CN115836122A - 用于预测多肽免疫原性的基于t细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开的主题提供了用于确定组合物，例如，包含抗体或其片段的组合物，引发产生抗药物抗体(ADA)的倾向的方法，以及用于执行此类方法的试剂盒。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月7日提交的美国临时申请第63/062,991号和2021年6月25日提交的美国临时申请第63/215，199号的优先权，这些临时申请中的每一者的内容通过引用整体并入，并且要求对其每一者的优先权。
技术领域
本公开涉及用于确定组合物引发产生抗药物抗体(ADA)的倾向的方法以及用于执行此类方法的试剂盒。
背景技术
治疗剂(例如抗体)极大地改善了越来越多的严重和难治性疾病的治疗。不幸的是，当将此类治疗剂施用于患者时，可能会引发抗药物抗体(ADA)的产生。ADA可以对治疗剂具有中和作用。这些中和作用可包括限制治疗剂的活性、增加治疗剂的清除率以及可归因于施用治疗剂的总体临床缓解的潜在降低。在某些情况下，ADA的产生也与患者严重不良事件的发生同时发生，包括超敏反应和过敏反应。
在药物开发的临床前阶段了解治疗剂的免疫原性能够提高治疗剂在随后的临床阶段成功的可能性。虽然通常使用计算机(in silico)工具预测免疫原性表位，但已经开发出几种基于细胞的技术来确定临床前治疗候选物的免疫原性潜力。其中一种技术称为主要组织相容性复合物(MHC)II类相关的肽蛋白质组学(MAPP)。MAPP参与一群抗原呈递细胞(APC)(例如树突状细胞)与目标治疗剂(例如基于多肽的治疗剂)的孵育。APC将内化治疗剂并将其加工成短肽。肽被加载到MHC II类分子上并呈递在APC的表面上。通过液相色谱质谱(LC/MS)对这些MHC-肽复合物进行免疫沉淀和分析，可以识别治疗剂中潜在的免疫原性表位。用于确定临床前治疗候选物的免疫原性潜力的另一种技术是T细胞增殖测定，其涉及与APC(例如，树突状细胞，已与基于多肽的目标治疗剂一起孵育)共培养后检测T细胞增殖。然而，这些技术是劳动密集型的、耗时的并且需要大量的高成本设备。因此，在本领域中需要一种更具时效性和成本效益的、用于确定治疗剂(例如，基于多肽的治疗剂)引发产生ADA的倾向的方法来确定治疗剂(例如，一种基于多肽的治疗剂)引发ADA的产生的倾向。
发明内容
本公开提供了用于确定组合物相对于参考倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体的倾向的方法。在某些实施例中，本公开的方法可以包括(a)在存在该组合物的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；(b)在不存在该组合物的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；(c)确定是CD4+并且表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(d)确定是CD4+并且表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及(e)计算刺激指数值。在某些实施例中，当(e)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，当(e)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则所述组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，刺激指数值可以通过以下方式确定：(i)将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的百分比，(ii)异常值总和分析和/或(iii)线性回归。在某些实施例中，淋巴细胞从单一供体获得的。在某些实施例中，淋巴细胞是从约20个供体至约50个供体获得，例如，从约35个至约45个供体。在某些实施例中，淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
在某些实施例中，用于确定组合物引发产生对该组合物具有特异性的抗体的倾向的方法包括(a)在存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；(b)在不存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；(c)确定是CD4+并且表达以下项的来自个体供体的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(d)确定是CD4+并且表达以下项的来自个体供体的；或(iii)未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(e)计算供体中的每一个的刺激指数值；并且(f)在供体的刺激指数值大于或等于参考值刺激指数值的情况下，计算反应性淋巴细胞供体的数量；并且在供体的刺激指数值小于参考刺激指数值的情况下，计算未受刺激的淋巴细胞供体的数量。在某些实施例中，刺激指数值可以通过以下方式确定：(i)将在(c)中确定的单个供体的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的该单个供体的未受刺激的淋巴细胞的百分比，(ii)异常值总和分析和/或(iii)线性回归。在某些实施例中，如果受刺激供体的数量大于供体总数量的30％，则组合物具有高倾向引发产生对组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，如果受刺激供体的数量少于供体总数量的20％，则组合物具有低倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，淋巴细胞是从约20个供体至约50个供体获得，例如，从约35个至约45个供体。在某些实施例中，淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
在某些实施例中，组合物包含新抗原。在某些实施例中，组合物为肽、多肽或小分子化合物。在某些实施例中，多肽为抗体或其片段，例如，抗体或其片段为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施例中，组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。在某些实施例中，抗体或其片段为双特异性抗体。
本公开进一步提供了用于确定新抗原相对于参考抗原引发对新抗原具有特异性的免疫应答的倾向的方法。例如，但不作为限制，该方法可以包括(a)在存在新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；(b)在不存在新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；(c)确定是CD4+并且表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(d)确定是CD4+并且表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及(e)计算刺激指数值。在某些实施例中，刺激指数值可以通过(i)将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的百分比来确定，(ii)异常值总和分析和/或(iii)通过线性回归。在某些实施例中，当(e)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则新抗原具有较大的倾向引发产生对新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(e)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则新抗原具有较小的倾向引发产生对新抗原特异性的免疫应答。
在某些实施例中，参考刺激指数值是参考组合物的刺激指数值，例如，一种在临床环境中不引发ADA产生或在临床环境中具有低倾向引发ADA产生的组合物。在某些实施例中，参考刺激指数值为从约1.0到约4.0，即，从约1.0到约2.0。在某些实施例中，参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大或约1.8或更大。
在某些实施例中，淋巴细胞包含T细胞。在某些实施例中，至少30％的淋巴细胞包含T细胞。在某些实施例中，T细胞为CD8-T细胞。在某些实施例中，至少10％的T细胞包含CD8-T细胞。在某些实施例中，约1x105至约1x107淋巴细胞与组合物一起培养。在某些实施例中，巴细胞与约10μg/ul至约1,000μg/ml的组合物一起培养。在某些实施例中，淋巴细胞与组合物一起培养约48小时或更短时间。
在某些实施例中，确定是CD4+并且表达以下项的受刺激或未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
本公开提供一种用于确定组合物相对于参考倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法。在某些实施例中，该方法可以包括(a)在存在组合物的情况下培养抗原呈递细胞(APC)以产生受刺激的APC；(b)在不存在组合物的情况下培养APC以产生未受刺激的APC；(c)分别将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将所未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及(f)计算刺激指数值。在某些实施例中，当(f)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则组合物具有较大的倾向引发对组合物具有特异性的抗体，并且当(f)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，刺激指数值通过将在(d)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。在某些实施例中，刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。在某些实施例中，APC是从单一供体获得的。在某些实施例中，APC是从约20个至约50个供体获得的。在某些实施例中，APC是从约35至约45个供体获得的。在某些实施例中，APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
本公开进一步提供了一种用于确定组合物引发产生对该组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，其中方法包括：(a)在存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的APC以产生受刺激的APC；(b)在不存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的APC，以产生未受刺激的APC；(c)将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(f)计算供体中的每一个的刺激指数值；并且(g)计算在供体刺激指数值大于或等于参考值刺激指数值的情况下反应性淋巴细胞供体的数量并且在供体刺激指数值小于参考刺激指数值时的情况下非反应性淋巴细胞供体的数量。在某些实施例中，如果反应性供体的数量大于供体总数量的30％，则组合物具有高倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体；如果反应性供体的数量少于供体总数量的20％，则组合物具有低倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，刺激指数值通过将在(d)中确定的个体供体的CD4+淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的该个体供体的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。在某些实施例中，刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。在某些实施例中，刺激指数值通过将在(d)中确定的个体供体的CD4+淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的该个体供体的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。在某些实施例中，APC是从约20个至约50个供体获得的。在某些实施例中，APC是从约35至约45个供体获得的。在某些实施例中，APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
本公开提供了一种用于确定新抗原相对于参考抗原引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答的倾向的方法。在某些实施例中，该方法包括(a)在存在新抗原的情况下培养APC以产生受刺激的APC；(b)在不存在新抗原的情况下培养APC以产生未受刺激的APC；(c)将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及(f)计算刺激指数值。在某些实施例中，当(f)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则新抗原具有较大的倾向引发对新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(f)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。在某些实施例中，新抗原存在于与MHC II类分子的复合物中。在某些实施例中，刺激指数值通过将在(d)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。在某些实施例中，刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。在某些实施例中，APC是从约20个至约50个供体获得的。在某些实施例中，APC是从约35至约45个供体获得的。在某些实施例中，APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
在某些实施例中，该参考刺激指数值为从约1.0至约4.0、从约1.0至约3.0或从约1.8至约3.0。在某些实施例中，该参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大或约3.0或更大。
在某些实施例中，该CD4+淋巴细胞包括CD8-T细胞。在某些实施例中，至少10％的CD4+淋巴细胞是CD8-T细胞。
在某些实施例中，该组合物包含肽、多肽或小分子化合物。在某些实施例中，肽或多肽包含新抗原。在一些实施例中，多肽是抗体或其片段。在一些实施例中，抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施例中，组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
