CN112048447B

CN112048447B - 一种重组胶红酵母及在生产水溶性中性多糖中的应用

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Publication number: CN112048447B
Application number: CN202010985310.9A
Authority: CN
Inventors: ***
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2020-09-18
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2040-09-18
Also published as: CN112048447A

Abstract

本发明公开了一种重组胶红酵母及在生产水溶性中性多糖中的应用。一种重组胶红酵母，由出发菌株胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)NRRL Y‑1594中过表达外源基因α‑1‑2岩藻糖基转移酶基因所得。本发明重组胶红酵母在胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)中过表达外源基因α‑1‑2岩藻糖基转移酶基因所得，发酵后水溶性中性多糖中含有四种单糖组分：葡萄糖、半乳糖、甘露糖和岩藻糖，发酵后水溶性中性多糖产量与出发菌株的产量没有差异，但水溶性中性多糖中的岩藻糖含量比例明显提高，这种多糖分子较之出发菌株的多糖对巨噬细胞RAW具有更高的免疫调节活性，且没有细胞毒性，因此具有更好的药用前景。

Description

一种重组胶红酵母及在生产水溶性中性多糖中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种重组胶红酵母及在生产水溶性中性多糖中的应用。

背景技术

胶红酵母是一种具有重要工业，农业应用潜力的酵母，能产生类胡罗卜素，油脂，还能作为生防菌株和饲料酵母应用。

公开号为CN111363768A的发明申请公开了一种胶红酵母CICC胞外多糖的制备方法及其在抗肝癌中的应用，高压蒸汽灭菌固体培养基，冷却后倒平板，接种菌株，活化，分离纯化，再次培养菌种，得胶红酵母菌种的纯培养菌落；接种于液体培养基扩大培养，分离上清液与胶红酵母细胞，提取胞外多糖；离心分离胶红酵母细胞与培养液，取上清液，依次在不同浓度的乙醇溶液中分别进行醇沉，离心，得胶红酵母胞外多糖粗品；干燥，充分溶解于蒸馏水中，冷冻干燥，分离、纯化，制得胶红酵母R.mucilaginosa CICC 33013胞外多糖。其用于抗肝癌中。

文献(康雨芳等，胶红酵母胞外多糖的抗疲劳作用，食品工业科技，2018，39(9)，301-305页)将小鼠随机分成正常对照组(生理盐水)、胶红酵母多糖高(100mg/kg·bw)、中(50mg/kg·bw)和低(25mg/kg·bw)剂量组，连续灌胃10d后，通过小鼠负重游泳实验，记录小鼠力竭游泳时间，并测定小鼠运动后血清中尿素氮(BUN)、血乳酸(BLA)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平以及肝脏中的丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平，考察胶红酵母胞外多糖的抗疲劳作用。结果表明，胶红酵母胞外多糖可以极显著延长小鼠负重游泳时间(p＜0.01)，负重游泳后与正常组相比，血清中BUN的含量显著降低(高剂量组p＜0.01，中、低剂量组p＜0.05)，BLA的含量也显著降低(高剂量组p＜0.01，中剂量组p＜0.05)，血清中LDH的活性明显提高(高剂量组p＜0.05)，肝脏中MDA的含量显著下降(高、中、低剂量组p＜0.05)，SOD活力显著提高(高剂量组p＜0.01，中剂量组p＜0.05)，CAT活性极显著提高(高、中、低剂量组p＜0.01)，GPH-Px活力显著提高(高剂量组p＜0.01，中、低剂量组p＜0.05)。说明胶红酵母胞外多糖具有抗疲劳的作用。

文献(康雨芳等，胶红酵母胞外多糖镇痛及抗氧化作用的研究，食品科技，2018，43(2)，212-217页)研究胶红酵母粗多糖的镇痛活性和不同给药方式对镇痛作用的影响，以及多糖纯化后各组分的体外抗氧化活性。方法:采用温浴甩尾实验分别测定小鼠给药前、皮下注射和腹腔注射粗多糖后60min内的痛阈值，考察胶红酵母胞外粗多糖的镇痛作用，利用DEAE-52离子柱层析对粗多糖进行纯化，得到EPS-1，EPS-2，EPS-3，EPS-4，EPS-5 5种多糖，研究纯化后各组分对羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力。结果:在小鼠温浴甩尾实验中，胶红酵母多糖能够显著延长小鼠的痛阈值，皮下注射30min后和腹腔注射20min后药效达到最大，中剂量组(25mg/kg)效果最佳，痛阈提高率分别达99.9％和124.9％，具有显著的镇痛活性。与Vc相比，EPS-4和EPS-5对·OH自由基具有很强的清除能力，且效果高于Vc，各组分对O2-·自由基均有一定的清除能力。

