CN112029780B - 一种丹参转录因子SmNAC78基因及其表达载体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个丹参NAC转录因子SmNAC78基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；以及丹参NAC转录因子SmNAC78蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过SmNAC78转录因子克隆及功能验证证明SmNAC78转基因后能够通过促进丹参酮合成途径关键酶基因高表达，进一步提高丹参酮合成的产量。本发明对阐明丹参酮生物合成的调控机制提供了分子基础，为利用代谢工程手段提高丹参酮类化合物产量提供基因资源，具有重大的应用价值。

Description

一种丹参转录因子SmNAC78基因及其表达载体的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，更具体地，涉及一种丹参转录因子SmNAC78基因及其表达载体的应用。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草属多年生草本药用植物，是我国常用的中药材，用药历史悠久，在我国作为药用已有2000多年的历史，以根大肥厚显朱红色得名，常以干燥根及根茎入药。丹参的有效活性成分之一是脂溶性二萜丹参酮类化合物，其主要包括：二氢丹参酮I，丹参酮I，丹参酮IIA，隐丹参酮。丹参临床上广泛用于治疗心脑血管***疾病，还具有抗肿瘤，抗菌，抗炎，保护器官等作用。以丹参为主要组成的药品种类较多，如复方丹参滴丸，丹参酮片，丹参酮IIA磺酸钠注射液，丹参舒心胶囊等。随着我国心脑血管患者的增多，丹参药材市场需求量将不断增加，目前市场需求量已增至2万吨。近年来随着丹参栽培种植面积不断扩大，连作障碍问题突出，导致其生长慢，有效成分含量低，种质资源退化等现象，严重影响市场需求。因此，通过代谢工程和生物合成调控手段提高丹参活性成分含量来解决丹参供不应求的问题成为国内外研究热点。

丹参药用成分含量是丹参药材品质的评价标准，2015版《药典》规定，药材含丹参酮IIA，隐丹参酮和丹参酮的总量不得少于0.25％。据统计，不同产地之间的丹参酮类成分含量差异大，很多产地丹参酮含量都达不到药典标准。药效成分合成的根源是受到遗传和环境等因素共同调控的，其在响应不同环境条件时，通过植物体内的信号转导因子(转录因子或信号蛋白等)调控丹参酮合成途径基因的表达，进而影响丹参酮含量。为保证丹参药材质量，同时在体外提高丹参酮产量，挖掘关键调控基因至关重要。

目前，丹参酮的分子形成机制一直是国内外研究热点，为了大量获得活性丹参酮类化合物以及从源头控制中药材的质量，有必要解析丹参酮类化合物的生物合成途径调控网络。已有技术表明，NAC家族转录因子SmNAC36能够通过结合丹参酮合成途径关键酶基因来促进丹参酮的合成(CN110616224A)。但目前还未发现SmNAC78基因能够参与调控丹参酮的生物合成。

发明内容

本发明在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高丹参中丹参酮含量的方法。本发明证明丹参转录因子SmNAC78基因能够正向调控丹参酮的生物合成，增加丹参酮活性成分的含量，为提高丹参酮产量提供了新的途径，对解决丹参酮药源紧缺具有十分重要的意义。

本发明的第一个目的在于提供一个促进丹参酮生物合成的丹参转录因子SmNAC78基因。

本发明的第二个目的在于提供一种丹参转录因子SmNAC78蛋白。

本发明的第三个目的在于提供一种含有所述丹参转录因子SmNAC78基因的重组载体和重组菌株。

本发明的第四个目的在于提供一种提高植物中丹参酮含量的方法。

本发明的第五个目的在于提供所述丹参转录因子SmNAC78基因和丹参转录因子SmNAC78蛋白在促进丹参酮生物合成中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

首先在丹参的全基因组数据中筛选出一个NAC转录因子SmNAC78基因，在此基础上克隆SmNAC78基因，利用过表达与沉默技术下研究SmNAC78对丹参酮合成的调控作用，并通过酵母单杂交技术和转录激活实验来揭示其调控机制。

因此，本发明要求保护一个促进丹参酮生物合成的丹参转录因子SmNAC78基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还要求保护一种促进丹参酮生物合成的丹参转录因子SmNAC78蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还要求保护一种重组载体。

优选地，所述重组载体含有核苷酸序列为SEQ ID NO：1的丹参转录因子SmNAC78基因。

优选地，所述重组载体为表达载体。

优选地，所述表达载体为pK7WG2D。

并要求保护一种含有上述重组载体的重组菌株。

因此，所述的重组载体或重组工程菌的任一种或两种在提高植物中丹参酮含量中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还要求保护一种提高植物中丹参酮含量的方法，具体地，在植物中过表达所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1的丹参转录因子SmNAC78基因。

优选地，所述植物为丹参。

优选地，一种提高丹参中丹参酮含量的方法，其主要步骤为：

把含有丹参转录因子SmNAC78基因的重组载体构建到植物表达载体上获得SmNAC78基因过表达载体，将SmNAC78基因过表达载体转入菌株获得转染重组菌株；利用重组菌株转化浸染丹参外植体，获得阳性转化丹参。