在某些实施例中，约1x105至约1x107APC与该组合物和/或新抗原一起培养。在某些实施例中，APC与约10μg/ul至约1,000μg/ml的组合物和/或新抗原一起培养。在某些实施例中，APC与组合物和/或新抗原一起培养约48小时或更短。
在某些实施例中，通过流式细胞术确定表达以下项的CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
本公开进一步提供了用于执行本文公开的任何一种方法的试剂盒。
附图说明
图1显示了用于确定组合物引发产生ADA的倾向的方法的非限制性实施例的示意图。
图2示出了两种不同抗体
和bococizumab的FACS分析。
图3显示了具有不同的临床ADA率的以下六种抗体的分析：
GNE-αPCSK9(也称为RG7652)、阿利西尤单抗(alirocumab)
依洛尤单抗(evolocumab)
伯考赛珠单抗(bococizumab)和HA33。
图4A示出了
HA33和KLH表达CD134的供体数量。
图4B示出了
HA33和KLH表达CD137的供体数量。
图4C示出了
HA33和KLH表达CD134和CD137的供体数量。
图4D示出了
HA33和KLH表达CD134和/或CD137的供体数量。
图5示出了由本公开测定确定的预测免疫原性与临床观察到的免疫原性之间存在相关性。
图6A示出了显示HLA-DR和HLA-II的抗体阻断的示意图。
图6B示出了阻断HLA-DR和HLA-II后阳性供体的数量。
图7示出了IL-2体外分泌与临床免疫原性之间没有相关性。
图8示出了细胞因子体外分泌与临床免疫原性之间没有相关性。
图9显示了本公开用于确定组合物引发产生ADA的倾向的方法的非限制性实施例的示意图，其中分离的APC最初与该组合物一起培养，并且随后这些APC随后与T细胞共培养，并且T细胞的活化用于确定组合物引发产生ADA的倾向。
图10示出了本公开用于确定组合物引发ADA产生的倾向的方法的非限制性快速实施例的示意图，其中APC最初与组合物一起培养，然后随后与T细胞共培养，并且T细胞的活化用于确定组合物引发ADA产生的倾向。
图11A示出了具有对T细胞特异性的抗原结合结构域的四种双特异性抗体的分析。刺激指数(SI)值线示出了大于1.8的值。
图11B示出了具有对T细胞特异性的抗原结合结构域的四种双特异性抗体的分析。SI值线示出了大于3的值。
图12A示出了具有对T细胞特异性的抗原结合结构域的两个双特异性抗体的分析。SI值线示出了大于1.8的值。
图12B示出了具有对T细胞特异性的抗原结合结构域的两个双特异性抗体的分析。SI值线示出了大于3的值。
图13A示出了包括HLA阻断的T细胞活化测定的示意图，以表明所提出的免疫原性是由于T细胞的治疗特异性活化。
图13B示出了采用图13A中描述的测定法对双特异性抗体TDB2的分析。
图14示出了通过在单细胞(TDB4A)中表达其两个抗原结合结构域而产生的或由双细胞***产生的双特异性抗体的分析，其中每个细胞表达双特异性抗体(TDB4B)的两个抗原结合结构域之一。
具体实施方式
为清楚起见，但不作为限制，当前公开的主题的具体实施方式分为以下小节：
I.定义；
II.方法；
III.组合物；
IV.试剂盒；和
V.示例性实施例
I.定义
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等人(编)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，The Glossary of Genetics(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，“一个/种”或“一者”一词的使用可以表示“一个/一种/一者”，但也与“一个/一种/一者或多个/多种/多者”、“至少一个/一种/一者”和“一个/一种/一者或超过一个/一种/一者”的含义一致更进一步，术语“具有”、“包括”、“包含”和“包含”是可互换的，并且本领域技术人员认识到这些术语是开放式术语。
如本文所用，术语“约”或“大致”可指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，例如测量***的局限性。例如，按照给定值的实践，“约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”可以意指该特定值的可接受误差范围，例如由术语“约”修饰的值的±10％。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合”目标抗原的抗体是以足够的亲和力结合该抗原，使得该抗体可用作测定试剂(例如用作检测抗体)的抗体。通常，这种抗体不会与其他多肽发生明显的交叉反应。关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指明显不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定靶分子的结合相比于对照分子的结合来测量，该对照分子通常为具有类似结构但不具有结合活性的分子。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(诸如抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链及/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链及/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和v。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能及/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段诸如溶核酶；抗生素；毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及以下公开的各种抗肿瘤或抗癌药。
如本文所用，“检测抗体”是指特异性结合样品中的靶分子的抗体。在一定条件下，检测抗体与靶分子形成复合物。检测抗体能够通过标记(其可以被检测出)直接检测，或间接检测，例如，通过使用被标记并结合检测抗体的另一种抗体。对于直接标记，检测抗体通常与通过某些方式可检测的部分(例如，包括但不限于荧光素)结合。
本文使用的术语“检测”包括对靶分子或其加工过的形式的定性和定量测量。在某些实施例中，检测包括仅鉴定靶分子的存在以及确定靶分子是否以可检测的水平存在。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，EU编号***也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。
“框架”或“FR”是指除高变区(CDR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在某些实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在某些实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将实质上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或实质上所有CDR(例如CDR)对应于非人抗体的CDR，并且所有或实质上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“CDR”是指抗体可变结构域的每个区域：抗体可变结构域的序列高变(本文也称为“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。除非另外指明，否则可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人编号，出处同上。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中的(L1、L2、L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53—55(H2)和96—101(H3)处发生的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括CDR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
“免疫缀合物”是指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
本文中的“个体”、“受试者”或“供体”是脊椎动物，诸如人类或非人类动物(例如哺乳动物)。哺乳动物包括但不限于人类、非人类灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人类动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；小狗；猫；羊；猪；山羊；牛；马；和非人类灵长类动物，如猿和猴子。在某些实施例中，个体、受试者或供体为人。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境和在人工环境中发生的过程或反应。体外环境但不限于以试管和细胞培养物为例。
如本文所用，术语“体内”是指自然环境(例如，动物或细胞)以及在自然环境中发生的过程或反应，例如胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在某些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
如本文所用，术语“标记”或“可检测标记”是指可以与待检测或定量的物质(诸如抗体)连接的任何化学基团或部分。标记是一种可检测标记，适用于对物质进行灵敏检测或定量。可检测标记的非限制性实例包括但不限于发光标记，诸如荧光、磷光、化学发光、生物发光和电化学发光标记，放射性标记，酶，颗粒，磁性物质，电活性物质等。可替代地，可检测标记可以通过参与特异性结合反应来发出其存在的信号。此类标记的非限制性实例包括半抗原、抗体、生物素、链霉亲和素、his-标签、次氮基三乙酸、谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽等。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据目前公开的主题所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N端至C端，每条重链均具有可变区(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的实例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本公开的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。这种DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见，例如，Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
如本文所使用，“纯化的”多肽(例如，抗体)是指已经提高纯度的多肽，使得其以比存在于自身天然环境中和/或在实验室条件下初始合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语并且不一定意指绝对纯度。
如本文所用，术语“包装插页”是指通常包含在商业包装中的说明书，其中包含有关包装组件使用的信息。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在不考虑将任何保守取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2来生成氨基酸序列同一性％的值。ALIGN-2序列比较计算机程序由基因泰克公司(Genentech,Inc.)编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册。ALIGN-2程序可从基因泰克公司(Genentech,Inc.,South San Francisco,California)公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应经编译以在UNIX操作***上使用，UNIX操作***包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可以替代地表达为给定氨基酸序列A具有或包含与给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中Y是B中氨基酸残基的总数量。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别指明，否则本文所使用的所有氨基酸序列同一性％的值是如前一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“多肽”和“蛋白质”如在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可间插有非氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。在定义内还包括例如含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所使用的术语“多肽”和“蛋白”具体包括抗体。
如本文所用，术语“重组蛋白”通常是指已被基因操纵的肽和蛋白质。在某些实施例中，此类重组蛋白是“异源的”，例如对于正在被使用的细胞而言是外源的。
如本文所使用，“样品”是指大量材料的一小部分。在某些实施例中，样品包括但不限于培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体(例如血液、血浆、血清、粪便、尿液、淋巴液、腹水、导管冲洗液、唾液和脑脊液)和组织样品。样品的来源可以是固体组织(例如，来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活体组织切片或抽吸物)、血液或任何血液成分、体液(例如尿液、淋巴液、脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液)或来自个体的细胞，包括循环细胞。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(CDR)。(参见例如Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
II.方法
目前公开的主题提供了用于确定包含治疗剂(例如多肽或其片段)的组合物引发抗药物抗体(ADA)产生的倾向的方法。在某些实施例中，目前公开的方法可用于确定包含抗体或其片段或抗体-药物缀合物(ADC)的组合物引发ADA产生的倾向。本公开进一步提供了用于执行本文公开的方法的试剂盒。
