KR20160065872A - 암을 치료하기 위한 ly75에 대한 접합 항체 - Google Patents

암을 치료하기 위한 ly75에 대한 접합 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20160065872A
KR20160065872A KR1020167009799A KR20167009799A KR20160065872A KR 20160065872 A KR20160065872 A KR 20160065872A KR 1020167009799 A KR1020167009799 A KR 1020167009799A KR 20167009799 A KR20167009799 A KR 20167009799A KR 20160065872 A KR20160065872 A KR 20160065872A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
cancer
cell
lymphoma
cells
Prior art date
Application number
KR1020167009799A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102357173B1 (ko
Inventor
조나단 알렉산더 테렛
제임스 에드워드 애크로이드
Original Assignee
옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드 filed Critical 옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드
Publication of KR20160065872A publication Critical patent/KR20160065872A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102357173B1 publication Critical patent/KR102357173B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A61K47/48369—
    • A61K47/48561—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

본 발명은 LY75에 결합하는 항체를 제공한다. 항체를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체를 발현시키는 방법 또한 제공된다. 항체는 췌장암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 피부암, 갑상선암, 폐암, 방광암, 다발성 골수종 및 림프종을 포함하는 암의 치료에 사용될 수 있다.

Description

암을 치료하기 위한 LY75에 대한 접합 항체 {CONJUGATED ANTIBODIES AGAINST LY75 FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 일반적으로 면역학 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, LY75에 대하여 유도된 항체 및 기타 치료적 단백질, 이러한 항체 및 치료적 단백질을 코딩하는 핵산, 단일 클론 항체 및 기타 치료적 단백질을 제조하는 방법 및 질환 예를 들어 LY75 발현/활성에 의해 매개되고/되거나 이에 따른 리간드의 이상 발현/활성과 연관된 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
림프구 항원 75는 세포외 공간으로부터 포획된 항원을 전문화된 항원 처리 구획으로 유도하는 식작용 수용체로 작용하고, B-림프구의 증식의 감소를 유발하는 것으로 여겨진다. 림프구 항원 75의 발현은 췌장, 난소, 유방, 직장결장, 식도, 피부, 갑상선 및 폐(비소세포)암뿐 아니라 다발성 골수종 및 다수의 상이한 하위유형의 림프종 및 백혈병에서 관찰된다.
WO2009/061996은 인간 DEC-205(LY75)에 결합하는 단리된 단일 클론 항체 및 관련 항체 기반 조성물 및 분자를 개시한다. 또한, 항체를 포함하는 약학 조성물뿐 아니라 항체를 사용하는 치료 및 진단 방법도 개시된다.
WO2008/104806는 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 LY75에 결합할 수 있는 친화도 시약을 개시한다.
본 발명은 LY75에 대해 유도된 항체, 이러한 항체를 코딩하는 핵산, 본 발명의 항체를 코딩하는 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포, 항-LY75를 제조하기 위한 방법, 및, LY75 매개 장애, 예를 들어, 췌장암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 피부암, 갑상선암, 폐암, 두경부암, 방광암, 위암, 백혈병, 다발성 골수종및 림프종을 포함하는 인간암과 같은 질환의 치료를 위한 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 LY75 상의 에피토프에 결합하거나, 또는 (b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 LY75에 결합하기 위해 경쟁하는 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 제공한다.
일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 인간 LY75에 결합하고 서열 번호 5, 6, 및 7을 포함하는 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 8, 9 및 10을 포함하는 CDR로 이루어진 군으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 항체는 단리된 항체이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 LY75(서열 번호 15)에 결합하고 LY75를 발현하는 세포에 의해 내재화되고, 작동자 세포의 존재 하에 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 반응을 유발하거나 작동자 세포의 존재 하에 세포독성 T 세포 반응을 유발한다.