优选地，含有丹参转录因子SmNAC78基因的重组载体的构建方法为：利用基因克隆方法获得丹参SmNAC78基因正确序列，构建pLB克隆载体。

优选地，基因克隆方法采用的引物序列为：

F：ATGGAGGGGTCAGGAAGTCCAGT；

R：TCAATAAGAAGGCCAGTAGTTATCC。

优选地，构建的pLB克隆载体为pLB-SmNAC78。

优选地，SmNAC78基因过表达载体的构建方法为：采用Gateway***将pLB克隆载体构建到植物表达载体上获得SmNAC78基因过表达载体。

优选地，构建的植物表达载体为pK7WG2D-SmNAC78。

优选地，重组菌株的构建方法为：将SmNAC78基因过表达载体转入农杆菌获得转染重组农杆菌。

优选地，获得阳性转化丹参的方法为：利用上述重组农杆菌瞬时转化浸染丹参外植体，获得阳性转化丹参毛状根。

优选地，将上述获得的阳性丹参毛状根培养后进行化合物提取，检测丹参酮含量，筛选出丹参酮积累增多的株系。

优选地，上述阳性丹参毛状根的培养时间为一个半月，检测方法为液相色谱-质谱联用(LC-MS)。

进一步优选地，还包括对SmNAC78转录因子功能的验证，其验证方法包括以下步骤：

S1.采用同源重组方法构建亚细胞定位表达载体，瞬时转化拟南芥原生质体，确定丹参SmNAC78转录因子在细胞中的定位；

S2.采用同源重组方法构建酵母表达载体转化酵母，检测丹参SmNAC78转录因子激活作用。

优选地，步骤S1中构建的亚细胞定位载体为PBI221-GFP-SmNAC78。

优选地，步骤S2中构建的真核表达载体为pGBKT7-SmNAC78。

同时，本发明要求保护所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1的丹参转录因子SmNAC78基因在促进丹参酮生物合成中的应用。

本发明还要求保护所述氨基酸序列为SEQ ID NO：2的丹参转录因子SmNAC78蛋白在促进丹参酮生物合成中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明公开了SmNAC78转录因子克隆及功能验证的一整套完善体系，证明SmNAC78能够正向促进丹参酮的合成，可通过基因工程技术手段促进丹参酮产量的提高，具有重大的应用价值。

附图说明

图1为SmNAC78基因扩增PCR产物电泳检测图。

图2为SmNAC78转录因子在各个器官组织中的表达量差异分析(其中R表示根；S表示茎；L表示叶；F表示花；R1表示周皮；R2表示木质部；R3表示韧皮部)。

图3为转基因毛根提取液(A)和毛根表型(B)的示意图。

图4为过表达SmNAC78株系与对照株系(PKoe)中丹参酮类化合物含量差异结果图。

图5为过表达SmNAC78株系与对照株系(PKoe)相比上游关键酶基因(A)、下游关键酶基因(B)表达量差异结果图。

图6为SmNAC78亚细胞定位结果图。

图7为SmNAC78转录激活结果示意图(1表示阳性对照；2表示pGBKT7-SmNAC78；3表示阴性对照)。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1丹参转录因子SmNAC78基因克隆及表达量差异分析

一、丹参转录因子SmNAC78基因克隆

(一)实验方法

1、PCR产物扩增

本实验使用苏州东胜兴业科学仪器有限公司基因扩增仪，使用诺唯赞生物科技有限公司的高保真酶，以丹参cDNA为模板，引物稀释至10μM，扩增引物序列为：

F：ATGGAGGGGTCAGGAAGTCCAGT；

R：TCAATAAGAAGGCCAGTAGTTATCC。

反应体系及程序如下：

(1)在冰上配制下列反应混合液：

表1 PCR扩增体系

(2)反应程序：

表2 PCR扩增程序

2、PCR产物纯化

参照生工生物工程(上海)股份有限公司柱式胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行纯化，但略有改动，具体步骤如下：

(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。

(2)根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300～600μL的比例加入Buffer B2。

(3)将离心管置于50℃水浴5～10min，期间上下颠倒，直至胶块完全溶化。

(4)(可选步骤)当目的片段<500bp时，加入所使用的Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀。当目的片段≥500bp时，此步骤可以省略直接进行步骤(5)。

(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(6)向吸附柱中加入300μL Buffer B2，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(7)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中(注：Wash Solution请检查是否已加入适量的无水乙醇)。

(8)重复步骤(7)一次。将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。

(9)在吸附膜中央加入15～40μL Elution Buffer，室温静置1～2min，9000g离心1min。将所得到的DNA溶液放于-20℃保存或用于后续试验。

