CN115873775B - 一种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升放线菌次级代谢能力的方法 - Google Patents
一种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升放线菌次级代谢能力的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升放线菌次级代谢能力的方法,属于合成生物学及分子生物学领域。本发明通过研究转录调控蛋白BldD特定位点发生乙酰化对其功能的影响机制,利用翻译后修饰代谢工程策略进行菌种改造,提升放线菌次级代谢产物合成能力;所述调控蛋白BldD为放线菌属中高度保守的,调控形态分化与次级代谢产物合成的主导调控蛋白;所述特定位点为BldD功能结构域中可以发生乙酰化等翻译后修饰的赖氨酸位点。本发明基于调控蛋白BldD翻译后修饰原理,实现了在原产物合成能力基础上进一步提升其次级代谢产物合成产量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学及分子生物学领域,特别是涉及一种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升放线菌次级代谢能力的方法。
背景技术
BldD作为放线菌中重要的全局性调控因子,控制着放线菌体内诸多与生长,分化以及次级代谢相关的基因。在天蓝色链霉菌中发现BldD蛋白是由bldD基因编码而形成的小DNA结合蛋白,它不仅能阻遏自身表达还可以阻遏发育期重要的σ因子的表达,从而影响链霉菌形态分化和抗生素的产生。它还可以与c-di-GMP形成六聚体,通过c-di-GMP增强其结合能力以及转录调控相关基因的能力。除了控制生长与分化,BldD还控制着次级代谢产物合成基因的表达,如在红色糖多孢菌中,BldD可以激活红霉素合成基因的表达。现已经有多项研究证明BldD在各类放线菌中控制着诸如抗生素等次级代谢产物的合成,通过对其的过表达可以使相应产物的合成水平得到提升,如在林克链霉菌或红色糖多孢菌中,但缺乏通过改造BldD提升相应次级代谢能力的研究。
蛋白酰基化作为一种重要的翻译后修饰,可以通过改变蛋白质结构及带电性等影响蛋白质活性,并在转录调控、中心代谢及细胞定位等过程中发挥作用。通过翻译后修饰改造,对蛋白表达进行调控的手段。但随着合成生物学和分子生物学的发展,对于合成改造的要求也越来越高,新的改造靶点的缺乏成为了困扰许多人的问题。因此,利用酰基化修饰的原理改造BldD等调控蛋白寻找新的改造靶点,对提升目的产物合成效率至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升放线菌次级代谢能力的方法,以解决上述现有技术存在的问题,通过研究转录调控蛋白BldD特定位点发生乙酰化对其功能的影响机制,利用翻译后修饰代谢工程策略进行菌种改造,实现了提升放线菌次级代谢产物合成能力的目的。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升放线菌次级代谢能力的方法,所述方法包括利用翻译后修饰对放线菌体内的调控蛋白BldD的特定位点进行酰基化改造,提升所述放线菌次级代谢产物合成能力。更优选的是,所述调控蛋白BldD为放线菌属中高度保守的,调控形态分化与次级代谢产物合成的主导调控蛋白。所述放线菌为含有转录调控蛋白BldD的菌种。
优选的是,通过酶催化或者非酶催化反应对所述调控蛋白BldD的特定位点进行酰基化改造。
优选的是,所述特定位点包括所述调控蛋白BldD功能结构域中能发生酰基化的赖氨酸位点。
优选的是,所述调控蛋白BldD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示:
MGDYAKALGGKLRAIRQQQGLSLHGVEQKSGGRWKAVVVGSYERGDRAVTV QKLAELADFYGVPVAELLPEGRVPSGAEPATKVVINLERLQQLPAEKVGPLARYAATI QSQRGDYNGKVLSIRTEDLRSLAIIYDMTPGELTEQLIDWGVLPPEARPAREE。
优选的是,所述特定位点包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第11位赖氨酸。
优选的是,所述特定位点的酰基化包括将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第11位赖氨酸的乙酰化。
