BR112019028038A2 - uso de policetídeo sintetases tipo iii de bactérias como floroglucinol sintases - Google Patents
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Abstract
Uso de policetídeos sintetase tipo III de bactérias, como bactérias actinomicetos, como floroglucinol sintases. A presente invenção também se refere às moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam essas policetídeos sintase do tipo III, e também aos vetores e células hospedeiras que compreendem essas moléculas de ácido nucleico. A presente invenção também se refere a métodos para a produção de floroglucinol.
Description
[0001] A presente invenção reside nos campos de bioquímica microbiana e, mais particularmente, no campo da síntese de floroglucinol por enzimas microbianas. A mesma refere-se ao uso de policetídeo sintases do tipo III de bactérias, em particular, de bactérias actinomiceto, como floroglucinol sintases.
[0002] Floroglucinol é um composto orgânico aromático usado, em particular, na produção de produtos farmacêuticos e explosivos.
[0003] A síntese de floroglucinol é catalisada pelas policetídeo sintases do tipo III, conhecidas como floroglucinol sintase. Floroglucinol sintases executam a condensação de três moléculas de malonil-CoA de modo a formar uma molécula de floroglucinol de acordo com o seguinte esquema de reação (Reação I): Reação I
[0004] Inúmeros oligômeros podem, subsequentemente, ser sintetizados a partir de floroglucinol, como florotaninas. Florotaninas incluem em particular fucois, floretos e fucofloretois, que são produtos derivados de floroglucinol que constituem a parede de algas marrons. Além disso, várias atividades protetoras de algas marrons têm também sido atribuídas a florotaninas.
[0005] Atualmente, a síntese de floroglucinol foi descrita apenas em Gram- Pseudomonas fluorescens bacteria (Achkar et al., 2005; Zha et. al, 2006) e brown alga Ectocarpus siliculosus (Meslet-Cladière et al,. 2013). A enzima floroglucinol sintase envolvida na síntese de floroglucinol foi identificada nessas duas espécies. As mesmas são as únicas duas Floroglucinol sintases identificadas e caracterizadas até os dias atuais.
[0006] Em Pseudomonas fluorescens, a floroglucinol sintase é codificada pelo gene PHLD (Achkar et al., 2005; Zha et. al, 2006).
[0007] Em Ectocarpus siliculosus, a floroglucinol sintase é codificada pelo gene PKS1 (Meslet-Cladière et al., 2013).
[0008] Tem sido possível demonstrar atividade de floroglucinol sintase de PHLD em Escherichia coli que expressa um gene PHLD heterólogo (Achkar et al., 2005). Essa atividade foi confirmada in vitro, por meio de testes enzimáticos em pequena escala executados com um PHLD recombinante expresso e purificado a partir de culturas de Escherichia coli (Zha et al., 2006).
[0009] A atividade de floroglucinol sintase de PKS1 foi demonstrada in vitro, a partir PKS1 recombinante expresso e purificado em Escherichia coli e a partir de células de extratos de E. siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013, documento WO 2013/045510).
[0010] No entanto, as enzimas de PHLD e PKS1 exibem baixa atividade enzimática. Além disso, a possibilidade de sintetizar floroglucinol in vitro em grande escala com o uso dessas enzimas não foi provada. Finalmente, as floroglucinol sintases usadas nesses estudos foram produzidas por bactérias E. coli ou P. fluorescens. A atividade de tais enzimas quando as mesmas são produzidas por eucarióticos, como leveduras ou células de inseto ou de mamífero, é, portanto, desconhecida. No entanto, os sistemas eucariotas podem ser vantajosos, em particular para produções em larga escala. Os mesmos na verdade possibilitam a obtenção de enzimas que podem ser modificadas no nível pós-translacional.
[0011] Assim, ainda existe a necessidade de identificar novas floroglucinol sintases que têm uma alta atividade enzimática de síntese de floroglucinol in vitro ou in vivo, que são apropriadas para produção em escala industrial e que podem ser produzidas por sistemas eucariotas.
[0012] A exata caracterização funcional de uma policetídeo sintase é, no entanto, complicada pelo fato de que essa classe de enzimas reúne proteínas que têm grandes similaridades de sequência, enquanto podem catalisar substancialmente diferentes reações e reconhecer substratos inteiramente diferentes.
[0013] Apesar dessas dificuldades, os presentes inventores foram capazes de identificar polipeptídeos que estão presentes nas bactérias e têm atividade de floroglucinol sintase. Assim, novas Floroglucinol sintases foram identificadas, em particular, em bactérias Gram+. As mesmas constituem o primeiro exemplo de floroglucinol sintase em bactérias desse tipo. Os inventores demonstram aqui que essas novas floroglucinol sintases exibem uma alta atividade de síntese de floroglucinol. As mesmas são, assim, adequadas para produção em escala industrial. Além disso, as mesmas são funcionais quando produzidas em um sistema eucariota.
[0014] No contexto da presente invenção, os inventores demonstraram, de maneira inteiramente surpreendente, que as bactérias, além de Pseudomonas fluorescens, contêm no seu genoma um gene que codifica uma policetídeo sintase do tipo III que tem uma atividade funcional de floroglucinol sintase.
[0015] A presente invenção se refere, assim, a polipeptídeos escolhidos a partir de policetídeos sintase do tipo III de bactérias, em particular policetídeos sintase do tipo III de bactérias gram+, em particular o policetídeo sintetase do tipo III de bactérias actinomicetos, que podem ser usados como floroglucinol sintases.
[0016] A presente invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam floroglucinol sintases de bactérias, em particular, que codificam floroglucinol sintases de bactérias gram+, em particular, a policetídeo sintases do tipo III de bactérias actinomicetos, e também às floroglucinol sintases assim codificadas.
[0017] A invenção também se refere a vetores que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma floroglucinol sintase.
[0018] A invenção também se refere a células hospedeiras que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada ou pelo menos um vetor de acordo com a invenção.
[0019] A invenção também se refere a métodos para a produção de uma floroglucinol sintase funcional.
[0020] A invenção também se refere a métodos para a produção de floroglucinol.
[0021] A Figura 1 apresenta o alinhamento de sequência de proteínas das enzimas candidatas identificadas. O alinhamento das dez enzimas selecionadas com a enzimas PKS1.Es (PHLD.Es) foi executado com o uso do software Clustal W.
[0022] A Figura 2 apresenta um exemplo de separação de floroglucinol/resorcinol em uma coluna de propil-pentafluorofenila (PFP).
[0023] A Figura 3 mostra um exemplo da estrutura de uma unidade de gene construída para um dado candidato (PhlD.ii), tornando possível expressar os genes PHLD na levedura Saccharomyces cerevisiae.
[0024] A Figura 4 mostra os níveis de produção de floroglucinol nas cepas de levedura que expressam os vários genes candidatos PHLD.ii e os genes de controle PHLD.Pf e PKS1.Es (várias cópias) sob o controle do promotor ADH2, após 48 horas de cultura em uma placa de 24 poços na presença de 20 g.l-1 de etanol como de fonte de carbono a 30 °C. (A) Resumo dos vários dados medidos. (B) Densidades ópticas (DO) das várias culturas medidas a 600 nm (DO600), indicando o nível de crescimento de cada cepa. (C) Nível de produção de floroglucinol (em mg.l-1) medido no meio de cultura. (D) Nível de produção de floroglucinol (em mg.l-1) padronizado em relação ao número de cópias de genes integrados no genoma.
[0025] A Figura 5 mostra a estrutura dos construtos de genes integrados no genoma da levedura no locus de JLP1. O gene que codifica cada PHLD/PKS1 está sob o controle do promotor pADH2 ou do promotor pCCW12.
[0026] A Figura 6 mostra os níveis de produção de floroglucinol nas cepas de levedura que expressam os diferentes genes PHLD.ii (somente uma cópia) sob o controle do promotor ADH2 após 48 horas de cultura em uma placa de 24 poços na presença de 20 gl -1 de etanol como de fonte de carbono a 30 °C. (A) Resumo dos vários dados medidos. (B) Densidades ópticas (DO) das várias culturas medidas a 600 nm (DO600), indicando o nível de crescimento de cada cepa. (C) Nível de produção de floroglucinol (em mg.l-1) medido no meio de cultura.
[0027] A Figura 7 mostra os níveis de produção de floroglucinol nas cepas de levedura que expressam os diferentes genes PHLD (apenas uma cópia) sob o controle do promotor CCW12 após 48 horas de cultura em uma placa de 24 poços na presença de 20 g l-1 de glicose como de fonte de carbono em 30 °C. (A) Resumo dos vários dados medidos. (B) Densidades ópticas (DO) das várias culturas medidas em 600 nm (DO600), indicando o nível de crescimento de cada cepa. (C) Nível de produção de floroglucinol (em mg.l-1) medido no meio de cultura.