다른 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 특정 항체(예를 들어, 본원에서 "LY75_A1"로 지칭됨)의 중쇄 및/또는 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 서열 번호 1에 나타낸 서열을 가지는 항체 LY75_A1의 중쇄 가변(VH) 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및/또는 서열 번호 2에 나타낸 서열을 가지는 LY75_A1의 경쇄 가변(VL) 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR; 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR; 및 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 선택적으로 하나 이상의 임의의 CDR이 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결손을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 LY75에 결합하고 서열 번호 1 및/또는 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체는 서열 번호 2 및/또는 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 경쇄 가변 영역을 더 포함할 수 있다.
추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 LY75에 결합하고, 각각, 서열 번호 1 및/또는 2에 기재된 아미노산 서열 및 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
임의의 위의 서열에 대해 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 이상 서열 동일성을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 위에 언급된 값의 중간 범위, 예를 들어, 임의의 위의 서열에 대해 적어도 80~85%, 85~90%, 90~95% 또는 95~100% 서열 동일성을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 영역도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, 항체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 1에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 2 또는 서열 번호 2에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 16, 17, 18 및 19에 나타낸 바와 같이 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역의 골격(framework)에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 골격 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 20, 21, 22 및 23에 나타낸 바와 같이, 서열 번호 2의 경쇄 가변 영역의 골격에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 골격 영역을 포함한다.
또한, LY75에 결합하기 위해 본 발명의 항체와 경쟁하는 항체도 본 발명에 포함된다. 특정한 일 구현예에서, 항체는 각각 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 LY75에 결합하기 위해 경쟁한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(LY75_A1)와 LY75에 결합하기 위해 경쟁한다.
본 발명의 다른 항체는 동일한 에피토프 또는 본원에 기술된 항체에 의해 인지되는 LY75 상의 에피토프에 결합한다. 다른 특정한 구현예에서, 항체는, 각각, 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 LY75 상의 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체(LY75_A1)에 의해 인지되는 LY75 상의 에피토프에 결합한다.
추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 펩티드(들)에 특이적으로 결합하되, 상기 단편은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 연속(contiguous) 아미노산을 포함한다. 추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프는 서열 번호 27, 29, 30, 34, 35, 36 또는 37 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 펩티드, 2개 이상 또는 3개 이상의 펩티드를 포함하되, 상기 단편은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함한다. 추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프는 서열 번호 30, 36 및 37 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 펩티드, 예를 들어, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함하되, 상기 단편은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함한다.
추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 모 항체와 비교하여 가변 CDR을 포함한다. 따라서 본 발명은 모 항체의 변이형 가변 영역을 포함하는 변이형 항체를 제공하되, 모 항체는 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR, 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR, 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR, 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR, 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR 및 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR을 포함하고, 변이형 항체는, 특정 용도의 1 내지 4, 1 내지 3 또는 1 내지 2개의 치환을 가지는, 제1 vhCDR, 제2 vhCDR, 제3 vhCDR, 제1 vICDR, 제2 vICDR 및 제3 vICDR의 세트에서 총괄적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산 치환을 가지며, 항체는 LY75에 대한 특이적인 결합을 보유한다.
본 발명의 항체는 전장, 예를 들어, 다음의 이소형 중 임의의 것일 수 있다: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgAsec, IgD, 및 IgE. 대안적으로, 항체는 단편, 예를 들어 항원 결합 부위 또는 단일 사슬 항체(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 Fv 단편, 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 둘 이상의 단리된 CDR의 조합)일 수 있다. 항체는, 이에 제한되지는 않으나, 인간, 인간화, 및 키메라 항체를 포함하는 임의의 종류의 항체일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 면역접합체(즉, 공유 부착된 모이어티를 더 포함함)의 형태이다. 특정한 일 구현예에서, 모이어티는 약물, 예를 들어, 메이탄시노이드(maytansinoid), 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴(auristatin), 트리코테센(trichothecene), 칼리케아미신(calicheamicin), CC1065 또는 이의 유도체이다. 바람직한 일 구현예에서, 약물 모이어티는 DM1 또는 DM4이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자를 더 포함하고, 이에 따라 작동자 세포의 존재 하에 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 반응을 유발하여, LY75를 발현하는 세포를 살상할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자를 더 포함하고 이에 따라 작동자 세포의 존재 하에 세포독성 T 세포 반응을 유발함으로써 LY75를 발현하는 세포를 살상할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다. 다른 구현예에서 본 발명의 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산이 제공된다. 추가의 일 구현예에서 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 LY75에 결합하는 단리된 단일 클론 항체를 제공하되, 항체는 각각 서열 번호 3 및 4를 포함하는 핵산 서열 또는 전술된 핵산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가지는 핵산 서열 또는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열 번호 3 및 4와 상이한 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 전술된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게, 숙주 세포는, 숙주 세포가 핵산(들)이 발현되는 조건 하에 성장할 때 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 부위를 발현한다.