然而，不同菌种来源的胶红酵母胞外多糖种类和含量各有不同，生物活性也不相同。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种重组胶红酵母及在生产水溶性中性多糖中的应用。

一种重组胶红酵母，其特征在于，由出发菌株胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)NRRL Y-1594中过表达外源基因α-1-2岩藻糖基转移酶基因所得。胶红酵母的株号为NRRL Y-1594，此种酵母来自于美国农业部NRRL菌种保藏中心。

优选的，α-1-2岩藻糖基转移酶基因的序列如SEQ ID No.12所示。该基因由幽门螺杆菌来源的α-1-2岩藻糖基转移酶基因经过了酵母偏好性密码子优化而来。

构建时，将包含α-1-2岩藻糖基转移酶基因的表达盒与包含潮霉素抗性基因的表达盒相连后，导入到出发菌株内，利用抗性筛选获得阳性表达的重组胶红酵母。

本发明又提供了所述重组胶红酵母在生产水溶性中性多糖中的应用。

一种生产水溶性中性多糖的方法，包括以下步骤：发酵培养所述重组胶红酵母获得发酵液，从发酵液中分离纯化获得水溶性中性多糖。

优选的，分离纯化时，先将发酵液100℃煮沸10min，然后10000g、4℃离心10min，离心收集上清液，向上清液中加入2倍体积冰乙醇，混匀后4℃中保温使水溶性中性多糖析出，12000rpm高速离心10min，弃上清，收集沉淀即为所述水溶性中性多糖。

本发明还提供了所述方法制备的水溶性中性多糖。

本发明还提供了所述水溶性中性多糖在制备免疫调节RAW巨噬细胞生长的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于免疫调节RAW巨噬细胞生长的药物，活性成分为所述水溶性中性多糖。

本发明重组胶红酵母在胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)中过表达外源基因α-1-2岩藻糖基转移酶基因所得，发酵后水溶性中性多糖中含有四种单糖组分：葡萄糖、半乳糖、甘露糖和岩藻糖，发酵后水溶性中性多糖产量与出发菌株的产量没有差异，但水溶性中性多糖中的岩藻糖含量比例明显提高，这种多糖分子较之出发菌株的多糖对巨噬细胞RAW具有更高的免疫调节活性，且没有细胞毒性，因此具有更好的药用前景。

附图说明

图1为胶红酵母基因重组表达载体pRMFT18示意图。

图2为线性化重组表达载体电泳图。

图3为阳性克隆菌落PCR鉴定电泳图。

图4为重组表达菌株(recombinant strain)和原始菌株(initial strain)的胞外多糖产量比较结果图。

图5为MTT法测定多糖对细胞活性的影响结果图。

图6为ELISA法测定多糖对细胞因子表达水平的影响结果图，其中，图a代表多糖对IL1β细胞因子表达水平的影响；图b代表多糖对IL6细胞因子表达水平的影响；图c代表多糖对IL18细胞因子表达水平的影响；图d代表多糖对TNFα细胞因子表达水平的影响。

图7为Q-PCR法测定多糖对细胞因子转录水平的影响结果图，图a代表多糖对IL1β细胞因子转录水平的影响；图b代表多糖对IL6细胞因子转录水平的影响；图c代表多糖对IL18细胞因子转录水平的影响；图d代表多糖对TNFα细胞因子转录水平的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明提供一种胶红酵母水溶性胞外多糖，由葡萄糖，半乳糖，甘露糖和岩藻糖四种多糖组成。

本发明提供一种重组胶红酵母工程菌株，通过将岩藻糖基转移酶基因表达盒片段，整合同源臂基因片段与抗性质粒骨架连接，构建糖基转移酶重组表达质粒，然后将所述重组表达质粒线性化后，通过电穿孔，转化胶红酵母株NRRLY-1594感受态细胞，获得酵母重组工程菌株。

本发明提供一种胶红酵母胞外多糖的生产方法，将原始菌株和重组菌株分别接种到产多糖培养基的摇瓶中，通过96小时的发酵，分离上清液中加入3倍体积乙醇，获得多糖产物。

上述方案中，胶红酵母菌株NRRL-1594产一种新型水溶性中性胞外多糖，由葡萄糖，半乳糖，甘露糖和岩藻糖四种单糖组成。通过分子克隆和基因工程技术，在胶红酵母NRRL-1594中导入岩藻糖基转移酶的基因，构建胶红酵母重组工程菌；重组胶红酵母菌株用于多糖的摇瓶发酵生产，多糖产量与出发菌株持平，多糖中的岩藻糖含量有明显提高。出发菌株和重组菌株胞外多糖都具有免疫调节活性，重组菌株多糖的活性明显更强，应该与含有更多的岩藻糖有关。由于胶红酵母可以合成不饱和脂肪酸，高蛋白，胡萝卜素，胞外多糖等，是具有多种用途的饲料和生防菌株。因此本发明的上述技术方案提供了一种很大应用潜力的胶红酵母新菌株，还为此类酵母的菌种改造提供了新思路。

