CN104342409B - 重组人参超氧化物歧化酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种适合大肠杆菌分泌表达重组人参超氧化物歧化酶(recombinant ginseng superoxide dismutase，rgSOD)的信号肽核苷酸序列和编码人参SOD的SOD核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前述载体的工程细胞以及从该工程细胞纯化rgSOD的方法。优化后的超氧化物歧化酶基因非常适合大肠杆菌表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得rgSOD纯品。本发明还包括通过上述方法制备的重组人参超氧化物歧化酶在制备治疗与人老化相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆品中的应用。

Description

重组人参超氧化物歧化酶的制备方法

技术领域

本发明涉及大肠杆菌分泌表达重组人参超氧化物歧化酶的编码信号肽的核 苷酸序列和编码人参SOD的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的载体、含有前 述载体的工程细胞和从该工程细胞纯化rcSOD的方法及其用途，属于基因工程 和蛋白质生物化学领域。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,EC1.15.1.1,SOD)是一种广泛存 在于动植物、微生物中的金属酶。能催化生物体内超氧自由基(O^2-)发生歧化反 应，是机体内O^2-的天然消除剂(黎瑞珍,杨庆建,陈贻锐.超氧化物歧化酶(SOD) 活性的测定及其应用研究.海南琼州大学学报，2004年10月28日：34-36)。 从而清除O^2-，在生物体的自我保护***中起着极为重要的作用。SOD是一种 源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对 人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果(朱汉民，王赞舜.衰老机理研究 中的超氧物岐化酶.国外医学老年病分册,1985.(1):49～54；胡文荛,钟福孙, 韩宪法等.正常人、高血脂症、心血管病血中过氧化脂质和超氧物岐化酶的分 析.生化药物杂志,1988(2):48～50)。超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首 次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七 十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物 活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超 氧化物歧化酶。SOD几乎从人到细胞，从动物到植物，都有它的存在(Reis s.Rat liver sup eroxide dism utase purif icat ionand ager elat ed modificat ion.E uropan J.Biochem.1976,63:617～623)，按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是 含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基的称(Cu.Zn-SOD)，最为常见的一种酶，呈绿 色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰(Mn)金属辅基的称(Mn-SOD)， 呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁(Fe)金属辅 基的称(Fe-SOD)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。

人参超氧化物歧化酶(Cu/Zn型)蛋白全长152个氨基酸，单个肽链分子 量为15.3KD，以二聚体形式存在。

伴随生物科学技术的发展，人们开始了基因工程法表达SOD，但在大肠杆 菌中表达SOD往往以无活性的包涵体形式存在，虽然人们尝试了诸多复性方 法，终究因为成本高、复性率低等原因，很难实现工业化大规模生产要求。后 来，科研工作者探讨了利用真核生物酵母分泌表达，获得了较为满意的结果， 目前，上市的重组SOD，均用大肠杆菌胞内表达或酵母表达生产，虽然采用高 密度发酵，但表达水平低，加上由此带来的复杂的纯化工艺(需要反相层析)， 产率较低，此低产率不能满足市场需求。除了应用大肠杆菌表达***外，人们 也试图利用芽孢杆菌、啤酒酵母以及哺乳动物细胞等表达***生产SOD。采用 真核表达***能够实现SOD的活性，但遗憾的是，因为表达水平低、成本高等 因素，目前几乎没有人采用这些表达***来生产SOD。而大肠杆菌分泌表达系 统的研究是其中最重要的趋势。

本发明人通过多次筛选，发现了一个可用于分泌表达人参超氧化物歧化酶 蛋白的分泌信号肽段编码的基因(SEQ ID NO：1)，与人参超氧化物歧化酶编码 基因(SEQ IDNO：3)融合形成信号肽-人参超氧化物歧化酶编码基因，构建原核 表达载体后，转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，从而实现了rgSOD的高水 平分泌表达rgSOD，在此基础上完成了本发明。

本发明***优化、改变了获得SOD的大肠杆菌工程细胞的方法，利用大肠 杆菌基因表达的分泌肽段与SOD融合表达获得了更为满意的结果，并通过发酵 工艺的改进，同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、高活性极具产业化价 值的一种rgSOD生产方法。

发明内容

基于现有技术的缺欠，本发明的目的是提供编码上述信号肽的核苷酸序列、 含有该信号肽核苷酸序列和人参SOD核苷酸序列的载体、含有前述载体的工 程细胞以及从该工程细胞纯化rgSOD的方法。

本发明的发明人惊奇地发现,在表达如SEQ ID NO：3所示的人参SOD核 苷酸序列前，加入如SEQ ID NO：1所示的信号肽核苷酸序列，可以意外地获 得高融合表达的人参SOD的载体，且使用该载体表达的SOD易于纯化，纯度 高、收量大，活性高。