[0028] O termo “policetídeo sintase do tipo III” é destinado a significar uma enzima multifuncional ou um complexo enzimático que produz policetídeos e que não usa um domínio de proteína carreadora de acila (ou ACP).
[0029] O termo “policetídeo” é destinado a significar uma grande família de metabólitos secundários em bactérias, micetos, plantas e certas linhas de animais que se originam a partir da condensação iterativa de subunidades de acetila ou malonil por enzimas policetídeo sintases. Os policetídeos também servem como materiais de partida para a produção de uma ampla gama de produtos naturais e semissintéticos.
[0030] O termo “floroglucinol” é destinado a significar um composto orgânico aromático benzeno-1,3,5-triol que tem a seguinte fórmula química (fórmula I): Fórmula I
[0031] O termo “floroglucinol sintase” é destinado a significar uma enzima multifuncional ou um complexo enzimático que pertence à família de policetídeo sintases do tipo III e que catalisa síntese de floroglucinol. Uma floroglucinol sintase catalisa a condensação de três moléculas de malonil-CoA de modo a formar uma molécula de floroglucinol.
[0032] O termo “atividade enzimática”, ou “atividade catalítica”, ou então “atividade” de uma enzima é destinado a significar a eficiência de uma enzima para converter um substrato em um produto em um dado ambiente. A eficiência da enzima leva em conta aqui a taxa de conversão do substrato em um produto pela enzima e o grau de conversão do substrato em um produto pela enzima. A expressão “grau de conversão do substrato em um produto pela enzima” é destinada a significar aqui a relação entre a quantidade de produto final obtida em relação à quantidade inicial de substrato para uma quantidade definida de enzima. Por exemplo, para os fins da invenção, uma atividade enzimática pode ser expressa como uma quantidade de floroglucinol produzido em um dado volume (em g/l).
[0033] O termo “bactéria” é destinado a significar um organismo microscópico e procariota presente em todos os meios.
[0034] O termo “bactéria Gram+” ou “bactéria Gram-positiva” é destinado a significar uma bactéria que é positiva em manchamento Gram (isto é, que retém a violeta de genciana, também conhecido como violeta cristal, e permanece de cor malva-violeta ou de cor azul-escuro-roxa).
[0035] O termo “bactéria actinomiceto” ou “bactéria actinomiceto Gram” ou “bactéria actinomiceto Gram-positiva” é destinado a significar uma bactéria pertencente à ordem Actinomycetales na classificação de actinobactéria, que é positiva em relação ao manchamento Gram. Actinomicetos são bactérias, cujo crescimento dá origem a colônias que consistem em hifas, isto é, filamentos que irradiam, por crescimento por centrífuga, em torno do micro-organismo que deu origem aos mesmos.
[0036] O termo “Tsukamurella sp.” é destinado a significar uma bactéria actinomiceto com forma de haste, necessariamente aeróbica, não esporulada do gênero Tsukamurella. O gênero Tsukamurella compreende, em particular, a espécie Tsukamurella paurometabola (também referida como Tp doravante), Tsukamurella tyrosinosolvens (também referida como Tt doravante), Tsukamurella pseudospumae (também referida como Tps doravante), Tsukamurella pulmonis (também referida como TPU doravante) e Tsukamurella sp. 1534 (também referida como Tsp doravante).
[0037] O termo “Nocardia sp.” é destinado a significar uma bactéria actinomiceto filamentosa do gênero Nocardia. O gênero Nocardia compreende, em particular, a espécie Nocardia farcinica (também referida como Nf doravante).
[0038] O termo “Mycobacterium sp.” é destinado a significar uma bactéria actinomiceto não esporulante aeróbica na forma de bacilos, do gênero Mycobacterium. O gênero Mycobacterium compreende, em particular, as espécies de Mycobacterium marinum, Mycobacterium kansasii e Mycobacterium tuberculosis
(também referido respectivamente como Mma, Mc e Mt doravante).
[0039] O termo “Gordonia sp.” é destinado a significar uma bactéria actinomiceto do gênero Gordonia. O gênero Gordonia compreende, em particular, a espécie Gordonia hydrophobica (também referida como Gh doravante).
[0040] O termo “Pseudomonas sp.” é destinado a significar uma bactéria Gram- negativa (Gram-), que não forma esporos (ou não esporulante), que se encontra na forma de um bacilo e que é necessariamente aeróbica, do gênero Pseudomonas. O gênero Pseudomonas compreende, em particular, as espécies Pseudomonas fluorescens (também conhecidas como Pf doravante).
[0041] O termo “Ectocarpus sp.” é destinado a significar uma alga do gênero Ectocarpus, da classe de algas marrons, pertencente à família Ectocarpaceae. O gênero Ectocarpus compreende, em particular, as espécies Ectocarpus siliculosus.
[0042] O termo “PHLD.Pf” é destinado a significar, sem distinção, o gene que codifica a floroglucinol sintase de PHLD de P. fluorescens, ou o polipeptídeo codificado por esse gene.
[0043] O termo “PKS1.Es” ou “PHLD.Es” é destinado a significar, sem distinção, o gene que codifica a floroglucinol sintase de PKS1 de E. siliculosus, ou o polipeptídeo codificado por esse gene.
[0044] O termo “PhlD “ou “PHLD” indica aqui um gene candidato que codifica uma enzima floroglucinol sintase candidata, ou o polipeptídeo codificado por esse gene. De acordo com a nomenclatura escolhida pelos inventores, o termo “PhlD.ii “ou “PHLD.ii” indica aqui o gene candidato ou o polipeptídeo candidato de um dado organismo. As letras “ii” representam o gênero e as espécies às quais o dito organismo pertence.
[0045] O termo “molécula de ácido nucleico” é destinado a significar um polímero de qualquer comprimento de ácido desoxirribonucleico (DNA), ou polidesoxirribonucleotídeos, incluindo, em particular, DNAs complementares ou cDNAs, DNA genômicos, plasmídeos, vetores, genomas virais, DNA isolado, sondas, primers e qualquer mistura dos mesmos; ou um polímero de qualquer comprimento de ácido ribonucleico (RNA) ou polirribonucleotídeos, incluindo, em particular, RNAs mensageiros ou mRNAs, RNAs antissenso; ou poliribo-polidesoxirribonucleotídeos mistos. Os mesmos abrangem polinucleotídeos de fita simples ou dupla, linear ou circular e natural ou sintético. Além disso, um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos não naturais e pode ser interrompido por componentes não nucleotídicos.
[0046] No contexto da presente invenção, os termos “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “polinucleotídeo” e “sequência nucleotídica” são usados de forma intercambiável.
[0047] O termo “molécula isolada” é destinado a significar uma molécula, em particular, uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, uma molécula de ácido nucleico, um vetor plasmídico, um vetor viral ou uma célula hospedeira, que é extraída de seu ambiente natural (isto é, separada de pelo menos outro componente ao qual o mesmo está naturalmente associado).
[0048] Os termos “polipeptídeo”, “proteína” e “peptídeo” são destinados a significar polímeros de resíduos de aminoácidos que compreendem pelo menos nove aminoácidos ligados através de ligações peptídicas. O polímero pode ser linear, ramificado ou cíclico. O polímero pode compreender aminoácidos naturais e/ou aminoácidos análogos e que podem ser interrompidos por resíduos de não aminoácido. Como uma indicação geral e, contudo, sem ser ligado a isso no presente pedido, se o polímero de aminoácido contém mais que 50 resíduos de aminoácidos, isso é preferencialmente referido como um polipeptídeo ou uma proteína, ao passo que se o polímero é composto de 50 aminoácidos ou menos, o mesmo é preferencialmente referido como um “peptídeo”.
[0049] O termo “vetor” é destinado a significar um carreador, de preferência, uma molécula de ácido nucleico ou uma partícula viral, que contém os elementos necessários para permitir que uma ou mais moléculas de ácido nucleico sejam administradas em, propagadas em e/ou expressas em uma célula hospedeira ou em um organismo.