一个优选方案中，所述岩藻糖基转移酶编码基因来源于幽门螺杆菌ATCC 43504。

一个优选方案中，所述密码子优化过的岩藻糖基转移酶表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一个优选方案中，所述岩藻糖基转移酶表达盒中酶编码基因的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

一个优选方案中，所述岩藻糖基转移酶表达盒中酶编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

一个优选方案中，所述重组表达重组表达质粒为pRMKO19-PKS，图谱见图4。

本发明还提供所述的胶红酵母及其重组菌株摇瓶发酵生产多糖的方法，包括以下步骤：

步骤1：上述胶红酵母表达株接种种子液YPD培养基，摇床过夜摇菌制备种子液，；

步骤2：250ml发酵三角瓶中添加去离子水100ml，添加酵母粉2g，葡萄糖5g和氯化钠1g，搅拌均匀后，121℃高压灭菌。种子液按照比例接种到发酵瓶中，30度180rpm，发酵96小时。

步骤3多糖产量测定，采用乙醇沉淀法。1倍体积发酵液上清，加入3倍体积乙醇，4度静置12小时，离心收集多糖沉淀，干燥后

一个优选方案中，接种量为：胶红酵母表达株种子液按体积比3-5％接种于所述多糖发酵体系；发酵条件为：28-30℃条件下，发酵96小时。

在上述方案中，胶红酵母表达株接种发酵培养基前，先接种于种子培养基，并在28℃、180rpm下培养20-24h(优选培养24h)，得到种子液；将种子液按体积比3-5％(优选5％)接种于发酵培养基中，于30℃、180rpm摇床转速条件下，培养96小时。

种子培养基包含以下质量浓度的组分：酵母粉20g/L，葡萄糖50g/L。

多糖发酵培养基包含以下质量浓度组分：酵母粉10g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，葡萄糖50g/L，pH 6.5。

在上述方案中，通过上述公开发酵方式，可使得发酵结束时，发酵体系中水溶性多糖含量达到15.2g/L。

为更清楚的说明本发明的技术方案，将以具体的实施例进一步说明。

实施例1

构建糖基转移酶重组表达质粒pRMFT18。

(1)设计构建重组表达载体pRMFT18，相关具体引物序列如下：

上游同源臂引物UpF：5’-gtagtcatatgcttgtctcaaagattaagc-3’，

上游同源臂引物UpR：5’-acggcaacaattttaatatacgctat-3’；

下游同源臂引物DownF：5’-ggccgttcttagttggtggagtgattt-3’，

下游同源臂引物DownR：5’-Tccgcaggttcacctacggaaaccttgtt-3’；

糖基转移酶表达盒引物TF1：5’-agcttgcctcgtccccgccgggtcacccggccag-3’，

糖基转移酶表达盒引物TR1：5’-tcgacactggatggcggcgttagtatcgaatcg-3’；

潮霉素抗性表达盒引物HF1：5’-agcttgcctcgtccccgccgggtcacccggcca-3’，

潮霉素抗性表达盒引物HR1：5’-tcgacactggatggcggcgttagtatcgaatc-3’。

(2)以来自于美国NRRL菌种保藏中心的胶红酵母NRRL Y-1594基因组DNA为模板，在上游同源臂引物UpF和上游同源臂引物UpR作用下，PCR扩增上游整合同源臂序列(SEQ IDNO.9)。

(3)以胶红酵母NRRL Y-1594基因组DNA为模板，在下游同源臂引物DownF和下游同源臂引物DownR作用下，PCR扩增下游整合同源臂序列(SEQ ID NO.10)。

(4)全基因合成fucT岩藻糖基转移酶基因表达盒序列，包括依次连接的启动子序列(SEQ ID NO.11)、糖基转移酶基因(SEQ ID NO.12)和终止子序列(SEQ ID NO.13)。

使用引物TF1和TR1，PCR扩增糖基转移酶表达盒基因片段，通过引物给其带上同源重组序列区。

(5)以质粒pUG75(Genbank HQ401269.1)为模板，使用潮霉素抗性表达盒引物HF1和HR1，PCR扩增潮霉素抗性表达盒片段序列(SEQ ID NO.14)。

将上述步骤(2)～(5)共四条PCR产物按照上游同源臂、抗性基因表达盒、糖基转移酶表达盒、下游同源臂的顺序，以摩尔比1∶2∶2∶1的比例作为混合模板，利用无缝克隆试剂盒对片段进行融合，最终获得的基因片段序列如SEQ ID NO.15所示。