3、目的片段与pLB克隆载体连接

参照天根生化科技有限公司的pLB零背景快速克隆试剂盒说明书进行连接反应。但略有改动，具体步骤如下：

(1)按照以下顺序及体积在200μL离心管中加入以下成分。

表3 pLB克隆载体连接反应体系

(2)轻弹离心管以混和均匀反应液，短暂离心3～5s。

(3)将混合后的反应液放置干式恒温仪(金属恒温器)上22℃反应5min。反应结束后，将离心管立即置于冰上，进行后续的转化反应。

4、大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备与转化

本过程参照北京全式金生物技术有限公司感受态细胞制作与转化操作说明书，但略有改动，具体步骤如下：

(1)将从北京全式金生物技术有限公司购买的DH5α于LB固体培养基三线法活化，倒置于隔水式恒温培养箱37℃培养12～16h。

(2)挑单克隆于500μL(8个)无抗性的LB液体培养基中小摇37℃，200rpm约4h。

(3)以1:50，1:75，1:100比例分别接种于3瓶50mL无抗性的LB液体培养基里大摇37℃，200rpm培养1～2h，期间用紫外分光光度计间断性检测OD600值。选取培养时间为80～100min，OD600＝0.4～0.6之间的菌，进行后续操作。

(4)将菌液在双人超净台内分装于2个已预冷的50mL离心管中，于4℃，3500rpm离心集菌7min。

(5)用10mL预冷无菌的0.1M MgCl₂重悬菌体，4℃，3500rpm集菌7min，弃上清。

(6)加入10mL预冷无菌的0.1M CaCl₂重悬菌体(缓慢轻柔)，冰上静置30min，后于4℃，3500rpm集菌7min，弃上清。菌体用2mL预冷无菌的0.1M CaCl₂(含18％甘油)重悬菌体(缓慢轻柔)。

(7)最后每管100μL分装于预冷的无菌1.5mL离心管中，液氮速冻，于-80℃冰箱保存。

(8)制备工作浓度为100μg/mL载体对应抗性的LB琼脂糖平板。将平板放置在37℃，提前预热20min。

(9)取2.5～5μL连接产物加到100μL DH5α大肠杆菌感受态细胞中，轻弹混匀，冰上静置30min。

(10)将离心管置于42℃恒温水浴锅热激90s，取出离心管管后立即置于冰上中静置2min，其间不要晃动离心管。

(11)向离心管中加入500μL 37℃预热的无抗性的LB液体培养基，放于恒温培养摇床200rpm，37℃培养40～60min，使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

(12)在小型快速离心机中4000rpm离心2min，弃部分上清，用剩下的上清重悬菌液，全部吸取于含载体对应抗性的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞涂布。待平板表面干后，倒置平板于隔水式恒温培养箱37℃培养12～16h。

5、阳性克隆筛选

对转化后的大肠杆菌挑取部分单克隆，进行阳性克隆筛选，阳性克隆筛选参照唯赞生物科技有限公司的Taq酶使用说明书，略有改动，具体操作如下：

(1)挑取转化平板上的单克隆(6～12个)于500μL LB+载体对应抗性液体培养基中200rpm，37℃振荡培养5h，并编号。取1μL菌液作为PCR模板。

(2)在EP管中配置所需体积的反应体系(表4)，然后进行分装9μL/PCR管。

表4 PCR反应体系

(3)反应程序：

表5 PCR反应程序

(4)取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并挑选3个阳性克隆送测，测序均由生工生物工程上海股份有限公司测序，引物采用克隆载体或表达载体的通用引物。

(5)测序结果用MEGA5分析，通过与目的基因转录组序列比较，对测序正确的阳性克隆进行保菌，提质粒，400μL菌液加入400μL 30％甘油，用移液枪吹打混匀，放入液氮中速冻，长期保存于-80℃冰箱。

6、质粒提取

参照生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒说明书，将含有目的基因正确序列的重组载体的大肠杆菌菌株划线培养，挑取单克隆于50mL含有载体对应抗性LB液体培养基的锥形瓶中培养，处于生长平台期的菌体用于提取质粒。略有改动，具体步骤如下：

(1)每次使用前应检查Buffer P2和Buffer P3是否出现沉淀，如果有沉淀，请于37℃溶解沉淀，待冷却至室温后使用。

(2)对于高拷贝质粒，取1.5～5ml菌液，于小型高速离心机中8000g离心2min收集菌体，倒尽或吸干培养基。

(3)在菌体沉淀中加入250μL Buffer P1，吹打或振荡至彻底悬浮菌体。

(4)加入250μL BufferP2，立即温和颠倒离心管5～10次以混匀，室温静置2～4min。裂解时间与菌量相关，菌量多则适当延长时间，但最长不能超过5min。

(5)加入350μL BufteP2，立即温和颠倒离心管5～10次充分湿匀。

(6)样品于小型高速离心机最大转速12000g离心5～10min，将上清全部小心移入吸附柱，9000g离心30s。例掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(7)(可选步骤)在吸附柱中加入500μL去蛋白液Buffer DW1，9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

(8)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中(注：Wash Solution首次使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇)。

(9)重复步骤(8)一次。

(10)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min(注：此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验)。

(11)在吸附膜中央加入50～100μL Elution Bufer室温静置1～2min，9000g离心1min将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

(二)结果与分析

结果如图2所示，由凝胶电泳检测得到975大小的片段。将测序结果与基因组数据库得到的序列进行比对，结果一致，该基因长度为975bp，编码325个氨基酸的蛋白，将该基因命名为SmNAC78，核苷酸序列为如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列为如SEQ ID NO：2所示。