在某些实施例中，本公开的方法可用于鉴定与亲本多肽(例如，亲本抗体)相比具有降低的倾向引发产生ADA的多肽变体(例如，抗体变体)。在某些实施例中，本文公开的方法可用于分析新开发的多肽(例如，抗体)。例如，但不作为限制，本文公开的方法可用于鉴定多肽(例如，抗体)具有较低的从特异性结合相同抗原的较大多肽库中引发ADA的倾向。在某些实施例中，本公开的方法可用于在临床研究之前确定新开发的多肽(例如，抗体)的免疫原性潜力。在某些实施例中，本公开的方法可用于确定多肽聚集体(例如，抗体)的免疫原性潜力。在某些实施例中，目前公开的方法可用于分析抗体序列变体(例如)在抗体制造和/或生产过程中出现的那些的免疫原性。在某些实施例中，目前公开的方法可用于分析新抗原的免疫原性。在某些实施例中，目前公开的方法可用于分析肽的免疫原性。
在某些实施例中，本公开的方法可以包括在存在组合物的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞。在某些实施例中，该方法可以进一步包括在不存在组合物的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞。例如，但不作为限制，该淋巴细胞可以在存在该组合物的情况下培养，例如，约24至约72小时。在某些实施例中，淋巴细胞可以在存在多肽的情况下下培养约12至约72小时、约12至约60小时、约12小时至约48小时、约12小时至约24小时、约24小时至约72小时、约24小时至约60小时、约24小时至约48小时、约48小时至约72小时或约48小时至约60小时。在某些实施例中，淋巴细胞可以在存在组合物的情况下培养约48小时或更短。
在本公开的方法中使用的淋巴细胞浓度可以取决于所使用的培养皿和/或培养板的大小。例如，但不作为限制，淋巴细胞可以以一定浓度，约1x105至约1x107细胞/ml，例如，约2x106细胞/ml，例如，在24孔板和/或96-孔板使用。在某些实施例中，所用淋巴细胞的数量可以是约1x105至约9x106细胞、约3x105至约8x106细胞、从约3x105到约7x106细胞、从约4x105到约6x106细胞、从约5x105至约5x106细胞、约6x105至约4x106细胞、约7x105至约3x106细胞、从约8x105至约2x106细胞、从约9x105至约2x106细胞或从约9x105到约1x106细胞。在某些实施例中，使用约1x106淋巴细胞。在某些实施例中，所用淋巴细胞的数量可以从约1x105细胞到约3x105细胞，例如，大约2x105淋巴细胞被使用。在某些实施例中，淋巴细胞可以以一定浓度使用，从约0.1x106细胞/ml至约1x106细胞/ml，例如约0.2x106细胞/ml至约0.4x106细胞/ml。
用于目前公开的方法的淋巴细胞包括可以与细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)复合的抗原相互作用的任何细胞。例如，但不作为限制，淋巴细胞可以包含T细胞。例如，但不作为限制，至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的淋巴细胞为T细胞。在某些实施例中，至少约20％，例如，至少约30％的淋巴细胞是T细胞，例如，CD4+T细胞。在某些实施例中，淋巴细胞可以进一步包括抗原呈递细胞(APC)。
在某些实施例中，T细胞为CD8-T细胞。在一些实施例中，T细胞为CD4+T细胞。在一些实施例中，T细胞为CD4+CD8-T细胞。例如，但不作为限制，至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的T细胞是CD8-、CD4+或CD4+CD8-细胞。在某些实施例中，至少约20％，例如，至少约30％的T细胞是CD8-、CD4+或CD4+CD8-细胞。
淋巴细胞的非限制性来源包括从供体分离的外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施例中，PBMC是从供体的样品中分离，例如，从供体的血液样本分离。PBMC可以通过本领域已知的任何方法从供体样品中分离，例如，通过密度梯度离心。在某些实施例中，PBMC最初从供体样品中分离，然后进行CD8阴性选择以分离和/或选择CD8-细胞，例如，CD8-T细胞。在某些实施例中，PBMC可以是PBMC细胞系。在某些实施例中，淋巴细胞可以包含T细胞，例如，CD8-T细胞、CD4+T细胞或CD4+CD8-T细胞。在某些实施例中，该淋巴细胞可以从干细胞或iPSC细胞分化。例如，但不作为限制，淋巴细胞可以是T细胞，例如，从干细胞或iPSC细胞分化而来的CD8-T细胞、CD4+T细胞或CD4+CD8-T细胞。在某些实施例中，包括但不限于树突细胞、巨噬细胞和B细胞的APC可以从PBMC中分离出来，并用于包括在存在目标组合物和/或T细胞的情况下培养APC的方法中，如下面讨论。可供选择地和/或另外地，从PBMC获得的淋巴细胞可以包括T细胞，例如，CD8-T细胞、CD4+T细胞或CD4+CD8-T细胞，以及用于本文公开的方法的APC。
在某些实施例中，本公开的方法可以包括在暴露于组合物之前从PBMC中分离CD14+细胞。例如，但不作为限制，CD14+细胞可以被分离和诱导，例如，通过暴露于GM-CSF和/或IL4，分化为APC，例如，树突状细胞、例如，未成熟树突细胞，并且随后在存在组合物的情况下培养以产生受刺激的APC，例如，刺激成熟的树突状细胞。在某些实施例中，APC，例如，未成熟树突细胞，可以在存在组合物和GM-CSF、IL4、TNF-α、IL-1β、IL6和/或PGE2的情况下培养以产生受刺激的APC，例如，刺激成熟的树突状细胞。受刺激的APC，例如，单核细胞衍生的树突细胞，然后可以与T细胞，例如，CD4+T细胞和/或CD4+CD8-T细胞一起培养，并且可以检测T细胞活化。在某些实施例中，如下所述，T细胞可以从PBMC中分离。在某些实施例中，APC和T细胞可以从相同的PBMC样品或群体中分离。在某些实施例中，APC和T细胞可以从相同的供体中分离。在某些实施例中，在不存在T细胞的情况下用该组合物培养APC，随后用T细胞培养APC可以避免由于通过该组合物直接使T细胞活化而导致的潜在测定干扰。
在某些实施例中，淋巴细胞与约10μg/ul至约1,000μg/ml的组合物，例如约100μg/ml的组合物，一起培养。例如，但不作为限制，本文公开的组合物可以以一定的浓度使用，从约30μg/ml到约1,000μg/ml、从约40μg/ml到约1,000μg/ml、从约50μg/ml到约1,000μg/ml、从约60μg/ml至约1,000μg/ml、从约70μg/ml至约1,000μg/ml、从约80μg/ml至约1,000μg/ml、从约90μg/ml至约1,000μg/ml、从约10μg/ml至约900μg/ml、从约10μg/ml至约800μg/ml、从约10μg/ml至约700μg/ml、从约10μg/ml至约600μg/ml，从约10μg/ml至约500μg/ml、从约10μg/ml至约400μg/ml、从约10μg/ml至约300μg/ml、从约10μg/ml至约200μg/ml、从约50μg/ml ml至约150μg/ml或从约75μg/ml至约125μg/ml。在某些实施例中，淋巴细胞与约100μg/ml的组合物一起培养。在某些实施例中，淋巴细胞可以是与组合物一起培养的T细胞，例如CD4+T细胞和/或CD4+CD8-T细胞。在某些实施例中，淋巴细胞可以包括T细胞和APC，它们与组合物一起培养。可供选择地和/或另外地，方法可以包括在存在目标组合物和淋巴细胞，例如T细胞，的情况下培养APC例如，树突细胞、巨噬细胞和/或B细胞。在某些实施例中，该方法可以包括在存在目标组合物和淋巴细胞，例如T细胞，的情况下培养树突细胞。在某些实施例中，该方法可以包括在存在目标组合物但不存在T细胞的情况下培养分离的APC，例如树突细胞、巨噬细胞和/或B细胞。在某些实施例中，该方法可以包括在存在目标组合物但不存在T细胞的情况下培养分离的树突细胞。
在某些实施例中，该方法可以进一步包括确定是CD4+并且表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CDl37；或(iii)CD134和CD137。在某些实施例中，该方法可以包括确定是CD4+并且表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。在某些实施例中，该方法可以包括确定这样的细胞是否是活的。在某些实施例中，确定未受刺激和/或受刺激的淋巴细胞的量包括(i)使淋巴细胞(例如，T细胞)与一种或多种与CD4、CD134和/或CD137结合的检测剂接触，并且(ii)确定与一种或多种检测剂结合的淋巴细胞(例如，T细胞)的数量。
在某些实施例中，用于本文公开的方法的检测剂是抗体(本文也称为“检测抗体”)。在某些实施例中，该检测剂特异性结合到通过公开的方法分析的多肽，例如该检测剂特异性结合到存在于多肽或其片段上的表位。在某些实施例中，检测剂是与CD4结合的抗体。在某些实施例中，检测剂是结合CD134的抗体。在某些实施例中，检测剂是结合CD137的抗体。在某些实施例中，本文所公开的测定方法中使用的检测抗体能以从约0.05μg/ml至约5.0μg/ml(例如，约1μg/ml)的浓度使用。
在某些实施例中，可标记用于所公开方法的检测剂，例如检测抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记，以及放射性标记，以及间接(诸如通过酶促反应或分子相互作用)检测的部分(诸如酶或配体)。标记的非限制性实例包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I，荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素(fluorescein)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮；萤光素酶(luciferase)，诸如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(参见美国专利号4,737,456)；萤光素(luciferin)；2,3-二氢二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinedione)；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，诸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶；与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)偶联；生物素/亲和素；纺丝标记；噬菌体标记或稳定自由基等。在某些实施例中，检测剂(例如，抗体)用荧光团标记。
在某些实施例中，确定细胞数，例如，由一种或多种检测剂标记的淋巴细胞通过能够检测该检测剂的任何方法进行。在某些实施例中，检测剂可以通过监测检测剂的标记物来检测，例如，荧光标记物。在某些实施例中，确定由一种或多种检测剂标记的淋巴细胞的细胞数量是通过流式细胞术进行的。
在某些实施例中，方法还包括计算刺激指数值。在某些实施例中，刺激指数值可以通过将受刺激的淋巴细胞的百分比除以未受刺激的淋巴细胞的百分比来确定。可供选择地或另外地，刺激指数值可以通过异常值总和分析或通过线性回归来确定。在某些实施例中，该刺激指数值可以通过将受刺激的淋巴细胞的最大值或平均值除以未受刺激的淋巴细胞的最大值或平均值来确定。
在某些实施例中，方法可以包括将刺激指数值与参考刺激指数进行比较。在某些实施例中，当刺激指数值大于参考刺激指数值时，多肽具有比参考较大的倾向引发ADA产生。可供选择地，当多肽的刺激指数值小于参考刺激指数值时，多肽具有与参考相比较小的倾向引发ADA产生的倾向，例如在临床环境中。
在某些实施例中，参考刺激指数表示已知的引发ADA产生的倾向，例如，在临床环境中。在某些实施例中，参考刺激指数是从约1.0至约4.0、例如，从约1.0至约3.0、从约1.1至约2.0、从约1.2至约2.0、从约1.3至约2.0、从约1.4至约2.0、从约1.5至约2.0、从约1.6至约2.0、从约1.7至约2.0、从约1.8至约2.0或从约1.8至约3.0。在某些实施例中，刺激指数值是从约1.5至约2.0。在某些实施例中，刺激指数值是从约1.6至约1.8。在某些实施例中，参考刺激指数值是约1.6或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为1.7或更大。在某些实施例中，所述参考刺激指数值约为1.8或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为1.9或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.0或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.1或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.2或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.3或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.4或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.5或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.6或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.7或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.8或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为2.9或更大。在某些实施例中，参考刺激指数值约为3.0或更大。
在某些实施例中，参考刺激指数是由具有低倾向引发产生ADA的组合物(例如，参考组合物)产生的值，例如，在临床环境中。例如，但不作为限制，参考组合物可以是已显示在临床环境中不引发ADA产生或在临床环境中具有低倾向引发ADA产生的抗体。可供选择地或另外地，参考刺激指数可以是已显示引发产生ADA的组合物(例如，参考组合物)的刺激指数。例如，但不作为限制，参考组合物可以是在临床环境中已显示引发ADA产生的抗体。在某些实施例中，该参考组合物可以是在附图和/或实施例中的任一者中公开的抗体。可供选择地或另外地，在抗体变体的情况下，参考刺激指数可以是亲本抗体的刺激指数。在某些实施例中，在双特异性抗体的情况下，参考刺激指数可以是亲本抗体之一的刺激指数。
在某些实施例中，本公开的方法可以包括(i)在存在组合物的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；(ii)在不存在组合物的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；(iii)确定是CD4+并表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(a)CD134；(b)C137；或(c)CD134和CD137；(iv)确定是CD4+并表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(a)CD134；(b)CD137；或(c)CD134和CD137；以及(v)计算刺激指数值。在某些实施例中，当(v)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，当(v)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。