바람직한 일 구현예에서, 숙주 세포는 (i) 본 발명에 따른 발현 벡터; 또는 (ii) 본 발명의 항체의 중쇄 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터 및 본 발명의 항체의 경쇄 또는 이의 항원 결합 부위를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포를 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계 및 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 선택적으로 단리하는 단계를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 제조하는 것이 제공된다.
추가의 일 양태에서 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공되되, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 LY75를 발현하는 세포에 의해 내재화되며, 상기 항체 또는 항원 결합 부위는 공유 부착된 약물 접합체를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 LY75(서열 번호 15)에 결합하는 것이라는 점이 이해될 것이다. 일 구현예에서, 항체는 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR; 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR; 및 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 공유 부착된 약물 접합체를 포함한다.
추가의 일 양태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되되, 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체들 또는 이의 항원 결합 부위를 투여하고 이러한 본 발명의 항체 또는 항체들 또는 이의 항원 결합 부위는 작동자 세포의 존재 하에 ADCC 반응을 유발한다. 바람직하게, 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR; 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR; 및 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가의 일 양태에서 암을 치료하는 방법이 제공되되, 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체들 또는 이의 항원 결합 부위를 투여하고 이러한 본 발명의 항체 또는 항체들 또는 이의 항원 결합 부위는 작동자 세포의 존재 하에 세포독성 T 세포 반응을 유발한다. 바람직하게, 항체는 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR; 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR; 및 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 추가의 일 양태에서, 암의 치료에 사용하기 위한 하나 이상의 본 발명의 항체가 제공된다.
또한, 암의 치료를 위한 약제의 제조에서의 하나 이상의 본 발명의 항체의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, 암은 췌장암, 신장암, 간암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 방광암, 위암, 폐암, 백혈병, 골수종, 바람직하게는 다발성 골수종, 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 암은 비호지킨(non-Hodgkin's) 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt's) 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 방광암, 췌장암 및 3중 음성 유방암을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 대상체에서 암의 진행을 검출하고/하거나, 진단하고/하거나 스크리닝 또는 모니터링 하는 방법으로서, LY75가 상기 암에서 발현되는 것인 방법, 또는 상기 암에 대해 유도된 암 약물 또는 치료 요법의 효과를 모니터링 하는 방법이 제공되되, 이러한 방법은 LY75에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 하나 이상의 이의 단편의 수준 또는 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 암은 췌장암, 신장암, 간암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 방광암, 위암, 폐암, 백혈병, 골수종, 바람직하게는 다발성 골수종, 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 암은 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 방광암, 췌장암 및 3중 음성 유방암을 포함한다.
또한, 본 발명의 조성물(예를 들어, 항체) 및 선택적으로 사용 지침을 포함하는 키트도 본 발명의 범주 이내이다. 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약 또는 하나 이상의 추가적인 본 발명의 항체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명확해질 것이다.
도 1은 LY75_A1 중쇄(서열 번호 1), 인간 VH 3-15 생식계열(서열 번호 11) 및 인간 JH4 생식계열(서열 번호 12)의 정렬을 도시한 것이다. LY75_A1 중쇄의 CDR 영역에 밑줄이 쳐져 있다.