筛选出阳性克隆，经过序比对，序列正确，将携带阳性重组质粒的大肠杆菌扩繁并提取质粒。将质粒-20℃保存，重组质粒命名为pLB-SmNAC78。

二、丹参转录因子SmNAC78基因表达量差异分析

(一)实验方法

qRT-PCR检测：本实验使用QuantStudio5实时荧光定量PCR仪，使用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq II，具体反应体系及操作步骤如下：

(1)将cDNA模板稀释至50ng，引物稀释至10μM。

(2)在冰上按下表配置反应体系：

表6 qRT-PCR反应体系

(3)上机进行实时荧光定量PCR分析程序(两步法PCR扩增标准程序)：

Stage 1：预变性

Number of Cycle：1

95℃30s

Stage 2：PCR反应

Number of Cycle：40

95℃5s

60℃34s

Melt Curve Stage

(二)结果与分析

NAC转录因子SmNAC78开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)为975bp。为了获得正确序列，我们以丹参根cDNA为模板，设计基因克隆引物，使用基因特异性引物利用PCR手段进行候选基因克隆，获得目的条带(图1)，将目的条带构建到到pLB克隆载体后送公司测序，获得正确核酸序列。对SmNAC78在不同组织部位的表达进行分析(图2)，SmNAC78基因在各个组织部位的表达量的趋势与转录组结果一样，符合周皮＞韧皮部＞木质部的规律。

实施例2转基因SmNAC78毛状根株系的构建

一、实验方法

1、使用Gateway***构建过表达载体

过表达载体的构建采用Invitrogen的

Technology克隆***，用Gateway方法克隆，说明书略有改动。通过BP反应和LR反应分别将目的基因克隆到入门克隆载体pDONR221和植物过表达载体pK7WG2D。

(1)BP反应：以pLB-SmNAC78重组质粒为模板，使用带有attB位点引物，引物为：

F：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGAGGGGTCAGGAAGTCC；

R：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAATAAGAAGGCCAGTAGT。

与带有attP位点的pDONR221入门载体进行体外重组反应，产生入门克隆，BP反应体系为表7所示：

表7 BP反应体系

(反应条件：25℃过夜)

(2)将BP连接反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养12～16h后，挑取单克隆进行培养，进行菌液PCR，将阳性克隆子用M13通用引物测序，将测序成功的菌液提质粒用于下一步试验，并保菌。

(3)LR反应：将带有目的基因正确序列的质粒pDONR221-gene与带有attR位点的pK7WG2D进行体外重组反应，构建重组载体，LR反应体系为表8所示：

表8 LR反应体系

(反应条件：25℃过夜)

2、pK7WG2D-SmNAC78转化农杆菌ACC10060

制备农杆菌ACC10060感受态细胞，利用电击法将重组质粒转化农杆菌ACC10060，并保存菌种。步骤如下：

(1)将-80℃冰箱中保存的农杆菌菌种ACC10060在LB+Rif固体培养基上划线，于28℃培温箱中培养36h。

(2)待单克隆长出后，挑取接种于750μL LB+Rif液体培养基中，28℃，200rpm培养36h。

(3)取200μL菌液培养于200mL LB+Rif液体培养基中，28℃，200rpm培养OD600值至0.5～1.0之间，冰浴30min。

(4)用两个50mL离心管集菌，集菌两次。

(5)4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

(6)用25mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，4℃4000rpm离心10min，收集菌体，弃上清。

(7)用4mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，将两个管的菌液合并，4℃4000rpm离心10min，收集菌体，弃上清。

(8)用4mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，4℃4000rpm离心10min，收集菌体，弃上清。

(9)用2.5mL冰浴的10％甘油悬浮菌体，之后分装到1.5mL离心管中，每管100μL经液氮速冻后于-80℃保存备用。

(10)用1％的盐酸溶液浸泡电击杯内部10min，再用蒸馏水冲洗，之后用75％乙醇浸泡5min，置于空气中晾干。

(11)将电击杯冰浴后，向100μL农杆菌感受态细胞ACC10060中加入5μL pK7WG2D-SmNAC78质粒，轻轻吹吸2～3次，再转入电击杯中，盖上杯盖。

(12)选择细菌模式下“AGR”条件，迅速加入750μL LB液体培养基，28℃200rpm摇床中培养2～3h。

(13)取100μL培养好的菌液涂布于LB+Rif+Spec固体培养基上，倒置培养于28℃恒温箱中36h。

(14)待单菌落长出后，挑取接种于LB+Rif+Spec液体培养基中，28℃，200rpm摇床培养36h。

3、农杆菌介导的叶盘法侵染丹参

(1)外植体预培养：选取10天的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5×0.5cm²的小块，并用刀片将叶片表面划伤，以背面向上的方式将叶片置于1/2MS固体培养基上，于25℃左右光照16h/黑暗8h的条件下预培养2天。

(2)农杆菌的活化：

①晚上吸取100μL在-80℃冻存的农杆菌菌液加到5mL含有50mg/L Rif和50mg/LSpec的LB培养液里，28℃培养活化24h转速200rpm直至菌液浑浊。

②吸取上步100μL菌液加入5mL含50mg/L Rif和50mg/L Spec的LB的液体培养基中，于28℃振荡培养过夜转速200rpm。

③次日早上吸取上步4mL菌液加入40mL含50mg/L Rif和50mg/L Spec的LB的液体培养基中，于28℃振荡培养至OD600值在0.5左右(220rpm约2～6h，取决于吸取菌液的浓度)，将菌液倒入无菌离心管中，6000rpm离心10min，弃上清夜，用15～20mL的1/2MS液体培养基重悬沉淀菌体，用于浸染。

(3)浸染及共培养：将预培养材料放入1/2MS重悬液中浸染10min，取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的1/2MS固体培养基上黑暗中共培养48～72h。

(4)选择培养：

①将共培养的外植体用无菌水清洗3次(可选步骤)。

②400mg/L Carb水浸泡5min左右，(无菌水清洗1次，可选步骤)，吸干水分而后移入含50mg/L Kana(母液为50μg/μL)和400mg/L Carb(母液为400μg/μL)的1/2MS固体培养基上，于黑暗中进行筛选培养，每7天更换一次培养基。

③选择生长迅速长至2.0cm～3.0cm的抗性毛状根，将其切下，单独标号转入50mg/L Kana和400mg/L Carb和0.1mg/L IAA(母液为0.1mg/mL)的1/2MS固体培养基上，IAA可以刺激毛状根长愈伤组织，培养一周左右后，将阳性根转入含15mg/L Kana和200mg/L Carb的1/2MS培养基上恢复培养，此时毛根会长出许多侧根，有益于加快生长。

(5)液体培养：经过一次筛选的阳性毛状根在长至5cm后移入6,7V液体培养基中，于25℃黑暗中110rpm振荡进行扩大培养，初期继续加Kana筛选阳性，后期可不加Kana，这时根会长的很快。4周后取一部分提RNA，剩余一部分继续培养4周，4周后用冷冻干燥机干燥用于后续化学检测，剩余毛状根转入新的6,7V液体培养基中继代，留存备用。

二、结果与分析

在基因过表达分析实验中筛选得到的SmNAC78转录因子的过表达株系Pkoe和对照株系分别接入6,7V液体培养基屮，转基因株系各有三个生物学重复，培养一个半月后观察毛根表型。结果如图3A所示，发现过表达SmNAC78基因毛根株系与PKoe对照株系相比，SmNAC78毛根提取液颜色变红，同时SmNAC78毛根也更红(图3B)，暗示可能有丹参酮成分的积累，也说明SmNAC78基因可能有提高丹参酮成分含量的功能。

实施例3 SmNAC78转基因株系关键酶基因表达量和丹参酮含量的变化规律

一、实验方法

1、关键酶基因表达量变化检测

转基因毛根在6,7v液体培养基中培养4周后，提取RNA检测基因表达量变化差异，方法如下：

(1)每次微量提取一般需要50～100mg丹参毛根，采用液氮研磨法将植物在液氮中迅速研磨成粉末，用离心管估算装取50～100mg样品后加入1000μL细胞裂解液A，放置于涡旋振荡器振30s使其充***解。

(2)将上步所得混合物中的液体成分取1mL转移至净的1.5mL离心管

(3)在离心管中加入300μL的去蛋白液B和200μL WB溶液(如试剂盒中没有该成分请用氯仿替代)，置于涡旋振荡器振30s使其充分混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来，震荡后室温下静置2min。

(4)室温12000rpm离心8min，将上清液(不超过700μL)转移到另一个干净的1.5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取，容易造成污染。最好留下100μL上清液不取。

(5)加入等体积的漂洗液C，充分颠倒混匀(此时如有沉淀，属于正常现象，不能丢弃沉淀，务必将沉淀混合物一起上柱)再将所得混合物分两次(每次体积不超过700μL)加入同一个离心吸附柱中，每次加入吸附柱后都12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

(6)向吸附柱加500μL洗柱液D，12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。再向吸附柱加入500μL洗柱液D，重复一遍。再室温12000rpm离心1min以便去除残留的液体(此步非常重要)。

(7)膜上消化DNA

①将5μL的RNase-freeDNase I加入到45μL DNasebuffer中混匀(务必在离心管中混匀)配成DNA消化液，预热消化液37℃，1min，加入到离心吸附柱中室温(20～30℃)放置5min。

②直接在离心级附柱中加500μL的去酶液E，盖上盖后颠倒混匀数次。室温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。加入新的500μL去酶液E并重复此步骤一次。

③室温12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液，将吸附柱于室温2min，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇，防止残留乙醇影响后续类似酶切，PCR等反应。

(8)RNA洗脱：将离心吸附柱转移到RNase-free l.5ml离心收集管中，加入50μLRNA洗脱液，室温放置5min。12000rpm室温离心1min，离心管中溶液即为RNA。