优选的是,通过将所述调控蛋白BldD中乙酰化的赖氨酸定点突变为精氨酸的编码基因整合到所述放线菌中基因组中,解除翻译后乙酰化修饰对所述调控蛋白BldD转录活性的影响,实现对所述放线菌的改造,提升所述放线菌的次级代谢产物的合成能力。
优选的是,所述编码基因如SEQ ID NO:3所示:
atgggcgactacgccaaggcgctgggcggcaGgctccgcgctatccgccagcagcaaggtctctcgctgcacggcgtcgagcagaagtcaggcgggcggtggaaggccgtggtcgtcgggtcctatgaacgtggcgaccgcgcggtgaccgtgcagaagctggccgagctggccgacttctacggggtcccggtcgcggagctgctcccggagggccgggtgccttccggcgccgagcccgccaccaaagtcgtgatcaacctggagcggctgcaacagctcccggccgagaaggtgggcccgctggcccgctacgcggccaccatccagagccagcgcggcgactacaacggcaaggtgctgtccatccgcaccgaggacctgcgatccctggccatcatctacgacatgacgcccggagagctcaccgagcagctaatcgactggggcgtgcttccgcccgaagcgcgcccggcccgggaggagtga。
SEQ ID NO:3所示序列编码的蛋白(bldDK11R),其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示:
MGDYAKALGGRLRAIRQQQGLSLHGVEQKSGGRWKAVVVGSYERGDRAVTV QKLAELADFYGVPVAELLPEGRVPSGAEPATKVVINLERLQQLPAEKVGPLARYAATI QSQRGDYNGKVLSIRTEDLRSLAIIYDMTPGELTEQLIDWGVLPPEARPAREE。
本发明通过基因工程方法定点突变BldD蛋白的酰基化赖氨酸(如保守赖氨酸位点KLRAIR等)为精氨酸(模拟不能酰基化的赖氨酸位点,酰基化水平为零)或谷氨酰胺(模拟赖氨酸酰基化位点,酰基化水平为100%)。BldD蛋白的酰基化赖氨酸突变为谷氨酰胺(bldDK11Q),其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示:
MGDYAKALGGQLRAIRQQQGLSLHGVEQKSGGRWKAVVVGSYERGDRAVTV QKLAELADFYGVPVAELLPEGRVPSGAEPATKVVINLERLQQLPAEKVGPLARYAATI QSQRGDYNGKVLSIRTEDLRSLAIIYDMTPGELTEQLIDWGVLPPEARPAREE。
bldDK11Q的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示:
atgggcgactacgccaaggcgctgggcggcCagctccgcgctatccgccagcagcaaggtctctcgctgcacggcgtcgagcagaagtcaggcgggcggtggaaggccgtggtcgtcgggtcctatgaacgtggcgaccgcgcggtgaccgtgcagaagctggccgagctggccgacttctacggggtcccggtcgcggagctgctcccggagggccgggtgccttccggcgccgagcccgccaccaaagtcgtgatcaacctggagcggctgcaacagctcccggccgagaaggtgggcccgctggcccgctacgcggccaccatccagagccagcgcggcgactacaacggcaaggtgctgtccatccgcaccgaggacctgcgatccctggccatcatctacgacatgacgcccggagagctcaccgagcagctaatcgactggggcgtgcttccgcccgaagcgcgcccggcccgggaggagtga。
本发明公开了以下技术效果:
本发明经过研究发现BldD存在有多个乙酰化位点,不同赖氨酸位点的乙酰化可以影响BldD的结构与功能。体外及体内的乙酰化模拟发现,赖氨酸乙酰化会削弱BldD形成二聚体以及与目的基因DNA结合的能力,进而抑制BldD对下游次级代谢基因转录的调控,使得放线菌的生产能力受到限制。基于此机制,本发明将BldD的赖氨酸位点改造为带有正电荷但无法被乙酰化的精氨酸,从而削弱了体内环境对BldD的乙酰化限制,提升产物合成基因的转录水平,进一步提高了相应产物的产量。因此,本发明利用酰基化修饰的原理改造BldD调控蛋白,可以在过去的研究基础上提供更多有效的改造靶点,提升产物合成效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为BldD在体内及体外的乙酰化情况;(A)BldD在体内的乙酰化情况;(B)BldD在体外AcP或AcuA处理下的乙酰化情况;
图2为野生型BldD,AcP处理后的BldD和AcuA处理后的BldD的乙酰化位点质谱鉴定对比;
图3为K11乙酰化位点体内质谱鉴定;
图4为不同BldD和BldD突变体与DNA结合情况对比(A)BldD,BldDK11Q和BldDK11R与DNA结合情况的对比;(B)BldD,BldDK11Q和BldDK11R在加入1μM c-di-GMP情况下与DNA结合情况的对比;
图5为不同放线菌中BldD同源性比对;(A)不同细菌中BldD同源性比对;(B)红色糖多孢菌,天蓝色链霉菌和委内瑞拉链霉菌中的BldD的序列保守性对比;
图6为WT,ObldD,ObldDK11Q和ObldDK11R四种菌体内不同的红霉素合成基因的转录水平的对比;其中横坐标中S1-S4分别为WT,ObldD,ObldDK11Q和ObldDK11R四种菌体;
图7为WT,ObldD,ObldDK11Q和ObldDK11R四种菌体合成红霉素能力的对比;(A)不同菌体的红霉素产量对比;(B)使用枯草芽孢杆菌作为指示菌,不同菌体产生红霉素的抑菌圈对比。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
1、质粒构建
将使用引物pET-2077F/R(pET-2077F:5’-GTCGCGGATCCGAATTCATGGGCGACTACGCCAAG-3’;pET-2077R:5’-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCACTCCTCCCGGGCCG-3’)构建的含有同源序列的bldD片段克隆到EcoRⅠ/HindⅢ双酶切的pET28a质粒主链上,构建了用以将BldD体外表达并进行纯化的质粒pET28a-T7-his-BldD-his,并在此基础上构建位点突变质粒。通过引物pIB-2077F/R(pIB-2077F:5’-GCCGGTTGGTAGGATCCACATATGCATCATCATCATCATCACAGCAGCG-3’;pIB-2077R:5’-CGCGCGCGGCCGCGGATCCTCTAGAAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAG-3’)从质粒pET28a-T7-his-BldD-his中扩增出片段his-BldD-his,将该片段克隆到NdeⅠ/XbaⅠ双酶切的pIB139质粒主链上,构建pIB139-PermE-his-BldD-his质粒及位点突变质粒。
酶切体系为:5μL Buffer、4μL EcoRⅠ限制性内切酶、4μL HindⅢ限制性内切酶、30μL pET28a质粒和7μL ddH2O。通过琼脂糖电泳对酶切产物进行胶回收,用胶回收试剂盒对切割好的线性质粒进行回收。
通过PCR的方法扩增目的基因。PCR反应体系为:25μL buffer、1μL dNTP、1μL上游引物、1μL下游引物、1μL模板、1μL高保真DNA聚合酶以及20μL ddH2O。PCR反应程序为:95℃预变性10分钟,95℃变性15秒,56℃退火15s,72℃延伸1分钟/1000bp,将变性到延伸的过程循环34次,循环结束后72℃延伸5分钟,最后降温至12℃。在琼脂糖凝胶电泳后,将PCR产物与marker比对大小,大小正确后使用胶回收试剂盒进行纯化回收。
将得到的酶切质粒和扩增后的目的片段通过多片段同源重组酶进行连接,重组反应条件为:6μL同源重组酶、4μL目的片段、2μL酶切质粒混匀后在50℃环境下水浴30min,冰上放置5分钟后,将全部体系加入DH5α/BL21感受态中轻柔混匀,冰上放置30分钟后42℃水浴热激90秒,冰上放置3分钟后加入750μL LB培养液,在37℃,220rpm摇床中活化45分钟;将活化好的菌液涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上,37℃过夜培养12-18小时,挑取单克隆测序,与设计序列比对后,保留测序正确的单克隆即可获得含有pIB139-PermE-his-BldD-his和pIB139-PermE-his-BldD-his质粒的转化子。
2、过表达质粒转入红色糖多孢菌体内
抽提质粒:将50μL含有过表达质粒的DH5α大肠杆菌菌液,加入到5mL的LB液体培养基试管中,于37℃、220rpm摇床培养24小时,培养好的菌液通过质粒抽提试剂盒将质粒抽提并纯化。
质粒转入红色糖多孢菌:冰上将50μL pIB139-PermE-his-BldD-his质粒及位点突变质粒加入50μL红色糖多孢菌原生质体中,然后加入200μL PEG-T轻柔混匀,混匀后将所有液体涂布在无抗性的R3M固体培养基平板上,30℃培养24小时,在平板上均匀涂布1mL稀释至125μg/mL的安普霉素液体,30℃培养3-5天,培养后将平板上长出的单克隆体涂在预先涂有1mL稀释至125μg/mL安普霉素液体的无抗性R3M固体培养基平板上,30℃培养2-3天,挑取长出的菌体,加入到5mL的含有50μg/mL安普霉素的TSB液体培养基试管中,30℃,220rpm摇床培养48小时,吸取正常生长的菌液测序,通过M13F/R(M13F:5’-GTGCTGCAAGGCGATTAAGTT-3’;M13R:5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATGT-3’)引物进行扩增,与设计序列比对后,保留测序正确的菌液即可获得含有pIB139-PermE-his-BldD-his质粒及突变质粒的转化子。
3、蛋白体外表达和纯化
纯化菌体培养:将50μL带有pIB139-PermE-his-BldD-his质粒的BL21菌液加入到含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基试管中,37℃,220rpm摇床培养18h,然后将培养好的菌液加入到含有50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中,37℃,220rpm摇床培养至OD600为0.4-0.6,加入IPTG至浓度为96μg/mL,转入20℃,220rpm摇床,过夜培养。
蛋白体外纯化:培养完成后,将菌体离心并用PBS缓冲液洗涤,然后在低温条件下使用超声破碎仪将菌体破碎,使蛋白溶解在PBS缓冲液中,离心去除破碎后的杂质。使用镍柱对蛋白进行纯化,10mL NPI-10清洗并平衡镍柱,将破碎离心后的上清液通过0.45μm滤头加入镍柱,流速控制在15mL/h,使用10mLNPI-20清洗镍柱中未结合的杂蛋白,5mL NPI-250洗脱目的蛋白,最后用5mL 0.5M NaOH清洗镍柱,并用20mL NPI-10保存镍柱。洗脱的目的蛋白通过SDS-PAGE电泳验证大小,确认大小正确后,用超滤的方法将目的蛋白保存在PBS缓冲液中,以便后续使用。
蛋白质溶液超滤:选用孔径约为目标蛋白1/3大小的超滤管进行超滤,将蛋白缓冲液更换为PBS;首先在超滤管中加满去离子水,4℃,3000g离心10-15分钟,清洗超滤管的同时观察超滤管是否完好,然后倒掉去离子水;超滤管中加满PBS缓冲液,4℃,3000g离心10-15分钟,进一步清洗超滤管;加入蛋白液,然后用PBS缓冲液补满,4℃,3000g离心之剩余液体体积约1mL,再用PBS缓冲液补满,4℃,3000g离心之剩余液体体积在500-1000μL,取出此时的蛋白液体用于后续实验。
采用SDS-PAGE电泳,脱色后使用凝胶成像仪拍照。
4、Western-blot实验
将纯化的BldD蛋白定量后用于AcP乙酰化实验,反应体系如下:
表1反应体系
使用完成电泳后的蛋白胶进行实验,按正极-海绵-滤纸-PVDF膜-蛋白胶-滤纸-海绵-负极的顺序将蛋白胶夹在三明治夹板中,将组装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽中,加入冰袋保证实验在低温条件下进行,在100V的电压下电泳一定时间后(目的蛋白大小决定电泳时间,原则上1min/KD,但电泳时间最好不低于20min,不高于90min),终止电泳,取出PVDF膜,将与蛋白胶接触的一面朝上,用10mL TBST缓冲液清洗三次,清洗完毕后,加入10mL封闭液(5% ABV溶解于TBST),封闭2小时,加入一定量的一抗,4℃孵育过夜,倒去封闭液,用10mL TBST缓冲液清洗3次,清洗完毕后再加入10mL TBST和一定量的二抗,常温孵育1小时,孵育结束后,用10mL TBST清洗三次,膜清洗后完毕后,用显色液在ECL显色仪中进行观察。