도 2는 LY75_A1 경쇄(서열 번호 2), 인간 VK 012 생식계열(서열 번호 13) 및 인간 JK4 생식계열(서열번호 14)의 정렬을 도시한 것이다. LY75_A1 경쇄의 CDR 영역에 밑줄이 쳐져 있다.
도 3a는 HT-29에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이고, 대부분의 항체가 LY75에 결합하지만 단지 일부만 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 3b는 HT-29에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3c는 RAJI 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3d는 Namalwa 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3e는 Karpas 299세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3f는 BxPC3 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3g는 HupT4 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3h는 HPAFFII 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3i는 EHEB 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3j는 Mec-1 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3k는 AML-193 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3l는 HCC 70 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3m은 HCC 1806 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3n은 MDA-MB-468 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3o는 RT4 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3p는 5637 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3q는 SW780 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3r은 SCC-9 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3s는 OE 19 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3t는 OVCAR-3 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3u는 SK-OV-3 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3v는 MOLP-8 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 3w는 RPMI8226 세포에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 세포독성 활성을 도시한 것이다.
도 4a는 Raji 버킷 림프종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 효능을 도시한 것이다.
도 4b는 Namalwa 버킷 림프종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 효능을 도시한 것이다.
도 4c는 HPAFII 췌장 선암종 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 효능을 도시한 것이다.
도 4d는 SW780 인간 방광 암종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 효능을 도시한 것이다.
도 4e는 MDA-MB-468 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 효능을 도시한 것이다.
도 4f는 COLO205 직장결장 선암종 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 DM1 또는 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 효능을 도시한 것이다.
도 5a는 MCC-DM1에 접합된 항-LY75-mAb 및 항-LY75-mAb의 경쟁적 결합을 나타낸 것이다.
도 5b는 MCC-DM1에 접합된 항-LY75-mAb 및 LY75_A1의 비경쟁적 결합을 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6j는 펩티드 마이크로어레이 상에서 LY75 펩티드에 대한 항체 LY75_A1의 결합의 대표도를 나타낸 것이다.
도 7은 펩티드 마이크로어레이 검정 및 펩티드 풀 다운 검정에서 항체 LY75_A1에 의해 결합된 펩티드들의 아미노산 정렬을 보여주는 것이다. 강조된 펩티드는 항체 LY75_A1에 의해 인지되는 에피토프를 형성하는 경향이 있는 펩티드이다.
본 개시는 본원에 개략된 바와 같이 서열 번호 15에 기술된 LY75 단백질에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 LY75 항체는 이중특이적 분자일 수 있고, 이처럼 작동자 세포의 존재 하에 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 반응을 유발함으로써, LY75를 발현하는 세포를 살상할 수 있다.
또한, 본 발명의 LY75 항체는 이중특이적 분자일 수 있고, 이처럼 작동자 세포의 존재 하에 세포독성 T 세포 반응을 유발하여, LY75를 발현하는 세포를 살상할 수 있다.
또한, 본 발명의 LY75 항체는 LY75 수용체를 발현하는 세포와 접촉될 때 내재화될 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, LY75 수용체는 이에 제한되지는 않으나, 신장암, 간암, 식도암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 위암, 직장결장암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암 방광암, 백혈병 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병, 골수종, 바람직하게는 다발성 골수종, 림프종, 바람직하게는 DLBCL B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 및 폐암을 포함하는 일정한 암 세포 상에서 구분되게 발현되고/되거나 과발현된다.
이처럼, 본 발명의 LY75 항체가 약물에 접합(때때로 본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭됨)될 때, 이러한 ADC 분자의 암 세포로의 내재화는 세포 사멸 및 이에 따른 종양 치료를 야기한다.
본 발명은 특정 아미노산 서열을 가지는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특징을 소유하는 항체를 제공한다. 친화도 시약을 형성할 수 있는 한 세트의 CDR, 예를 들어, LY75에 대한 결합을 나타내는 항체가 본원에 기술된다.
따라서 본 개시는 항체, 바람직하게는 단리된 항체(아래에서 개략된 바와 같이, 다양한 종류의 잘 알려진 항체 구조, 유도체, 모사체 및 접합체를 포함함), 이러한 항체를 코딩하는 핵산, 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포, 항체를 제조하는 방법, 및 항체 및 선택적으로 약학적 담체를 포함하는 약학 조성물, 치료의 방법 및 항체의 사용을 포함하는 진단 및 암의 치료를 위한 항체의 용도를 제공한다.
LY75 단백질
림프구 항원 75는 세포외 공간으로부터 포획된 항원을 전문화된 항원 처리 구획으로 유도하는 식작용 수용체로 작용하고, B-림프구의 증식의 감소를 유발하는 것으로 여겨진다.
SWISS-PROT에 다르면, 림프구 항원 75는 비장, 흉선, 대장 및 말초 혈액 림프구에서 발현된다. 림프구 항원 75는 골수 및 B 림프구 세포주에서 검출된다. 본원에서 OGTA076b 및 OGTA076c로 지정된 이소형은 호지킨 및 리드 스턴버그(Hodgkin's and Reed-Sternberg(HRS)) 세포로 일컬어지는 악성 호지킨 림프종 세포에서 발현된다. LY75는 세포외 공간으로부터 포획된 항원을 전문화된 항원 처리 구획으로 유도하는 식작용 수용체로 작용하고, B-림프구의 증식의 감소를 유발하는 것으로 여겨진다.
LY75의 발현은 췌장, 방광, 난소, 유방(3중 음성 포함함), 직장결장, 식도, 피부, 갑상선 및 폐(비소세포) 암뿐 아니라 다발성 골수종 및 많은 상이한 하위유형의 림프종(DLBCL을 포함함) 및 백혈병에서 관찰된다.
본 발명의 항체는, 일정한 사례에서, 인간이 아닌 다른 종으로부터의 LY75와 교차 반응할 수 있다. 예를 들어, 임상 시험을 용이하게 하기 위해, 본 발명의 항체는 뮤라인 또는 영장류 LY75 분자와 교차 반응할 수 있다. 대안적으로, 일정한 구현예에서, 항체는 인간 LY75에 완전히 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 유형의 비인간 교차 반응성을 나타내지 않을 수 있다.
항체
본 발명은 항-LY75 항체, 일반적으로 본원에 기술된 치료적 및/또는 진단 항체를 제공한다. 본 발명에서 용도가 발견된 항체는 통상적인 항체뿐 아니라 아래에 기술된 항체 유도체, 단편 및 모사체를 포함하는 본원에 기술된 다수의 포맷을 취할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같이 한 세트의 6개의 CDR(아래에 기술된 소수의 아미노산 변형을 포함함)을 함유하는 항체 구조를 제공한다.
본원에서 사용된 "항체"는, 당해 분야에서 이해될 것인 바와 같이, 일부 구현예에서, 최소한 본원에 정의된 한 세트의 6개의 CDR을 함유하는, 다양한 종류의 구조를 포함하며, 이에 제한되지는 않으나 통상적인 항체(단일 클론 및 다중 클론 항체를 포함함), 인간화 및/또는 키메라 항체, 항체 단편, 조작된 항체(예를 들어, 아래에 개략된 아미노산 변형을 가짐), 다중특이적 항체(이중특이적 항체를 포함함), 및 당해 분야에 알려진 다른 유사체를 포함한다.
통상적인 항체 구조 단위는 통상적으로 4량체를 포함한다. 각각의 4량체는 통상적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는데, 각각의 쌍은 하나의 "경"(통상적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 하나의 "중" 쇄(통상적으로 약 50~70 kDa의 분자량을 가짐)을 가진다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형인 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 각각 정의된다. IgG는, 이에 제한되지는 않으나 lgG1, lgG2, lgG3, 및 lgG4를 포함하는 몇몇 서브클래스를 가진다. IgM는, 이에 제한되지는 않으나, lgM1 및 lgM2를 포함하는 서브클래스를 가진다. 따라서 본원에서 사용된 "이소형"은 그들의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특성에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 서브클래스를 의미한다. 알려진 인간 면역글로불린 이소형은 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, lgA2, lgM1, lgM2, IgD, 및 IgE이다. 치료적 항체가 또한 이소형 및/또는 서브클래스의 임의의 조합의 혼성을 포함할 수 있다는 점이 이해되어야 한다.
