.7A patent/CN103910886B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102227448A (zh) * | 2008-11-28 | 2011-10-26 | 巴勒莫大学 | 生产透明质酸官能化衍生物的方法及透明质酸官能化衍生物的水凝胶的形成 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106478841A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-03-08 | 海南大学 | 通过冷冻干燥与硫醇‑烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103910886A (zh) | 2014-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103910886B (zh) | 半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用 | |
| Wang et al. | Injectable dextran hydrogels fabricated by metal-free click chemistry for cartilage tissue engineering | |
| CN102227448B (zh) | 生产透明质酸官能化衍生物的方法及透明质酸官能化衍生物的水凝胶的形成 | |
| JP2855307B2 (ja) | 光反応性グリコサミノグリカン、架橋グリコサミノグリカン及びそれらの製造方法 | |
| Martínez-Mejía et al. | Synthesis of new chitosan-glutaraldehyde scaffolds for tissue engineering using Schiff reactions | |
| JP4791921B2 (ja) | ヒアルロン酸アミドおよびそれらの誘導体、並びにそれらの製造法 | |
| JP5872576B2 (ja) | アルケン単位およびチオールクリック化学カップリング反応を含む多糖誘導体 | |
| CN106478841B (zh) | 通过冷冻干燥与硫醇-烯点击化学制备的半胱氨酸透明质酸结合物及其合成方法和应用 | |
| EP4063400A1 (en) | Sulfhydryl modified hyaluronic acid, preparation method therefor and use thereof | |
| JP7208169B2 (ja) | 新規合成ポリマーおよび架橋ヒドロゲルシステム | |
| KR20120022944A (ko) | 다당류 유도체 및 그 하이드로겔 | |
| CN107635550A (zh) | 改良的含二硫化物的炔烃交联剂 | |
| Linker et al. | Ester functional epoxide monomers for random and gradient poly (ethylene glycol) polyelectrolytes with multiple carboxylic acid moieties | |
| Lin et al. | Redox-responsive hydrogels with decoupled initial stiffness and degradation | |
| Macková et al. | Thiolated poly (2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels as a degradable biocompatible scaffold for tissue engineering | |
| US20140348772A1 (en) | Production of hydrogels by means of diels-alder reaction | |
| CN109517162A (zh) | 可注射水凝胶及制备方法 | |
| EP4063399A1 (en) | Thiol-modified polymer compound, and preparation method therefor and application thereof | |
| CN100594938C (zh) | 具有肿瘤靶向作用的普鲁兰多糖载体材料 | |
| CN106432548B (zh) | 基于硫醇-烯点击化学的脂肪酸化肝素的制备及表征 | |
| CN112812329B (zh) | 巯基改性高分子化合物的水凝胶及其制备方法和用途 | |
| EP3101064B1 (en) | Diamine crosslinking agent, acidic polysaccharide crosslinked body, and medical material | |
| EP2058324A1 (en) | Depsipeptide containing lactic acid residue | |
| EP3052529B1 (en) | Single-step functionalization and cross-linking of hyaluronic acid | |
| Montheil et al. | Controlled silylation of polysaccharides: Attractive building blocks for biocompatible foams and cell-laden hydrogels |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |