JPH0654682A - ポリペプチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 スーパーオキサイドディスムターゼ（以下
「ＳＯＤ」と略す）遺伝子において、ヒトＳＯＤの１０
７位から１１３位までのアミノ酸配列に相当するＤＮＡ
配列を、ブタＳＯＤ遺伝子における、ブタＳＯＤの１０
６位から１１２位までのアミノ酸配列に相当するＤＮＡ
配列で置換して得られるＤＮＡと複製可能なベクターと
の組換えＤＮＡを含有する細胞を、培地中で培養し、産
生されたＳＯＤ活性を有するポリペプチドを採取するこ
とを特徴とするＳＯＤ活性を有するポリペプチドの製
法。 【効果】 ヒトＳＯＤ遺伝子において、１１１位のアミ
ノ酸ＣｙｓをコードするＴＧＣを合成オリゴヌクレオチ
ドを使用した部位特異的変異法によってＳｅｒをコード
するＴＣＣ変換する方法に代わって、天然に存在するブ
タＳＯＤ遺伝子からの制限酵素による消化産物である２
本鎖ＤＮＡを使用して、簡便に前記の変換が出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は下記一般式（１）

【０００２】

【化２】

【０００３】で表される少なくとも１５３個のアミノ酸
配列を有するスーパーオキサイドディスムターゼ（以下
「ＳＯＤ」と略す）を構成するポリペプチド（Ｎ末端
は、水素原子、或いはアセチル基またはアミノ酸残基が
付加してもよい）の製法に関し、さらには次の式
（２）、

【０００４】

【化３】

【０００５】（式中、ポリペプチド（１）は、上記式
（１）で表されるポリペプチドを示し、Ｙ1 およびＹ2
はそれぞれ０〜４の整数を示し、Ｙ1 ＋Ｙ2 は２または
４である）で表される銅および／または亜鉛の配位した
その二量体であるＳＯＤの製法に関する。

【０００６】

【従来の技術】ＳＯＤは、キサンチンオキシダーゼの研
究において、その中間生成物のスーパーオキサイドを分
解する酵素として、最初に見いだされた化合物である
（McCrod,J.& Fridovich,I.J.Biol.Chem.244,6049-605
5,(1969))。 このＳＯＤは、生体の酸素毒性防御機構と
いう観点から注目され、現在は、抗炎症剤として、慢性
関節リュウマチ変形性関節炎、放射線照射による副作
用、ある種の泌尿噐疾患などの治療に用いられており、
特に、ウシ肝臓からのＳＯＤが臨床的に利用されてい
る。

【０００７】これまでに、ＳＯＤを構成するポリペプチ
ドのアミノ酸配列構造については、ヒトを含む、ブタ、
ウシ、ウマ、ラット、マウスなど多くの種について報告
されている（勝部幸輝・谷口直之 ＳＯＤの新知見 メ
ディカルトリビューン社発行１９９０年）。また、ブタ
についての遺伝子ＤＮＡ配列については知られていない
が、ヒトの遺伝子ＤＮＡ配列（Sherman 、L., et al. P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 80,5465-5469,(1983)), ウシの
遺伝子ＤＮＡ配列(Hallewell,R.A., et al Biochem.Bio
phys.Res.Commun.181,474-480(1991))、ラットの遺伝子
ＤＮＡ配列(Ho,Y.S.and Crapo,J.D. Nucleic Acids Re
s. 15,6746 (1987)) 、マウスの遺伝子ＤＮＡ配列(Bewl
ey,G.C.,Nucleic Acids Res.16 2728 (1988))につい
て、それぞれ報告されている。

【０００８】アミノ酸配列の構造上の特徴を見てみる
と、ウシ、ウマ、ラット、マウスの動物種では、６、５
７、１４６位にＣｙｓ残基があり、このうち５７と１４
６位のＣｙｓ残基はＳ−Ｓ結合を形成し、サブユット内
部での構造的な安定性を高めると言われている（同前
出）。しかし、ヒトでは、これら以外に１１１位にＣｙ
ｓ残基が存在し、他の動物種ではすべてこの１１１位に
相当するアミノ酸はＳｅｒ残基である。そして、ヒトＳ
ＯＤにおいては、この１１１位のＣｙｓ残基を合成オリ
ゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異法によって種
々のアミノ酸に改変したムテインが報告されている（特
開昭６２−１３０６８４）。

【０００９】さらに、もっと一般的には、Ｃｙｓ残基を
合成オリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異法に
よって種々のアミノ酸に改変する方法や、Ｃｙｓ残基を
種々のアミノ酸に改変するように特定的に設計されたＤ
ＮＡ配列を持つ合成構造遺伝子を使用する方法が開示さ
れている（特開昭５９−９３０９３）。

【００１０】

【発明が解決しようとする問題点】ヒトＳＯＤのアミノ
酸配列の１１１位のＣｙｓ残基を含むペプチドをコード
するＤＮＡ配列を、Ｓｅｒ残基を含むペプチドをコード
するＤＮＡ配列に改変するにあたり、合成オリゴヌクレ
オチドを使用した部位特異的変異法や、特定的に設計さ
れたＤＮＡ配列を持つ合成構造遺伝子でムテインを作製
する方法に代わって、ＳＯＤのアミノ酸配列や遺伝子に
ついては、ヒトを含む、多くの種について報告されてい
る状況の中で、他のＤＮＡ組換え技術を使用したより簡
便で、かつ、天然のＳＯＤタンパク質の構造に関する知
見に基づいた方法を作出することが望まれていた。

【００１１】

【問題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＳＯ
Ｄから由来するペプチドフラグメントと他の動物種であ
るウシ、ラット、マウス等のＳＯＤから由来するペプチ
ドフラグメントとを結合させハイブリッドタンパク質を
作製する研究を行い、このハイブリッドタンパク質がＳ
ＯＤ活性を有することを確認し、本発明を完成するに至
った。すなわち、ヒトＳＯＤの１１１位のＣｙｓ残基を
含むペプチドをコードするＤＮＡ配列とヒトＳＯＤの１
１１位に相当するＳｅｒ残基を含むペプチドをコードす
るＤＮＡ配列が、ヒトＳＯＤ遺伝子配列とウシ、ラッ
ト、マウスの遺伝子配列の両者に共通にある２っの制限
酵素ＤｄｅＩとＣｆｒＩで切断され、さらに、ライゲー
ション反応により再結合でき、ヒトＳＯＤの諸部分と他
の動物種のＳＯＤから由来するヒトＳＯＤの１１１位に
相当するＳｅｒ残基を含むペプチドより構成されるハイ
ブリッドＳＯＤをコードする遺伝子を得て、この遺伝子
の遺伝情報を発現させる新たな方法である。

【００１２】特に、好ましい例として、本発明者らは、
ヒトＳＯＤとブタＳＯＤのアミノ酸配列に注目し、ヒト
ＳＯＤの１０６−１１６位のアミノ酸配列とブタＳＯＤ
の１０５−１１５位のアミノ酸配列が、ヒトＳＯＤの１
１１位のＣｙｓ残基とブタＳＯＤの１１０位のＳｅｒ残
基を異にする以外すべて一致していることに基づいて、
ヒトＳＯＤのＮ末端側ペプチド１−１０６、ブタＳＯＤ
の中間ペプチド１０６−１１２及びヒトＳＯＤのＣ末端
側ペプチド１１４−１５３から構成されるＳＯＤ類似ポ
リペプチドを作製する方法を鋭意研究し、ブタＳＯＤ遺
伝子については新たにそのＤＮＡ配列を決定し、ヒトＳ
ＯＤの１１１位に相当するＳｅｒ残基を含むペプチドを
コードするＤＮＡ配列が、２っの制限酵素ＤｄｅＩとＣ
ｆｒＩ切断され、さらに、ライゲーション反応により再
結合でき、ヒトＳＯＤの諸部分ブタのＳＯＤから由来す
るヒトＳＯＤの１１１位に相当するＳｅｒ残基を含むペ
プチドより構成されるヒト−ブタハイブリッドＳＯＤを
コードする遺伝子が得られた。これにより、この遺伝子
ＤＮＡと複製可能なベクターとの組換えＤＮＡを含有す
る細胞を培地中で培養し、（１）式に示すヒト−ブタハ
イブリッドＳＯＤポリペプチドの製法を見いだした。

【００１３】このヒト及びブタ遺伝子からなるＤＮＡ配
列によってコードされるヒト−ブタハイブリッドＳＯＤ
ポリペプチドは、ヒトＳＯＤのＮ末端側ペプチド１−１
０６、ブタＳＯＤの中間ペプチド１０６−１１２及びヒ
トＳＯＤのＣ末端側ペプチド１１４−１５３から構成さ
れ、ヒトＳＯＤの１０６−１１６位のアミノ酸配列とブ
タＳＯＤの１０５−１１５位のアミノ酸配列が、ヒトＳ
ＯＤの１１１位のＣｙｓ残基とブタＳＯＤの１１０位の
Ｓｅｒ残基を異にする以外すべて一致しており、公知で
あるヒトＳＯＤの１１１位のＣｙｓ残基を合成オリゴヌ
クレオチドを使用した部位特異的変異法によってＳｅｒ
残基にに改変したムテインと同一である（特開昭６２−
１３０６８４）。さらに、同前特許で開示されている技
術によれば、大腸菌などの宿主によって生産されたＳＯ
Ｄ類似ポリペプチドは、天然型ＳＯＤと同等な活性を有
し、安定性がより高いなど優れた性状を有していた。そ
れゆえ、本発明で得られたヒト及びブタ遺伝子からなる
ＤＮＡ配列は、ヒトＳＯＤの諸部分と他の動物種のＳＯ
Ｄから由来するヒトＳＯＤの１１１位に相当するＳｅｒ
残基を含むペプチドより構成されるヒト−ブタハイブリ
ッドＳＯＤポリペプチドをコードする遺伝子を制限酵素
などを利用したＤＮＡ組換え手法で作製する技術の中
で、特に好ましい。

【００１４】これにより、合成オリゴヌクレオチドを使
用した部位特異的変異法によってムテインを作製する方
法の代わりに、天然に存在するアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ配列を使用することで、簡便に種々のハイブリ
ッドＳＯＤポリペプチドを作製する方法が得られた。材
料となるヒト、ウシ、ラット、マウスＳＯＤ遺伝子は、
市販のｃＤＮＡライブラリーを公知の遺伝子配列から知
られる合成オリゴヌクレオチドを使用して、スクリーニ
ングして得ても、また、市販の肝臓ｍＲＮＡを用いて逆
転写酵素によりｃＤＮＡとなし、さらにそのｃＤＮＡを
用いたＰＣＲ反応で得ても良い。ブタＳＯＤ遺伝子は、
遺伝子配列が知られていないので、公知のアミノ酸配列
から推定される混合合成オリゴヌクレオチドを使用し
て、スクリーニングして得ても、また、市販のブタ肝臓
ｍＲＮＡから前述と同様に逆転写酵素による反応および
ＰＣＲ反応で得ても良い。

【００１５】例えば、ヒトＳＯＤ遺伝子に関しては、市
販のヒト肝臓ｍＲＮＡ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＴの等量混合物）、オリゴ（ｄ
Ｔ）および逆転写酵素とを用いてｃＤＮＡを合成し、次
いで公知のヒトＳＯＤのＮ末端側ペプチド例えば、Ｍｅ
ｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａに対応する１５塩
基程度の合成オリゴヌクレオチドＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡ
ＡＧＧＣＣをプローブにして、コロニーハイブリダイゼ
ーションによってクローンを選択する。選択されたクロ
ーンからヒトＳＯＤ遺伝子を含む挿入断片を電気泳動に
より回収し、続いて、この挿入断片を、例えばｐＵＣ１
１８などのベクターでサブクローニングして、通常のＤ
ＮＡ塩基配列決定により挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決
定する。

【００１６】さらに、この挿入断片は、大腸菌での発現
に高効率となるように、開始コードンＡＴＧの上流にあ
る塩基配列を適宜な塩基配列に変換するとよい。好まし
くは、塩基配列ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡに変
換する。この変換は、簡便には前記の塩基配列のオリゴ
ヌクレオチドを予め合成し、このオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用いたＰＣＲ反応により実施すればよ
い。また、この変換は、後述するヒトーブタハイブリッ
ド遺伝子を作製したのちに行ってもよい。

【００１７】また、ブタＳＯＤ遺伝子に関しては、例え
ば、市販のブタ肝臓ｍＲＮＡ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＴの等量混合物）、オリゴ
（ｄＴ）および逆転写酵素とを用いてｃＤＮＡを合成
し、次いで公知のブタＳＯＤのＮ末端側ペプチド例え
ば、Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓに対応する２１塩基を含む混合３２塩基の合成
オリゴヌクレオチドＣＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣ
ＮＡＣＮＡＡA/G ＧＣＮＧＴＮＴＧC/T （但し、斜線の
前後の塩基は、表記された位置において表記された塩基
をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを示しており、こ
れらのオリゴヌクレオチドの混合物であることを示す。
またＮはＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃを表す）と公知のブタＳＯＤの
Ｃ末端側ペプチド例えば、Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｃ
ｙｓ−ＧｌｙーＶａｌ−Ｉｌｅのアンチセンスに対応す
る２１塩基を含む混合３２塩基の合成オリゴヌクレオチ
ドＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣG/T/A ＡＴＮＡＣＮＣＣG/A Ｃ
ＡＮＧＣT/C ＡＡＮＣＧをプラーマーにして、ＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼでＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応産物
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、約０．４５Ｋｂｐのブ
タＳＯＤ遺伝子を含む挿入断片となし、この断片を電気
泳動により回収すればよい。ついでこの挿入断片を、例
えばｐＵＣ１１８などのベクターのＥｃｏＲＩサイトに
サブクローニングして、通常のＤＮＡ塩基配列決定によ
り挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決定する。

【００１８】次に、これら得られたヒトＳＯＤ遺伝子と
ブタ、ウシ、ラット、マウスＳＯＤ遺伝子とから、ハイ
ブリッドＳＯＤポリペプチドをコードする遺伝子を作製
する方法について、ヒト−ブタハイブリッド遺伝子を１
例にとって詳しく説明すると、ヒトＳＯＤ遺伝子におい
て、ヒトＳＯＤの１０７位から１１３位までのアミノ酸
配列に相当するＤＮＡ配列を、ブタＳＯＤ遺伝子におけ
る、ブタＳＯＤの１０６位から１１２位までのアミノ酸
配列に相当するＤＮＡ配列で置換すればよく、簡便に
は、それぞれの遺伝子配列中に共通にある制限酵素サイ
トを利用して行えばよく、約０．７ＫｂｐのヒトＳＯＤ
遺伝子断片と約０．４５ＫｂｐのブタＳＯＤ遺伝子断片
に共通にある制限酵素サイトＤｄｅＩとＣｆｒＩをもっ
て連結せしめればよい。すなわち、約０．７Ｋｂｐのヒ
トＳＯＤ遺伝子を含む挿入断片を制限酵素ＤｄｅＩで消
化し、約０．３５ＫｂｐのＤＮＡ断片を電気泳動により
回収する。同様に、約０．７ＫｂｐのヒトＳＯＤ遺伝子
を含む挿入断片を制限酵素ＣｆｒＩで消化し、電気泳動
により約０．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。一方、約
０．４５ＫｂｐのブタＳＯＤ遺伝子断片を同様に制限酵
素ＤｄｅＩとＣｆｒＩで消化し、約２０ｂｐのＤＮＡ断
片を電気泳動により回収する。これら３っの、すなわ
ち、約０．３５Ｋｂｐ，約０．３ｋｂｐと約２０ｂｐの
ＤＮＡ断片をライゲーション反応によって連結した後、
例えばｐＵＣ１１８などのベクターのＸｂａＩとＢａｍ
ＨＩサイトにサブクローニングして、プラスミッドｐＵ
Ｃ１１８−ＨＢＳＯＤを得る。そして、通常のＤＮＡ塩
基配列決定により挿入断片のＤＮＡ塩基配列を決定す
る。これの全ＤＮＡ塩基配列は図４に示す通りである。
この連結操作によって、ヒトＳＯＤのＮ末端側ペプチド
１−１０６、ブタＳＯＤの中間ペプチド１０６−１１４
及びヒトＳＯＤのＣ末端側ペプチド１１５−１５３から
構成されるヒト−ブタハイブリッドＳＯＤポリペプチド
をコードする約０．７Ｋｂｐの遺伝子を作製できる。

【００１９】次いで、このヒト−ブタハイブリッドＳＯ
Ｄポリペプチドをコードする遺伝子を挿入したプラスミ
ッドｐＵＣ１１８−ＨＢＳＯＤが、目的とするＳＯＤ活
性を発現することの確認のために、適宜有効な発現ベク
ターを構築すればよい。このような発現ベクターを構築
するにあたり、宿主微生物としてエシェリヒア（Escher
ichia)属に属するエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li：大腸菌）、例えばエシェリヒア・コリＤＨ１，同Ｈ
Ｂ１０１，同ＭＶ１１８４，同ＭＶ１３０４，同Ｗ３１
１０，同Ｃ６００株等に適する発現プラスミッド、例え
ば、ｐＩＮＩ，ｐＩＮ 、ｐＫＮ１９等を使用してもよ
く、また、バチルス・ズブチルスを宿主微生物とする場
合には、例えばプラスミッドｐＴＵＢ２１８，ｐＴＵＢ
２８５等の発現プラスミッドが使用でき、またサッカロ
マセス・セレビシア等の酵母を宿主とする場合には、例
えばプラスミッドｐＡＭ８２等の発現用ベクターを使用
してもよく、さらにＳＶ４０ウィルスの後期プロモター
で外来遺伝子を発現させるウィルスベクター、例えばプ
ラスミッドｐＳＶＬ（ファルマシア社製）やプラスミッ
ドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＢＲＬ社製）を使用してなる動
物細胞、例えばサル腎（ＣＯＳ）細胞やチャイニーズハ
ムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞、さらにまたＣＨＯｄ
ｈｆｒ−（葉酸還元酵素欠損）株細胞等を宿主として構
築し、このようにして調製したベクターを宿主細胞に移
入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法によっ
てＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞等に直接上記のようにして得
られたプラスミッドベクターの移入を行うか、その他公
知の宿主生物に移入する方法であるコンピテント法、ポ
リエチレンングリコール法を用いて形質転換体を得れば
よい。またこのようなベクターを用いる場合、前記と同
様にベクターを制限酵素で切断し、挿入すべきヒト−ブ
タハイブリッド遺伝子を含むＤＮＡ断片のサイトとライ
ゲーションできるように、適宜いづれかのサイトを付加
または削除するかして常法により調製し、組換え使用す
ればよい。

【００２０】例えば、このようにして得られた形質転換
体である微生物は、目的とするヒト−ブタハイブリッド
ＳＯＤポリペプチドを発現せしめるために培養するが、
培養の形態は液体培養で行えばよく、工業的には深部通
気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源として
は、微生物の培養に通常使用されているものが広く使用
でき、微生物の同化可能な炭素源、例えばグルコース、
シュクロース、糖蜜、グリセリン、スターチ加水分解物
などが使用され、窒素源としては利用可能な窒素化合物
であればよく、例えばコーン・スチープ・リカー、大豆
粉、カゼイン加水分解物、ペプトン、種々の肉エキス、
酵母エキス、硫安、塩化アンモニウムなどが使用され、
その他、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシ
ウム、鉄、マンガン、亜鉛、銅などとのリン酸塩、塩化
塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩などとの水溶性塩を添加す
る。培養温度は、微生物が生育し、ヒト−ブタハイブリ
ッドＳＯＤを生産する範囲で適宜変更できるが、エシェ
リヒア属に属する微生物の場合、好ましくは２０〜４２
℃程度である。培養時間は、条件によって多少異なる
が、ヒト−ブタハイブリッドＳＯＤポリペプチドが最高
収量に達する時間を見計らって適当な時期に培養を終了
すればよく、通常は１２〜７２時間程度である。次い
で、培養後、ヒト−ブタハイブリッドＳＯＤは、菌体を
含む培養液そのままを採取して分離、精製すればよい。
ヒト−ブタハイブリッドＳＯＤが菌体内に存在する場合
には、得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段
にて菌体を回収し、次いでこの菌体をボールミルや超音
波による機械的破砕方法やリゾチームなどの酵素的破砕
方法で破砕し、必要に応じてキレート剤や界面活性化剤
を添加してヒト−ブタハイブリッドＳＯＤを可溶化して
分離採取し、前述の分離、精製手段を適宜組み合わせて
分離、精製すればよい。

【００２１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６６７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ 起源：ヒト及びブタ肝由来のものに基づく合成 配列の名称：ヒトーブタハイブリッド遺伝子 配列 CTAGAGGGTA TTAATAATG GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC 49 Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly 1 5 10 GAC GGC CCA GTG CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT 97 Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn 15 20 25 GGA CCA GTG AAG GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG 145 Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu 30 35 40 CAT GGA TTC CAT GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC 193 His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr 45 50 55 AGT GCA GGT CCT CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA 241 Ser Ala Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro 60 65 70 AAG GAT GAA GAG AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC 289 Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp 75 80 85 AAA GAT GGT GTG GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC 337 Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu 90 95 100 TCA GGA GAC CAT TCC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA 385 Ser Gly Asp His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys 105 110 115 GCA GAT GAC TTG GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA 433 Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly 120 125 130 135 AAC GCT GGA AGT CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA TAAA 482 Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln 140 145 150 CATTCCCTTG GATGTAGTCT GAGGCCCCTT AACTCATCTG TTATCCTGCT AGCTGTAGAA 542 ATGTATCCTG ATAAACATTA AACACTGTAA TCTTAAAAGT GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 602 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGTACCTT CTGAGGCGGA AAGAACCAGC 662 GGATC 667

【００２２】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定され
るものでない。

【００２３】

【実施例１】 ヒトＳＯＤ遺伝子のクローニング （１）市販のヒトポリ（Ａ）ＲＮＡ（クローンテック
ラボラトリー インコーポレーション,Cat# CL6684)
２．５μｇを含む水溶液５μｌを、６５℃で５分間加熱
し、急冷したのち、これに２０μｌの５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ８．３）、８ｍＭＭｇＣｌ2 、３０ｍＭＫＣ
ｌ，０．３ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭのｄＮＴＰ
ｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの等量混
合物）、ｐＣＶ１−オリゴｄＴプライマー（ファルマシ
ア社製）１．４μｇと１．５単位の逆転写酵素（宝酒造
社製）を加え、３７℃３０分間反応させた。反応液に等
量のフェノールを加え、遠心後の水層を等量のフェノー
ル・クロロホルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロ
ホルムで処理し、水層に等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと
２．５倍容のエタノールを加え−７０℃に１５分間放置
した。１５，０００ｒｐｍ、１５分の遠心にて回収した
沈澱物を７５％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し
た。これを１５μｌの１４０ｍＭカコジル酸ソーダ、３
０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、１ｍＭＣＯＣｌ2
、０．１ｍＭジチオスレイトール，０．２ｍＭのｄＣ
ＴＰと１８単位のターミナルトランスフェラーゼ（ファ
ルマシア社製）を加え、３７℃２０分間反応させ、同様
に、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿
し、減圧乾燥した。これを１０μｌの５０ｍＭＮａＣ
ｌ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭ
ｇＣｌ2 、１ｍＭジチオスレイトールで溶解し、２５単
位のＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）を加え、３７℃１時
間反応させた。フェノール・クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿し、減圧乾燥したのち、沈殿を１０μｌのＴＥ
（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴ
Ａの混液）に溶した。この溶液１μｌに７ｎｇのｐＬ１
オリゴｄＧリンカー（ファルマシア社製）を１０μｌの
ＴＥ、０．１Ｍ ＮａＣｌに溶解したものを加え、６５
℃で５分間加熱し、室温に３０分間置いた。次に２０ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、４ｍＭＭｇＣｌ2 、１
００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ硫安、０．１ｍＭ βーＮＡ
Ｄ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡと０．６μｇのＥ．ｃｏｌ
ｉＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社製）を加え、全量を
１００μｌとし、１２℃で一晩置いた。これに１μｌの
４ｍＭのｄＮＴＰｓ、１μｌの１５ｍＭ βーＮＡＤ、
１μｌのＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（０．４μｇ：フ
ァルマシア社製）、１μｌのＤＮＡポリメラーゼ（０．
３μｇ：ファルマシア社製）、１μｌのＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮａｓｅＨ（１単位：ファルマシア社製）を加え、１
２℃で１時間、ついで２５℃で１時間保温した。

【００２４】（２）次に、プラスミドＤＮＡの大腸菌へ
の導入は大腸菌をコンピタント細胞として導入する方法
をとった。大腸菌はＤＨ１株（ＢＲＬ製）を用いた。コ
ンピタント細胞の作製は、井上らの方法を用いた（Inou
e,H. et al. Gene, 96, 23-28(1990) ）。（１）で調製
した溶液２０μｌと作製したコンピタント細胞２００μ
ｌとを混合し、４℃で３０分間インキュベートした。そ
れを４２℃、３０秒間加熱後，ＳＯＣ培地（２％トリプ
トン，０．５％イーストエキス，１０ｍＭ ＮａＣｌ，
２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4 ，２０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）を１ｍｌ加
えて３７℃、１時間保温した。これを、アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１０ｇ，
イーストエキス５ｇ，ＮａＣｌ １０ｇ、寒天１５ｇ／
１ＬのＨ2 Ｏ）上に広げ、一晩培養し形質転換体を得
た。以後、この方法を用いて、大腸菌へのプラスミドＤ
ＮＡの導入を行った。

【００２５】（３）一晩培養して得られた形質転換体に
ついてコロニーハイブリダイゼーション法を用いてヒト
ＳＯＤ遺伝子のクローンの選択を行った。ＬＢ寒天培地
上に生育したコロニーをナイロン膜上に移し、この膜を
０．５ＭＮａＯＨ−１．５ＮａＣｌ溶液で１分間、３Ｍ
酢酸ソーダ（ｐＨ５．５）で１分間処理した後、８０℃
２時間乾燥した。次にこの膜を、５０ｍｌの３倍ＳＳＣ
（２０倍：ＮａＣｌ１７５．３ｇ、クエン酸ソーダ８
８．２ｇ、水１Ｌ）、０．１％ＳＤＳで６０℃１時間処
理、洗浄した。この膜を、１０ｍｌの６倍ＳＳＣ、６０
μｇ／ｍｌのサケＤＮＡ、１０倍デンハルト溶液（フィ
コール５０ｇ、ポリビニルピロリドン５０ｇ、ＢＳＡ５
０ｇ、水５００ｍｌ）からなる溶液に入れ、４３℃２時
間置き、次いで、５’端を³²Ｐでラベルした合成オリゴ
ヌクレオチド（１０⁷ ｃｐｍ／μｇ）５’ＡＴＧＧＣＧ
ＡＣＧＡＡＧＧＣＣ３’（この合成オリゴヌクレオチド
はヒトＳＯＤのＮ末アミノ酸、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−Ａｌａをコードする塩基配列である。また、
ＤＮＡ合成機８７５０型、ミリポア社製を使用して合成
した）を加え、４３℃一晩置いた。その後、４倍ＳＳ
Ｃ，１０倍デンハルト液，０．１％ＳＤＳで４３℃１５
分間処理、洗浄し、オートラジオグラフィーを取った。
このようにしてコロニーを検索した結果、ヒトＳＯＤ遺
伝子を有するクローンを得た。

【００２６】（４）この形質転換体から、Maniatisらの
方法（Maniatisら、Molecular Cloning,104,Cold Sprin
g Harbor(1982)）でプラスミッドＤＮＡを調製し、ｐｈ
ＳＯＤ１とした。このプラスミッドＤＮＡ１０μｇをＨ
緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、各々の２０ユニ
ットの制限酵素ＰｓｔＩとＰｖｕＩＩを加え全量を２５
μｌとし、３７℃２時間保温切断した後、低融点アガロ
ース（ＢＲＬ社製）ゲル電気泳動を行い、約０．７ｋｂ
ｐのヒトＳＯＤ遺伝子断片を切り出し、６５℃、１０分
間保温し、ゲルを融解した。水飽和フェノールを等量加
え、混和後氷中に５分間放置した。15,000rpm 、５分間
遠心し、上清（水層）を分取し、その水層を等量のフェ
ノール／クロロホルムで２回処理し、水層を回収後、1/
10容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量のエタノールを
加え、−７０℃に１５分間放置した。１５，０００ｒｐ
ｍ、１５分の遠心にて回収した沈澱物を７５％エタノー
ルで２回洗浄し、減圧乾燥した。

【００２７】また、ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造社
製）１μｇをＨ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、
各々の５ユニットの制限酵素ＰｓｔＩとＰｖｕＩＩを加
え全量を１０μｌとし、３７℃２時間保温切断した後、
５０mM トリス−塩酸（ｐＨ８．０）中にバクテリアア
ルカリホスファターゼ（東洋紡績社製）を０．５単位加
え、６５℃で１時間反応させた（以下ＢＡＰ処理とい
う）。反応液をフェノール・クロロホルム液で２回処理
した後、水層に１０分の１容の３M 酢酸ナトリウムおよ
び２．５倍容のエタノールを加え、遠心してベクターを
回収した。このベクターと前に調製した０．７Ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を、ライゲーションキット（宝酒造社製）を
用いて連結させた。予め、大腸菌ＭＶ１１８４株（宝酒
造社製）を前述の方法に従ってコンピテント細胞とし、
このコンピテント細胞に反応液を加え、形質転換体を得
た。得られた形質転換体からシークエンス反応の鋳型と
なる１本鎖ＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡを保持
した形質転換体を２ｘＹＴ培地（１．６％トリプトン，
１％イーストエキス，０．５％ＮａＣｌ，５０μｇ／ｍ
ｌアンピシリン）５ｍｌ中で３７℃、２時間振とう培養
した。ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（1.0x1011pfu/m
l，宝酒造社製）５０μｌを加え、３７℃でさらに一晩
振とう培養した。培養液を6,000rpm 10min遠心し、上清
を集め、その上清にＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレング
リコール６０００，２Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．０１％ ｇｅｌａｔｉ
ｎ，０．２％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ）を１／５容加え、
よく混ぜて室温に１５分間放置した。14,000rpm 10min
遠心し、沈澱物を得た。この沈澱物を１ｍｌのＳＭ溶液
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．２
％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，０．０１％ ｇｅｌａｔｉ
ｎ，０．１Ｍ ＮａＣｌ）に懸濁し、さらに０．２ｍｌ
のＰＥＧ溶液を加え、懸濁し室温に１５分間放置した。
14,000rpm 10min 遠心し、沈澱物を得た。これにＴＥ溶
液を加えてよく懸濁した。この懸濁液に等量のフェノー
ルを加え、遠心後の水層を等量のフェノール・クロロホ
ルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロホルムで処理
し、水層に１０分の１容の３M 酢酸ナトリウムと２．５
倍容のエタノールを加え−７０℃に１５分間放置した。
１５，０００ｒｐｍ、１５分の遠心にて回収した沈澱物
を７５％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥した。得ら
れた１本鎖ＤＮＡは１０μｌの滅菌水に溶解した。この
ように調製した１本鎖ＤＮＡを鋳型にして、Taq Dye Pr
imer Cycle Sequencing Kit,-21M13（ＡＢＩ社製）を用
いてシークエンス反応を行い、ＡＢＩ社のＤＮＡシーク
エンサー（モデル３７３Ａ）を用いて泳動し、データの
解析を行ってＤＮＡシークエンスを決定した。このＤＮ
Ａシークエンスにより、ヒトＳＯＤ遺伝子とベクター由
来のＤＮＡ断片を含む６８８塩基対の図１に示す塩基配
列が決定した。

【００２８】（５）この遺伝子配列を、大腸菌での発現
実験のために次の手順で改変した。上で得られた塩基配
列に基づき、２っのオリゴヌクレオチドＣＧＣＧＣＴＣ
ＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡ
ＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＣとＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴ
ＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧを合成し、８０μ
ｌのＨ2 Ｏ、１０μｌの１０ＸＴａｑポリメラーゼ緩衝
液（プロメガ社製）、１μｇの各々オリゴヌクレオチ
ド、１ｎｇの０．７ＫｂｐＤ断片、０．１ｍＭのｄＮＴ
Ｐｓ及び１０単位のＴａｑポリメラーゼ緩衝液（プロメ
ガ社製）を加えて、ＰＣＲ反応をした。反応液に等量の
フェノールを加え、遠心後の水層を等量のフェノール・
クロロホルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロホル
ムで処理し、水層に１０分の１容の３M 酢酸ナトリウム
と２．５倍容のエタノールを加え−７０℃に１５分間放
置した。１５，０００ｒｐｍ、１５分の遠心にて回収し
た沈澱物を７５％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥し
た。これを、２０μｌのＨ2Ｏに溶かし、Ｈ緩衝液（Man
iatisら、前出）中において制限酵素ＸｂａＩとＢａｍ
ＨＩ（東洋紡績社製）で完全消化して挿入断片を調べる
と、約０．７ｋｂｐ長だった。低融点アガロース電気泳
動を行い、約０．７ｋｂｐのヒトＳＯＤ遺伝子断片を得
て、水に溶解した。

【００２９】また、ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造社
製）１μｇをＨ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、
各々の５ユニットの制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩを加
え全量を１０μｌとし、３７℃２時間保温切断した後、
ＢＡＰ処理した。反応液をフェノール・クロロホルム液
で２回処理した後、水層に１０分の１容の３M 酢酸ナト
リウムおよび２．５倍容のエタノールを加え、遠心して
ベクターを回収した。このベクターと前に調製した０．
７ＫｂｐのＤＮＡ断片を、ライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結させた。次に、反応液をコンピタ
ント大腸菌ＭＶ１１８４株（宝酒造社製）に加え、形質
転換体を得て、プラスミッドＤＮＡを調製し、ｐＵＣ１
１８−ｈＳＯＤとした。同様にして、ＤＮＡシークエン
スを決定し、６６７塩基対の図２に示す塩基配列が決定
した。

【００３０】

【実施例２】 ブタＳＯＤ遺伝子のクローニング 市販のブタポリ（Ａ）ＲＮＡ（クローンテック ラボラ
トリー インコーポレーション,Cat# CL6684)２．５μ
ｇを含む水溶液５μｌを、６５℃で５分間加熱し、急冷
したのち、これに２０μｌの５０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．３）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭＫＣｌ，
１０ｍＭジチオスレイトール及びの２ｍＭのｄＮＴＰｓ
（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰの等量混合
物）、１μｇのオリゴｄＴ（ファルマシア社製）と１．
５単位の逆転写酵素（宝酒造社製）を加え、４２℃１時
間反応させた。その反応液の一部１μｌに、８０μｌの
Ｈ2 Ｏ、１０μｌの１０ＸＴａｑポリメラーゼ緩衝液
（プロメガ社製）、１μｇの各々の混合合成オリゴヌク
レオチドＣＧＣＧＣＧＡＡＴＣＡＴＧＧＣＮＡＣＮＡＡ
A/G ＧＣＮＧＴＮＴＧＣC/T （但し、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、
Ｃを表す）とＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣG/T/A ＡＴＮＡＣＮ
ＣＣG/A ＣＡＮＧＣT/C ＡＡＮＣＧ、０．１ｍＭのｄＮ
ＴＰｓ及び１０単位のＴａｑポリメラーゼ緩衝液（プロ
メガ社製）を加えて、ＰＣＲ反応をした。反応液に等量
のフェノールを加え、遠心後の水層を等量のフェノール
・クロロホルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロホ
ルムで処理し、水層に１０分の１容の３M 酢酸ナトリウ
ムと２.５倍容のエタノールを加え−７０℃に１５分間
放置した。１５，０００ｒｐｍ、１５分の遠心にて回収
した沈澱物を７５％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥
した。これを、２０μｌのＨ2 Ｏに溶かし、Ｈ緩衝液
（Maniatisら、前出）中においてＥｃｏＲＩ（東洋紡績
社製）で完全消化した後、この約０．４５ｋｂｐの挿入
断片を参考例１と同様な操作によって、ｐＵＣ−１１８
にサブクローニングして、得られたプラスミドをｐＵＣ
１１８ーｐＳＯＤと命名した。また、同様にして、塩基
配列を決定したところ、４５７塩基対の図３に示すブタ
ＳＯＤ遺伝子の一部の塩基配列が決定した。