在某些实施例中，本公开的方法可以包括在存在组合物下和不存在CD4+淋巴细胞(例如，T细胞)的情况下培养APC，例如CD14+APC。在某些实施例中，在用组合物培养此类APC之前从PBMC中分离APC。在某些实施例中，方法还可以包括在不存在组合物的情况下和在不存在CD4+淋巴细胞(例如，T细胞)的情况下培养APC，例如分离的APC。在某些实施例中，方法可以进一步包括与之前在存在组合物的情况下培养的APC共培养CD4+淋巴细胞(例如，T细胞)以产生受刺激的CD4+淋巴细胞(例如，受刺激的T细胞)。在某些实施例中，方法可以进一步包括与之前在不存在组合物的情况下培养的APC共培养CD4+淋巴细胞(例如，T细胞)以产生未受刺激的CD4+淋巴细胞(例如，未受刺激的T细胞)。在某些实施例中，CD4+淋巴细胞，例如CD4+T细胞和/或CD4+CD8-T细胞，是从PBMC中分离的。在某些实施例中，T细胞和APC分离自相同的PBMC群体。在某些实施例中，T细胞(例如，CD4+T细胞)和APC(例如，CD14+APC)是自体的。在某些实施例中，APC是树突细胞。
在某些实施例中，本公开的方法可以包括(i)在存在组合物的情况下培养APC以产生呈递组合物抗原的APC；(ii)在不存在组合物的情况下培养APC以产生不呈递组合物抗原的APC；(iii)将(i)的APC与CD4+淋巴细胞共培养；(iv)将(ii)的APC与CD4+淋巴细胞共培养；(v)确定是CD4+并且表达以下项的来自(iii)的共培养物的CD4+淋巴细胞的百分比：(a)CD134；(b)CD137；(c)CD134和CD137；并且(vi)确定是CD4+并且表达以下项的来自(iv)的共培养物的T细胞的百分比：(a)CD134；(b)CD137；(c)CD134和CD137；以及(vii)计算刺激指数值。在某些实施例中，方法还可以包括将(vii)的刺激指数值与参考刺激指数值进行比较。在某些实施例中，当(vii)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。在某些实施例中，当(vii)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。
在某些实施例中，方法可以包括用从一个以上供体获得的淋巴细胞分析该组合物。在某些实施例中，本公开的方法可以包括通过(i)用目标组合物单独培养源自个体供体的淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞和(ii)在不存在组合物的情况下单独培养来源于个体供体的淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞来分析组合物引发产生ADA的倾向。
例如，但不作为限制，与本公开的方法结合使用的淋巴细胞(例如，PBMC、APC和/或T细胞)可以来源于至少2个或更多个、至少3个或更多、至少4个或更多、至少5个或更多、至少6个或更多、至少7个或更多、至少8个或更多、至少9个或更多、至少10个或更多、至少15个或更多、至少20个或更多、至少25个或更多、至少30个或更多、至少35个或更多、至少40个或更多或至少45个或更多个体供体。在某些实施例中，此类淋巴细胞(例如PBMC或APC)可以与目标组合物分开培养。在某些实施例中，来自约20至约50个供体的淋巴细胞，例如，可以用来与目标组合物分开培养。在某些实施例中，来自约35至约45个供体的淋巴细胞可以单独使用，例如，与目标组合物一起培养。在某些实施例中，来自个体供体的淋巴细胞可以是T细胞(例如CD4+T细胞和/或CD4+CD8-T细胞)，它们与组合物一起培养。在某些实施例中，来自个体供体的淋巴细胞可以包括T细胞和APC，它们与组合物一起培养。可供选择地或另外地，方法可以包括在存在目标组合物和源自个体供体的淋巴细胞(例如，T细胞)的情况下培养APC，例如树突细胞、巨噬细胞和/或B细胞。
在某些实施例中，方法可以进一步包括(a)确定是CD4+并且表达以下项的来自个体供体的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；并且(b)确定是CD4+并且表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
在某些实施例中，方法可以进一步包括(a)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；并且(b)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
在某些实施例中，确定每个个体供体的刺激指数值，例如，可以通过将单个供体的受刺激的淋巴细胞百分比除以该单个供体的未受刺激的淋巴细胞百分比。
在某些实施例中，确定每个个体供体的刺激指数值，例如，可以通过将与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；除以该个体供体的与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
在某些实施例中，该方法还包括计算在供体的刺激指数值大于或等于参考值刺激指数值的情况下反应性淋巴细胞供体的数量和在供体的刺激指数值小于参考刺激指数值的情况下非反应性淋巴细胞供体的数量。在某些实施例中，如果反应性供体的数量大于供体总数量的30％，则组合物具有高倾向引发抗体的产生。可供选择地，如果反应性供体的数量少于供体总数量的20％，则组合物具有低倾向引发抗体的产生。
本公开进一步提供了用于确定新抗原引发对该新抗原的免疫应答的倾向的方法。在某些实施例中，方法包括(a)在存在新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；(b)在不存在新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；(c)确定是CD4+并且表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(d)确定是CD4+并且表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及(E)计算刺激指数值(例如，通过将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的百分比)。在某些实施例中，当(e)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则新抗原具有较大的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(e)中的刺激指数值小于参考刺激指数值，则新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。在某些实施例中，新抗原是与MHC分子(例如，MHC II类分子)形成的复合物。例如，但不作为限制，新抗原可以与MHCII类分子复合
本公开进一步提供了用于确定新抗原引发对该新抗原的免疫应答的倾向的方法。在某些实施例中，该方法包括(a)在存在新抗原的情况下培养APC以产生受刺激的APC；(b)在不存在新抗原的情况下培养APC以产生未受刺激的APC；(c)将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；(f)计算刺激指数值(例如，通过将在(d)中确定的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的未受刺激的淋巴细胞的百分比)。在某些实施例中，当(f)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则新抗原具有较大的倾向引发对新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(f)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。在某些实施例中，新抗原是与MHC分子(例如，MHC II类分子)形成的复合物。例如，但不作为限制，新抗原可以与MHC II类分子复合。
III.组合物
本公开提供了用于确定组合物引发ADA产生的倾向的方法。下文提供了可通过所公开的方法分析的此类组合物的非限制性实例。例如，但不作为限制，使用本文公开的任何方法测定的组合物可包含多肽或多肽片段(例如，肽)。在某些实施例中，该组合物可以包含抗体或其片段，例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施例中，组合物可以包含抗体-药物缀合物(ADC)。在某些实施例中，抗体可以是单域抗体。在某些实施例中，组合物可以包含新抗原或含有新抗原的复合物。在某些实施例中，组合物是对新抗原具有特异性的抗体。
1.多肽和肽
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可以包含肽或蛋白质或其片段。
在某些实施例中，组合物可以是蛋白质或其片段。在某些实施例中，该蛋白质可以具有至少约15至100kD的分子量，例如，接近约15kD。在某些实施例中，蛋白质可以包括至少约50、约60、约70、约80、约90、约100、约200、约300、约400、约500个氨基酸、约1,000个氨基酸、约1,500个氨基酸、约2,000个氨基酸、约2,500个氨基酸、约3,000个氨基酸、约35,000个氨基酸或约40,000个氨基酸。蛋白质的非限制性实例包括所有蛋白质，并且通常包括包含一个或多个二硫键的蛋白质，该蛋白质包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。在某些实施例中，蛋白质(例如，抗体)可以包括其他翻译后修饰，包括但不限于糖基化和脂化。见，例如，Prabakaran等人，WIREs Syst Biol Med(2012)，其通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，组合物可以是肽。在某些实施例中，肽可由约3-50个氨基酸残基组成。在某些实施例中，3-50个氨基酸残基在更大的多肽或蛋白质中可以是连续的，或者可以是在更大的多肽或蛋白质的一级序列中不连续但在三维空间中接近的一组3-50个残基。在某些实施例中，肽可以是肽的一部分、完整蛋白质或多肽的一部分并且可以通过蛋白水解处理从该蛋白质或多肽中释放或可以保留为蛋白质或多肽的一部分。
在某些实施例中，肽可具有3个或更多残基的长度、4个或更多残基的长度、5个或更多残基的长度、6个或更多残基、7个或更多残基、8个或更多残基、9个残基或更多残基、10个或更多残基、11个或更多残基、12个或更多残基、13个或更多残基、14个或更多残基、15个或更多残基、16个或更多残基、17个或更多残基、18个或更多残基、19个或更多残基、20个或更多残基、21个或更多残基、22个或更多残基、23个或更多残基、24个或更多残基、25个或更多残基、26个或更多残基、27个或更多残基、28个或更多残基、29个或更多残基、30个或更多残基、31个或更多残基、32个或更多残基、33个或更多残基、34个或更多残基、35个或更多残基、36个或更多残基、37个或更多残基、38个或更多残基、39个或更多残基、40个或更多残基、41个或更多残基、42个或更多残基、43个或更多残基、44个或更多残基、45个或更多残基、46个或更多残基、47个或更多残基、48个或更多残基、49个或更多残基或50个或更多残基。在某些实施例中，肽具有3至50个残基的长度、5至50个残基、3至45个残基、5至45个残基、3至40个残基、5至40个残基、3至35个残基、5至35个残基、3至30个残基、5至30个残基、3至25个残基、5至25个残基、3至20个残基、5至20个残基、3至15个残基、5至15个残基、3至10个残基、3至10个残基、5至10个残基、10至15个残基、15至20个残基、20至25个残基、25至30个残基、30至35个残基、35至40个残基、40至45个残基或45至50个残基。在某些实施例中，肽具有约5至约30个残基的长度。
在某些实施例中，肽具有9个残基的长度。在某些实施例中，肽具有10个残基的长度。在某些实施例中，肽具有11个残基的长度。在某些实施例中，肽具有12个残基的长度。在某些实施例中，肽具有13个残基的长度。在某些实施例中，肽具有14个残基的长度。在某些实施例中，肽具有15个残基的长度。在某些实施例中，肽具有16个残基的长度。在某些实施例中，肽具有17个残基的长度。在某些实施例中，肽具有18个残基的长度。在某些实施例中，肽具有99个残基的长度。在某些实施例中，肽具有20个残基的长度。在某些实施例中，肽具有21个残基的长度。在某些实施例中，肽具有22个残基的长度。在某些实施例中，肽具有23个残基的长度。在某些实施例中，肽具有24个残基的长度。在某些实施例中，肽具有25个残基的长度。在某些实施例中，肽具有26个残基的长度。在某些实施例中，肽具有27个残基的长度。在某些实施例中，肽具有28个残基的长度。在某些实施例中，肽具有29个残基的长度。在某些实施例中，肽(例如，肽)具有30个残基的长度。在某些实施例中，肽具有31个残基的长度。在某些实施例中，肽具有32个残基的长度。在某些实施例中，肽具有33个残基的长度。在某些实施例中，肽具有34个残基的长度。在某些实施例中，肽具有35个残基的长度。在某些实施例中，肽具有36个残基的长度。在某些实施例中，肽具有37个残基的长度。在某些实施例中，肽具有38个残基的长度。在某些实施例中，肽具有39个残基的长度。在某些实施例中，肽具有40个残基的长度。在某些实施例中，肽具有41个残基的长度。在某些实施例中，肽具有42个残基的长度。在某些实施例中，肽具有43个残基的长度。在某些实施例中，肽具有44个残基的长度。在某些实施例中，肽具有45个残基的长度。在某些实施例中，肽具有46个残基的长度。在某些实施例中，肽具有47个残基的长度。在某些实施例中，肽具有48个残基的长度。在某些实施例中，肽具有49个残基的长度。在某些实施例中，所述肽具有50个残基的长度。
在某些实施例中，蛋白质或其片段可以是如本文所公开的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，肽可以是如本文所公开的新抗原。
2.抗体或其片段
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物包含抗体或其片段，例如，单克隆抗体及其片段。例如，但不作为限制，本公开的方法可用于确定新开发和/或已鉴定的抗体或其片段的免疫潜能。
抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，以及下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见诸如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies中，卷113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York,第269-315页(1994)中所述；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571，894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白质水解消化以及由重组宿主细胞(诸如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。