2、实时荧光定量分别检测过表达转基因株系SmNAC78转录因子基因本身表达量的差异。

参照TaKaRa公司的反转录试剂盒说明书进行反转录，分两步，具体反应体系和条件如下：

(1)在200μL离心管中配制下列反应混合液(在冰上操作)。

表9-1反转录体系1

(2)反应条件42℃保温2min，反应完立即放冰上。

(3)按顺序配制下列反转录反应液，总量为20μL。

表9-2反转录体系2

(4)用移液枪轻柔吹打缓慢混匀。

(5)进行PCR反应，程序为37℃保温15min，85℃失活5s。

(6)反转后的cDNA保存于-20℃中，长期保存于-80℃冰箱备用。

以上述反转录的cDNA为模板，进行qRT-PCR荧光定量实验，体系如表9。本实验使用QuantStudio5实时荧光定量PCR仪，使用TaKaRa公司的TB Green Premix Ex Taq II，具体反应体系及操作步骤如下：

(7)将cDNA模板稀释至50ng，引物稀释至10μM。

(8)在冰上按下表配置反应体系：

表10 qRT-PCR体系

(9)上机进行实时荧光定量PCR分析程序(两步法PCR扩增标准程序)：

Stage 1：预变性

Number of Cycle：1

95℃ 30s

Stage 2：PCR反应

Number of Cycle：40

95℃ 5s

60℃ 34s

Melt Curve Stage

3、LC-MS检测毛状根与培养液中丹参酮类化合物含量

取培养4个月的丹参毛状根用于化合物检测，步骤如下：

(1)色谱柱：使用安捷伦C18色谱柱(3.0mm×100mm，1.8μM)，柱温25℃，流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈溶液(B)，流速0.4mL/min，进样量2μL；MS条件：电喷雾(ESI)离子源，正离子，哨气温度300℃，采集分子量m/z 100～1700；色谱条件见表10。(注：后运行时间posttime设置3min)表11检测丹参酮类化合物含量液相条件

(2)标准品溶液制定：取丹参酮IIA粉末，精密称定1mg加入1mL色谱级甲醇，制成浓度为1mg/mL母液，工作浓度为1μg/mL。二氢丹参酮II，柳杉酚，丹参酮新酮，隐丹参酮，二氢丹参酮I，丹参酮内脂，隐丹参酮，丹参酮IIB，甘西鼠尾新酮A，铁锈醇母液浓度为1mg/mL，工作浓度为1μg/mL，按照等比例制成混合标准品后使用。

(3)样品处理及上样：取丹参毛状根在冻干机上冻干后称重，使用研钵磨粉，取10mg毛状根粉末用1mL(色谱级甲醇加内标(伞形内酯0.0005mg/mL))提取，提取物超声处理(功率140W，频率42kHz)30min，放冷，12000g离心10min，将上清取至进样瓶中，即得样品溶液。进LC-MS仪器测定。

二、结果与分析

检测丹参酮类化合物含量，结果如图4所示，可知在过表达SmNAC78转基因株系中鉴定到多个丹参酮类化合物的含量均有增加，比如sugiol，Cryptotanshinone，TanshinoneIIA(T-IIA)，Tanshinon IIB(T-IIB)，Miltirone，Dihydrotanshinone I(DT-I)，说明SmNAC78转录因子正向调控丹参酮生物合成。

检测关键酶基因表达量变化,结果如图5所示，在SmNAC78转基因株系中，过表达株系(78oe1，78oe2，78oe4)与对照株系(PKoe)相比，丹参酮生物合成途径上游关键酶基因DXR，HDS，HMGS，PMK，MCT，MK，GGPPS，IDI，HDR1的表达量都有一定程度的提高，HMGR1，DXS2的表达量变化不明显(图5A)；下游关键酶基因CYP76AH1，CYP76AH3，CYP76AK1，KSL1，CPS1的表达量均有明显的增加(图5B)，说明SmNAC78基因可能通过调节这些表达量有变化的关键酶基因来调控丹参酮生物合成。

实施例4 SmNAC78转录因子亚细胞定位分析

一、实验方法

亚细胞定位表达载体载体构建采用同源重组方法，设计带有同源臂引物，克隆目的基因，连接表达载体PBI221-GFP，构建重组载体PBI221-GFP-SmNAC78，与空白对照分别瞬时转化到拟南芥的原生质体中，(拟南芥叶片原生质体的制备与转染方法为PEG4000法)步骤如下：

使用生长4周没有抽苔的拟南芥制备原生质体，把重组质粒PBI221-GFP-SmNAC78诱导进原生质体中，同时转染空载体PBI221-GFP作为空白对照。表达载体上带有GFP蛋白(绿色荧光信号)，适宜条件下孵育一段时间后，在共聚焦显微镜下可以观察到GFP绿色荧光信号位置，确定基因在细胞中的定位位置。具体步骤如下：