5、红色糖多孢菌培养方式
取50μL保存的红色糖多孢菌菌液,将其接种于5mL TSB液体试管中,试管中预先加入玻璃珠,30℃,220rpm摇床培养48小时,取500μL试管中培养好的菌液,将其接种于30mLTSB液体培养基中,摇瓶中预先加入玻璃珠,30℃,220rpm摇床培养48小时,最后取0.5~1mL上述种子液接种于含50mL TSB培养基的500mL三角瓶中,使初始OD600为0.05,在30℃、220rpm的摇床培养。
6、乙酰化位点鉴定
体外乙酰化位点鉴定:将90μL纯化好的BldD蛋白与10μL乙酰磷酸(AcP)(100mM)混匀,对照组10μL超纯水,37℃孵育5小时,SDS-PAGE和Western-blot分析蛋白体外乙酰化情况,确认乙酰化后,通过SDS-PAGE电泳的方法将蛋白分离并从胶上切割,进行质谱鉴定。
体内乙酰化位点鉴定:将培养好的红色糖多孢菌转入离心管中,先离心并用PBS缓冲液清洗一次菌体,然后再用PBS缓冲液重悬菌体并加入蛋白酶抑制剂和组蛋白去乙酰酶抑制剂(100μM曲古抑菌素A,50mM烟酰胺和50mM丁酸钠)。将菌体用超声破碎仪进行破碎,离心除去细胞碎片,上清液即是全蛋白溶液。取含有约300μg蛋白的细胞全蛋白溶液,加入BldD抗体5μg,4℃孵育2小时,然后加入40μL蛋白A+G琼脂糖凝胶,4℃过夜孵育,孵育完毕后,用PBS缓冲液将凝胶清洗5次,最后将与凝胶结合的蛋白通过煮沸洗脱于SDS上样缓冲液中,SDS-PAGE蛋白电泳并用Western-blot分析蛋白乙酰化水平。将大小正确的条带从SDS-PAGE胶上切割取出,质谱分析其乙酰化位点。
7、蛋白质点突变
使用点突变试剂盒和引物K11Q F/R及K11R F/R对pET28a-T7-his-BldD-his质粒中的bldD进行点突变,将11位赖氨酸所对应的基因序列aag突变为cag和agg序列,即将赖氨酸分别突变为谷氨酰胺和精氨酸,然后将突变后的质粒转化入BL21感受态中,转化以及后续步骤与突变之前相同。
K11Q F:5’-GCGGCCAGCTCCGCGC-3’;
K11Q R:5’-GGCCGCCCAGCGCCTT-3’;
K11R F:5’-GCGGCAGGCTCCGCGC-3’;
K11R R:5’-CTGCCGCCCAGCGCCT-3’。
8、阻滞凝胶电泳分析(EMSA)
制备阻滞凝胶电泳实验所用探针:使用合成的带有生物素标记的引物(上海生工生物工程有限公司)扩增出所需要的探针,完成探针的制备。扩增引物为:
bldD_F:5’-AGCCAGTGGCGATAAGTCCCGACGGCTGTCGGC-3’;
bldD_R:5’-AGCCAGTGGCGATAAGCCGTTTCATTCGCCCCGTC-3’。
阻滞凝胶实验:首先将蛋白按稀释到所需要的梯度浓度,在EP管内加入4μL蛋白溶液(无蛋白管用去离子水代替),2μL去离子水和2μL 5×EMSA结合缓冲液,盖上盖子,常温孵育15分钟,加入1μL稀释好的探针溶液,混匀后在18℃低温条件下孵育30分钟;配制20mLEMSA实验用非变性胶(1.0mL 10×TBE buffer,14.2mL ddH2O,4mL 39:1acrylamide/bisacrylamide,625μL 80%甘油,150μL 10%过硫酸铵,10μL TEMED),加入洗净烘干并用封口膜封好的胶板中,***梳子,室温放置约40分钟,待非变性胶凝固后,将胶板放入装有0.5×TBE缓冲液的电泳槽中,拔掉梳子,放入冰袋,160V电压下低温预电泳1-2小时;将孵育完成后的样品全部加入到预电泳完毕的胶孔中,在电泳槽中放入冰袋,低温条件下,使用100V电压电泳1.5-2小时,待条带至合适位置后停止电泳,取出非变性胶用来进行转膜实验,该转膜实验使用N+尼龙膜,步骤与Western-blot相同,转膜缓冲液为0.5×TBE缓冲液,电泳槽中放入冰袋,低温条件下380mA恒流转膜30~60min,转膜完成后,将尼龙膜与EMSA胶接触的一面朝上,放置于干净的容器中,使用紫外交联仪(UV-light cross-linker),选择254nm紫外波长,120mJ/cm2,交联1分钟,将交联好的尼龙膜用15mL封闭液常温封闭30min,封闭完成后,加入15mL封闭液和5μL Streptavidin-HRP Conjugate(1:2000稀释)抗体,常温孵育30min,孵育完毕后,用15mL洗涤液洗涤三次,每次15min,洗涤结束后,使用化学发光成像方法观察实验结果,该方法与Western-blot相同。