无缝克隆试剂盒进行DNA片段融合的操作条件为：待融合的DNA片段，按照比例混合，4度保温10min，然后50℃金属浴保温15min，取出2μl混合产物，作为扩增模板。利用上游同源臂的上游引物F和下游同源臂的下游引物R，进行PCR扩增，回收产物片段。

PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火50s，68℃延伸4min，30个循环；25℃保温10min。

(6)将上述融合后的PCR产物片段，通过加尾试剂盒操作，回收产物通过T-A克隆连入pMD18-T载体，获得重组质粒，名称为pRMFT18(图1)。pRMFT18即为带有外源岩藻糖基转移酶的胶红酵母重组表达质粒。

实施例2

胶红酵母NRRLY-1594重组表达株构建。

(1)胶红酵母单菌落接种YPD培养基，28℃，180rpm培养16-24小时，

(2)5ml新鲜培养液离心收集菌体，无菌水洗涤两遍，缓冲液I(1M sorbitol，50mMsodium citrate，pH5.8)悬浮菌体，即为感受态细胞。

(3)pRMFT18载体用BamHI酶切后，琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图2，可以看到4.5kb和2.5kb两个片段，切胶回收4.5kb片段，即为线性化载体片段。

(4)100μl胶红酵母感受态细胞中加入5μg线性化载体片段，置于电转杯中，转化参数设置为电阻200Ω，电压1750V，电场强度25μF。

(5)电击后，细胞加入1ml YPD培养基，在28℃摇床，100rpm复苏1小时，然后收集所有菌体，涂布含有100μg/ml的潮霉素的YPD培养基。

(6)28℃培养三天后，菌落PCR鉴定阳性克隆，琼脂糖凝胶电泳图见图3，其中特异性鉴定引物扩增出来4.5kb片段的均为双交换阳性克隆，能扩增出来0.5kb片段或者扩增不出来的均为阴性克隆或者单交换。

菌落PCR扩增条件如表1所示。

表1菌落PCR扩增条件

试剂	用量
		2×Taqmix	25μl
无菌水	22μl
		上游引物(10μmol/l)	1μl
下游引物(10μmol/l)	1μl
		基因合成的载体模板	2μl

PCR的反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，循环数30；72℃延伸10min。鉴定用特异性引物序列如下：

JD-F：AGGGCAAAAACACACTCCGTTCG，

JD-R：GTTGCTCCTGGGATGTGGACAT。

图3中的结果证明，整合表达外源岩藻糖基转移酶的重组胶红酵母菌株构建成功。

实施例3

胶红酵母出发菌株/重组表达菌株产多糖能力测定和多糖组成分析。

(1)产多糖能力测定

胶红酵母重组表达株(实施例2制备)与出发菌株，将上述两种菌接种于产多糖培养基，180rpm，30℃摇瓶发酵120小时。发酵结束后，发酵液100℃煮沸10min，然后10000g，4℃离心10min，离心收集上清，加入2倍体积冰乙醇，混匀后4℃过夜，12000rpm高速离心10min，弃上清，收集沉淀即为胞外多糖，80℃烘干后测定重量。

图4结果显示，原始菌株和重组表达菌株的水溶性中性多糖产量分别为14.4g/L，14.5g/L，表明糖基转移酶的重组表达没有明显影响到胶红酵母的合成胞外中性多糖的总产量。

(2)多糖产物的单糖组成分析

取2mg多糖，1ml的2M三氟乙酸在120度条件下水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2ml双蒸水，100mg硼氢化钠还原，加入冰醋酸中和，旋蒸，110度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却，然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复5次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品；

GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30*0.25*0.25；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。

其中标准品顺序为：鼠李糖，岩藻糖，***糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖。

表2原始菌株胞外多糖单糖组成

表3重组菌株胞外多糖单糖组成

保留时间(min)	单糖组成	重组菌株多糖(相对含量比例)
			20.701	鼠李糖	0.000
20.940	岩藻糖	0.152
			21.51	***糖	0.000
22.034	木糖	0.000
			31.62	甘露糖	0.280
31.743	葡萄糖	0.173
			32.552	半乳糖	0.395

通过表2和表3的结果我们可以得知，重组菌株胞外多糖中的岩藻糖相对含量比例为0.152，较之出发菌株胞外多糖中的岩藻糖相对含量比例为0.065明显提升。说明重组菌株中导入的重组岩藻糖基转移酶，能够明显提高多糖产物的岩藻糖相对含量比例。