(1)选择生长4周左右，叶片舒展，没有抽苔的拟南芥制备原生质体。

(2)配制酶解液，胶带剥离叶片下表皮，剥离面朝下浸入酶解液中(5mL一个培养皿，酶解大概20片叶片，以覆盖培养皿为准，大概可以做15个200μL体系的转染)。将上述溶液放置在55℃烘箱约5～10min，溶解的酶解液为透明淡棕色。拿出烘箱恢复至室温后，加入1M CaCl₂和10％BSA两种成分。

(3)置于摇床平台上避光低速(40rpm)摇40～80min。

(4)用剪过的1mL枪头将酶解液吸入圆底离心管中，100～200g离心3min(室温)底部会有深绿色沉淀，轻轻倒去上清。

(5)沿着管壁加入10～20mL的W5溶液，轻轻摇晃将沉淀悬起来，100～200g离心3min，轻轻倒去上清，再重复一次。

(6)加入5～10mL的W5，冰浴30min以上。

(7)用移液枪将W5吸出来，加入1mL mmg溶液，轻轻混匀去显微镜下观察细胞状态。

(8)在2mL离心管中加入20～30ug质粒，体积约为20μL(单转10μL)。

(9)用剪过的枪头加入200μL(单转100μL)的原生质体溶液，再加入220μL(单转110μL)的PEG4000(不要贴着管壁加)，轻轻晃匀，然后避光静置10min。

(10)加入880μL W5溶液(单转990μL)，100～200g离心2min，吸取上清。

(11)加入1mL的W5溶液(贴着管壁加)，100～200g离心2min，吸取上清。

(12)加入1mL的W5溶液(贴着管壁加)，轻轻晃匀，横至于26℃培养箱培养16h～(从孵育时间开始算，到孵育完在显微镜下观察到定位位子不能超过72h)。

二、结果与分析

结果如图6所示，表达载体上带有GFP蛋白(绿色荧光信号)，适宜条件下孵育一段时间后，在共聚焦显微镜下观察GFP绿色荧光信号位置，空载体PBI221-GFP的绿色荧光信号充满整个细胞，而SmNAC78转录因子的绿色荧光信号均只出现在细胞核，说明SmNAC78转录因子定位在细胞核，是一个核蛋白，具有转录因子基本特征。

实施例5转录激活分析实验

一、实验方法

为了验证SmNAC78是否具有转录活性，我们将该基因全长构建到pGBKT7载体上，转化酵母菌株AH109。将重组载体pGBKT7-SmNAC78通过酵母转化法转化进酿酒酵母AH109中，同时转化空载体pGBKT7作为阴性对照，转化pGBKT7-ANAC096作为阳性对照。后续观察显色情况判断有无转录激活作用。转化以及显色具体步骤如下：

1、AH109酵母感受态细胞的制备

(1)将-80℃保存的酵母菌AH109菌种在YPDA固体培养基上划线，30℃培养至生长出单菌落。

(2)挑取单菌落接种于10mL的YPDA液体培养基中，30℃250rpm过夜摇菌。

(3)次日早上检测OD600值，当其达到1.6～1.8之间时，按1:50的比例转接于100mLYPDA液体培养基中，30℃250rpm摇菌3～5h。

(4)当菌液OD600达到1.0～1.1之间时，3,000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用1/2体积(25mL)无菌ddH2O悬浮。

(5)3,000rpm离心5min，弃上清，用无菌ddH2O悬浮(体积＝100μL×要转化质粒的个数)；

2、AH109酵母感受态细胞的转化,步骤如下：

(1)取60μL分装到1.5mL管中，然后按以下顺序及体积加入表11中的以下试剂：

表11溶液配方

(2)轻弹混匀，30℃金属浴30min而后42℃热激25min，在冰上静置5min，7000g离心15s，收集菌体弃上清，加入200μL ddH2O重悬菌体。涂布SD/-Trp-His二缺固体培养基，每板100μL，最后置于30℃培养箱中生长2d。

(3)酵母克隆滤纸显色分析

将在SD/-Trp-His二缺培养基上生长的酵母菌在新的二缺平板上划线，每个克隆划三道，30℃培养3～4d。准备显色液(Z-缓冲液，X-gal溶液β-巯基乙醇)，取2mL显色液加入灭菌的培养皿中，放入无菌滤纸浸润，取另一张滤纸覆盖与二缺培养基上生长的酵母克隆，用涂布器小心赶出气泡，使滤纸尽可能地与酵母接触。用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，轻轻取出滤纸，置于液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻，克隆朝上放置于预先浸润的滤纸上，轻按使滤纸之间不要有气泡。30℃生长箱中放置，观察显色情况，根据之前所做的标记确定显色菌落。

二、结果与分析

为了验证SmNAC78转录因子的转录激活活性，把构建好的重组载体pGBKT7-SmNAC78与空白对照pGBKT7分别转化酿酒酵母细胞AH109，通过酵母异源表达方法把带有正确目的序列重组载体pGBKT7-SmNAC78诱导进酿酒酵母细胞AH109中。表达载体上带有LacZ报告基因，通过β-半乳糖苷酶活性测定，结果如图7所示，空载体pGBKT7在显色板上不显蓝色，阳性对照pGBKT7-ANAC096显蓝色，而SmNAC78转录因子在显色板上显蓝色，说明SmNAC78转录因子具有转录激活活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广州中医药大学(广州中医药研究院)