为了分析体内BldD乙酰化对放线菌代谢的影响,将带有BldD,BldDK11Q,BldDK11R基因片段的重组型质粒导入到红色糖多孢菌内,使这些基因在其菌体内过表达。收集培养好后的菌体进行RT-PCR实验。具体如下:
取相应时间点的菌体,使用RNA抽提试剂盒提取菌体内的RNA,然后使用RNA反转录试剂盒,将抽提出来的RNA反转录为cDNA。通过无核酸水将cDNA稀释至100ng/μL,按20μL的体系进行加样,使用引物相应RT-PCR引物进行RT-PCR实验,按照说明书程序设置进行。
PCR体系(20μL):SYBR Premix Ex Taq GC(2×)10μL;PCR Forward Primer(10μM)0.5μL;PCR Reverse Primer(10μM)0.5μL;Template cDNA(~100ng)1μL;无菌蒸馏水8μL。
PCR程序:95℃60s;95℃10s,60℃10s,72℃30s,40cycles;65℃5s。
上述RT-PCR检测设计到的基因引物如下:
SACE_8101-F:5’-GTTGCGATGCCGTGAGGT-3’;
SACE_8101-R:5’-CGGGTGTTACCGACTTTCA-3’;
eryBIV-F:5’-GCAGCCGCAGGATCACGC-3’;
eryBIV-R:5’-GCCGCCCGTGTTGCTCTA-3’;
eryAI-F:5’-CCGCTGATGCCGAACGAC-3’;
eryAI-R:5’-CACCCTTCCCCGCACTCTG-3’;
ermE-F:5’-CCTCCAGGCACCAGTCCAC-3’;
ermE-R:5’-AGTCGTTGCGGGAGAAGCT-3’;
eryK-F:5’-CCGATGGACCACGAGCAGTT-3’;
eryK-R:5’-AAGGCGGGAGATCAGGTCGT-3’。
为了探究是否可以利用BldD的乙酰化机制,改造该蛋白,从而提升相关次级代谢产物的浓度,在发现赖氨酸位点KLRAIR突变为精氨酸可以进一步提高红霉素合成基因的表达情况后,进一步计划测定了四种菌株(WT,ObldD,ObldDK11Q,ObldDK11R)的产物浓度。将四种菌株分别在TSB培养基中发酵培养120h,提取其上清液,使用以枯草芽孢杆菌作为指示的抑菌圈实验以及HPLC实验分别测定了四种菌株的红霉素产量,具体如下:
(1)抑菌圈实验
将50μL枯草芽孢杆菌接种于5mL LB液体培养基中,在37℃、220rpm条件下,培养至OD600为0.6左右,取500μL的菌液均匀涂抹在LB固体培养基平板的表面。使用50mL TSB液体培养基培养野生型、ObldD、ObldDK11Q和ObldDK11R红色糖多孢菌至120h,在4℃,5600rpm条件下离心收取上清液,四种上清液各取10μL上清液滴在同一块涂抹有枯草芽孢杆菌的LB平板上的不同区域,待板干后,将平板放置于37℃培养箱内培养6-8h,待培养完成后,使用游标卡尺测量各个抑菌圈大小,用以比较红霉素抑菌活力。
(2)HPLC测定红霉素浓度
发酵结束后将发酵液定容到相同体积,8000×g离心10min,收集相同体积(50mL)的上清液放于-80℃冷冻,用冷冻干燥机冻干至粉末,加入一定量乙腈充分溶解后离心收集上清,用离心浓缩仪SpeedVac旋干。然后用1mL甲醇溶解,进样之前用0.22μm有机相滤膜过滤。配制浓度分别为2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL和0.078125mg/mL红霉素标准品(梯度稀释),测定后用于制作标准曲线。用HPLC对红霉素样品和标准品进行分析。
仪器型号:Agilent 1100HPLC;
色谱柱:C18 column(5μm inner diameter,250×4.6mm);
波长:215nm;
进样量:10μL;
流动相:45% A相:30mM KH2PO4(pH 8.0);55% B相:乙腈;
流速:1mL/min。
9、结果与分析
(1)赖氨酸位点KLRAIR的乙酰化影响了BldD与DNA位点结合