【００３１】これら実施例１及び実施例２の方法による
ヒトＳＯＤ遺伝子とブタＳＯＤ遺伝子のクローニングの
フローを、図５に示す。

【００３２】

【実施例３】 ヒトＳＯＤ遺伝子とブタＳＯＤ遺伝子の
ハイブリッド遺伝子の作製実施例１で作製したｐＵＣ１
１８ーｈＳＯＤプラスミド２０μｇをＨ緩衝液（Maniat
isら、前出）を用いて、各々の３０ユニットの制限酵素
ＸｂａＩとＢａｍＨＩを加え全量を２５μｌとし、３７
℃２時間保温切断した後、低融点アガロース電気泳動を
行い、約０．７ｋｂｐのヒトＳＯＤ遺伝子断片を得た。
引き続き、この断片２μｇをＭ緩衝液（Maniatisら、前
出）を用いて、５ユニットの制限酵素ＤｄｅＩ（東洋紡
績社製）を加え全量を２５μｌとし、３７℃２時間保温
切断した後、低融点アガロース電気泳動を行い、約０．
３５ｋｂｐのヒトＳＯＤ遺伝子由来断片を得た。また、
前述の約０．７ｋｂｐのヒトＳＯＤ遺伝子断片２μｇを
Ｍ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、５ユニットの
制限酵素ＣｆｒＩ（宝酒造社製）を加え全量を２０μｌ
とし、３７℃２時間保温切断した後、低融点アガロース
電気泳動を行い、約０．３ｋｂｐ断片を得た。

【００３３】一方、実施例２で作製したｐＵＣ１１８ー
ｐＳＯＤプラスミド５μｇをＭ緩衝液（Maniatisら、前
出）を用いて、１０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩを加
え全量を２５μｌとし、３７℃２時間保温切断した後、
低融点アガロース電気泳動を行い、約０．４５ｋｂｐの
ブタＳＯＤ遺伝子断片を得た。引き続き、この断片１μ
ｇをＭ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、５ユニッ
トの制限酵素ＤｄｅＩ（東洋紡績社製）と５ユニットの
制限酵素ＣｆｒＩ（宝酒造社製）を加え全量を２５μｌ
とし、３７℃２時間保温切断した後、低融点アガロース
電気泳動を行い、約２０ｂｐブタＳＯＤ遺伝子由来断片
を得た。

【００３４】このようにして得られた約０．３５ｋｂｐ
と約０．３ｋｂｐのヒトＳＯＤ遺伝子由来断片と約２０
ｂｐブタＳＯＤ遺伝子由来断片各々の１００ｎｇをライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて１６℃、３０
分間反応させ連結させた。次に、この操作で得られた約
０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片２０ｎｇと制限酵素ＸｂａＩ
とＢａｍＨＩで切断し、ＢＡＰ処理したベクターｐＵＣ
１１８と混合し、ライゲーションキット（宝酒造社製）
を用いて１６℃、３０分間反応させ連結させた。これ
を、大腸菌ＭＶ１１８４株のコンピタント細胞に導入
し、形質転換体を得た。サブクローニングして、得られ
たプラスミドをｐＵＣ１１８ーＨＳＯＤと命名した。ま
た、同様にして、塩基配列を決定したところ、６６７塩
基対の図４に示すヒトＳＯＤ遺伝子とブタＳＯＤ遺伝子
のキメラ融合遺伝子の塩基配列が決定した。

【００３５】この実施例３の方法によるヒトーブタハイ
ブリッド遺伝子の構築フローを図６に示す。

【００３６】

【実施例４】 発現ベクターの構築 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ｐＯＸ１３（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１５６５）株から調製したプラスミッドＤＮＡ１０
μｇをＭ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、１０ユ
ニットの制限酵素ＤｒａＩを加え全量を２５μｌとし、
３７℃２時間保温切断した後、低融点アガロース電気泳
動を行い、約０．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。一方、
ｐＵＣ１３プラスミッドＤＮＡ（宝酒造社製）１μｇを
Ｍ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、５ユニットの
制限酵素ＳａｌＩを加え全量を１０μｌとし、３７℃２
時間保温切断した後，フェノール抽出処理及びエタノー
ル沈殿処理して沈殿物を得た。この沈殿物を、６７ｍＭ
ＫＰＯ4 、６．７ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ２−メル
カプトエタノール及び３３μＭの４ＮＴＰｓを含む反応
液に溶解し、クレノウ断片酵素（宝酒造社製）２０ユニ
ットを加え、２２℃１時間反応した。これを、ＢＡＰ処
理した。これに、まえの操作で得られた約０．２ｋｂｐ
のＤＮＡ断片２０ｎｇを混合し、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて１６℃、３０分間反応させ連結
させた。これを、大腸菌ＭＶ１１８４株のコンピタント
細胞に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体か
ら、プラスミッドＤＮＡを調製し、ｐＫＮ１９とした。
このｐＫＮ１９プラスミッドＤＮＡ１μｇをＨ緩衝液
（Maniatisら、前出）を用いて、各々の５ユニットの制
限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩを加え全量を１０μｌと
し、３７℃２時間保温切断した後、ＢＡＰ処理した。一
方、実施例３で得られたｐＵＣ１１８ーＨＳＯＤ、１０
μｇをＨ緩衝液（Maniatisら、前出）を用いて、各々の
２０ユニットの制限酵素ＸｂａＩとＢａｍＨＩを加え全
量を５０μｌとし、３７℃２時間保温切断した後、低融
点アガロース電気泳動を行い、約０．７ｋｂｐの断片を
得た。この断片と先にＢＡＰ処理したベクターｐＫＮ１
９と混合し、ライゲーションキット（宝酒造社製）を用
いて１６℃、３０分間反応させ連結させた。これを、大
腸菌Ｗ３１１０株のコンピタント細胞に導入し、形質転
換体を得た。サブクローニングして、得られたプラスミ
ドをｐＫＮ１９ーＨＳＯＤと命名した。