在某些实施方案中，通过本文公开的方法分析的组合物可以是双抗体。双抗体是包含两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体(也在Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中进行了描述)可以通过本公开的方法分析。
在某些实施例中，通过本公开的方法分析的抗体可以是单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见，例如美国专利号6,248,516B1)。单域抗体的其他非限制性例子在Iezzi等人，FrontImmunol.9：273(2018)中公开，其内容通过引用整体并入本文。在某些实施例中，抗体是杂交体(Hybrigenics Services，Cambridge，MA)。
3.嵌合抗体、人源化抗体和人抗体
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物包含嵌合抗体，例如，人源化抗体。例如，但不作为限制，目前公开的方法可用于鉴定具有低或较低倾向引发产生ADA的抗体的嵌合形式，例如，与亲本抗体或抗体的其他嵌合形式相比。可供选择地或另外地，本公开的方法可用于鉴定具有低倾向引发产生ADA的嵌合抗体。
某些嵌合抗体在现有技术中有所描述，例如，在美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)中。在某些实施例中，嵌合抗体包括非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体可以是其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，嵌合抗体可以是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在某些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可以是人抗体。例如，但不作为限制，目前公开的方法可用于鉴定具有低或较低倾向引发产生ADA的人抗体的嵌合形式。
4.源自文库的抗体
在某些实施例中，通过本文所公开的方法分析的组合物可包含通过筛选用于具有所需活性或多种活性的抗体的组合库而分离的抗体或其片段。例如，但不作为限制，目前公开的方法可用于鉴定源自文库的抗体，该抗体具有低或较低的倾向引发产生ADA，例如，与具有所需结合特征和/或结合相同抗原的其他源自文库的抗体相比。
在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
5.多特异性抗体
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可以包含多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的单克隆抗体。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。例如，但不作为限制，目前公开的方法可用于鉴定具有低或较低倾向引发产生ADA的多特异性抗体，例如，与结合相同表位的其他多特异性抗体相比。可供选择地或另外地，本公开的方法可用于鉴定具有低倾向引发产生ADA的多特异性抗体。
在某些实施例中，目前公开的方法可用于鉴定多特异性抗体，例如，具有低或较低倾向引发产生ADA的双特异性抗体，例如，与其他抗体相比，例如，结合至少一个与多特异性抗体相同的表位的单特异性或多特异性抗体。
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可包含对T细胞具有结合特异性的双特异性抗体。例如，但不作为限制，双特异性抗体可以包含与T细胞结合的第一抗原结合结构域，以及针对第二表位的第二结合特异性，例如，一种不存在于T细胞上的表位。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”，也可以通过所公开的方法进行分析(参见，例如，US 2006/0025576A1)。
6.免疫缀合物
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可以包含免疫缀合物、例如，包含抗体与一种或多种细胞毒剂，例如，化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素、细菌、真菌的酶活性毒素、植物或动物来源或其片段)或放射性同位素偶联的免疫缀合物。例如，抗体或抗原结合部分可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物。
在某些实施例中，免疫缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体偶联至一种或多种药物，包括但不限于美登木素类(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235 B1)；奥瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基奥瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588以及7,498,298)；多拉司他汀；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；和Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环类药物，诸如柔红霉素或多柔比星(参见Kratz等人，Current Med.Chem.13：477—523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters16：358—362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12：1529—1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336—4343(2002)；以及美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地碱；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉罗他赛、替塞他赛和奥他他赛；单端孢菌素和CC1065。
在某些实施例中，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段偶联的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、限制霉素、苯酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在某些实施例中，免疫缀合物包括与放射性原子偶联以形成放射性缀合物的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。非限制性实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或1123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari et a1.，CancerRes.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
在某些实施例中，免疫缀合物包括但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC—SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酰基-EMCS、磺酰基-GMBS、磺酰基-KMUS、磺酰基-MBS、磺酰基-SIAB、磺酰基-SMCC、磺酰基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
7.抗体变体
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可以包含之前公开的抗体的抗体变体。例如，本公开的方法可用于鉴定抗体，这些抗体是之前公开的抗体的变体，例如，比亲本抗体具有低倾向引发产生ADA。在某些实施例中，可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并且可以通过使用所公开的方法来筛选抗体变体的免疫原性。
在某些实施例中，抗体变体可以是抗体的氨基酸序列变体，例如，通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括但不限于抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或***和/或取代。此类变化的目标位点包括但不限于CDR和FR。可以进行缺失、***和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终抗体(即修饰的)具有所需特征，例如抗原结合。
在某些实施例中，抗体变体可以是已经改变以增加或减少抗体糖基化程度的抗体。例如，但不作为限制，抗体糖基化位点的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来实现。
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的抗体是Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如，取代)。
在某些实施例中，抗体变体可以是半胱氨酸工程抗体(例如，“thioMAb”)其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在某些实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或连接基-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可以如诸如美国专利号7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化的抗体。
8.新抗原
在某些实施例中，通过本文公开的方法分析的组合物可以包含新抗原。新抗原是与正常组织或器官不相关的抗原，通常来源于基因突变，例如，***/缺失、基因融合、移码突变、单核苷酸突变或前述的组合。在某些实施例中，新抗原是肿瘤新抗原(也称为肿瘤特异性抗原或TSA)。由于肿瘤新抗原被认为是“非自身的”，它们可以通过抗原呈递细胞(APC)上的MHC分子进行加工和展示。通过T细胞(例如，CD8+和/或CD4+T细胞)与呈递在APC上的此类肿瘤新抗原的结合是可以针对与肿瘤新抗原相关的肿瘤产生免疫应答的一种方式。见，例如，Jiang等人，J.of Hematology&Oncology 12(93)(2019)，其内容以引用方式并入本文。
在某些实施例中，可以在复合物的背景下分析新抗原。例如，但不作为限制，新抗原可以与MHC分子形成复合物，例如，一种MHC I类或II类分子。在某些实施例中，新抗原可以与MHC II类分子形成复合物。
可通过本领域已知的任何方法鉴定用于本公开的新抗原。例如，但不作为限制，新抗原可以通过下一代测序和/或in silico建模来鉴定。见，例如，Garcia-Garijo等人，Front Immunol.10：1392(2019)，其内容通过引用并入本文。在某些实施例中，可以在目前公开的方法中分析通过此类方法鉴定的新抗原以确定新抗原引发对该新抗原具有特异性的免疫应答的倾向。
IV.试剂盒
当前公开的主题进一步提供了包含可用于进行本文公开的方法的材料的试剂盒。在某些实施例中，本公开的试剂盒包括含有淋巴细胞的容器和/或含有一种或多种用于检测本文描述的标志物(例如，CD4、CD134，和/或，CD137)的试剂的容器。合适容器的非限制性实例包括瓶子、试管、小瓶和微量滴定板。容器可以由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。
在某些实施例中，试剂盒可以包括含有一种或多种淋巴细胞的一个或多个容器。在某些实施例中，试剂盒可以包括至少一个容器，该容器含有PBMC、淋巴细胞、APC和/或T细胞。例如，但不作为限制，试剂盒可以包括至少一个容器，该容器包括CD8-T细胞、CD4+T细胞和/或CD4+CD8-T细胞。在某些实施例中，本公开的试剂盒包括在一个或多个容器中源自一个或多个供体的淋巴细胞。在某些实施例中，本公开的试剂盒可以进一步包括一种或多种用于检测本文公开的一种或多种标志物(例如，CD1 34和/或CD137抗体)的试剂。
在某些实施例中，试剂盒还包括包装插页，该说明书提供使用试剂盒中提供的组分的说明。例如，本公开的试剂盒可以包括包装插页，该插页提供在公开的方法中使用淋巴细胞和/或试剂的说明。
可替代地或另外地，从商业和用户的角度来看，期望试剂盒可以包括其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂和过滤器。在某些实施例中，试剂盒可以包括用于收集和/或处理血液样品的材料，例如，从样品中分离淋巴细胞。
V.示例性实施例
A.当前公开的主题提供了一种用于确定组合物相对于参考倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，其包括：
(a)在存在组合物的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；
(b)在不存在组合物的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；
(c)确定是CD4+并表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(d)确定是CD4+并表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(e)计算刺激指数值；
其中当(e)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体，并且当(e)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。
A1.前述A的方法，其中参考刺激指数值为约1.0至约2.0。
A2.前述A的方法，其中参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大或约1.8或更大。
A3.前述A-A2中任一项的方法，其中刺激指数值通过将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的百分比来确定。
A4.前述A-A3任一项的方法，其中刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
A5.前述A-A4中任一项的方法，其中淋巴细胞包括T细胞。
A6.前述A5的方法，其中至少30％的淋巴细胞包括T细胞。
A7.前述A5或A6的方法，其中T细胞包括CD8-T细胞。
A8.前述A7的方法，其中至少10％的T细胞包含CD8-T细胞。
A9.前述A-A8中任一项的方法，其中淋巴细胞是从单一供体获得的。
A10.上述A-A8中任一项的方法，其中淋巴细胞是从约20至约50个供体中获得的。
A11.前述A10的方法，其中淋巴细胞是从约35至约45个供体中获得的。
A12.前述A10的方法，其中淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得.
