CN115896048B - 一种酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn-SOD及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn‑SOD及其制备方法和用途，其编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明提供的重组人Cu、Zn‑SOD的酶活比天然人Cu、Zn‑SOD的酶活高约一倍，酶活稳定性相对于天然人Cu、Zn‑SOD的稳定性高。

Description

一种酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn-SOD及其制备方法和 用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn-SOD及其制备方法和用途。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD，E.C.1.15.1.1)是机体活性氧自由基清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，在延缓衰老以及其他由自由基引起的疾病方面有很好的预防和治疗功效。

目前已知的超氧化物歧化酶有4种类型：铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-0SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和镍超氧化物歧化酶(Ni-SOD)，其中Cu、Zn-SOD广泛存在于大多数的哺乳动物和真菌等真核生物细胞质、叶绿体和过氧化氢酶体内，是自然界中分布最为广泛的一种超氧化物歧化酶，同时也是目前应用最为广泛的超氧化物歧化酶。

目前大多数超氧化物歧化酶(SOD)产品主要来源于动物血液、内脏等，由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少；特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、***以及由动物传播的SARS等恶性传染病的疫情不时发生，生产动物源血液制品的风险加大；此外，对产品纯度要求的提高也增加了生产成本。随着基因工程技术的发展，微生物、植物和动物等不同来源的SOD基因被克隆表达。然而，重组表达的SOD要么以无活性包涵体存在，要么存在活力低，容易失活，或者耐热性差等问题。

通过基因工程手段获得SOD，主要包括与其他蛋白融合表达，对人SOD做点突变，从其他物种中筛选高性能SOD等几种方式。

CN103789278A公布了一种新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制备方法，该新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白穿透细胞膜的效率非常高，从而使原本不能通过细胞膜的Cu，Zn-SOD转导至细胞膜发挥生物学功能。

CN102526712B公布了一种SOD-TAT融合蛋白在制备防治放射损伤药物中的应用。SOD-TAT不仅可消除细胞外的自由基，还可消除细胞内的自由基，此外，SOD-TAT还可以跨越血脑屏障，其放射防护效果的深度和广度远远强于现有临床使用的放射防护剂。

CN101603048B公布了一种真菌Cu_Zn-SOD的免分子伴侣的原核表达方法。CN104450632公布了一组可提高SOD耐热温度和热稳定性的氨基酸序列及其应用。它是一组来源于Geobacillus属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列。

CN101525600B公布了一种提高重组人Cu，Zn-SOD活性蛋白产量的方法。该发明通将第6位和111位的半胱氨酸突变为丝氨酸，使得裂菌上清中的重组蛋白占重组蛋白总体表达的比例由40％提高到80％，并且从上清中纯化的突变体rhCu，Zn-SOD的比活性与上清中纯化的未突变rhCu，Zn-SOD的相当。然而，该专利并未对产物的稳定性进行研究。

有鉴于此，本领域仍需要继续研究酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn-SOD。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶活高、稳定性好的重组人Cu、Zn-SOD，并同时提供其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明一方面提供一种重组人Cu、Zn-SOD，其编码基因的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

本发明还提供了一种重组人Cu、Zn-SOD，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示

本发明还提供了一种上述重组人Cu、Zn-SOD的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)以人Cu、Zn-SOD的氨基酸序列为模板进行密码子优化，得到核苷酸序列SEQ IDNO:1，然后进行全基因合成，得到编码所述人Cu、Zn-SOD的核酸片段，构建基因的表达载体并转化宿主细胞，得到表达菌株。

(2)选择上游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，下游引物5′-GCTGAGCAATAACTAGC-3′，以步骤(1)中所述的基因的表达载体为模板，进行易错PCR；构建突变基因的表达载体并转化宿主细胞，构建突变体文库，筛选正突变，获得菌种；

(3)菌种活化后，按10％的比例接种的LB培养基中，用IPTG诱导目的蛋白表达，并收集菌体；

(4)对步骤(3)收集的菌液进行菌体破碎，使用Ni亲和层析柱和离子交换层析柱进行纯化，得到提纯的重组人Cu、Zn-SOD。

作为本发明进一步的改进，所述步骤(1)中编码所述人Cu、Zn-SOD的核酸片段通过Nde I和Kpn I酶切位点连接到pET30a(+)质粒上，pET30a(+)-SOD，转入BL21(DE3)感受态中，得到表达人Cu、Zn-SOD的大肠杆菌表达菌株。