【００３７】この実施例４の方法によるヒトーブタハイ
ブリッド遺伝子発現ベクターの構築フローを図７に示
す。

【００３８】

【実施例５】 ＳＯＤの大腸菌内での発現 （１） 上で得られたプラッミドｐＫＮ１９ーＨＳＯＤ
を保持する形質転換体を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
を含有するＢＨＩ培地１ｍｌにおいて、３７℃で１８時
間振とう培養した後、３、０００ｒｐｍ、１０分間遠心
分離して、菌体ペレットを得た。この菌体ペレットに１
ｍＭＣｕＳＯ4 、１ｍＭＺｎＳＯ4 ，５０ｍＭシュクロ
ースを含む５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）バツフ
ァー１ｍｌを加えた。氷冷下にて、菌体を１分間超音波
破砕した。ヒトＳＯＤに対する抗体を用いたＥＩＡによ
る測定の結果、ｐＫＮ１９ーＨＳＯＤを保持した大腸菌
Ｗ３１１０は８０μｇ／ｍｌを産生した。

【００３９】（２）ｐＫＮ１９ーＨＳＯＤを発現させ
た、大腸菌体２００ｇを１ｍＭＣｕＳＯ4 、１ｍＭＺｎ
ＳＯ4 ，５０ｍＭシュクロースを含む５０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．６）緩衝液６００ｍｌに懸濁した後、１
分間超音波破砕した。破砕液に６００ｍｌのクロロホル
ムーエタノール混液（３：５）を加え、４℃、１５分間
攪拌し、遠心分離にて、沈殿物を除いた。上澄液に３０
０ｇのＫ2 ＨＰＯ4 を溶かし、生じたエタノール層を
（５００ｍｌ）を−２０℃、３０分間冷却し、析出した
沈殿物を遠心分離にて除き、上澄液をエバポレーターに
て減圧濃縮した。得られた濃縮液３００ｍｌは５０ｍＭ
シュクロース、２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．８で平衡
化したセファデックスＧ−２５ゲル（ファルマシア社
製）カラム（４．５×６０ｃｍ）を用いたゲル濾過によ
り同緩衝液に置換した。これにＤＥ５２（ワットマン社
製）１０ｇを加え、４℃、３０分間攪拌し、不純物を吸
着させ、ガラスフィルターで濾別した。濾液は５０ｍＭ
シュクロースを含む２．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）に対して透析を行った後、同緩衝液で平衡化したＤ
ＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製）
カラム（１．６×２０ｃｍ）を通過させ、ＳＯＤを吸着
させた。カラムを同緩衝液で洗浄した後、リン酸バツフ
ァー除濃度を２．５ｍＭから５０ｍＭまで直線的に上昇
させてＳＯＤを溶出させた。ＳＯＤ活性はほぼ１つのピ
ークとして溶出されたため、このピークを集め、凍結乾
燥した。得られた凍結乾燥粉末を、１０ｍｌの蒸留水に
溶解し、５０ｍＭシュクロースを含む１０ｍＭトリス−
塩酸（ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化したセファデックス
Ｇ−１００（ファルマシア社製）カラム（４．５×８０
ｃｍ）に流入させ、ゲル濾過精製を行った。以上の手法
によって得られたＳＯＤは重量としては約２．５ｇで、
ＳＯＤ１ｍｇあたり３０００〜３５００ユニットで、電
気泳動的に単一バンドを示し、前記したペプチド配列で
あることを確認した。

【００４０】

【発明の効果】本発明方法によると、ヒトＳＯＤ遺伝子
において、１１１位のアミノ酸ＣｙｓをコードするＴＧ
Ｃを合成オリゴヌクレオチドを使用した部位特異的変異
法によってＳｅｒをコードするＴＣＣ変換する方法に代
わって、天然に存在するブタＳＯＤ遺伝子からの制限酵
素による消化産物である２本鎖ＤＮＡを使用して、簡便
に前記の変換が出来るようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はヒトＳＯＤ遺伝子の塩基配列である。

【図２】図２はヒトＳＯＤ遺伝子の５’及び３’側配列
の一部を改変した塩基配列である。

【図３】図３はブタＳＯＤ遺伝子の塩基配列である。

【図４】図４は発現に用いたヒトーブタハイブリッド遺
伝子の塩基配列である。

【図５】図５はヒトＳＯＤ遺伝子及びブタ遺伝子のクロ
ーニングのフローを示す図である。

【図６】図６はヒトーブタハイブリッド遺伝子の構築の
フローを示す図である。

【図７】図７はヒトーブタハイブリッド遺伝子の発現ベ
クターの構築フローを示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】スーパーオキサイドディスムターゼ（以下
   「ＳＯＤ」と略す）遺伝子において、ヒトＳＯＤの１０
   ７位から１１３位までのアミノ酸配列に相当するＤＮＡ
   配列を、ブタＳＯＤ遺伝子における、ブタＳＯＤの１０
   ６位から１１２位までのアミノ酸配列に相当するＤＮＡ
   配列で置換して得られる下記一般式（１） 【化１】 のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡと複
   製可能なベクターとの組換えＤＮＡを含有する細胞を培
   地中で培養し、産生されたＳＯＤ活性を有するポリペプ
   チドを採取することを特徴とするＳＯＤ活性を有するポ
   リペプチドの製法。