[0050] A partir de um ponto de vista funcional, esse termo engloba vetores de manutenção (vetores de clonagem), vetores para expressão em várias células ou organismos hospedeiros (vetores de expressão), vetores extracromossômicos (por exemplo, plasmídeos multicópias) ou vetores de integração (por exemplo, projetados para integrar o genoma de uma célula hospedeira e para produzir cópias adicionais da molécula de ácido nucleico que contém os mesmos, quando a célula hospedeira replica). Esse termo também engloba vetores transportadores (por exemplo, que funcionam tanto em hospedeiros procariotas e/ou hospedeiros eucariotas) e vetores de transferência (por exemplo, para a transferência de molécula de ácido nucleico (ou moléculas) para o genoma de uma célula hospedeira).
[0051] A partir de um ponto de vista estrutural, os vetores de acordo com a invenção podem ser fontes genéticas naturais, sintéticas ou artificiais, ou uma combinação de elementos genéticos naturais e artificiais.
[0052] Assim, no contexto da invenção, o termo “vetor” deve ser entendido amplamenteem geral, enquanto incluindo vetores plasmídicos (ou plasmídeos) e vetores virais.
[0053] Um “plasmídeo”, conforme usado aqui, denota um construto de DNA replicável. Normalmente, de vetores plasmídicos contêm genes marcadores selecionáveis que permitem que as células hospedeiras que transportam o plasmídeo sejam identificadas e/ou selecionadas positiva ou negativamente na presença do composto correspondente ao marcador selecionável. Uma variedade de genes marcadores positivos e negativos selecionáveis são conhecidos na técnica. Por meio de ilustração, um gene de resistência a antibióticos pode ser usado como um gene marcador positivo selecionável para selecionar uma célula hospedeira na presença do antibiótico correspondente.
[0054] O termo “vetor viral”, como usado aqui, se refere a um vetor de ácido nucleico que compreende pelo menos um elemento de um genoma viral e que pode ser empacotado em uma partícula viral, ou uma partícula viral. Os vetores virais podem ser competentes para replicação ou seletivos (por exemplo, projetados para replicar melhor ou seletivamente em células hospedeiras específicas), ou podem ser geneticamente desativados de modo a serem defeituosos ou deficientes para replicação.
[0055] O termo “célula hospedeira” é destinado a significar uma célula contendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção. De um modo vantajoso, a célula hospedeira tem a capacidade de expressar um polipeptídeo com atividade de floroglucinol sintase e/ou de produzir o vetor da invenção. Vantajosamente, de novo, a célula hospedeira tem a capacidade de sintetizar o floroglucinol.
[0056] A célula hospedeira pode consistir em um único tipo de células ou em um grupo de diferentes tipos de células. A célula hospedeira pode também ser uma célula híbrida, isto é, uma célula resultante da fusão de pelo menos duas células de tipo diferente.
[0057] A célula hospedeira pode pertencer a linhas celulares de cultura, a células primárias, a células-tronco ou a células proliferativas. No contexto da invenção, o termo “células hospedeiras” compreende células procariotas, células eucariotas inferiores, como células de3 levedura, e outras células eucariotas, como células de insetos, células vegetais e células de mamíferos (por exemplo, células humanas ou não humanas, de preferência, células não humanas).
[0058] O termo “célula hospedeira” compreende mais amplamente células que contenham ou tenham contido a molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, e também a progênie de tais células. A célula hospedeira pode, por exemplo, ser isolada ou organizada em um tecido ou em um órgão, ou então pode estar dentro de um organismo completo. No caso em que a célula hospedeira encontra-se dentro de um organismo completo, o dito organismo é não humano.
[0059] É assim evidente que uma “célula hospedeira” de acordo com a presente invenção é uma célula hospedeira recombinante, ou seja, uma célula que aloja um material genético exógeno. Assim, uma célula hospedeira não é uma célula que existe naturalmente, mas é uma ferramenta de biologia molecular obtida por técnicas de manipulação genética.
[0060] O termo “identidade” é destinado a significar uma correspondência de sequência exata entre dois polipeptídeos ou duas moléculas de aminoácido. A “porcentagem de identidade” entre duas sequências depende do número de resíduos idênticos comuns às duas sequências, e leva em conta o número de intervalos que devem ser introduzidos para um melhor alinhamento e o comprimento de cada intervalo. Vários programas de computador e algoritmos matemáticos estão disponíveis na técnica anterior para determinar a porcentagem de identidade entre sequências de aminoácidos, como, por exemplo, o programa Blast disponível nas bases NCBI ou ALIGN (Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff (ed.), 1981, Supl. 3 482 a 489). Programas para determinar a homologia entre sequências nucleotídicas estão também disponíveis em um banco de dados especializado (por exemplo, Genbank, programas Wisconsin Sequence Analysis Package, BESTFIT, FASTA e GAP). A título de ilustração, a expressão “pelo menos 80% de identidade de sequência “, conforme usado aqui, representa 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.
[0061] Na descrição detalhada a seguir, as modalidades podem ser tomadas isoladamente ou combinadas de forma adequada por aqueles versados na técnica.
[0062] O foco aqui é sobre os polipeptídeos isolados escolhidos de policetídeo sintases do tipo III de bactérias, em particular, de policetídeo sintases do tipo III de bactérias gram+, em particular, de policetídeo sintases do tipo III de bactérias actinomicetos.
[0063] De fato, os inventores identificaram, de maneira inteiramente surpreendente, genes que codificam novas policetídeos sintases do tipo III no genoma de bactérias que não eram conhecidos por codificar esse tipo de enzima. Os inventores demonstraram, em particular, de maneiras mais surpreendente, que essas novas policetídeo sintases do tipo III têm atividade de floroglucinol sintase.
[0064] A presente invenção se refere em particular ao uso de polipeptídeos isolados escolhidos de policetídeo sintases do tipo III de bactérias como floroglucinol sintases, de preferência com a exclusão do policetídeo sintase do tipo III de Pseudomonas fluorescens PHLD.Pf. A presente invenção se refere em particular ao uso de polipeptídeos isolados escolhidos de policetídeo sintases do tipo III de bactérias como floroglucinol sintases, com a exclusão do policetídeo sintase do tipo III de Pseudomonas fluorescens PHLD.Pf.
[0065] A presente invenção também se refere em particular ao uso de polipeptídeos isolados escolhidos de policetídeo sintases do tipo III de bactérias gram+, em particular, de policetídeo sintases do tipo III de bactérias actinomicetos, como o floroglucinol sintases.
[0066] Vantajosamente, o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com uma sequência escolhida de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
[0067] Vantajosamente, o dito polipeptídeo isolado é escolhido dentre as policetídeos sintetase tipo III das bactérias gram+. De um modo vantajoso, o dito polipeptídeo isolado é escolhido dentre as policetídeo sintases do tipo III de bactérias actinomicetos escolhidas do grupo que consiste em Tsukamurella sp., Nocardia sp., Mycobacterium sp., E Gordonia sp., Em particular, Tsukamurella paurometabola, Tsukamurella tyrosinosolvens, Tsukamurella pseudospumae, Tsukamurella pulmonis, Tsukamurella sp. 1534, Nocardia farcinica, Mycobacterium marinum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis e Gordonia hydrophobica.
[0068] De acordo com uma modalidade, o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos que tem, de preferência, pelo menos 60% de identidade, com mais preferência pelo menos 65% de identidade, com mais preferência pelo menos 70% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 75% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 80% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 85% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 90% de identidade, com mais preferência pelo menos 95% de identidade, com mais preferência pelo menos 96% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 97% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 98% de identidade, e ainda com mais preferência pelo menos 99% de identidade, com uma sequência escolhida de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID n.: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID
NO: 10.
[0069] De acordo com uma particularmente vantajosa modalidade, o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
[0070] Em uma modalidade preferencial, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase tem uma sequência de aminoácidos escolhida de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
[0071] Vantajosamente, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase é escolhido dentre o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Tp de Tsukamurella paurometabola, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Tt de Tsukamurella tyrosinosolvens, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Tps de Tsukamurella pseudospumae, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Tpu de Tsukamurella pulmonis, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Tp de Tsukamurella sp. 1534, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Nf de Nocardia farcinica, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Mma de Mycobacterium marinum, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Mk de Mycobacterium kansasii, o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Mt de Mycobacterium tuberculosis e o polipeptídeo isolado com atividade de floroglucinol sintase PHLD.Gh de Gordonia hydrophobica.
[0072] A presente invenção se refere a moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam pelo menos um polipeptídeo escolhido dentre policetídeo sintase do tipo III de bactérias, em particular, policetídeo sintases do tipo III de bactérias actinomicetos.
[0073] Vantajosamente, o dito polipeptídeo é como definido acima.
[0074] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada compreende um promotor que controla a expressão de pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo como definido acima. Assim, de acordo com uma modalidade, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um polipeptídeo escolhido dos policetídeo sintases do tipo III como definido acima e também que compreende um promotor que controla a expressão da dita pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos.
[0075] Vantajosamente, o promotor é um promotor exógeno, em particular um promotor de levedura, preferencialmente um promotor escolhido dentre ADH2 (pADH2) e CCW12 (pCCW12), com mais preferência um promotor escolhido dentre ADH2 (pADH2) de Saccharomyces cerevisiae e CCW12 de S. cerevisiae, com mais preferência um promotor escolhido dentre ADH2 da SEQ ID NO: 13 e CCW12 da SEQ ID NO: 14.
[0076] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada compreende um terminador de transcrição para pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo como definido acima. Assim, de acordo com uma modalidade, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um polipeptídeo escolhido dos policetídeo sintases do tipo III como definido acima e também que compreende um terminador que controla a expressão da dita pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos.
[0077] Vantajosamente, o terminador é um terminador exógeno, em particular um terminador de levedura, preferencialmente o terminador RPL3 (tRPL3), com mais preferência o terminador RPL3 de S. cerevisiae, com mais preferência o terminador RPL3 da SEQ ID NO: 15.
[0078] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula de ácido nucleico isolada compreende tanto um promotor quanto um terminador que são como definidos acima. Assim, de acordo com uma modalidade, a presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo escolhido dos policetídeo sintases do tipo III como definido acima e também que compreende um promotor e um terminador que controla a expressão da dita pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos.
[0079] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico também compreende uma sequência de exportação. De um modo vantajoso, essa sequência de exportação permite a secreção ou excreção do polipeptídeo (ou polipeptídeos) codificado pela dita molécula de ácido nucleico, no meio celular.
[0080] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é isolada de cepas homólogas em cultura, de preferência, escolhidas de Tsukamurella sp., Nocardia sp., E Mycobacterium sp., Em particular, Tsukamurella pourometabola, Tsukamurella tyrosinosolvens, Tsukamurella pseudospumae, Tsukamurella pulmonis, Tsukamurella sp. 1534, Nocardia farcinica, Mycobacterium marinum, Mycobakterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis e Gordonia hydrophobica.
[0081] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é isolada de um vetor heterólogo ou célula hospedeira, que compreende a dita molécula, em que o dito vetor ou a dita célula hospedeira é como definido acima e como descrito abaixo nas secções “células hospedeiras” ou “vetores”.
[0082] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada é sintetizada in vitro por meio de técnicas de síntese nucleica que aqueles versados na técnica sabem perfeitamente como definir.
[0083] De acordo com uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada é recombinante.
[0084] A presente invenção se refere a vetores que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucleico como definido acima.
[0085] Vantajosamente, o vetor é um plasmídeo.
[0086] Os vetores que são adequados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, vetores bacteriófagos, plasmídicos ou cosmídicos para expressão em células hospedeiras procariotas como bactérias (por exemplo, E. coli, ou bactérias do gênero Pseudomonas); vetores para expressão em leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schyzosaccharomyces pombe, Pichia pastoris); vetores de baculovírus para expressão em sistemas de células de insetos (por exemplo,
células Sf 9); vetores virais e plasmídicos para expressão em sistemas de células vegetais (por exemplo, o plasmídeo Ti, o vírus do mosaico de couve-flor CaMV, o vírus do mosaico do tabaco TMV); e também vetores virais e plasmídicos para expressão em células ou organismos eucarióticos superiores.
[0087] Esses vetores estão, em geral, comercialmente disponíveis (por exemplo, junto a fornecedores como Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega, etc), disponíveis junto a instituições de depósito, como A Coleção Americana do Tipo de Cultura (ATCC, Rockville, Md.), ou têm sido a matéria de várias publicações que descrevem a sua sequência, suas estruturas e os métodos para produzir as mesmas, de modo que os versados na técnica possam aplicar as mesmas sem dificuldade.
[0088] Exemplos representativos de vetores de plasmídeo adequados compreendem, sem limitação, pREP4, pCEP4 (Invitrogen), pCI (Promega), pCI (Promega), pVAX (Invitrogen) e pgWiz (Gene Therapy System Inc).
[0089] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a células hospedeiras que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucleico ou pelo menos um vetor como definido acima.
[0090] De acordo com várias modalidades, a dita célula hospedeira, em particular a dita célula hospedeira heteróloga mencionada acima, pode ser uma célula procariótica, uma célula eucariótica inferior, como uma célula de levedura, e outras células eucarióticas, como células de insetos, células vegetais e mamíferos células (por exemplo, células humanas ou não humanas, de preferência células não humanas).
[0091] Vantajosamente, a célula hospedeira é um micro-organismo selecionado dentre bactérias, leveduras, fungos, algas e cianobactérias.
[0092] A célula hospedeira é preferencialmente uma levedura, em que a dita levedura é, em particular, selecionada dentre os gêneros Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, Pichia (Hansenula), Debaryomyces, clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus e Malassezia.
[0093] Ainda mais particularmente, a levedura é selecionada dentre as espécies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa e Torulaspora glabrata.
[0094] Ainda mais particularmente, a levedura é do gênero Saccharomyces, de preferência, das espécies Saccharomyces cerevisiae.
[0095] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira compreende pelo menos uma cópia da molécula de ácido nucleico como definido acima, integrado ao seu genoma.
[0096] De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira compreende uma única cópia da molécula de ácido nucleico como definido acima, integrado ao seu genoma.
[0097] Quando a célula hospedeira é uma célula de levedura, a cópia ou cópias da molécula de ácido nucleico podem ser integradas em diferentes loci, preferencialmente no locus URA3, no locus JLP1, no locus LEU2 ou no locus TRP1 do genoma da dita célula de levedura. Quando a célula hospedeira é uma levedura de células e várias cópias da molécula de ácido nucleico está integrada, as várias cópias podem ser integradas ao mesmo locus, ou em diferentes loci, preferencialmente em qualquer uma das combinações dos loci URA3, JLP1, LEU2 e/ou TRP1.
[0098] De forma vantajosa, os códons usados na molécula de ácido nucleico foram adaptados para ótima expressão na célula hospedeira selecionada.
[0099] Uma ótima expressão pode em particular, ser obtida quando os códons escolhidos são aqueles preferencialmente usados pelo organismo de origem da célula hospedeira. Os códons preferencialmente usados são conhecidos pela maioria dos organismos vulgarmente usados no campo. Os versados na técnica terão a capacidade de facilmente determinar os códons mais vantajosos para serem usados como uma função da célula hospedeira escolhida.
[00100] Para isso, os versados na técnica sabem qual técnica usar para modificar os códons da molécula de ácido nucleico. Os códons podem, por exemplo, ser modificado por mutagênese sítio-dirigida in vitro com o uso de uma amostra da molécula de ácido nucleico das quais os códons devem ser adaptados, por meio de uma amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR). Alternativamente, a molécula de ácido nucleico pode ser sintetizada in vitro diretamente com os códons otimizados.
[00101] As células hospedeiras podem ser cultivadas em pequena escala e grande escala, biorreatores aeróbicos ou anaeróbicos, em frascos ou em placas de Petri. A cultura pode ser realizada a uma temperatura, em um pH, em um meio de cultura e em um teor de oxigênio que são adequados para uma determinada célula hospedeira.
[00102] A presente invenção também se refere a um método para a produção de um polipeptídeo com atividade da floroglucinol sintase, conforme definido acima.
[00103] De acordo com uma modalidade, o método para a produção de um polipeptídeo com atividade da floroglucinol sintase, conforme definido acima, compreende pelo menos as etapas que consistem em: (i) introduzir uma molécula de ácido nucleico ou um vetor como descrito acima em uma célula hospedeira adequada de acordo com a descrição anterior; e (ii) cultivar, in vitro, a dita célula hospedeira obtida na etapa (i) sob condições que permitem o crescimento da dita célula hospedeira e/ou a expressão da dita molécula de ácido nucleico, de modo a produzir o dito polipeptídeo.
[00104] De acordo com outra modalidade, o método para a produção de um polipeptídeo com atividade da floroglucinol sintase, conforme definido acima, compreende pelo menos a etapa que consiste em: (i) cultivar, in vitro, uma célula hospedeira que expressa o dito polipeptídeo, por exemplo, uma célula hospedeira como descrito acima, sob condições que permitem o crescimento da dita célula hospedeira e/ou a expressão da molécula de ácido nucleico contida na dita célula hospedeira, de modo a produzir o dito polipeptídeo.
[00105] De acordo com uma modalidade possível, o método para produzir um polipeptídeo com atividade de floroglucinol sintase compreende pelo menos uma etapa adicional escolhida dentre as etapas que consistem em: (a) recuperar as células que expressam o dito polipeptídeo, obtidas após a etapa de cultura; e (β) purificar o polipeptídeo a partir das células recuperadas na etapa (α).
[00106] A presente invenção também se refere a um método para a produção de floroglucinol.
[00107] De acordo com uma modalidade M1, o método para a produção de floroglucinol compreende pelo menos as etapas que consistem em: (i) obter células por meio da implantação de um dos métodos descritos acima; (ii) colocar as células obtidas na etapa (i) em contato com um substrato adequado; (iii) incubar a mistura resultante da etapa (ii) sob condições adequadas para a produção de floroglucinol; (iv) opcionalmente, recuperar o meio de reação que compreende o floroglucinol, obtido após a etapa (iii); e (v)opcionalmente, purificar o floroglucinol a partir do meio de reação da etapa (iv).
[00108] De acordo com outra modalidade M2, o método para a produção de floroglucinol compreende as etapas que consistem em: (i) colocar uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo com atividade da floroglucinol sintase como definida acima, por exemplo, uma célula hospedeira como definida acima, em contato com um substrato adequado; (ii) cultivar, in vitro, a célula hospedeira da etapa (i) sob condições que permitem o crescimento da dita célula hospedeira e/ou a expressão da molécula de ácido nucleico contida na dita célula hospedeira, assim como para produzir floroglucinol; (iii) opcionalmente, recuperar o meio de cultura que compreende o floroglucinol, obtido após a etapa (ii); e (iv) opcionalmente, purificar o floroglucinol a partir do meio de cultura de da etapa (iii).
[00109] Para os fins de métodos M1 e M2, o substrato é uma fonte de carbono. De um modo vantajoso, a fonte de carbono é uma fonte de carbono puro ou um subproduto industrial (como melaço ou xarope verde, por exemplo, a partir da indústria do açúcar). De preferência, o substrato da fonte de carbono puro ou o subproduto industrial é um açúcar simples, como a glicose (ou dextrose), frutose, galactose, manose, sacarose, lactose ou maltose; um açúcar complexo, como um monossacarídeo, um dissacarídeo ou trissacarídeos, ou mais de um polissacarídeo como amido; um álcool, como etanol; um ácido; um ácido graxo e derivado de éster do mesmo; ou uma mistura de açúcares, de álcoois, de ácidos e/ou de ácidos graxos ou os derivados de éster dos mesmos.
[00110] De preferência, o substrato é glicose. Alternativamente, o substrato é etanol.
[00111] De acordo com outra modalidade M3, o método para a produção de floroglucinol compreende pelo menos as etapas que consistem em: (i) colocar pelo menos um polipeptídeo obtido na etapa (β) do método como descrito acima em contato com um substrato adequado; (ii) incubar a mistura resultante da etapa (i) sob condições adequadas para a produção de floroglucinol; (iii) opcionalmente, recuperar o meio de reação que compreende o floroglucinol, obtido após a etapa (ii); e (iv) opcionalmente, purificar o floroglucinol a partir do meio de reação da etapa (iii).
[00112] De acordo com outra modalidade M4, o método para a produção de floroglucinol compreende pelo menos as etapas que consistem em:
(i) colocar pelo menos um polipeptídeo como definido acima em contato com um substrato adequado; (ii) incubar a mistura resultante da etapa (i) sob condições adequadas para a produção de floroglucinol; (iii) opcionalmente, recuperar o meio de reação que compreende o floroglucinol, obtido após a etapa (ii); e (iv) opcionalmente, purificar o floroglucinol a partir do meio de reação da etapa (iii).
[00113] Para os fins desses métodos M3 e M4, o substrato é um tioéster. Vantajosamente, o substrato é uma acil-Coenzima A (ou acil-CoA), como malonil-CoA, acetil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA e palmitoil-CoA, ou uma mistura dos mesmos. De preferência, o substrato é malonil-CoA.
[00114] De acordo com uma modalidade preferencial, a purificação do floroglucinol é executada por extração líquido-líquido.
[00115] Os exemplos a seguir pretendem ilustrar a presente invenção sem qualquer limitação.
[00116] As enzimas respectivamente codificadas pelo gene PHLD de Pseudomonas fluorescens (Zha et al., 2006), e pelo gene PKS1 de Ectocarpus siliculosus (Meslet-Cladière et al., 2013) são usadas nos mesmos como controles.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS FLUOROGLUCINOL SINTASES
[00117] Até a presente invenção, apenas dois floroglucinol sintases foram identificados e caracterizados: - a enzima codificada pelo gene PHLD de Pseudomonas fluorescens (Zha et al., 2006), e - a enzima codificada pelo gene PKS1 de Ectocarpus siliculosus (Meslet- Cladière et. al, 2013).
[00118] Os inventores agora constataram e caracterizaram novas floroglucinol sintases com o uso de análises genéticas e funcionais.
[00119] Como indicado na introdução acima, a caracterização funcional exata de uma policetídeo sintase é complexa uma vez que essa classe de grupos de enzimas juntos com proteínas tem alta similaridade de sequência, embora possam catalisar substancialmente diferentes reações e reconhecer substratos inteiramente diferentes.
1.1. SELEÇÃO DE NOVAS ENZIMAS CANDIDATAS
[00120] A fim de identificar novas floroglucinol sintases, os inventores identificaram sequências que codificam policetídeo sintases do tipo III putativas. As sequências de tais policetídeo sintases do tipo III putativas assim identificadas pelos inventores foram analisadas e alinhadas entre si com o uso, em particular, como uma base, do alinhamento de policetídeo sintase do tipo III publicado por Meslet-Cladière et al. 2013.
[00121] A análise desse alinhamento de sequência resultou na seleção de um grupo de enzimas candidatas, em que as sequências de proteínas disso estão próximas àquelas do produto do gene PKS1.Es da alga Ectocarpus siliculosus (Tabelas 1 e 2). TABELA 1: POLICETÍDEOS SINTETASES DO TIPO III PUTATIVAS IDENTIFICADAS. AS LINHAS SOMBREADAS MOSTRAM AS ENZIMAS QUE TÊM UMA ATIVIDADE CONHECIDA DE FLOROGLUCINOL SINTASE.
Função Referência nos conhecid Nome bancos de Espécies Reino a ou dados putativa policetíd eo Pseudomona Gamaproteobactérias/pseudom PHLD.Pf AAY95147.1 sintase s fluorescens onais (bactérias) do tipo III Pf-5 DE PhlD
III Ectocarpus PKS1.Es CBN76919.1 policetíd Ochrophytes (algas) siliculosus eo
Função Referência nos conhecid Nome bancos de Espécies Reino a ou dados putativa sintase sem peptídeo sinal 2- 32 Tsukamurell policetíd WP_01312695 a Actinobactérias/tsukamurella PHLD.Tp eo
5.1 paurometabo (bactérias) sintase la Tsukamurell policetíd WP_06852579 a Actinobactérias/tsukamurella PHLD.Tt eo
0.1 tyrosinosolve (bactérias) sintase ns Tsukamurell policetíd PHLD.Tp WP_06856995 a Actinobactérias/tsukamurella eo s 9.1 pseudospum (bactérias) sintase ae policetíd PHLD.Tp WP_06856759 Tsukamurell Actinobactérias/tsukamurella eo u 8.1 a pulmonis (bactérias) sintase policetíd PHLD.Ts WP_01920276 Tsukamurell Actinobactérias/tsukamurella eo p 3.1 a sp. 1534 (bactérias) sintase PHLD.Nf WP_01121146 policetíd Nocardia Actinobactérias/corinebactérias
Função Referência nos conhecid Nome bancos de Espécies Reino a ou dados putativa
4.1 | eo farcinica (bactérias) sintase policetíd PHLD.M WP_01239395 Mycobacteri Actinobactérias/corinebactérias eo ma 4.1 | um marinum (bactérias) sintase policetíd Mycobacteri ZP_04749411. Actinobactérias/corinebactérias PHLD.Mk eo um kansasii 1| (bactérias) sintase ATCC 12478 policetíd Mycobacteri WP_03167773 Actinobactérias/corinebactérias PHLD.Mt eo um
8.1 (bactérias) sintase tuberculosis policetíd Gordonia WP_06617259 Actinobactérias/actinomycetale PHLD.Gh eo hydrophobic
0.1 s (bactérias) sintase a TABELA 2: SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNAS DAS POLICETÍDEO SINTASES DE TIPO
III PUTATIVAS IDENTIFICADAS SEQ ID NO: Nome Sequência de proteínas
TRHLAIDPLSDDFADFSARPDTIRQRMDLYFEHAAPLAIE SEQ ID NO: PHLD.Tp TARRALGAVDATEVGQLIFVTSTGFLAPGVDVAVTRSLGL 1
APGVDVAVIRALGLAPQTSRVVINFMGCAAAMNALRVST SEQ ID NO: PHLD.Tt DYVRAHPDRKSLMICLELSSVNAVFSGDPNDVVISSLFA 2
VDPADVGQLVFVTSTGFLAPGVDVAVIRALGLSPGTSRV SEQ ID NO: PHLD.Tp VINFMGCAAAMNALRVSTDYVRAHPDRKSLMICLELSSV 3 s NAVFSGDPNDVVISSLFADGCGAALIGASEVGHPLPAGN
TYGQAESADRVAARFDDPRQAERIRRVYAKTRVTERHL SEQ ID NO: PHLD.Tp
AIDPLTPEFAEFSARPDTVRERMDLFFEHAAPLAIETARR 4 u
RVIVNFMGCAAAMNALRVASDFVRAHPDRKSLMVCLEL SEQ ID NO: PHLD.Ts
SSVNAVFSGDPNDVVISSLFADGCGAAVIGASEVGHPLP 5 p
VDVAVLRELGLVPTVGRVVVNFMGCAAAMNGIRTGVDY SEQ ID NO: PHLD.Nf VRAHPDKKALVVCLELSSVNAVFADDVNDVIIHSLFGDG 6
7 ma TGAPQRVVAQADAAARVSELFVDPQQRERISRIYDKTRI
DVAIVKELGLSRAISRVVVNFMGCAAAMNAIRTATNYVRA SEQ ID NO: PHLD.Mk HPAMKALVVCIELCSVNAVFDNAVKDVVIHSLFGDGCAA 8
LAVDVSKRALAGLPYRAAEIGLLVLATSTGFIAPGVDVAIV SEQ ID NO: PHLD.Mt KELGLSPSFGDGCAALVIGASQVQEKLEPGKVVVRSSF 9
TGFIAPGVDVAVITELGLAPTVHRVIINFMGCAAAINGISTA SEQ ID NO: TDHVRANPDSRALLICLELSSVNAVFGADPVELVTHSLF PHLD.Gh 10 GDGCGAMLIGASPVGRRLAPGQLVVRDTFSHLFHDTGD
[00122] A Figura 1 apresenta o alinhamento das sequências de proteínas das enzimas candidatas listadas na Tabela 1. O alinhamento das dez enzimas candidatas selecionadas com a enzima PKS1.Es foi executado com o uso do software Clustal W.
[00123] A Tabela 3 apresenta a matriz das identidades de sequência que existem entre essas várias enzimas candidatas e PHLD.Pf e PKS1.Es. TABELA 3: MATRIZ DAS IDENTIDADES DE SEQUÊNCIA QUE EXISTEM ENTRE AS VÁRIAS ENZIMAS CANDIDATAS. PHLD,Mma PHLD,Tpu PHLD,Tps PHLD,Tsp PHLD,Gh PHLD,Mk PHLD,Tp PHLD,Mt PKS1,Es PHLD,Nf PHLD,Pf PHLD,Tt PHLD,Tt ID 74,7 84,2 85,4 75,7 58,2 55,8 55,3 44,6 55,8 19,3 36,3 PHLD,Tp 74,7 ID 76,3 76 76,5 55,4 55 54,7 42,7 58,4 21,3 34 PHLD,Tps 84,2 76,3 ID 87,2 77,9 57,6 57,7 56,3 45,2 58,3 20,4 37,3 PHLD,Tpu 85,4 76 87,2 ID 76,8 57,8 56,2 54,7 44,7 58,9 20,3 37 PHLD,Tsp 75,7 76,5 77,9 76,8 ID 56 56,3 55 45,3 54,8 19,9 35 PHLD,Nf 58,2 55,4 57,6 57,8 56 ID 67,5 67,2 55,5 55,7 19,1 35,9
PHLD,Mm 55,8 55 57,7 56,2 56,3 67,5 ID 82,7 65,6 54,9 19,9 35,8 a PHLD,Mk 55,3 54,7 56,3 54,7 55 67,2 82,7 ID 66 52,8 19 35,4 PHLD,Mt 44,6 42,7 45,2 44,7 45,3 55,5 65,6 66 ID 44,3 15,1 27,7 PHLD,Gh 55,8 58,4 58,3 58,9 54,8 55,7 54,9 52,8 44,3 ID 21,1 35,9 PHLD,Pf 19,3 21,3 20,4 20,3 19,9 19,1 19,9 19 15,1 21,1 ID 23,1 PKS1,Es 36,3 34 37,3 37 35 35,9 35,8 35,4 27,7 35,9 23,1 ID
[00124] Os resultados mostram que a distância filogenética que existe entre as enzimas candidatas e a enzima bacteriana PHLD.Pf é considerável uma vez que menos do que 25% de identidade é observada entre esses dois grupos. Não é, por conseguinte, possível atribuir, a priori, uma função de floroglucinol sintase às policetídeo sintases putativas estudadas, devido a essa forte divergência de sequência.
1.2. MEDIÇÃO DAS ATIVIDADES DA FLOROGLUCINOL SINTASE EM LEVEDURAS
[00125] A fim de identificar as floroglucinol sintases entre os candidatos identificados acima, um método de extrair e testar o floroglucinol foi desenvolvido conforme detalhado abaixo.
1.2.1. MÉTODO DE EXTRAÇÃO DE FLOROGLUCINOL
[00126] O método foi desenvolvido usando o resorcinol como padrão interno. Vários testes resultaram no desenvolvimento de um método de extração líquido-líquido executado a pH 4,0 na presença de acetato de etila como solvente, e por saturação da fase aquosa com NaCl. A extração é executada por 30 min com agitação circular. A fase orgânica é removida e o solvente acetato de etila é evaporado sob um fluxo de nitrogênio N2 a 30 °C. O extrato seco obtido após a completa evaporação é em seguida absorvido em um predeterminado volume de uma mistura a 50% - 50% de etanol/H2O.
[00127] O rendimento de extração foi medido por espectrometria de massa após cromatografia de alta pressão em uma coluna C18 (dimensões: 100 mm × 2,1 mm; tamanho de partícula: 1,7 µm) com o uso de um gradiente de ácido metanoico (HCOOH)/acetonitrila (ACN) a 0,03%.
[00128] Os rendimentos de extração foram determinados com o uso de soluções de floroglucinol e o resorcinol preparadas no meio de cultura usado para o cultivo das leveduras. As concentrações de floroglucinol correspondem aos pontos de fundo (20 μg.ml-1) e topo (200 μg.ml-1) da faixa de ensaio. A concentração de resorcinol corresponde à concentração adicionada como padrão interno durante os ensaios (200 μg.ml-1). Os resultados são apresentados na Tabela 4. TABELA 4: RENDIMENTO DE EXTRAÇÃO PARA FLOROGLUCINOL (20 E 200 µg.ml-1) E PARA RESORCINOL (200 µg.ml-1), EXTRAÍDO COM ACETATO DE ETILA,
DE ACORDO COM O MÉTODO DESCRITO Produto Floroglucinol Resorcinol (EI) Concentração de floroglucinol ou de 20 200 200 resorcinol no meio de cultura (μg.ml-1) RND (%) 76 89 82
1.2.2. DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO DE ANÁLISE UPLC/UV E UPLC/MS
[00129] Um método de análise por cromatografia UPLC e absorvância UV (radiação ultravioleta) medida foi desenvolvido. O extrato é cromatografado em uma coluna de pentafluorofenil propila (PFP) que tem as dimensões de 100 mm x 2,1 milímetro; tamanho de partícula: 1,8 µm, de acordo com um gradiente de HCOOH/ACN a 0,1% - HCOOH a 0,1%. O floroglucinol é detectado por UV a 230 nm. Um método de espectrometria de massa UPLC (UPLC/Massa) também foi desenvolvido.
[00130] A quantificação é realizada com o uso de uma faixa de 20 a 200 μg.ml-1 de floroglucinol diluído em meio de cultura de levedura (Extrato de Levedura 1%, bactopeptona a 2%) na presença de uma quantidade fixa de resorcinol, usados como interno padrão. A quantidade de floroglucinol é determinada por meio do cálculo das razões superficiais dos picos de cromatografia de floroglucinol/resorcinol.
[00131] A Figura 2 apresenta um exemplo de picos de cromatografia em floroglucinol/resorcinol obtidos em uma coluna de PFP.
[00132] Esse método de ensaio, assim, possibilita de forma confiável medir, qualitativa e quantitativamente, o floroglucinol presente em uma amostra.
[00133] O método de espectrometria UPLC-massa (UPLC/massa) possibilita analisar as amostras contendo uma concentração de floroglucinol que varia de 2 a 50 μg.ml-1. EXEMPLO 2: IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS FLOROGLUCINOL SINTASES
2.1. EXPRESSÃO DOS GENES CANDIDATOS NA LEVEDURA SACCHAROMYCES
[00134] Os 10 genes candidatos (PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD.Mk, PHLD.Mt e PHLD.Gh) selecionados e descritos acima, e também os genes PHLD.Pf e PKS1.Es que codificam as duas floroglucinol sintases identificadas até o presente momento, usadas como controles (consulte as Tabelas 1 e 2), foram sintetizados por adaptação dos códons usados para expressão ótima em na levedura de S. cerevisiae.
[00135] Essa adaptação de códon foi executada a fim de otimizar a expressão desses genes diferentes nas células de levedura (esses 12 genes sintéticos codificam proteínas estritamente idênticas às proteínas expressas pelos organismos de origem). Cada um desses genes foi colocado sob o controle do mesmo promotor de levedura ADH2 (pADH2) que permite a sua expressão, em particular quando o meio de cultura contiver etanol como fonte de carbono. O terminador de transcrição do gene de levedura RPL3 (TRPL3) foi colocado a jusante de cada um dos 12 genes colocados sob o controle do promotor ADH2.
[00136] A Figura 3 mostra um exemplo de uma unidade de gene assim construída para um candidato ou um determinado controle (PHLD.ii).
[00137] As várias unidades genéticas assim construídas foram independentemente integradas ao locus URA3 do genoma de uma cepa do tipo selvagem de levedura de S. cerevisiae. A cepa do tipo selvagem usada é a cepa comercial W303 (genótipo: MAT-a, his3, leu2, trp1, ura3, ade-). A técnica de integração usada permite a integração de um número variável de cópias de cada unidade genética. Para cada construto, o número de cópias das unidades genéticas integradas foi determinado por PCR quantitativa de acordo com o método convencional de Taqman.
[00138] As cepas de levedura que expressam diferentes números de cópias de cada um dos 10 genes candidatos PHLD.ii ou dos genes de controle PHLD.Pf e PKS1.Es descritos acima foram cultivadas na presença de 20 g.l-1 de etanol como fonte de carbono por 48 horas a 30 °C. As 12 cepas de levedura independentemente obtidas após transformação e integração, no locus URA3 das unidades genéticas descritas acima foram, portanto, analisadas quanto à sua capacidade de produzir floroglucinol. A cepa parental do tipo selvagem W303 foi cultivada sob as mesmas condições e usada como um controle.
[00139] As densidades ópticas (DO) das várias culturas foram medidas a 600 nm (DO600), assim indicando o nível de crescimento de cada cepa (Figuras 4A e B).
[00140] A capacidade das várias cepas de levedura que expressam os diferentes genes PHLD.ii sob o controle do promotor ADH2 para sintetizar floroglucinol foi testada com o uso do método de extração e ensaio desenvolvido como descrito na seção 1.2 acima. O nível de produção de floroglucinol (em mg.l-1) foi medido no meio de cultura (Figuras 4A e C).
[00141] A Figura 4 mostra que todas as cepas que expressam diferentes números de cópias dos genes PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD.Mk, PHLD.Mt e PHLD.Gh produzem uma quantidade significativa de floroglucinol que é excretada para o meio de cultura (Figuras 4A, C e D). Esses resultados, assim, indicam que cada um de esses 10 genes expressa uma floroglucinol sintase que é ativa em levedura.
[00142] Além disso, como esperado, a não produção de floroglucinol foi medida na cepa parental de controle W303 (dados não mostrados).
[00143] Assim, esse estudo funcional tornou possível identificar dez novas floroglucinol sintases, codificadas respectivamente pelos genes PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD.Mk, PHLD.Mt e PHLD.Gh. Esse estudo revela pela primeira vez que bactérias Gram+, em particular, bactérias actinomicetos codificam floroglucinol sintases funcionais (PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD. Mk, PHLD.Mt e PHLD.Gh).
[00144] Esse estudo também revela pela primeira vez que a enzima PKS1.ES é funcional quando a mesma é expressa em um sistema eucariota heterólogo, ou seja, levedura. Esse estudo também revela, inesperadamente, que PHLD.Pf não codifica uma floroglucinol sintase que é funcional em leveduras. Esse resultado é surpreendente uma vez que a enzima codificada por PHLD.Pf exibe uma atividade de floroglucinol sintase demonstrada quando a mesma é expressa em Escherichia coli (Achkar et al., 2005).
2.2. EXPRESSÃO DOS GENES CANDIDATOS NA LEVEDURA DE
[00145] A produção de floroglucinol por cepas que têm integrada apenas uma única cópia do gene candidato PHLD selecionado e identificado como sendo funcional na levedura (consulte os resultados da seção precedente e Figura 4) foi também avaliada. O gene PKS1.Es que codifica floroglucinol sintase que é funcional em leveduras de acordo com os resultados descritos na seção 2.1 acima foi usado como controle positivo. O gene PHLD.Pf que codifica floroglucinol sintase que é não funcional em leveduras de acordo com os resultados descritos na seção 2.1 acima foi usado como controle negativo.
[00146] Cada um desses genes foi colocado quer sob o controle do promotor de levedura ADH2 (pADH2), que permite a sua expressão em particular quando o meio de cultura contém etanol como fonte de carbono, quer sob o controle do promotor de levedura CCW12 (pCCW12), que permite sua expressão, em particular durante a glicólise, quando o meio de cultura contém glicose como fonte de carbono. O terminador de transcrição do gene de levedura RPL3 (TRPL3) foi colocado a jusante de cada um dos construtos.
[00147] Os detalhes dos vários construtos genéticos produzidos são relatados na Figura 5.
[00148] As cepas de levedura que expressam uma única cópia de PHLD ou de PKS1 foram cultivadas na presença de 20 g.l-1 de etanol como fonte de carbono (construtos controlados por pADH2) ou na presença de 20 g.l-1 de glicose (construtos controlados por pCCW12) por 48 horas a 30 °C (Figuras 6 e 7). As cepas foram cultivadas e analisadas quanto à sua capacidade de produzir floroglucinol.
[00149] As densidades ópticas das várias culturas foram medidas a 600 nm (indicando o nível de crescimento de cada cepa, Figuras 6A e B e Figuras 7A e B) e a produção de floroglucinol (em mg.l-1) foi medida em o meio de cultura, para 2 transformantes independentes para cada construto (Figuras 6A e C e Figuras 7A e 9C).
[00150] A Figura 6 (A e C) mostra que as cepas que expressam uma única cópia dos genes PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD. mk, PHLD.Mt ou PHLD.Gh sob o controle do promotor ADH2 sintetizam uma quantidade mensurável e significativa de floroglucinol que é excretada para o meio de cultura, na presença de etanol como de fonte de carbono.
[00151] Para as culturas executadas na presença de glicose como fonte de carbono, todas as cepas que expressam uma única cópia dos genes PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD.Mk, PHLD.Mt e PHLD.Gh sob o controle do promotor CCW12 sintetizam floroglucinol, em uma quantidade que é comparável para as culturas executadas na presença de etanol como fonte de carbono (Figuras 7A e C)
[00152] Os resultados obtidos acima confirmam os resultados obtidos nas cepas que contêm várias cópias dos floroglucinol sintases descritas na seção 2.1 acima. Assim, a expressão das enzimas candidatas PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Nf, PHLD.Mma, PHLD.Mk, PHLD.Mt e PHLD.Gh resultou na produção significativa de floroglucinol pelas leveduras células. Esses resultados mostram que esses genes codificam as floroglucinol sintases e que essas floroglucinol sintases são ativas nas células de levedura.
[00153] Esses resultados adicionalmente mostram que os níveis de produção de floroglucinol são elevados, mesmo quando uma única cópia do gene que codifica a floroglucinol sintase é expressa.
[00154] Esses resultados são as primeiras manifestações da existência de uma atividade de floroglucinol sintase nas bactérias do tipo gram+.