A13.前述A-A12中任一项的方法，其中约1×105至约1×107个淋巴细胞与组合物一起培养。
A14.前述A-A13中任一项的方法，其中淋巴细胞与约10μg/ul至约1,000μg/ml的组合物一起培养。
A15.前述A-A14中任一项的方法，其中组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
A16.前述A15的方法，其中肽或多肽包含新抗原。
A17.前述A15的方法，其中多肽为抗体或其片段。
A18.前述A17中任一项的方法，其中抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
A19.前述A-A14中任一项的方法，其中组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
A20.前述A-A19中任一项的方法，其中淋巴细胞与组合物一起培养约48小时或更短时间。
A21.前述A-A20中任一项的方法，其中确定是CD4+并且表达以下项的受刺激或未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
B.当前公开的主题提供了一种用于确定组合物引发产生对该组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，包括：
(a)在存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；
(b)在不存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；
(c)确定是CD4+并且表达以下项的来自个体供体的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(d)确定是CD4+并且表达以下项的来自供体的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)计算供体中的每一个的刺激指数值；并且
(f)计算在供体刺激指数值大于或等于参考值刺激指数值的情况下反应性淋巴细胞供体的数量，并且在供体刺激指数值小于参考刺激指数值的情况下非反应性淋巴细胞供体的数量；
其中如果反应性供体的数量大于供体总数量的30％，则组合物具有高倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体；并且如果反应性供体的数量少于供体总数量的20％，则该组合物具有低倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体。
B1.前述B的方法，其中参考刺激指数值为约1.0至约2.0。
B2.前述B的方法，其中参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大或约1.8或更大。
B3.前述B-B2中任一项的方法，其中刺激指数值通过将在(c)中确定的个体供体的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的该个体供体的未受刺激的淋巴细胞的百分比来确定。
B4.前述B-B3任一项的方法，其中刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
B5.前述B-B4中任一项的方法，其中淋巴细胞包括T细胞。
B6.前述B5的方法，其中至少30％的淋巴细胞包括T细胞。
B7.前述B5或B6的方法，其中T细胞包括CD8-T细胞。
B8.前述B7的方法，其中至少10％的T细胞包括CD8-T细胞。
B9.前述B-B8中任一项的方法，其中淋巴细胞是从约20至约50个供体中获得的。
B10.前述B9的方法，其中淋巴细胞是从约35至约45个供体中获得的。
B11.前述B9的方法，其中淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
B12.前述B-B11中任一项的方法，其中组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
B13.前述B12的方法，其中多肽是抗体或其片段。
B14.前述B13的方法，其中抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
B15.前述B12的方法，其中肽或多肽包含新抗原。
B16.前述B-B11中任一项的方法，其中组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
B17.前述B-B16中任一项的方法，其中淋巴细胞与组合物一起培养约48小时或更短时间。
B18.前述B-B17中任一项的方法，其中确定是CD4+并且表达以下项的受刺激或未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
C.当前公开的主题提供了一种用于确定新抗原相对于参考抗原引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答的倾向的方法，包括：
(a)在存在新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；
(b)在不存在新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；
(c)确定是CD4+并表达以下项的受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(d)确定是CD4+并表达以下项的未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(e)计算刺激指数值；
其中当(e)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则新抗原具有较大的倾向引发对新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(e)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。
C1.前述C的方法，其中新抗原存在于与MHC II类分子的复合物中。
C2.前述C或C1的方法，其中参考刺激指数值为约1.0至约2.0。
C3.前述C或C1的方法，其中参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大或约1.8或更大。
C4.前述C-C3中任一项的方法，其中刺激指数值通过将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的百分比来确定。
C5.前述C-C3任一项的方法，其中刺激指数值通过异常值和分析确定或通过线性回归确定。
C6.前述C-C5中任一项的方法，其中淋巴细胞包括T细胞。
C7.前述C6的方法，其中至少30％的淋巴细胞包括T细胞。
C8.前述C6或C7的方法，其中T细胞包括CD8-T细胞。
C9.前述C8的方法，其中至少10％的T细胞包括CD8-T细胞。
C10.前述C-C9中任一项的方法，其中淋巴细胞是从约20至约50个供体中获得的。
C11.前述C10的方法，其中淋巴细胞是从约35至约45个供体中获得的。
C12.前述C10的方法，其中淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
C13.前述C-C12中任一项的方法，其中淋巴细胞与新抗原一起培养约48小时或更短。
C14.前述C-C13中任一项的方法，其中确定是CD4+并且表达以下项的受刺激或未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
D.当前公开的主题提供了一种用于执行上述A-C14任一项的方法的试剂盒。
E.当前公开的主题提供了一种用于确定组合物相对于参考倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，包括：
(a)在存在组合物的情况下培养抗原呈递细胞(APC)以产生受刺激的APC；
(b)在不存在组合物的情况下培养APC，以产生未受刺激的APC；
(c)将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；
(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(f)计算刺激指数值；
其中当(f)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体，并且当(f)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。
E1.前述E的方法，其中参考刺激指数值为约1.0至约4.0、约1.0至约3.0或约1.8至约3.0。
E2.前述E的方法，其中参考刺激指数值是约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大或约3.0或更大。
E3.前述E-E2中任一项的方法，其中刺激指数值通过将在(d)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。
E4.前述E-E2任一项的方法，其中刺激指数值通过异常值和分析确定或通过线性回归确定。
E5.前述E-E4任一项的方法，其中CD4+淋巴细胞包括CD8-T细胞。
E6.前述E5的方法，其中至少10％的CD4+淋巴细胞是CD8-T细胞。
E7.E-E6任一项的前述方法，其中APC是从单一供体获得的。
E8.前述E-E6中任一项的方法，其中APC是从约20至约50个供体获得的。
E9.前述E8的方法，其中APC是从约35至约45个供体获得的。
E10.前述E8的方法，其中APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
E11.前述E-E10中任一项的方法，其中约1x105至约1x107APC与组合物一起培养。
E12.前述E-E11任一项的方法，其中APC与约10μg/ul至约1,000μg/ml的组合物一起培养。
E13.前述E-E12中任一项的方法，其中组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
E14.前述E13的方法，其中肽或多肽包含新抗原。
E15.前述E13的方法，其中多肽是抗体或其片段。
E16.前述E15的方法，其中抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
E17.前述E-E12中任一项的方法，其中组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
E18.前述E-E17中任一项的方法，其中前述APC与组合物一起培养约48小时或更短。
E19.前述E-E18中任一项的方法，其中确定表达以下项的CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
E20.前述E-E19中任一项的方法，其中确定表达以下项的CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
F.目前公开的主题提供了一种用于确定组合物引发产生对该组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，包括：
(a)在存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的APC以产生受刺激的APC；
(b)在不存在组合物的情况下分别培养来自个体供体的APC，以产生未受刺激的APC；
(c)将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；
(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(f)计算供体中的每一个的刺激指数值；并且
(g)计算在供体刺激指数值大于或等于参考值刺激指数值的情况下反应性淋巴细胞供体的数量，并且在供体刺激指数值小于参考刺激指数值的情况下非反应性淋巴细胞供体的数量；
其中如果反应性供体的数量大于供体总数量的30％，则该组合物具有高倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体；并且如果反应性供体的数量少于供体总数量的20％，则该组合物具有低倾向引发产生对该组合物具有特异性的抗体。
F1.前述F的方法，其中参考刺激指数值为约1.0至约4.0、约1.0至约3.0或约1.8至约3.0。
F2.前述F的方法，其中参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大或约3.0或更大。
F3.前述F-F2中任一项的方法，其中刺激指数值通过将在(d)中确定的个体供体的CD4+淋巴细胞的百分比除以在(e)中确定的个体供体的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。
F4.前述F-F2任一项的方法，其中刺激指数值通过异常值和分析确定或通过线性回归确定。
F5.F-F4中任一项的前述方法，其中CD4+淋巴细胞包括CD8-T细胞。
F6.前述F5的方法，其中至少10％的CD4+淋巴细胞是CD8-T细胞。
F7.前述F-F6中任一项的方法，其中APC是从约20至约50个供体获得的。
F8.前述F7的方法，其中APC是从约35至约45个供体获得的。
F9.前述F7的方法，其中APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
F10.前述F-F9中任一项的方法，其中组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
F11.前述F10的方法，其中多肽是抗体或其片段。
F12.前述F11的方法，其中抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
F13.前述F10的方法，其中肽或多肽包含新抗原。
F14.前述F-F9中任一项的方法，其中组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
F15.前述F-F14中任一项的方法，其中APC与组合物一起培养约48小时或更短。
F16.前述F-F15中任一项的方法，其中确定表达以下项的CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
G.当前公开的主题提供了一种用于确定新抗原相对于参考抗原引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答的倾向的方法，包括：
(a)在存在新抗原的情况下培养APC以产生受刺激的APC；
(b)在不存在新抗原的情况下培养APC，以产生未受刺激的APC；
(c)将受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；
(d)确定与表达以下项的受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)确定与表达以下项的未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(f)计算刺激指数值；
其中当(f)中的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则新抗原具有较大的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(f)中的刺激指数值小于参考刺激指数值时，则新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。
G1.上述G的方法，其中新抗原以与MHC II类分子的复合物存在。
G2.前述G或G1的方法，其中参考刺激指数值为约1.0至约4.0、约1.0至约3.0或约1.8至约3.0。
G3.前述G或G1的方法，其中参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大或约3.0或更大。
G4.前述G-G3中任一项的方法，其中刺激指数值通过将(d)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比除以(e)中确定的CD4+淋巴细胞的百分比来确定。
G5.前述G-G3任一项的方法，其中刺激指数值通过异常值和分析确定或通过线性回归确定。
G6.前述G-G5任一项的方法，其中CD4+淋巴细胞包括CD8-T细胞。
G7.前述G6的方法，其中至少10％的CD4+淋巴细胞是CD8-T细胞。
G8.前述G-G7中任一项的方法，其中APC是从约20至约50个供体获得的。
G9.前述G8的方法，其中APC是从约35至约45个供体获得的。
G10.前述G8的方法，其中APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
G11.前述G-G10中任一项的方法，其中APC与新抗原一起培养约48小时或更短。