作为本发明进一步的改进，所述步骤(2)中突变基因经过酶切回收后与载体pET30a(+)连接，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，获得表达菌株。

本发明最后一方面提供如上所述的重组人Cu、Zn-SOD在医疗或美容领域的用途。

本发明技术方案的有益效果在于：

(1)本发明所获得的重组人Cu、Zn-SOD的酶活比天然人Cu、Zn-SOD的酶活高约一倍。

(2)本发明所获得的重组人Cu、Zn-SOD的酶活稳定性相对于天然人Cu、Zn-SOD的稳定性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的具体实施方式，下面将对附图作简单介绍。

图1发酵全菌及纯化样品电泳图；

M：蛋白Marker，1：天然Cu、Zn-SOD全菌，2：天然Cu、Zn-SOD破菌沉淀，3：天然Cu、Zn-SOD破菌上清，4：天然Cu、Zn-SOD亲和纯化，5：天然Cu、Zn-SOD离子交换纯化，6：BSA，7：突变Cu、Zn-SOD全菌，8：突变Cu、Zn-SOD沉淀，9：突变Cu、Zn-SOD上清，10：突变Cu、Zn-SOD亲和纯化，11：突变搜到离子交换纯化，12：BSA。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例1天然人Cu、Zn-SOD大肠杆菌表达构建

以人Cu、Zn-SOD的氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P00441.2)为模板进行密码子优化，得到如下基因序列：

(SEQ ID NO:1)，委托金唯智合成基因序列，并通过Nde I和Kpn I酶切位点连接到pET30a(+)上得到pET30a(+)-SOD，转入BL21(DE3)感受态中，得到表达人Cu、Zn-SOD的大肠杆菌表达菌株。

实施例2基因突变

以pET30a(+)-SOD为模板进行易错PCR，上游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，下游引物5′-GCTGAGCAATAACTAGC-3′。

PCR体系为：2×Taq PCR Master Mix 25μl，质粒模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，氯化锰溶液1μl，加ddH2O补足50μl。

易错PCR循环程序:降落PCR，95℃预变性5min，循环1次；95℃变性30s、58℃变性30s、72℃变性100s，每个循环退火温度降低1℃，循环5次；95℃变性30s、55℃变性30s、72℃变性100s，循环25次；72℃延伸10min，循环1次。

实施例3超级感受态的制备及突变体文库的构建

将获得的含有一定突变率的目的基因经过Nde I和Kpn I酶切回收后与载体pET30a(+)连接，将连接产物加入到提前取出冰上融化的E.coli Bl21感受态细胞中，按超级感受态制备试剂盒操作说明制备转化效率更高的超级感受态。将复活后的菌液涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养30min后，将培养皿倒置过夜培养，构建转化子数量较高的突变体文库。

实施例4单克隆的诱导表达及正突变筛选

将固体培养基上的菌落逐个挑到96孔细菌培养板中(每孔含200μl已添加抗生素的LB培养基)，于37℃、200rpm培养12-16h；然后以2％的接种量将各孔中的菌液转接到新的96深孔板中(每孔含500μl已添加抗生素的LB培养基)，培养6h后，加入IPTG进行诱导表达。离心收集诱导后的菌体，每孔加入40的细胞裂解液，于37℃放置1-2h使菌体裂解；于4℃、12000rpm离心10min，取上清，按实施例5的方法测定酶活，筛选正向突变。

剩余菌液与甘油以7∶3的比例混匀后，-80℃冰冻保存，作为种子。

实施例5酶活测定和筛选

1.溶液

A液：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(Tris-HCL)，pH8.20；

B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液。

2.邻苯三酚自氧化速率测定

在25℃左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸馏水2.00mL，B液0.15mL。加入B液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率△A325(min-1)。

3.样品酶活测定

SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按2步骤加入酶液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2△A325(min-1)，