实施例4

胶红酵母出发菌株和重组表达株胞外多糖免疫调节活性的测定。

(1)MTT法测定多糖对细胞活力影响

用MTT法测定多糖YL-1对RAW264.7细胞活力的影响。将对数生长期的细胞以2×10⁴细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃培养24小时。将多糖样品YL-1溶解在完全培养基中，并形成不同的梯度(0、5、12.5、25、50、100、200μg/mL)处理RAW264.7细胞，并培养24小时。除去培养基后，加入100μL 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5二苯基四唑溴化物(MTT，0.5mg/mL)，并将板在37℃下孵育细胞培养箱中放置4小时。丢弃液体后，将150μl DMSO添加到每个孔中。避光震荡10分钟将晶体完全溶解。使用酶标仪记录每个孔在490nm的吸光度(A)。使用以下公式计算细胞活力：细胞活力＝样品/对照。

图5中的结果表明重组菌株胞外多糖和出发菌株胞外多糖都没有表现出对RAW264.7的细胞毒性。出发菌株的胞外多糖在5μg/ml的工作浓度下，对细胞生长还有一定的促进作用，在12.5和25μg/ml的工作浓度下，促进作用下降。重组菌株胞外多糖在5，12.5和25μg/ml的工作浓度下对细胞生长没有明显影响。

(2)ELISA法测定多糖对细胞因子表达量的影响

将对数生长期的细胞以2×10⁴细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃培养24小时。将多糖样品YL-1溶解在完全培养基中，并形成不同的梯度(0、5、12.5、25μg/mL)处理RAW264.7细胞，并培养24小时，同时加入1μg/mL的脂多糖作为阳性对照。培养基上清中的细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-18使用酶联免疫试剂盒Enzyme-Linked Immuno SorbentAssay(ELISA)来测定。Elisa试剂盒(Thermol BMS 607HS and BMS 603-2)用来测定TNF-αand IL-6.Elisa试剂盒(Beyotime PI301 and PI553)分别用来测定IL-1βand IL-18。

图6中的结果说明，在提高IL-1β细胞因子表达量的方面，重组菌株多糖和出发菌株多糖的活性都高于LPS；在提高IL-6和TNF-α细胞因子表达量方面，重组菌株多糖活性接近于LPS，高于出发菌株多糖；在提高IL-18细胞因子表达量方面，重组菌株多糖和出发菌株多糖的活性都低于LPS，重组菌株多糖高于出发菌株多糖。总之，重组菌株多糖在提高四种细胞因子表达量方面比出发菌株具有更好的活性。

(3)Q-PCR法测定多糖对细胞因子转录水平的影响

将对数生长期的细胞以2×10⁴细胞/孔的密度接种在96孔板中，在37℃培养24小时。将多糖样品YL-1溶解在完全培养基中，并形成不同的梯度(0、5、12.5、25μg/mL)处理RAW264.7细胞，并培养24小时，同时加入1μg/mL的脂多糖作为阳性对照。培养基离心后，收集细胞，细胞总RNA提取试剂盒，提取样品细胞中的RNA，然后利用Q-PCR的方法测定细胞中的细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-18的转录水平。使用的引物名称和序列见表4。

图7中的结果说明，在提高四种细胞因子转录水平的方面，重组菌株多糖和出发菌株多糖的活性都低于LPS；在提高IL-1β，IL-6和TNF-α细胞因子表达量方面，重组菌株多糖活性略低于LPS，但是明显高于出发菌株多糖；在提高IL-18细胞因子表达量方面，重组组菌株多糖和出发菌株多糖的活性都明显低于LPS，多糖组转录水平约为LPS组的一半，但重组菌株多糖组转录水平明显高于出发菌株多糖组。总之，重组菌株多糖在提高四种细胞因子转录水平方面比出发菌株具有更好的活性。

表4 Q-PCR引物序列

最后说明的是上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种重组胶红酵母及在生产水溶性中性多糖中的应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acggcaacaa ttttaatata cgctat 26

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccgttctt agttggtgga gtgattt 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtt 29

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg ccag 34

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgacactgg atggcggcgt tagtatcgaa tcg 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg cca 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgacactgg atggcggcgt tagtatcgaa tc 32

<210> 9

<211> 600

<212> DNA

<213> 胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)

<400> 9

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtttaag caataaacag 60

tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtc atagtttatt tgatggtacc ttactacatg 120

gataactgtg gtaattctag agctaataca tgctgaaaaa tcccgacttc tggaagggat 180

gtatttatta gatccaaaac caatggcctt cgggtcccta tggtgaatca tgataactgc 240

tcgaatcgca tggccttgcg ccggcgatgc ttcattcaaa tatctgccct atcaactttc 300

gatggtagga tagaggccta ccatggtgat gacgggtaac ggggaataag ggttcgattc 360

cggagagagg gcctgagaaa cggccctcag gtctaaggac acgcagcagg cgcgcaaatt 420

atcccctggc aacactttgc cgagatagtg acaataaata acaatgcagg gctcttacgg 480

gtcttgcaat tggaatgagt acaatttaaa tcccttaacg aggatcaatt ggagggcaag 540

tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaaa ttgttgccgt 600

<210> 10

<211> 516

<212> DNA

<213> 胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)