在本发明的又一个方面，提供了一种在编码人参超氧化物歧化酶的核苷酸 序列前加入一个能使人参超氧化物歧化酶表达后分泌到细胞壁与原生质膜间隙 的分泌肽段核酸序列，所述的核苷酸序列SEQ ID NO：1能够编码SEQ ID NO： 2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列SEQ ID NO：1与人参超氧化物歧 化酶编码区序列SEQ ID NO：3融合形成核苷酸序列SEQ ID NO：5。

在本发明的再一个方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述的核苷 酸序列。优选地，所述表达载体为pET22b。

在本发明的再一个方面，提供了一种工程细胞，它是通过所述表达载体序 列转化宿主细胞而获得的，且表达载体中整合有编码重组超氧化物歧化酶的核 苷酸序列。

优选地，所述的工程细胞是大肠杆菌菌株为BL21(DE3)。

在本发明的进一步方面，提供了一种生产人参超氧化物歧化酶的表达方 法，包括以下步骤：在适合表达条件下，培养本发明上述的宿主细胞，从而分 泌表达人参超氧化物歧化酶；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)。所述培养包括：培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液 浓度达到OD600，诱导期时间为18-21hr，发酵及诱导温度保持在16-25℃，IPTG 用量为0.05-1mM/L，诱导期的pH值为6-8。所述大肠杆菌宿主细胞包括可以 用IPTG诱导合成人参超氧化物歧化酶，并且能够分泌到细胞壁与原生质膜间 隙的大肠杆菌细胞。

在本发明的另一个方面，对表达后重组人参SOD进行了粗提和进一步纯 化。其包括如下步骤：(1)对发酵样品通过离心和/或过滤方式收集菌体，用溶菌 酶处理菌体，再通过离心方法获得清液，(2)通过盐析和/或超滤进行初步纯化 后，或直接通过阴离子交换、疏水层析方法，获得纯度达到95％以上(如95-99.9 ％)的纯品，本发明所制备的重组人参SOD活性在5500U、或6000U以上。

在本发明的另一个方面，本发明提供使用上述方法制备的重组人参SOD 在制备治疗与人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及 其化妆品中的用途。所述重组人参超氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列：

a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；和/或

b)SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；或

c)SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。

本发明的主要优点在于：(1)优化后的链接分泌信号肽基因非常适合大肠杆 菌表达，具有高表达、高稳定、高分泌的特点；(2)含有分泌信号肽的超氧化物 歧化酶基因的宿主菌株具有高密度生长的特性，非常适于基因工程药物大规模 高密度的发酵生产。大肠杆菌表达的hgSOD以可溶性、具活性形式分泌到细胞 壁与原生质膜间隙；产物不须复性，可以直接进行纯化；同时由于表达水平高， 纯化工艺复杂程度大大简化，得率得到大幅度提高；(3)与真核***表达相比， 成本大大降低，产业化价值得到大幅度提升。

附图说明

图1显示用于编码本发明信号肽的核苷酸序列。

图2本发明信号肽的氨基酸序列。

图3显示用于编码本发明天然人参SOD的核苷酸序列。

图4本发明天然人参SOD的氨基酸序列。

图5显示用于编码本发明重组人参SOD的核苷酸序列。

图6本发明重组人参SOD的氨基酸序列。

图7用于编码本发明信号肽的核苷酸序列和由其推定的本发明信号肽的氨基酸序列的对应图。

图8用于编码本发明融和表达的重组人参SOD的核苷酸序列和由其推定的本发 明融和表达的重组人参SOD的氨基酸序列的对应图。

图9是本发明的一种表达质粒pET-rgSOD的构建示意图。

图10是摇瓶37℃条件下rgSOD表达电泳图。各泳道如下：泳道1、诱导前； 泳道2、诱导后，诱导4小时取样，SDS-PAGE电泳检测表达情况。

图11是在不同温度条件下(IPTG浓度为1mM/L)rgSOD表达电泳图。诱导 20小时后，收集菌体，用溶菌酶在37℃条件下，处理2小时，15000rpm离心 10分钟，取上清，SDS-PAGE检测表达情况。

图12是IPTG浓度对rgSOD表达水平的影响。在20℃条件下，分别用0.6mM、 0.4mM、0.2mM、0.1mM浓度的IPTG诱导表达。诱导20小时后，收集菌体， 用溶菌酶在37℃条件下，处理2小时，15000rpm离心10分钟，取上清， SDS-PAGE检测表达情况。

图13是在6.5L发酵罐中rgSOD的表达情况电泳图。各泳道如下：泳道1、诱 导前取样；泳道2、诱导20小时取样。

图14是纯化后的rgSOD的电泳图。在6.5L发酵罐中表达rgSOD，收集菌体， 用溶菌酶在37℃条件下，处理2小时，15000rpm离心10分钟，取上清，用阴 离子交换层析、疏水层析以后的蛋白SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发 明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。

在实施本发明的过程中，使用了分子生物学、基因工程学、遗传学、细胞 分子生物学、生物化学、蛋白质生物化学、蛋白质生物化学工程、制药工艺学、 医学、生理学、病理学、动物实验学，Sambrook等(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)等很多 传统技术和基础理论。这些技术是熟知的。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种重组人参超氧化物歧化酶,其中， 所述人参超氧化物歧化酶包含任一如下氨基酸序列：

a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；和/或

b)SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；或

c)SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。

在本发明的又一个实施方式中，通过分子克隆提供编码所述信号肽和人参 超氧化物歧化酶的核苷酸序列。

本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。 优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。本发明还涵盖编码具有如本 文所定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列” 是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部 分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成物或重组物，其可以是双链的或 单链的(无论其代表正义链还是反义链)核酸分子。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种分离的核酸分子，其中，所 述分离的核酸分子包含任一如下核苷酸序列：

a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或

b)编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

c)编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

编码具有如本文所定义的酶或蛋白的核苷酸序列可以从产生所述酶或蛋白 的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟 知的。本文仅为举例性质，例如利用强变性剂提取总RNA，利用转录和反转录 方法，产生所述酶或蛋白的生物的染色体DNA或信使RNA(mRNA)来构建 基因组DNA和/或cDNA文库。

还有，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述酶或蛋白的核 苷酸序列，再如，利用自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退 火、连接并克隆到适当的载体中。

因此，所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成 和cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自 合成的、基因组的或cDNA的片段根据需要而制得。每个连接的片段对应于整 个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链 式反应(PCR)来制备。

本文中术语“PCR”被称之为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)是指在DNA聚合酶的催化下，通过变性、退伙，聚合扩增等反复循环 达到几何数量级扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)制备引物，如PCR引物，用于可 选扩增反应的引物；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、和其它片段 的长度可以是至少12个、如至少15个，优选为至少20个、如至少25个、30 个、35个或40个核苷酸，且其也涵盖在如本文所用的术语多核苷酸之内。

通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的 特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列。因此，在本发明的一个可选实施方式中， 可以使用本领域已知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列。

通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式 逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方 法的技术。引物设计可以根据提高纯度需要考虑在目的蛋白N端或C端的核苷 酸序列加入编码标签蛋白(Tagged-protein expression system)的核苷酸序列， 常见的标签蛋白包括但不限于His-tag蛋白，Flag-tag蛋白，GST-tag蛋白等。

可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发 明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)。它们也可以通过标准技术进行克隆。通常使 用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。 这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约12至 40个核苷酸)，使引物接触从人参中获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区 域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶 上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含适合的限制 性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。

如上所述，可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制 备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)。它们也可以通过标准技术进行克 隆。通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的 多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物 (如约15至30个核苷酸)，使引物接触从人参中获得的mRNA或cDNA，在可 以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在 琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以设计引入使其包含 适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。 酶切位点的设计可以根据载体克隆位点和编码具有本文所定义的特定性质的酶 或蛋白的核苷酸序列来设定，往往在前面加入若干个保护碱基，详细可以参考 PROMEGA公司提供的保护碱基设定参考手册。

在本发明的一个具体实施方式中，所述人参超氧化物歧化酶通过表达任一 以下所示的核苷酸序列而获得：

a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或

b)编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

c)编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

术语“构建体”，即指构建的载体,其包含载体载体本身的核苷酸序列和依照 本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列，且其 直接或间接地与启动子连接。在一些具体实施方式中，优选构建体至少包含本 发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的酶或蛋白且可操作地 与启动子连接的核苷酸序列。

术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。其包含载体本身的 核苷酸序列和依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的酶或蛋白的 核苷酸序列，且其直接或间接地与强启动子连接。优选地，本发明的表达载体 包含载体本身的核苷酸序列和所述信号肽-人参SOD结合的核苷酸序列，表达 载体可以被引入到生物(如大肠杆菌宿主生物)的基因组中。术语“引入”优选涵 盖稳定的引入到基因组中。

在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种表达载体，其中所述表达载 体含有任一如下核苷酸序列：

a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；和/或

b)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或

c)SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

优选地，所述表达载体为pET22b。

如本文所定义的编码人参SOD的核苷酸序列和信号肽序列可以存在于载 体中，在该载体中所述核苷酸序列可操作地连接到调控序列，使得所述调控序 列能够通过适合的宿主细胞(如大肠杆菌)表达所述核苷酸序列，即所述载体是 表达载体。本发明的载体可以被转化到上述的适合宿主细胞中，以表达具有如 本文所定义的编码人参SOD活性的酶或蛋白。通常根据其将被引入的宿主细胞 来选择载体(如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体、基因组***物)。本发明可以 涵盖发挥等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载体。一旦转化到所 选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能，或 可以自行整合进入基因组。

所述载体可以包含一个或多个选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因， 如提供氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。载 体可以在体外使用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。

表达载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序 列。所述载体可以是pET 1-46系列载体(NOVAGEN公司)、pGEX系列载体、 pUC系列载体、pACYC系列载体、pUB系列载体、pE系列载体、pAMB系列 载体和pIJ系列载体。优选为pET系列载体，最优选为pET22b。

上述核苷酸序列的检测是通过核苷酸序列测序仪来完成，同时通过各种分 子生物学软件来分析所得到的基因是否是目的基因。常用分析软件有 GENTYX,Vector NTI,GenDOC,DNAman,也可以借助于BLAST和FASTA进行 离线和/或在线搜索和检索分析用以比对核苷酸序列和蛋白质序列。

本文所使用的术语“酶”与术语“氨基酸序列”和/或术语“多肽”和/或术语“蛋 白”同义。在一些实例中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”和/或“酶”同义，可以互 为替代使用。

本文所使用的术语“重组人参SOD”与术语“融和表达的重组人参SOD”同 义。

本文术语“信号肽”是根据所用的序列和/或载体，通过由宿主细胞表达编码 人参SOD的核苷酸序列所产生的人参SOD可以被分泌出或包含在细胞内。信 号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对人参 SOD编码序列来说可以是天然的或外源的。可以使用能够指导所表达的人参 SOD进入所选宿主细胞(优选为大肠杆菌BL21宿主细胞)分泌途径的任何信号 肽编码序列。

用于本发明任一方法和/或应用中的编码人参SOD的核苷酸序列可以编码 天然的人参SOD或人参SOD变体。例如，用于本发明的编码人参SOD的核苷 酸序列可以是中所述的一种。NCBI这些文献通过引用并入本文。

本文所用的术语“人参SOD”优选地是指具有催化超氧自由基转化为过氧 化氢和产生氧气功能的酶。

优选地，用于本发明任一方法和/或应用中的人参SOD是能够将各种有机 体内的超氧自由基转化为过氧化氢和产生氧气功能。所述有机体包括但不限于 动物、植物和微生物。首选为动物，优选为人类。

在本发明的一些实施方式中，可以将编码信号肽的核苷酸序列可操作地连 接到编码所选人参SOD的核苷酸序列。所选人参SOD可以在本文所定义的宿 主细胞中作为融合蛋白表达。

本发明还涵盖由用于本发明任一方法和/或应用中的编码人参超氧化物歧 化酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

本发明提供了一种特别适合在大肠杆菌细胞中表达的人参超氧化物歧化酶 的分泌肽段编码序列。该序列是根据大肠杆菌密码子偏爱性等原则而筛选出 的。设计出的专门为rgSOD分泌表达的编码序列用常规方法进行全基因合成， 或通过PCR方法实现的。

本文中的术语“细胞”包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特 定性质的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何细胞，其与术语 “生物”和/或术语“细菌”和/或术语“微生物”和/或术语“细菌微生物”同义，互为替 换使用。如在背景技术所描述的含有编码天然人参SOD酶的天然核苷酸序列的 天然人参植物细胞也包含在本文术语“细胞”内。

与本发明有关的术语“工程细胞”或“转化的宿主细胞”包括任何包含编码具 有如本文定义的特定性质的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其获得的产物的细 胞，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的酶或蛋白的核 苷酸序列在所述生物内表达。优选核苷酸序列被引入到生物的基因组中。术语 “转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境 中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。因此，本发明的转基因生物包括 包含以下任何一种或组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的酶或蛋白 的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文 定的细胞或其产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的 特定性质的酶或蛋白且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并 不与重组人参超氧化物歧化酶编码基因相连。

在本发明的再一个实施方式中，提供一种工程细胞，其中所述工程细胞是 通过转化上述表达载体进入宿主细胞后获得的细菌细胞。

所述宿主微生物可以是原核或真核生物。本发明的人参SOD或者编码人参 SOD的核苷酸序列可获自于，包括但不限于以下属的细菌微生物：埃希氏菌属 (Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弯曲 杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrionaceae)、木杆菌属(Xylella)、硫化叶菌属 (Sulfolobus)、气单胞菌属(Aeromonas)、链霉菌属(Streptomyces)、酵母菌属 (Saccharomyces)、乳球菌属(Lactococcus)、、曲霉属(Aspergillus)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、李斯特菌属(Listeria)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、中慢 生根瘤菌属(Mesorhizobium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、黄单胞菌属(Xanthomonas) 和假丝酵母属(Candida)；优选为埃希氏菌属(Escherichia).优选为埃希氏菌属 (Escherichia)。

适宜地，本发明的人参SOD或者编码人参SOD的核苷酸序列可以获自于， 优选获自于以下细菌微生物：大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus sp)、空 肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、弧菌(Vibrionaceae)、苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、硫磺矿硫叶菌(Sulfolobus solfataricus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、 乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、野油 菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、***滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、脱卤脱亚硫酸菌 (Desulfitobacterium dehalogenans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、单核细胞增多 性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、 百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)。优选为大肠杆菌细胞，更优选为BL21 (ED3)大肠杆菌细胞。

在本发明的一些实施例中，制备了一些感受态细胞以利于体外载体转入到 宿主细胞中。常用制备感受态细胞包括低温处理。例如16℃。

再者，适合用于本发明的宿主生物也可以为植物。因此，本发明还涉及产 生具有增强SOD表达水平的转基因植物的方法，其包括以下步骤：利用本文定 义的人参过氧化物歧化酶(尤其是利用包含本文定义的人参过氧化物歧化酶的 表达载体或构建体)转化植物细胞，和由转化的植物细胞培养出植物。

在一个实施方式中，根据本发明的人参SOD可以是可获自于，优选获自于 大肠杆菌BL21JZY001(分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichia Coli)的人参SOD，所述大肠杆菌菌株JZY001由吉林省金梓源生物科技有限公司根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China GeneralMicrobiological Culture Collection Center(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮政编码：100101) 保藏日为2014年09月29日，保藏号为CGMCC9743。

在本发明的一些实施方式中，对适合本发明的细菌微生物的菌种、培养条 件、诱导条件和表达发酵条件等进行了实验性研究，所述条件还包括溶氧、转 速和温度等外部各种条件。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于大肠杆 菌生长、表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括但并不限于 以下培养基：LB、马铃薯糖琼脂培养基、豆芽汁培养基、豌豆琼脂培养基、马 铃薯-蔗糖-琼脂培养基、马铃薯-蔗糖-琼脂培养基等，优选为LB培养基。

溶氧条件都可以控制，适合的溶氧控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气、 空气混合气体的通入来解决。

在另一优选例中，本发明还通过发酵工艺优化，进一步优化了rgSOD的表 达条件。由于表达水平高，达到100mg/L以上，且为可溶性表达，给纯化工艺 带来极大便利，通过二步层析工艺，大幅度提高产品得率，得到了表达量高、 比活性高、提纯方便、得率高和性状稳定的rgSOD产品，大大降低生产成本， 非常适合大规模生产。

在优化基因的5′端与3′端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方 法，将优化基因克隆入表达载体(如pET28、pET22等)。然后，转化入BL21(DE3) 宿主细胞，用IPTG诱导，摇瓶表达选出高表达工程细胞。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于大肠杆 菌生长、表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括(但并不限于) 以下培养基：

一种优选的摇瓶培养条件是：挑取LB平板上的单克隆，以LB为摇瓶培 养液，培养至OD600，用IPTG诱导表达，诱导18-21小时，rgSOD产量可达 50-200mg/L。

为了大规模生产rgSOD，需要在发酵罐上培养工程细胞，表达rgSOD，因 此对大肠杆菌BL21(DE3)工程细胞的中试表达条件进行优化，发酵规模从 1L到300L，发酵能力呈线性放大。优化后表达量大于400mg/L发酵物。

经过本发明的反复实验，表达条件进行优化如下：

1.对于培养基的选择而言，发酵罐发酵时可选择无机盐培养基，也可在无 机盐培养基基础上进行一定更改，但所含离子成份宜与无机盐培养基相似。

2.就温度的控制而言，rgSOD的发酵及诱导温度保持在16-25℃。

3.就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在6-8；

4.就溶氧(DO)的控制而言，DO控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气/ 空气混合气体的通入来解决。

5.就补料的流加而言，补料种类宜包括淀粉、葡萄糖等碳源，可单独补料 或混合补料。

6.就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓 度控制在0.1-1mM/L。

7.就氨苄西林使用量而言，要求100mg-400mg，能够有效地抑制杂菌生长。

8.就诱导时间而言，没有特别限制，通常为18-21小时，较佳地为20小时。

在本发明的一些实施方式中，从发酵的细菌中抽提人参SOD蛋白。该抽提 过程就是所述的粗提，具体包括收集菌体，离心获得生物量，破壁溶出蛋白， 盐析、过滤等步骤。

表达的rgSOD存在于细胞壁与原生质膜之间，表达水平大于200mg/L发酵 物，使纯化复杂度大大下降。通常，发酵样品先以离心或过滤等方式收集细胞， 然后用溶菌酶(4-10mg/g菌体)溶解细胞壁多糖，使目标蛋白进入上清液体中， 上清液含目的蛋白质rgSOD。上清液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后 再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化，所述盐析为用0-60％中性硫酸铵分 级粗提蛋白，超滤用超滤膜进行过滤，例如用截留分子量为10KD的超滤膜进 行过滤。

在本发明的一些实施方式中，对粗提后的蛋白进行进一步纯化。层析技术 包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析 等技术。经不同层析技术、层析过程比较，优化的层析方法包括：1.阴离子交 换层析：阴离子交换层析介质包括但不限于Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。 如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换 层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进 行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液***相似，然后上样， 进行盐浓度或pH的梯度洗脱；2.疏水层析：疏水层析介质包括但不限于 Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、 (NH4)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏 水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。3.凝胶过滤层析疏水层析介质包括(但 不限于)Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系， 或进一步精纯。

经过上述纯化可得到rgSOD纯品，纯化得率通常为40％以上，纯度95％ 以上，纯品得率约200mg/L培养物。

纯化后的rgSOD可用常规方法制成各种剂型，如冻干粉针剂。选择一定的 稳定剂，同时还可添加表面活性剂、抗氧化剂等保护剂，及适当缓冲液进行冷 冻干燥。得到的制品具有活性损失小、水分含量低、稳定性好、易于长期保存 等特点。rgSOD还可做成水针剂、喷雾剂、微球缓释剂，以及经PEG修饰制成 长效制剂等。

在本发明的一个实例中，构建了rgSOD的BL21(ED3)表达工程细胞， IPTG诱导，高水平分泌表达rgSOD，不需复性。

在本发明的另一个实例中，经过发酵参数优化，提高rgSOD的表达水平。

因表达蛋白属于胞外分泌型，不需破菌处理。在本发明的另一个实例中， 经过纯化，得到rgSOD纯品，纯化得率50％以上，纯度95％以上，纯品得率 约200mg/L培养物。

在本发明又一个实施方式中，纯化后原液加入适当辅料，制成rgSOD的注 射用粉针剂。稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

优选地，所述孵育温度和孵育时间的组合可以有效保证至少5％的SOD活 性，优选至少10％的SOD活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、 40％、50％、60％或75％的酶或蛋白活性。

在再一个实施方式中，样品经10KD膜包超滤浓缩置换缓冲液、 Q Sepharose F.F.以及phenyl sepharose F.F.层析以后得到纯度大于95％、得率在 50％以上的纯品。

综上所述，在一个完整的具体实施方式中，本发明提供了一种制备重组人 参超氧化物歧化酶的方法，其中，所述方法包括如下步骤:

a)将如下的任一核苷酸序列克隆入表达载体pET22b的步骤，所述的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，和/或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列， 或SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列；

b)将所述表达载体pET22b转入到宿主细胞大肠杆菌BL21(ED3)细胞的步骤；

c)将宿主细胞大肠杆菌BL21(ED3)细胞进行培养步骤，培养条件包括：培养 分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600，诱导时间为 18-21hr，发酵及诱导温度保持在16-25℃，诱导期IPTG浓度在0.1-0.2mM/L；

d)分离纯化出融核表达的重组人参超氧化物歧化酶的步骤，对发酵样品通过离心和/或过滤方式收集菌体，用溶菌酶1mg/g菌体，在37℃条件下，处理2小 时，再通过离心获得清液；

e)通过盐析和/或超滤进行初步纯化步骤，所述盐析为用0-60％中性硫酸铵分级粗提蛋白，超滤用超滤膜进行过滤，所述超滤膜为截留分子量为10KD的超滤 膜；

f)通过阴离子交换、疏水层析方法，从而获得纯度达到95-99.9％的重组人参超氧化物歧化酶的步骤。

在本发明的另一个实施方式中，提供使用上述方法制备的人参SOD在制备 治疗与人超氧化物歧化酶相关疾病或病理症状的药物、食品、保健品及其化妆 品中的用途。所述重组人参超氧化物歧化酶含有任一如下氨基酸序列：

a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；和/或

b)SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；或

c)SEQ ID NO.6所示氨基酸序列。

上述相关疾病或病理症状包括但不限于：白内障、退化性眼底病变，新生 儿视网膜病变、异位性皮肤炎、色素沉着黑斑、老人斑、皮肤过敏、高血压、 动脉硬化、心肌梗塞、心肌无力、心律不整、鼻子过敏、气喘、肺气肿、肺纤 维化、成人呼吸窘迫症、老年痴呆、帕金森氏症、脑循环障碍、镰刀型贫血、 蚕豆症、铅中毒、肾脏病、蛋白尿、膀胱炎、摄护腺肥大、肾丝球发炎、便秘、 口臭、糖尿病及共并发症、风湿性关节炎、癌症、化疗副作用手术、器官移植、 肝炎、更年期、衰老病(aging，老化)等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等，分子克隆实验指南(New York： ColdSpring Harbor LaboratoryPress，1989)；Jan-Christer Janson等，Protein Purification(John Wiley&Sonss，Inc.，1998)中所述的条件，或按照制造厂商所 建议的条件。

实施例

实施例1.rgSOD大肠杆菌表达载体的构建：

分泌肽段基因参考大肠杆菌K12菌株分泌蛋白和SEQ ID NO：2(图2)所示 膜蛋白信号肽设计，并全基因合成的，其序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段 (图1)。其中用于编码本发明信号肽的核苷酸序列与其演绎的本发明信号肽的 氨基酸序列见图7。同时在其5′端引入NdeI酶切位点。如SEQ ID NO：4所示天然 人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列(图4)和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列是已 知的(图3)，如NCBI的Genbank登陆号分别为AF034630.1和AAB87572，目的 基因的获得是根据天然人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列，用常规基因合成法， 在人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列的5′端引入分泌肽段基因，并在人参超氧化物歧化酶的氨基酸序列的3′端引入XhoI酶切位点，该基因SEQ ID NO：5(图5) 编码分泌肽-人参超氧化物歧化酶氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示(图6)。用 于编码本发明融和表达的重组人参SOD的核苷酸序列及其演绎的本发明融和表 达的重组人参SOD的氨基酸序列对应关系见图8。

表达质粒pET-rgSOD的构建及高表达工程细胞的获得构建过程如图9所 示。合成的分泌肽-超氧化物歧化酶全基因用NdeI+XhoI内切酶(来源于NEB Biolab)酶切，同时将载体pET22b用相同的NdeI+XhoI进行酶切，然后用NEB TAKARADNA连接酶(solution 1,TAKARA，中国大连)连接入pET22b载体中， 得到pET-rgSOD，测序证实DNA序列正确无误。然后，将pET-rgSOD质粒， 转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃条件下，用IPTG诱导4小时后确定 表达人参超氧化物歧化酶(图10)。

实施例2温度对rgSOD表达水平的影响

取单克隆，接种到LB一级种子液中，培养17-20hr；取3只50mL培养管， 按1∶50的比例分别接种于三只5mL培养基的50mL培养管中，培养4hr左右， 1mM/LIPTG诱导，诱导温度分别为16℃、25℃、37℃，收集菌体，用溶菌酶 在37℃条件下，处理2小时，15000rpm离心10分钟，取上清，SDS-PAGE检 测表达情况。实验结果表明，在摇瓶中表达rgSOD在16℃、25℃都几乎差不 多，然而37℃表达分泌蛋白相对较少(图11)。

实施例3IPTG浓度对rgSOD表达水平的影响

取单克隆，接种到LB一级种子液中，培养17-20hr；按1∶50的比例分别 接种于5只装有5mL培养基的50mL培养管中，37℃培养4hr左右，冷却到20℃， 分别加入IPTG，使培养基中浓度为0.6mM、0.4mM、0.2mM、0.1mM诱导， 收集菌体，用溶菌酶在37℃条件下，处理2小时，15000rpm离心10分钟，取 上清，SDS-PAGE检测表达情况。实验结果表明，几个梯度浓度IPTG诱导rgSOD 表达量差不多，用0.1mM的IPTG浓度诱导比较经济，节约成本(图12)。

实施例4.中试发酵条件选择及优化NBS BioFlo 3000发酵罐(6.5L)经过上述 优化后，rgSOD表达量约为300mg/L发酵液，表达量明显增加(图13)。

实施例5.rgSOD纯化实施例4的发酵物4℃下5000rpm离心10分钟，收集 菌体，用溶菌酶溶解菌体，溶解酶使用量为1mg/g菌体，37℃温浴2小时。离 15000rpm离心去除菌体，收集澄清液。使用Millipore超滤器，超滤膜截流分 子量为10KD，超滤时留取回流液。上清超滤至体积剩下500ml左右，加入以 10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水 平和10mM PB(pH7.4)缓冲液的电导水平接近。

阴离子交换层析：层析介质：Q Sepharose F.F.(Phamarcia)缓冲液：溶液A： 10mMPBS(pH7.4)，溶液B：10mM PB+1M NaCl(pH7.4)上样：将超滤浓缩的 rgSOD溶液(1L左右，电导为4000us/cm左右)上样清洗：上样后用6CV(柱体 积，下同)的溶液A清洗层析柱梯度：清洗后直接用30％溶液B洗脱目标蛋白 收集：收集30％B洗脱下的蛋白层析。

疏水层析：phenyl-sepharose(Phamarcia)缓冲液：溶液A：10mM PBS(pH 7.4)，溶液C：10mM PB+3M NaCl(pH7.4)上样：将层析1得到的样品加入固体 NaCl至3.0M，上样梯度：100％A直接清洗收集：收集100％A洗下的目的蛋 白样品经过此2步层析，即阴离子交换层析、疏水层析以后，纯度提高至95％ (图14)、得率在50％以上的rgSOD纯品，纯品得率200mg/L培养物。

SOD的活力测定方法

改良的邻苯三酚自氧化法简单易行，较为实用。化学发光法和光化学扩增 法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于 Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需 要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理 相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性 强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是 目前较好的测定方法之一。通常情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测 定法。根据SOD国家标准，本公司采用改良Marklund法，即邻苯三酚自氧化 方法。

1定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧话速率50％时所需要的SOD量为一个活 力单位。

2原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据SOD抑制邻苯三 酚自氧化能力测定SOD活力。

3试剂：A液：pH8.200.1mol/L三枪甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(内 含1mmol/L EDTA.2Na)。称取1.214g Tris和37.2mg EDTA.2Na溶于62.4mL 0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml。B液：4.5mmol/L邻苯三酚盐酸 溶液。称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶于，并定容至 100mL。

4仪器：紫外-可见分光光度计，机密酸度计，精确度0.01pH，离心机，10mL 比色皿，10mL离心管，玻璃乳钵。

5样品的制备：

6分析步骤：邻苯三酚自氧化速率测定，在25℃左右，于10mL比色皿中 一次加入A液2.35mL，蒸馏水2mL，B液0.15mL。加入B液立即混合并倾入 比色皿，分别测定在325波长条件下初始和1min后吸光值，二者之差即邻苯 三酚自氧化速率△A₃₂₅(min^-1).本试验确定△A₃₂₅(min^-1)为0.060。SOD活 性测定加样程序表如下：

试液	空白	样液	SOD液
				A液/ml	2.35	2.35	2.35
蒸馏水/ml	2	1.8	1.8
				样液或SOD液/ul	0	20	20
B液/ml	0.15	0.15	0.15

7结果计算：液体样品计算如下:

式中：

U/mL：SOD酶活力单位

△A325：邻苯三酚自氧化速率

△A’325：样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率

V：所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL)

D：酶液或样液的稀释倍数

4.5：反应液总体积，单位为毫升(mL)

计算结果保留3位有效数字。

固体样品计算公式如下：

式中：

U/g：SOD酶活力单位

△A325：邻苯三酚自氧化速率

△A’325：样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率

V：所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL)

V1：样液总体积，单位为毫升(mL)

D：酶液或样液的稀释倍数

m：样品质量，单位为克(g)

4.5：反应液总体积，单位为毫升(mL)

计算结果保留三位有效数字。

提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附 权利要求书所限定的范围。

本发明不局限在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面 的单一说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况 下进行各种修改和改动。根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范 围内的功能上等同的用途对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的 改动和修改意欲落在所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及与 这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限制。应当理解，本公开不局限于 特定的方法、试剂、组合物和生物***，当然，所述方法、试剂、组合物和生 物***可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式， 不用来是限制性的。

本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用 而全文并入本文，包括所有的附图和表格，使得它们不与本说明书的明确教导 相矛盾。在权利要求范围内提出其他的实施方式。

Claims (9)

1.一种重组人参超氧化物歧化酶,其特征在于，所述人参超氧化物歧化酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子的核苷酸序列如编码SEQ IDNO:6的氨基酸序列的SEQ ID NO.5所示。

3.一种重组人参超氧化物歧化酶，其特征在于，所述人参超氧化物歧化酶通过表达编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列获得。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET22b。

6.一种工程细胞，其特征在于，所述工程细胞是通过转化权利要求4所述的表达载体进入宿主细胞后获得的细菌细胞。

7.如权利要求6所述的工程细胞，其特征在于，所述工程细胞为大肠杆菌BL21(ED3)细胞。

8.一种制备重组人参超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括:

a)将SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列克隆入表达载体pET22b的步骤；

b)将所述表达载体pET22b转入到宿主细胞大肠杆菌BL21(ED3)细胞的步骤；

c)将宿主细胞大肠杆菌BL21(ED3)细胞进行培养步骤，培养条件包括：培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600，诱导时间为18-21hr，发酵及诱导温度保持在16-25℃，诱导期IPTG浓度在0.1-0.2mM/L；

d)分离纯化出融合表达的重组人参超氧化物歧化酶的步骤，对发酵样品通过离心和/或过滤方式收集菌体，用溶菌酶1mg/g菌体，在37℃条件下，处理2小时，再通过离心获得清液；

e)通过盐析和/或超滤进行初步纯化步骤，所述盐析为用0-60％中性硫酸铵分级粗提蛋白，超滤用超滤膜进行过滤，所述超滤膜为截留分子量为10KD的超滤膜；

f)通过阴离子交换、疏水层析方法，从而获得纯度达到95-99.9％的重组人参超氧化物歧化酶的步骤。

9.如权利要求8所述的方法制备的重组人参超氧化物歧化酶在制备治疗与人超氧化物歧化酶相关疾病的药物、食品、保健品及其化妆品中的用途。