表1SOD活性测定加样表

4.结果计算

U/mL——SOD酶活力单位；

△A325——邻苯三酚自氧化速率；

△A'325——样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率；

V——所加酶液或样液体积，单位为毫升(L)；

D——酶液或样液的稀释倍数；

4.5——反应液总体积，单位为毫升(mL)。

上述SOD活力除以蛋白浓度即得到蛋白的比活(U/mg)。

实施例6突变体的复筛

高通量筛选方法建立的体系是微量的，在一定程度上存在误差，常用于目的基因定向进化的初筛。为进一步测定突变体的表达及活性，将初筛得到的突变体进行摇瓶扩大培养，收集菌体，并超声破碎菌体获得目的蛋白；按实施例5的方法测定酶活，通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况。进一步确定酶活高的突变体。最终确定突变体2-A6、8-F11、14-D3、14-E2、20-B3的突变体酶活最高。后对各突变体的获得的SOD的稳定性进行研究，只有8-F11突变体的稳定性好，故以下实施例只体现8-F11。

实施例7高表达突变体质粒提取及测序

将复筛得到的高酶活突变体8-F11涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养30min后，将培养皿倒置过夜培养。挑取单克隆接种至含LB的摇瓶中，37℃，180rpm，过夜培养。用索莱宝的质粒提取试剂盒提取质粒。

1.取5mL菌液，12000rpm离心1min，尽量吸除上清

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液Ⅰ(预先加入RNaseA)，使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

3.向离心管中加入250μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充***解。

4.向离心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

5.将上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱加入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

7.向吸附柱中加入700μL漂洗液Ⅱ(预先加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

8.向吸附柱中加入500μL漂洗液Ⅱ，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

9.12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除

10.将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。

将提取得到的质粒送金唯智测序，得到突变后的基因序列如下(SEQ ID NO:2)：

经翻译后，得到对应的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

通过与天然人Cu、Zn-SOD的氨基酸序列进行比对，发现测序确定为15位的缬氨酸突变成了甘氨酸，51位的苯丙氨酸突变成了缬氨酸。

实施例8高表达突变体摇瓶放大培养

将酶活高的8-F11突变体菌种活化后，以1‰的比例接种到30ml LB培养基中，37℃，180rpm培养过夜。再以10％的比例接种到100ml LB培养基中培养3h后，加入0.5mM IPTG诱导6h，收集菌体。

实施例9纯化

1.破碎离心

将实施例7得到的菌体，用20mM Tris，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0按1:20的比例重悬后，超声破碎。12000g离心10min，收集上清，并用0.45μm滤膜过滤。

2.亲和层析

A液：20mM Tris，500mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0

B液：20mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0

GE Ni Sepharose 6FF 5mL预装柱，用A液平衡，将步骤1中的上清以流速1ml/min的速度上样；然后再用A液洗杂，体积25ml；用50％的B液洗脱，收集洗脱峰，即为初纯的SOD。

3.离子交换

A液：20mM Tris，pH8.0

B液：20mM Tris，1M NaCl，pH8.0

步骤2中获得的SOD溶液，用离子交换的A液稀释至电导小于4mS/cm。

GE Q Sepharose 6FF 5mL预装柱，用A液平衡，将稀释好的SOD溶液以流速1ml/min的速度上样；然后再用A液洗杂，体积25ml；用25％的B液洗脱，收集洗脱峰，即为提纯的Cu、Zn-SOD。

试验例1

将酶活高的8-F11突变体和天然SOD菌体分别按照实施例7和8的方法进行放大培养和纯化，获得突变Cu、Zn-SOD和天然Cu、Zn-SOD。

将上述各步骤的样品做SDS-PAGE，结果见图1。由图可见(1)突变SOD与天然SOD的表达量差别不大，均可达到全菌蛋白的60％以上；(2)SOD主要以可溶形式表达，沉淀中目的蛋白占比很少；(2)SOD的纯度很高，没有明显的杂蛋白条带，在98％以上。

测定酶活

按实施例5测定步骤3获得的天然SOD和突变SOD的酶活。测定结果见下表

	比活(U/mg)
		天然SOD	12325
突变SOD	23173

从结果可以看出，突变以后，比活提高了接近一倍。

试验例2提纯SOD的稳定性

将试验例1中得到的SOD纯品，过滤除菌后，分装到1.5ml的无菌EP管中，100μl/管，分别在室温、4℃、-20℃和-80℃保存，考察样品的稳定性。数据见下表(U/mg)：

从数据可以看出，天然SOD在室温及4℃的酶活随着存放时间的延长，逐渐降低；而突变SOD的酶活随着时间无明显的变化。二者在-20℃和-80℃存放酶活都很稳定。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种重组人Cu、Zn-SOD，其特征在于，其编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组人Cu、Zn-SOD，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种如权利要求1所述的重组人Cu、Zn-SOD在制备医疗或美容产品中的用途。