<400> 10

ggccgttctt agttggtgga gtgatttgtc tggttaattc cgataacgaa cgagacctta 60

acctgctaaa tagaccagcc ggctttggct agctgctgtc ttcttagagg gactatcagc 120

gtttagctga tggaagtttg aggcaataac aggtctgtga tgcccttaga tgttctgggc 180

cgcacgcgcg ctacactgac agagccagcg agtctaccac ctttgccgga aggcatgggt 240

aatcttgtga aactctgtcg tgatggggat agaacattgc aattattgtt cttcaacgag 300

gaatacctag taagcgtgat tcatcagatc gcgttgatta cgtccctgcc ctttgtacac 360

accgcccgtc gctactaccg attgaatggc ttagtgaggc ctccggattg gctattggga 420

gctcgcgaga gcacccgact gccgagaagt tgtacgaact tggtcattta gaggaagtaa 480

aagtcgtaac aaggtttccg taggtgaacc tgcgga 516

<210> 11

<211> 379

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg ccagcgacat ggaggcccag aataccctcc 60

ttgacagtct tgacgtgcgc agctcagggg catgatgtga ctgtcgcccg tacatttagc 120

ccatacatcc ccatgtataa tcatttgcat ccatacattt tgatggccgc acggcgcgaa 180

gcaaaaatta cggctcctcg ctgcagacct gcgagcaggg aaacgctccc ctcacagacg 240

cgttgaattg tccccacgcc gcgcccctgt agagaaatat aaaaggttag gatttgccac 300

tgaggttctt ctttcatata cttcctttta aaatcttgct aggatacagt tctcacatca 360

catccgaaca taaacaacc 379

<210> 12

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcctttat attatgatag gctacaccat aaagccgaga gcgtgaatga caccaccgca 60

ccctacaaga ttaaaggcaa cagcctttat actttaaaaa aaccctccca ttgttttaaa 120

gaaaaccacc ctaatttgtg cgcgctcatc aataatgaga gcgatccttt gaaaagaggg 180

tttgccagtt ttgtagcgag caacgctaac gctcctatga ggaacgcttt ctatgacgct 240

ttaaattcta ttgagccagt tactggggga ggagccgtga aaaacacttt aggctataag 300

gttggaaaca aaagcgagtt tttaagccaa tacaaattca acctgtgttt tgaaaactca 360

caaggctatg gctatgtaac cgaaaaaatc attgacgctt actttagcca tactattccc 420

atttattggg ggagtcccag cgtggcgaaa gattttaacc ctaagagttt tgtgaatgtc 480

catgatttca acaactttga tgaagcgatt gattacgtga gatacttgca cacgcaccca 540

aacgcttatt tagacatgct ctatgaaaac cctttaaaca cccttgatgg gaaagcttac 600

ttttaccaaa atttgagttt taaaaaaatc ctagattttt ttaaaacgat tttagaaaac 660

gacacgattt atcataataa ccctttcatt ttctatcgtg atttgaatga gccgttagta 720

tccattgata atttgagaat caattatgat aatttgaggg ttaattatga tgatttgagg 780

gttaattatg atgatttgag ggttaattat gatgatttga gaatcaatta tgatgatttg 840

agaatcaatt atgatgattt gagaattaat tatgagcgcc ttttgcaaaa cgcttcacct 900

ttattggaat tgtcccaaaa cacctctttt aaaatctatc gcaaaattta tcaaaaatcc 960

ttacccttat tgcgtgtaat aaggaggtgg gttaaaaaat aa 1002

<210> 13

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt 60

atattgtagt tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat ttatattttt tttcgcctcg 120

acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta 180

tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga 240

<210> 14

<211> 1648

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg ccagcgacat ggaggcccag aataccctcc 60

ttgacagtct tgacgtgcgc agctcagggg catgatgtga ctgtcgcccg tacatttagc 120

ccatacatcc ccatgtataa tcatttgcat ccatacattt tgatggccgc acggcgcgaa 180

gcaaaaatta cggctcctcg ctgcagacct gcgagcaggg aaacgctccc ctcacagacg 240

cgttgaattg tccccacgcc gcgcccctgt agagaaatat aaaaggttag gatttgccac 300

tgaggttctt ctttcatata cttcctttta aaatcttgct aggatacagt tctcacatca 360

catccgaaca taaacaacca tgggtaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa 420