G12.根据权利要求G-G11中任一项的方法，其中确定表达以下项的CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
H.当前公开的主题提供了一种用于执行E-G12的任一项的方法的试剂盒。
实例
以下实施例仅是对本公开的主题的说明，不应视为任何形式的限制。
实施例1：T细胞CD4+表达测定
基于多肽的治疗剂具有引发ADA产生的免疫原性潜力。特别地，这种基于多肽的治疗剂可以被抗原呈递细胞例如树突细胞摄取和加工，以在其表面上呈递与II类MHC分子复合的基于多肽的治疗剂的片段。T细胞随后与抗原呈递细胞表面呈递的片段相互作用，引发免疫反应，导致B细胞产生ADA。
本文开发了一种用于确定抗体引发产生ADA的倾向的方法。这种方法在药物开发过程中可能是非常有价值的工具，因为它可以用于预测新开发药物在临床前开发阶段的免疫原性潜力。图1提供了方法的实验细节示意图。使用Uni-Sep血液分离管通过密度梯度离心从幼稚的健康供体血液中分离出外周(PBMC)。在一些实验中，使用CD8 dynabeads(Thermo Fisher，Waltham，MA，目录号：11147D)耗尽了CD8+细胞。值得注意的是，该测定当PBMC在没有CD8耗尽的情况下培养时也产生了良好的结果。然后用含有10％人AB血清(Sigma Aldrich，目录号：H3667)的AIM-V培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)在24孔板以2x106细胞/mL的浓度或96孔板(Costar，目录号3526)中以0.2-0.4x106细胞的浓度并用最终浓度为100μg/mL的测试抗体培养CD8-细胞。所有样品一式三份进行测试。对于每个供体，还包括对由培养基处理的细胞组成的阴性对照和Imject Mariculture KLH(mcKLH)(100μg/ml)的阳性对照的反应。将细胞置于37℃的5％CO2培养箱中42-48小时。42-48小时后，轻轻重悬细胞，将每一个24孔中的200μl转移到圆底96孔板中。通过使用CD4、CD134、CD137抗体和活标记物测量CD4活化。通过流式细胞术分析细胞，并使用FlowJo FACS分析软件(TreeStar，Inc.；Ashland，OR)分析散点图。对于数据分析，刺激指数(SI)的计算方法是将每种处理的[live+CD4+CD134+CD137+和live+CD4+CD134+CD137-和live+CD4+CD134-CD137+]的细胞的平均百分比和/或最大百分比除以每次处理的仅培养基处理的孔(未受刺激的细胞)的[live+CD4+CD134+CD137+和live+CD4+CD134+CD137-和live+CD4+CD134-CD137+]的细胞的平均百分比。
图2显示了两种不同抗体
和bococizumab的FACS分析，它们具有不同的临床ADA率。与具有低ADA率的
相比，具有高ADA率的Bococizumab导致表达CD4活化标志物的细胞数量更多。
对具有不同临床ADA率的六种抗体的分析证实，所公开测定的结果与临床ADA率相关(图3)。通过上述方法分析抗PCSK9抗体、
GNE-αPCSK9、alirocumab
evolocumab
bococizumab和HA33。
GNE-αPCSK9、alirocumab
evolocumab
bococizumab和HA33A的临床ADA率分别为0.6％、3.3％、5.1％、0.3％、48％和73％(图3)。如图3所示，bococizumab或HA33的阳性供体数量显著高于任何其他具有低免疫原性的抗体，这与观察到的不同抗体的临床ADA率有关。
在来自健康供体的40个PBMC中测试了临床上已知ADA的两种治疗剂HA33和
的T细胞反应。大多数供体在用KLH刺激时检测呈阳性。此外，用
处理细胞对CD134或CD137表达几乎没有任何影响；然而，HA33处理显示CD134(10个供体；图4A)和CD137(14个供体；图4B)显著增加并且CD134和CD137双阳性(13个供体；图4C)。当检测CD134和/或CD137表达时，14名供体对HA33呈阳性，只有1名供体对
呈阳性(图4D)。这些结果与观察到的临床ADA相关。
对其他治疗剂的分析证实了预测的免疫原性与临床观察到的免疫原性之间存在相关性。如图5所示，那些在测定中具有较大百分比的阳性供体的治疗剂在临床中也表现出较高的临床ADA率。例如，导致80％的供体呈阳性的briakinumab的临床ADA率为40-86％；而导致4.16％的供体呈阳性的avelumab
的临床ADA率为4.10％。
为确认T细胞的活化依赖于生物治疗剂抗原的呈递，在存在HLA-DR和HLA-II阻断抗体的情况下进行了测定(图6A)。如图6A所示，抗体阻断HLA-II与存在于T细胞表面的TCR的相互作用，从而阻断T细胞的活化。如图6B所示，阻断HLA-DR和HLA-II蛋白降低了阳性供体的百分比，表明T细胞活化(观察到CD134和/或CD137表达的增加)和确定阳性供体取决于抗原呈递。这些数据证实CD134和/或CD137可以用作活化标志物并且所公开的测定方法可以预测治疗剂的免疫原性。
评估其他潜在标志物以确定这些标志物的表达是否也可用于该测定。特别地，在该测定中分析了细胞因子的分泌和表达作为免疫原性的潜在标志物。如图7所示，IL-2体外表达与临床免疫原性之间没有相关性。细胞因子IL-4、TNFα和INFγ的体外分泌与临床免疫原性之间也没有相关性(图8)。
如表1所示，本文公开的方法有几个优点。特别地，本领域已知的增殖测定需要大约20周来进行，需要大约2名分析员并且花费大约30,000美元。相比之下，本文公开的测定只需要大约2周的时间来执行，需要1名分析人员并且花费大约1,000美元。
表1
实施例2：结合T细胞的双特异性抗体的T细胞表达测定
本文开发了一种用于确定抗体引发产生ADA的倾向的方法。基于PBMC的测定的一个潜在挑战是受到目标生物治疗剂的生物活性的干扰，例如通过直接T细胞参与的免疫调节。为了克服这一挑战，开发了第二个树突状细胞-T细胞测定平台。
在该测定中，PBMC通过密度梯度离心使用Uni-Sep血液分离管从天然健康供体的血液中分离出来，并在至少2个试管中冷冻(每管最多30x106PBMC)。图9和图10提供了该方法的实验细节示意图，其中图10提供了有关条件的更多细节。第1天，从至少1管PBMC中分离出CD14+单核细胞。然后将CD14+单核细胞以1.0x106细胞/mi的密度在具有DC培养基(RPMI、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、1％卡那霉素、10％AB血清)的24孔板中培养，补充IL4(17-2ng/mL)和GM-CSF(66.6ng/mL)，培养24小时，并置于5％CO2培养箱中。这种CD14+单核细胞的培养使单核细胞能够分化为树突状细胞(DC)。24小时后，用无菌PBS洗涤单核细胞衍生的DC，并用含有IL4(17.2ng/mL)、GM-CSF(66.6ng/mL)、TNF-α(5ng/mL)、IL-1β(5ng/mL)、IL-6(150ng/mL)、PGE2(1μg/mL)和100μg/ml测试的生物治疗剂的DC培养基培养。将细胞置于5％CO2培养箱中。然后以每孔0.1百万/mL-200μL/孔的浓度(96孔板中20,000个细胞/孔)培养单核细胞衍生的DC，以使DC再成熟24小时。
在这个阶段，成熟的DC暴露于生物治疗剂24小时以允许抗原摄取和加工以及抗原肽的呈递。第3天，从相同的自体PBMC群(来自较早的试管)中分离出CD4+细胞。同时，成熟的DC用PBS洗涤3次。CD4+T细胞和成熟的DC以5个T细胞与1个DC(200,000个T细胞+20,000个DC)的比例共培养。这种方法可以精确控制CD4+T细胞与APC的比例，从而提高测定灵敏度。CD4+T细胞和DC的比例可以变化(5：1、10：1和20：1)并且可以进一步调整。
细胞在5％CO2培养箱中培养至少19小时(时间不定，包括24小时、48小时或72小时)。所有样品均重复三次制备。对于每个供体，分析了对由培养基处理的细胞(称为未受刺激的细胞)组成的阴性对照的反应。通过使用CD4、CD134、CD137抗体和活标记物测量CD4活化。通过流式细胞术分析细胞，并使用FlowJo FACS分析软件(Tree Star，Inc.；Ashland，OR)分析散点图。对于数据分析，刺激指数(SI)的计算方法是将每种处理的[live+CD4+CD134+CD137+和live+CD4+CD134+CD137-和live+CD4+CD134-CD137+]的细胞的平均百分比和/或最大百分比除以每次处理的仅培养基处理的孔(未受刺激的细胞)的[1ive+CD4+CD134+CD137+和live+CD4+CD134+CD137-和live+CD4+CD134-CD137+]的细胞的平均百分比和/或最大百分比。
通过上述方法分析五种不同的双特异性抗体，即，TDB1、TDB2、TDB3、TDB4和TDB5，它们各自具有与T细胞结合的抗原结合结构域。如图11A、11B、12A和12B所示，双特异性抗体的刺激指数高于已知具有低ADA率的
这些数据表明所有五种双特异性抗体都比
更具免疫原性。
为确认T细胞的活化依赖于生物治疗剂抗原的呈递，在存在HLA-II阻断抗体的情况下进行了测定(图13A)。如图13B所示，阻断HLA-II蛋白将双特异性抗体的刺激指数降低到与已知具有低ADA率的对照相当的值。
图14提供了对通过两种不同方法产生的对T细胞具有结合特异性的双特异性抗体的分析。第一种方法包括在单个细胞中表达两个抗原结合结构域以产生双特异性抗体，在图14中记为TDB4A。第二种方法包括在单独的细胞中表达每个抗原结合结构域，随后分离和组合抗原结合结构域以产生双特异性抗体，在图14中记为TDB4B。如图14所示，TDB4B导致比TDB4A更高的刺激指数。
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除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样，本文所呈现的特定特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于图示和描述的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施例的前文描述。其并不旨在穷举或将所公开的主题限制为所公开的那些实施例。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离所公开主题的精神或范围的情况下，可以对所公开主题的组成和方法进行各种修改和变化。因此，其意图为，所公开的主题包括在所附权利要求及其等同内容的范围内的修改和变化。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其内容通过引用整体合并于本文。
Claims (108)
1.一种用于确定组合物相对于参考倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，其包括：
(a)在存在所述组合物的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；
(b)在不存在所述组合物的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；
(c)确定是CD4+并且表达以下项的所述受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(d)确定是CD4+并且表达以下项的所述未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(e)计算刺激指数值；
其中当(e)中的所述刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则所述组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体，并且当(e)中的所述刺激指数值小于所述参考刺激指数值时，则所述组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考刺激指数值为从约1.0至约2.0。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、或约1.8或更大。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的所述百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的所述百分比来确定。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞包含T细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中至少30％的所述淋巴细胞包含T细胞。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述T细胞包含CD8-T细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中至少10％的所述T细胞包含CD8-T细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是从单个供体获得的。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是从约20个供体至约50个供体获得的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述淋巴细胞是从约35至约45个供体获得的。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中约1x105至约1x107个淋巴细胞与所述组合物一起培养。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞与约10μg/ul至约1,000μg/ml的所述组合物一起培养。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肽或多肽包含新抗原。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述多肽为抗体或其片段。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞与所述组合物一起培养约48小时或更短时间。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中确定是CD4+并且表达以下项的所述受刺激的或所述未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
23.一种用于确定组合物引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，其包括：
(a)在存在所述组合物的情况下分别培养来自个体供体的淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；
(b)在不存在所述组合物的情况下分别培养来自所述个体供体的淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；
(c)确定是CD4+并且表达以下项的来自所述个体供体的所述受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(d)确定是CD4+并且表达以下项的来自所述供体的所述未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)计算所述供体中的每一个的刺激指数值；并且
(f)计算其中所述供体的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值的反应性淋巴细胞供体的数量，以及其中所述供体的刺激指数值小于所述参考刺激指数值的非反应性淋巴细胞供体的数量；
其中如果反应性供体的数量大于供体的总数量的30％，则所述组合物具有高倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体；并且
如果反应性供体的数量小于供体的总数量的20％，则所述组合物具有低倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述参考刺激指数值为从约1.0至约2.0。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、或约1.8或更大。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过将在(c)中确定的个体供体的受刺激的淋巴细胞的所述百分比除以在(d)中确定的所述个体供体的未受刺激的淋巴细胞的所述百分比来确定。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞包含T细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中至少30％的所述淋巴细胞包含T细胞。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述T细胞包含CD8-T细胞。