通过在37℃条件下将10mM的AcP与BldD孵育可以发现,体外BldD可以被AcP乙酰化,同时也可以被红色糖多孢菌乙酰转移酶AcuA依赖的酶催反应乙酰化(图1B)。而针对BldD体内富集以及乙酰化检测下发现,BldD在体内也可以被乙酰化(图1A)。通过质谱鉴定可以发现,在体外情况下,BldD多个位点可以被乙酰化,而在体内条件下,仅赖氨酸位点KLRAIR存在乙酰化的情况(图2和图3)。这些结果表明BldD在菌体内存在依赖AcP催化赖氨酸位点KLRAIR乙酰化的现象。
以赖氨酸位点KLRAIR为例,为了探究赖氨酸位点KLRAIR的乙酰化是否对BldD的功能存在影响,将赖氨酸位点KLRAIR突变为不带正电荷的谷氨酰胺(Q)以及带有正电荷但不能被乙酰化的精氨酸(R)。用这两种突变的蛋白以及野生型BldD与DNA探针进行EMSA实验。实验结果表明,在将赖氨酸突变为Q之后,BldD与DNA以及c-di-GMP的结合能力被削弱,而突变为R的BldD的DNA结合能力没有受到很大影响(图4A和B)。这些实验结果说明,赖氨酸位点KLRAIR的乙酰化会抑制BldD与DNA和c-di-GMP的结合。在BldD行使功能的过程中,与DNA或c-di-GMP的结合十分关键,当它们受到影响时,BldD的生理功能也必然受到了影响。
(2)针对红色糖多孢菌BldD赖氨酸位点的改造同样适用于其它放线菌
由于研究过程中选用红色糖多孢菌BldD作为研究对象,为了证明相应研究与应用可以适用于其它放线菌,对BldD在不同放线菌中的普遍性和保守性进行了分析。通过进化树的分析可以发现,BldD广泛分布于各类放线菌中且这些BldD具有很高的同源性,对比天蓝色链霉菌,委内瑞拉链霉菌和红色糖多孢菌的BldD的序列可以发现,BldD的序列存在高度保守性(图5)。BldD大部分的可被乙酰化的赖氨酸都位于保守序列,其中红色糖多孢菌BldD的K11,即保守赖氨酸位点KLRAIR,该赖氨酸位点也同样存在于其它放线菌中且具有很高的保守性,所以针对红色糖多孢菌BldD该位点乙酰化的研究及利用同样适用于其它的放线菌。
(3)利用BldD乙酰化改造相应位点可以进一步提高次级代谢产物合成基因的表达
RT-PCR实验结果表明,相比于野生型BldD的过表达,BldDK11Q的过表达很难有效提升红霉素合成相关基因的转录水平,而BldDK11R的过表达则在野生型BldD过表达菌体的基础上进一步了提升了红霉素合成基因基因的转录水平(图6)。实验结果表明:在菌体内,赖氨酸位点KLRAIR的乙酰化会抑制BldD对下游基因的控制能力,而通过过表达BldDK11R,可以有效的屏蔽这种抑制作用,在野生型过表达菌株的基础上进一步提升次级代谢产物合成基因的转录水平。
(4)针对BldD乙酰化位点的改造可以进一步提高菌体次级代谢产物的合成能力
抑菌圈实验以及HPLC实验结果表明:在这四种菌株中,ObldDK11R的红霉素抑菌圈最大,效价最高,ObldD次之,然后是ObldDK11Q和WT两种菌株(图7)。说明通过将BldD的赖氨酸位点KLRAIR突变为精氨酸(R),可以进一步提升红色糖多孢菌生产红霉素的能力,提升产物的产量。这也说明,赖氨酸位点KLRAIR突变为精氨酸可以进一步提高菌体次级代谢产物的合成能力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种基于调控蛋白BldD翻译后修饰提升红色糖多孢菌产红霉素的能力的方法,其特征在于,所述方法包括利用翻译后修饰对红色糖多孢菌体内的调控蛋白BldD的特定位点进行酰基化改造,提升所述红色糖多孢菌产红霉素的能力;
所述调控蛋白BldD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述调控蛋白BldD的特定位点的酰基化为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第11位赖氨酸定点突变为精氨酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过将所述调控蛋白BldD中乙酰化的赖氨酸定点突变为精氨酸的编码基因整合到所述红色糖多孢菌中基因组中,解除翻译后乙酰化修饰对所述调控蛋白BldD转录活性的影响,实现对所述红色糖多孢菌的改造,提升所述红色糖多孢菌的产红霉素的能力。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述编码基因如SEQ ID NO:3所示。
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Title |
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