gtttctgatc gaaaagttcg acagcgtctc cgacctgatg cagctctcgg agggcgaaga 480

atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg taaatagctg 540

cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc 600

gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt gcatctcccg 660

ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg ctgttctgca 720

gccggtcgcg gaggcaatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt 780

cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc 840

gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc 900

cgtcgcgcag gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca 960

cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc gcataacagc 1020

ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt 1080

cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca 1140

tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca 1200

actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg 1260

cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag 1320

cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc 1380

cagcactcgt ccgagggcaa aggaataatc agtactgaca ataaaaagat tcttgttttc 1440

aagaacttgt catttgtata gtttttttat attgtagttg ttctatttta atcaaatgtt 1500

agcgtgattt atattttttt tcgcctcgac atcatctgcc cagatgcgaa gttaagtgcg 1560

cagaaagtaa tatcatgcgt caatcgtatg tgaatgctgg tcgctatact gctgtcgatt 1620

cgatactaac gccgccatcc agtgtcga 1648

<210> 15

<211> 4410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtttaag caataaacag 60

tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtc atagtttatt tgatggtacc ttactacatg 120

gataactgtg gtaattctag agctaataca tgctgaaaaa tcccgacttc tggaagggat 180

gtatttatta gatccaaaac caatggcctt cgggtcccta tggtgaatca tgataactgc 240

tcgaatcgca tggccttgcg ccggcgatgc ttcattcaaa tatctgccct atcaactttc 300

gatggtagga tagaggccta ccatggtgat gacgggtaac ggggaataag ggttcgattc 360

cggagagagg gcctgagaaa cggccctcag gtctaaggac acgcagcagg cgcgcaaatt 420

atcccctggc aacactttgc cgagatagtg acaataaata acaatgcagg gctcttacgg 480

gtcttgcaat tggaatgagt acaatttaaa tcccttaacg aggatcaatt ggagggcaag 540

tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcg tatattaaaa ttgttgccgt 600