[00155] De maneira mais geral, os resultados mostram que as enzimas candidatas do PHLD.ii testadas exibem uma atividade que, em geral, é maior do que as únicas duas floroglucinol sintases conhecidas antes deste estudo, ou seja, as enzimas de E. siliculosus e P. fluorescens. As enzimas candidatas de PHLD do gênero Tsukamurella (PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Tp) são particularmente ativas quando as mesmas são expressas em levedura. De fato, a produção de floroglucinol padronizada pelo número de cópias demonstra que as enzimas de Tsukamurella testadas (PHLD.Tp, PHLD.Tt, PHLD.Tpu, PHLD.Tps e PHLD.Tsp) têm uma atividade de floroglucinol sintase que é pelo menos 10 vezes mais elevada de que a enzima PKS1 de Ectocarpus siliculosus no sistema de expressão em levedura testado aqui. De acordo com esses resultados, a enzima PHLD.Tpu parece, em particular, ser a enzima mais ativa, sob as diferentes condições testadas.
[00156] As três enzimas PHLD.Mma (de Mycobacterium marinum), PHLD.Nf (de Nocardia farcinica) e PHLD.Gh (de Gordonia hydrophobica) também são significativamente muito ativas.
[00157] A presente invenção fornece, assim, várias novas vias originais e vantajosas para a biossíntese de floroglucinol em leveduras.
2.3. OBSERVAÇÕES ADICIONAIS
[00158] O estudo realizado pelos inventores e relatado aqui possibilitou identificar 10 novas enzimas que têm uma atividade de floroglucinol sintase. Essas 10 novas floroglucinol sintases são provenientes de bactérias gram+ da ordem Actinomycetales, incluindo o gênero Tsukamurella (PHLD.Tt, PHLD.Tps, PHLD.Tpu, PHLD.Tsp, PHLD.Tp), o gênero Nocardia (PHLD.Nf); o gênero Mycobacterium (PHLD.Mma, PHLD.Mt e PHLD.Mk) e o gênero Gordonia (PHLD.Gh) e nunca haviam sido descritas até agora como produtoras de floroglucinol.
[00159] Esses resultados, portanto, demonstram pela primeira vez e de forma inequívoca que é possível sintetizar floroglucinol em células de levedura.
[00160] É importante a observação de que o floroglucinol sintetizado é mais do que 95% segregado no meio de cultura pelas células de leveduras. Essa secreção particularmente eficiente é muito favorável para a implantação de um processo de bioprodução de floroglucinol.
[00161] As floroglucinol sintases das bactérias actinomicetos do gênero Tsukamurella parecem ser as mais ativas de acordo com os resultados obtidos até o presente momento. Na verdade, os resultados obtidos mostram que as enzimas PHLD de Tsukamurella sp., expressas em células de levedura, são no mínimo, 10 vezes mais ativas do que a floroglucinol sintase da alga marrom Ectocarpus siliculosus da técnica anterior, sob as condições testadas.
[00162] As enzimas PHLD de Tsukamurella sp. podem, portanto, representar as enzimas de escolha para implantar um processo de bioprodução de floroglucinol na levedura S. cerevisiae.
[00163] Finalmente, as enzimas identificadas pelos inventores são originais em termos de espécies de origem e em termos de sequências de proteínas. De fato, é mostrado pela primeira vez que bactérias Gram+ codificam floroglucinol sintases funcionais. Além disso, a sequência de proteínas da enzima que é a mais ativa sob as condições experimentais testadas pelos inventores, PHLD.Tpu de Tsukamurella pulmonis, difere significativamente da sequência da enzima PKS1.Es conhecida de Ectocarpus siliculosus (diferença de mais do que 63%, Tabela 3).
REFERÊNCIAS DA LITERATURA Achkar J et al., (2005) “Biosynthesis of phloroglucinol” J Am Chem Soc. 127:5.332 a
5.333. Meslet-Cladière L, Delage L, Leroux CJ, Goulitquer S, Leblanc C, Creis E, Gall EA, Stiger-Pouvreau V, Czjzek M, e Potin P. (2013) “Structure/function analysis of a type III polyketide synthase in the brown alga Ectocarpus siliculosus reveals a biochemical pathway in phlorotannin monomer biosynthesis.” Plant Cell. 25:3.089 a 3.103. Zha W, Rubin-Pitel SB e Zhao H. (2006) “Characterization of the substrate specificity of PHLD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens.” J Biol Chem. 281:32.036 a 32.047
Claims (15)
1. Uso caracterizado por ser de pelo menos um polipeptídeo escolhido dentre policetídeo sintases do tipo III de bactérias, como o floroglucinol sintase, com a exclusão da policetídeo sintase do tipo III de Pseudomonas fluorescens PHLD.Pf.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo é escolhido dentre as policetídeo sintases do tipo III das bactérias actinomicetos.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 50% de identidade com uma sequência escolhida dentre SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que as ditas bactérias actinomicetos Gram+ são escolhidas do grupo que consiste de Tsukamurella sp., Nocardia sp., Mycobacterium sp e Gordonia sp., em particular, Tsukamurella pulmonis, Tsukamurella paurometabola Tsukamurella tyrosinosolvens, Tsukamurella pseudospumae, Tsukamurella sp. 1534, Nocardia farcinica, Mycobacterium marinum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium tuberculosis e Gordonia hydrophobica.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 60% de identidade, com mais preferência pelo menos 65% de identidade, com mais preferência pelo menos 70% de identidade, ainda mais de preferência pelo menos 75% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 80% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 85% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 90% de identidade, com mais preferência pelo menos 95% de identidade, com mais preferência pelo menos 96% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 97% de identidade, ainda com mais preferência pelo menos 98% de identidade e ainda com mais preferência pelo menos 99%
de identidade, com uma sequência escolhida dentre SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 1, SEQ No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos escolhida dentre SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 e SEQ ID No: 10.
7. Molécula de ácido nucleico isolada caracterizada por compreender pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e que compreende ainda um promotor que controla a expressão da dita pelo menos uma sequência de ácido nucleico.
8. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor exógeno, em particular um promotor de levedura.
9. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um terminador de transcrição ou a dita sequência de ácido nucleico, de preferência um terminador exógeno, como um terminador de levedura.
10. Vetor caracterizado por compreender pelo menos uma molécula de ácido nucleico, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o dito vetor é, de preferência, um plasmídeo.
11. Célula hospedeira caracterizada por compreender pelo menos uma molécula de ácido nucleico, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, ou pelo menos um vetor, do tipo definido na reivindicação
10.
12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é um micro-organismo selecionado dentre bactérias, leveduras, fungos, algas e cianobactérias, de preferência uma levedura, em que a dita levedura é, em particular, selecionada dentre Saccharomyces, Candida, Ashbya, Dekkera, gêneros Pichia
(Hansenula), Debaryomyces, Clavispora, Lodderomyces, Yarrowia, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces, Brettanomycces, Cryptococcus e Malassezia; mais particularmente dentre as espécies de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces bayanus, Zigosaccharomyces bailii, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera brucelensis, Dekkera intermedia, Brettanomycces custersii, Brettanomycces intermedius, Kluyveromyces themotolerens, Torulaspora globosa ou Torulaspora glabrata; ainda mais particularmente, a levedura é do gênero Saccharomyces, de preferência das espécies Saccharomyces cerevisiae.
13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma cópia da dita molécula de ácido nucleico é integrada ao genoma da dita célula hospedeira.
14. Método para a produção de floroglucinol caracterizado por compreender as etapas que consistem em: (i) colocar uma célula hospedeira que expressa o polipeptídeo com atividade da floroglucinol sintase, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, por exemplo, uma célula hospedeira, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em contato com um substrato adequado; (ii) cultivar, in vitro, a célula hospedeira da etapa (i) sob condições que permitem o crescimento da dita célula hospedeira e/ou a expressão da molécula de ácido nucleico contida na dita célula hospedeira, de modo a produzir floroglucinol; (iii) opcionalmente, recuperar o meio de cultura que compreende o floroglucinol, obtido após a etapa (ii); e (iv) opcionalmente, purificar o floroglucinol a partir do meio de cultura da etapa (iii).
15. Método para a produção de floroglucinol caracterizado por compreender pelo menos as etapas que consistem em: (i) colocar pelo menos um polipeptídeo, do tipo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em contato com um substrato adequado; (ii) incubar a mistura resultante da etapa (i) sob condições adequadas para a produção de floroglucinol; (iii) opcionalmente, recuperar o meio de reação que compreende o floroglucinol, obtido após a etapa (ii); e (iv) opcionalmente, purificar o floroglucinol a partir do meio de reação da etapa (iii).
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