31.根据权利要求30所述的方法，其中至少10％的所述T细胞包含CD8-T细胞。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是从约20个供体至约50个供体获得的。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述淋巴细胞是从约35至约45个供体获得的。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
35.根据权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述多肽为抗体或其片段。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述肽或多肽包含新抗原。
39.根据权利要求23至34中任一项所述的方法，其中所述组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
40.根据权利要求23至39中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞与所述组合物一起培养约48小时或更短时间。
41.根据权利要求23至40中任一项所述的方法，其中确定是CD4+并且表达以下项的所述受刺激的或所述未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
42.一种用于确定新抗原相对于参考抗原引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答的倾向的方法，其包括：
(a)在存在所述新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生受刺激的淋巴细胞；
(b)在不存在所述新抗原的情况下培养淋巴细胞以产生未受刺激的淋巴细胞；
(c)确定是CD4+并且表达以下项的所述受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(d)确定是CD4+并且表达以下项的所述未受刺激的淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(e)计算刺激指数值；
其中当(e)中的所述刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则所述新抗原具有较大的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(e)中的所述刺激指数值小于所述参考刺激指数值时，则所述新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述新抗原存在于与MHC II类分子的复合物中。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述参考刺激指数值为从约1.0至约2.0。
45.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、或约1.8或更大。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过将在(c)中确定的受刺激的淋巴细胞的所述百分比除以在(d)中确定的未受刺激的淋巴细胞的所述百分比来确定。
47.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞包含T细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中至少30％的所述淋巴细胞包含T细胞。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述T细胞包含CD8-T细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中至少10％的所述T细胞包含CD8-T细胞。
52.根据权利要求42至51中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞是从约20个供体至约50个供体获得的。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述淋巴细胞是从约35至约45个供体获得的。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述淋巴细胞是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
55.根据权利要求42至54中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞与所述新抗原一起培养约48小时或更短时间。
56.根据权利要求42至55中任一项所述的方法，其中确定是CD4+并且表达以下项的所述受刺激的或所述未受刺激的淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
57.一种用于执行根据权利要求1至56中任一项所述的方法的试剂盒。
58.一种用于确定组合物相对于参考倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，其包括：
(a)在存在所述组合物的情况下培养抗原呈递细胞(APC)以产生受刺激的APC；
(b)在不存在所述组合物的情况下培养APC以产生未受刺激的APC；
(c)将所述受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将所述未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；
(d)确定与表达以下项的所述受刺激的APC一起培养的所述CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)确定与表达以下项的所述未受刺激的APC一起培养的所述CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(f)计算刺激指数值；
其中当(f)中的所述刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则所述组合物具有较大的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体，并且当(f)中的所述刺激指数值小于所述参考刺激指数值时，则所述组合物具有较小的倾向引发对所述组合物具有特异性的抗体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述参考刺激指数值为从约1.0至约4.0、从约1.0至约3.0或从约1.8至约3.0。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大、或约3.0或更大。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过将在(d)中确定的CD4+淋巴细胞的所述百分比除以在(e)中确定的CD4+淋巴细胞的所述百分比来确定。
62.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
63.根据权利要求58至62中任一项所述的方法，其中所述CD4+淋巴细胞包含CD8-T细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中至少10％的所述CD4+淋巴细胞为CD8-T细胞。
65.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其中所述APC是从单个供体获得的。
66.根据权利要求58至64中任一项所述的方法，其中所述APC是从约20个供体至约50个供体获得的。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述APC是从约35个至约45个供体获得的。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
69.根据权利要求58至68中任一项所述的方法，其中将约1x105至约1x107个APC与所述组合物一起培养。
70.根据权利要求58至69中任一项所述的方法，其中所述APC与约10μg/ul至约1,000μg/ml的所述组合物一起培养。
71.根据权利要求58至70中任一项所述的方法，其中所述组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述肽或多肽包含新抗原。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述多肽为抗体或其片段。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
75.根据权利要求58至70中任一项所述的方法，其中所述组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
76.根据权利要求58至75中任一项所述的方法，其中所述APC与所述组合物一起培养约48小时或更短时间。
77.根据权利要求58至76中任一项所述的方法，其中确定表达以下项的所述CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
78.一种用于确定组合物引发产生对所述组合物具有特异性的抗体的倾向的方法，其包括：
(a)在存在所述组合物的情况下分别培养来自个体供体的APC以产生受刺激的APC；
(b)在不存在所述组合物的情况下分别培养来自所述个体供体的APC以产生未受刺激的APC；
(c)将所述受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将所述未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；
(d)确定与表达以下项的所述受刺激的APC一起培养的所述CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)确定与表达以下项的所述未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(f)计算所述供体中的每一个的刺激指数值；并且
(g)计算其中所述供体的刺激指数值大于或等于参考刺激指数值的反应性淋巴细胞供体的数量，以及其中所述供体的刺激指数值小于所述参考刺激指数值的非反应性淋巴细胞供体的数量；
其中如果反应性供体的数量大于供体的总数量的30％，则所述组合物具有高倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体；并且
如果反应性供体的数量小于供体的总数量的20％，则所述组合物具有低倾向引发产生对所述组合物具有特异性的抗体。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述参考刺激指数值为从约1.0至约4.0、从约1.0至约3.0或从约1.8至约3.0。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大、或约3.0或更大。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过将在(d)中确定的个体供体的CD4+淋巴细胞的所述百分比除以在(e)中确定的所述个体供体的CD4+淋巴细胞的所述百分比来确定。
82.根据权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
83.根据权利要求78至82中任一项所述的方法，其中所述CD4+淋巴细胞包含CD8-T细胞。
84.根据权利要求83所述的方法，其中至少10％的所述CD4+淋巴细胞为CD8-T细胞。
85.根据权利要求78至84中任一项所述的方法，其中所述APC是从约20个供体至约50个供体获得的。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述APC是从约35个至约45个供体获得的。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
88.根据权利要求78至87中任一项所述的方法，其中所述组合物包含肽、多肽或小分子化合物。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述多肽为抗体或其片段。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
91.根据权利要求88所述的方法，其中所述肽或多肽包含新抗原。
92.根据权利要求78至87中任一项所述的方法，其中所述组合物为抗体-药物缀合物(ADC)。
93.根据权利要求78至92中任一项所述的方法，其中所述APC与所述组合物一起培养约48小时或更短时间。
94.根据权利要求78至93中任一项所述的方法，其中确定表达以下项的所述CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
95.一种用于确定新抗原相对于参考抗原引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答的倾向的方法，其包括：
(a)在存在所述新抗原的情况下培养APC以产生受刺激的APC；
(b)在不存在所述新抗原的情况下培养APC以产生未受刺激的APC；
(c)将所述受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起以及将所述未受刺激的APC与CD4+淋巴细胞一起分别培养；
(d)确定与表达以下项的所述受刺激的APC一起培养的所述CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；
(e)确定与表达以下项的所述未受刺激的APC一起培养的CD4+淋巴细胞的百分比：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137；以及
(f)计算刺激指数值；
其中当(f)中的所述刺激指数值大于或等于参考刺激指数值时，则所述新抗原具有较大的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答，并且当(f)中的所述刺激指数值小于所述参考刺激指数值时，则所述新抗原具有较小的倾向引发对所述新抗原具有特异性的免疫应答。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述新抗原存在于与MHC II类分子的复合物中。
97.根据权利要求95或96所述的方法，其中所述参考刺激指数值为从约1.0至约4.0、从约1.0至约3.0或从约1.8至约3.0。
98.根据权利要求95或96所述的方法，其中所述参考刺激指数值为约1.6或更大、约1.7或更大、约1.8或更大、约1.9或更大、约2.0或更大、约2.1或更大、约2.2或更大、约2.3或更大、约2.4或更大、约2.5或更大、约2.6或更大、约2.7或更大、约2.8或更大、约2.9或更大、或约3.0或更大。
99.根据权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过将在(d)中确定的CD4+淋巴细胞的所述百分比除以在(e)中确定的CD4+淋巴细胞的所述百分比来确定。
100.根据权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述刺激指数值通过异常值和分析来确定或通过线性回归来确定。
101.根据权利要求95至100中任一项所述的方法，其中所述CD4+淋巴细胞包含CD8-T细胞。
102.根据权利要求101所述的方法，其中至少10％的所述CD4+淋巴细胞为CD8-T细胞。
103.根据权利要求95至102中任一项所述的方法，其中所述APC是从约20个供体至约50个供体获得的。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述APC是从约35个至约45个供体获得的。
105.根据权利要求103所述的方法，其中所述APC是从至少约20个供体、至少约25个供体、至少约30个供体、至少约35个供体、至少约40个供体或至少约45个供体获得的。
106.根据权利要求95至105中任一项所述的方法，其中所述APC与所述新抗原一起培养约48小时或更短时间。
107.根据权利要求95至106中任一项所述的方法，其中确定表达以下项的所述CD4+淋巴细胞的百分比是通过流式细胞术进行的：(i)CD134；(ii)CD137；或(iii)CD134和CD137。
108.一种用于执行根据权利要求58至107中任一项所述的方法的试剂盒。
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