agcttgcctc gtccccgccg ggtcacccgg ccagcgacat ggaggcccag aataccctcc 660

ttgacagtct tgacgtgcgc agctcagggg catgatgtga ctgtcgcccg tacatttagc 720

ccatacatcc ccatgtataa tcatttgcat ccatacattt tgatggccgc acggcgcgaa 780

gcaaaaatta cggctcctcg ctgcagacct gcgagcaggg aaacgctccc ctcacagacg 840

cgttgaattg tccccacgcc gcgcccctgt agagaaatat aaaaggttag gatttgccac 900

tgaggttctt ctttcatata cttcctttta aaatcttgct aggatacagt tctcacatca 960

catccgaaca taaacaacca tgcctttata ttatgatagg ctacaccata aagccgagag 1020

cgtgaatgac accaccgcac cctacaagat taaaggcaac agcctttata ctttaaaaaa 1080

accctcccat tgttttaaag aaaaccaccc taatttgtgc gcgctcatca ataatgagag 1140

cgatcctttg aaaagagggt ttgccagttt tgtagcgagc aacgctaacg ctcctatgag 1200

gaacgctttc tatgacgctt taaattctat tgagccagtt actgggggag gagccgtgaa 1260

aaacacttta ggctataagg ttggaaacaa aagcgagttt ttaagccaat acaaattcaa 1320

cctgtgtttt gaaaactcac aaggctatgg ctatgtaacc gaaaaaatca ttgacgctta 1380

ctttagccat actattccca tttattgggg gagtcccagc gtggcgaaag attttaaccc 1440

taagagtttt gtgaatgtcc atgatttcaa caactttgat gaagcgattg attacgtgag 1500

atacttgcac acgcacccaa acgcttattt agacatgctc tatgaaaacc ctttaaacac 1560

ccttgatggg aaagcttact tttaccaaaa tttgagtttt aaaaaaatcc tagatttttt 1620

taaaacgatt ttagaaaacg acacgattta tcataataac cctttcattt tctatcgtga 1680

tttgaatgag ccgttagtat ccattgataa tttgagaatc aattatgata atttgagggt 1740

taattatgat gatttgaggg ttaattatga tgatttgagg gttaattatg atgatttgag 1800

aatcaattat gatgatttga gaatcaatta tgatgatttg agaattaatt atgagcgcct 1860

tttgcaaaac gcttcacctt tattggaatt gtcccaaaac acctctttta aaatctatcg 1920

caaaatttat caaaaatcct tacccttatt gcgtgtaata aggaggtggg ttaaaaaata 1980

atcagtactg acaataaaaa gattcttgtt ttcaagaact tgtcatttgt atagtttttt 2040

tatattgtag ttgttctatt ttaatcaaat gttagcgtga tttatatttt ttttcgcctc 2100

gacatcatct gcccagatgc gaagttaagt gcgcagaaag taatatcatg cgtcaatcgt 2160

atgtgaatgc tggtcgctat actgctgtcg attcgatact aacgccgcca tccagtgtcg 2220

acatcaggcg cagcttgcct cgtccccgcc gggtcacccg gccagcgaca tggaggccca 2280

gaataccctc cttgacagtc ttgacgtgcg cagctcaggg gcatgatgtg actgtcgccc 2340

gtacatttag cccatacatc cccatgtata atcatttgca tccatacatt ttgatggccg 2400

cacggcgcga agcaaaaatt acggctcctc gctgcagacc tgcgagcagg gaaacgctcc 2460

cctcacagac gcgttgaatt gtccccacgc cgcgcccctg tagagaaata taaaaggtta 2520

ggatttgcca ctgaggttct tctttcatat acttcctttt aaaatcttgc taggatacag 2580

ttctcacatc acatccgaac ataaacaacc atgggtaaaa agcctgaact caccgcgacg 2640

tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctgat gcagctctcg 2700

gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctgcgg 2760

gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg 2820

gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctgacctat 2880

tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac cgaactgccc 2940

gctgttctgc agccggtcgc ggaggcaatg gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag 3000

acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat 3060

ttcatatgcg cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc 3120

gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga ggactgcccc 3180

gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac ggacaatggc 3240

cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc 3300

gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc 3360

gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt 3420

ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg 3480

cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc 3540

gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga 3600

aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca aaggaataat cagtactgac aataaaaaga 3660

ttcttgtttt caagaacttg tcatttgtat agttttttta tattgtagtt gttctatttt 3720

aatcaaatgt tagcgtgatt tatatttttt ttcgcctcga catcatctgc ccagatgcga 3780

agttaagtgc gcagaaagta atatcatgcg tcaatcgtat gtgaatgctg gtcgctatac 3840

tgctgtcgat tcgatactaa cgccgccatc cagtgtcgac attcgccatt cagggccgtt 3900

cttagttggt ggagtgattt gtctggttaa ttccgataac gaacgagacc ttaacctgct 3960

aaatagacca gccggctttg gctagctgct gtcttcttag agggactatc agcgtttagc 4020

tgatggaagt ttgaggcaat aacaggtctg tgatgccctt agatgttctg ggccgcacgc 4080

gcgctacact gacagagcca gcgagtctac cacctttgcc ggaaggcatg ggtaatcttg 4140

tgaaactctg tcgtgatggg gatagaacat tgcaattatt gttcttcaac gaggaatacc 4200

tagtaagcgt gattcatcag atcgcgttga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc 4260

gtcgctacta ccgattgaat ggcttagtga ggcctccgga ttggctattg ggagctcgcg 4320

agagcacccg actgccgaga agttgtacga acttggtcat ttagaggaag taaaagtcgt 4380

aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggag 4410

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agggcaaaaa cacactccgt tcg 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttgctcctg ggatgtggac at 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtctactga acttcggggt gat 23

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aactgatgag agggaggcca t 21

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agttgacgga ccccaaaag 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agctggatgc tctcatcagg 20

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gctaccaaac tggatataat cagga 25

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccaggtagct atggtactcc agaa 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gccatgtcag aagactcttg cgtc 24

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtacagtgaa gtcggccaaa gttgtc 26

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gattactgct ctggctccta gc 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gactcatcgt actcctgctt gc 22

Claims

1.一种重组胶红酵母，其特征在于，由出发菌株胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)NRRL Y-1594中过表达外源基因α-1-2岩藻糖基转移酶基因所得，所述α-1-2岩藻糖基转移酶基因的序列如SEQ ID No.12所示。

2.如权利要求1所述的重组胶红酵母，其特征在于，将包含α-1-2岩藻糖基转移酶基因的表达盒与包含潮霉素抗性基因的表达盒相连后，导入到出发菌株内，利用抗性筛选获得阳性表达的重组胶红酵母。

3.如权利要求1~2任一所述重组胶红酵母在生产水溶性中性多糖中的应用。

4.一种生产水溶性中性多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵培养权利要求1~2任一所述重组胶红酵母获得发酵液，从发酵液中分离纯化获得水溶性中性多糖。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，分离纯化时，先将发酵液100℃煮沸10min，然后10000g、4℃离心10min，离心收集上清液，向上清液中加入2倍体积冰乙醇，混匀后4℃中保温使水溶性中性多糖析出，12000rpm高速离心10min，弃上清，收集沉淀即为所述水溶性中性多糖。

6.如权利要求5所述方法制备的水溶性中性多糖。

7.如权利要求6所述水溶性中性多糖在制备调节RAW264.7巨噬细胞生长的试剂中的应用。

8.一种用于调节RAW264.7巨噬细胞生长的试剂，其特征在于，活性成分为如权利要求6所述水溶性中性多糖。