<120> 一种丹参转录因子SmNAC78基因及其表达载体的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza)

<400> 1

atggaggggt caggaagtcc agtgaaggag gagaagctgc cacccggctt ccggttccac 60

ccgaccgacg aagaactcat cacctactat ttaatcaaca agatctccga cgcaaccttc 120

accggaaggg ccatcggaga cgttgatctc aacaagtgtg agccctggga tcttccaggg 180

aaggcgaaaa tgggagagaa agagtggtat ttcttcagcc tccgggaccg taagtatccg 240

acgggggttc ggacgaaccg ggcgacgaac acgggatact ggaagacgac gggaaaagac 300

aaggagatat acaacagcaa cacgtcggag ttggtgggga tgaagaaaac tttggtgttt 360

tacagaggga gagctccaag gggagagaag accaactggg tcatgcatga atatcgcatt 420

cattccaaat ctgcttatag aactaacaag caagatgagt gggtagtgtg ccgcgtcttc 480

caaaagagcg ccggaggtaa aaaataccca tcaacccaat caagagcagt caaccccttc 540

tcctacaaca tcgaccttcc ccaaaacccc atgcaatctc aaatcatgca gccagacaac 600

ttccacttcc ccggcagaaa ctacatgact cccgccgaga ttcaagaata caacaaagtc 660

ttcaccggcg ccgccgccgc cgccgcctcc accagcatga tcaacttccc cgtcccgccg 720

caggtcaact acggtggcgg cgccggggcc ggctgcttca ccatatccgg gctgaacttg 780

aacctcggcg gaggaatgag ggcggcgcag gggatgaacc agcaagacgt gaccgccgcc 840

gccgccatgc tcaacggcgg cggcgccgcc atgggtggtg aacaggctgc cgggtatgga 900

ggagacatga acaacaggtt tgttgtgggc atggaccagt gtggtgactt ggataactac 960

tggccttctt attga 975

<210> 2

<211> 324

<212> PRT

<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza)

<400> 2

Met Glu Gly Ser Gly Ser Pro Val Lys Glu Glu Lys Leu Pro Pro Gly

1 5 10 15

Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile Thr Tyr Tyr Leu Ile

20 25 30

Asn Lys Ile Ser Asp Ala Thr Phe Thr Gly Arg Ala Ile Gly Asp Val

35 40 45

Asp Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Gly Lys Ala Lys Met

50 55 60

Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Leu Arg Asp Arg Lys Tyr Pro

65 70 75 80

Thr Gly Val Arg Thr Asn Arg Ala Thr Asn Thr Gly Tyr Trp Lys Thr

85 90 95

Thr Gly Lys Asp Lys Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Thr Ser Glu Leu Val

100 105 110

Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Arg Gly Arg Ala Pro Arg Gly

115 120 125

Glu Lys Thr Asn Trp Val Met His Glu Tyr Arg Ile His Ser Lys Ser

130 135 140

Ala Tyr Arg Thr Asn Lys Gln Asp Glu Trp Val Val Cys Arg Val Phe

145 150 155 160

Gln Lys Ser Ala Gly Gly Lys Lys Tyr Pro Ser Thr Gln Ser Arg Ala

165 170 175

Val Asn Pro Phe Ser Tyr Asn Ile Asp Leu Pro Gln Asn Pro Met Gln

180 185 190

Ser Gln Ile Met Gln Pro Asp Asn Phe His Phe Pro Gly Arg Asn Tyr

195 200 205

Met Thr Pro Ala Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Lys Val Phe Thr Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Met Ile Asn Phe Pro Val Pro Pro

225 230 235 240

Gln Val Asn Tyr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Phe Thr Ile Ser

245 250 255

Gly Leu Asn Leu Asn Leu Gly Gly Gly Met Arg Ala Ala Gln Gly Met

260 265 270

Asn Gln Gln Asp Val Thr Ala Ala Ala Ala Met Leu Asn Gly Gly Gly

275 280 285

Ala Ala Met Gly Gly Glu Gln Ala Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Met Asn

290 295 300

Asn Arg Phe Val Val Gly Met Asp Gln Cys Gly Asp Leu Asp Asn Tyr

305 310 315 320

Trp Pro Ser Tyr

Claims (10)

1.一个丹参转录因子SmNAC78基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种丹参转录因子SmNAC78蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1的丹参转录因子SmNAC78基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为表达载体。

5.一种重组菌株，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。

6.权利要求3所述的重组载体或权利要求5所述的重组菌株的任一种或两种在提高丹参中丹参酮含量中的应用。

7.一种提高丹参中丹参酮含量的方法，其特征在于，在植物中过表达权利要求1所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1的丹参转录因子SmNAC78基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用权利要求5所述的重组菌株转化浸染丹参外植体，获得阳性转化丹参。

9.权利要求1所述的丹参转录因子SmNAC78基因在促进丹参酮生物合成中的应用。

10.权利要求2所述的丹参转录因子SmNAC78蛋白在促进丹参酮生物合成中的应用。

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