많은 구현예에서, 다수의 적용에서 특정한 용도가 발견된 lgG1을 포함하는, IgG 이소형이 본 발명에서 사용된다.
각 사슬의 아미노 말단 부위는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 가변 영역에서, 중쇄 및 경쇄의 각각의 V 도메인에 대해 3개의 루프가 합쳐져서 항원 결합 자리를 형성한다. 각각의 루프는 상보성 결정 영역(본원에서 "CDR"로 지칭됨)이라 지칭되며, 아미노산 서열에서의 변형이 가장 유의하다. "가변"은 항체 간 서열에서 가변 영역의 일정한 세그먼트가 광범위하게 다르다는 사실을 지칭한다. 가변 영역 내 가변성은 고르게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은, 각각 9~15개 아미노산 길이 또는 더 긴 "과가변 영역"이라 불리는 극도로 가변성인 짧은 영역에 의해 분리되는 골격 영역(FR)이라 불리는 15~30개의 아미노산의 상대적으로 불변인 구간으로 이루어진다.
각 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카복시 말단까지 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열된 3개의 과가변 영역("상보성 결정 영역," "CDR") 및 4개의 FR로 구성된다
과가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역 내 대략 아미노산 잔기 24~34(LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50~56(LCDR2) 및 89~97(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역 내 대략 약 31~35B(HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50~65(HCDR2), 및 95~102(HCDR3)로부터의 아미노산 잔기; Kaba. 등(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 과가변 루프를 형성하는 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 영역 내 잔기 26~32(LCDR1), 50~52(LCDR2) 및 91~96(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역 내 26~32(HCDR1), 53~55(HCDR2) 및 96~101(HCDR3); Chothia 및 Lesk((1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)를 포함한다. 본 발명의 특이적인 CDR이 아래에 기술된다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 가변 도메인 내 잔기(대략, 경쇄 가변 영역의 잔기 1~107 및 중쇄 가변 영역의 잔기 1~113)를 지칭할 때 카바트 번호 시스템이 일반적으로 사용된다(예를 들어, Kabat et al., 위(1991)).
CDR은 항원 결합, 더욱 구체적으로, 항체의 에피토프 결합 자리의 형성에 기여한다. "에피토프" 또는 "항원성 결정부"라는 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 자리를 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매에 대한 노출에서도 유지되지만, 3차 접힙에 의해 형성된 에피토프는 통상적으로 변성 용매로의 처리로 소실된다. 에피토프는 통상적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 고유한 공간 형태로 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같이, 주어진 항체에 대해 어떠한 에피토프가 결합하지는 결정하는 방법(즉, 에피토프 맵핑)은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 면역블롯팅 및 면역침전 검정을 포함하되, LY75로부터 중첩 또는 연속 펩티드를 주어진 항-LY75 항체와의 반응성에 대해 시험한다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은, 당해 분야의 기술 및 본원에 기술된 기술, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차 핵 자기 공명(예를 들어, 문헌(Epitope Mapping Protocoles in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.(1996)) 참조)를 포함한다. "에피토프 맵핑"이라는 용어는 항체-항원 인식을 위한 분자 결정부의 식별 과정을 지칭한다.
각 사슬의 카복시 말단부는 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. Kabat 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 다수의 일차 서열을 수집하였다. 서열의 보존성의 정도에 기반하여, Kabat 등은 각각의 일차 서열을 CDR 및 골격으로 분류하였고, 이의 목록을 만들었다(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al. 참조).
면역글로불린의 IgG 서브클래스에서, 중쇄 내에 몇몇 면역글로불린 도메인이 존재한다. "면역글로불린(Ig) 도메인"은 본원에서 구분되는 3차 구조를 가지는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 본 발명에서 관심 있는 것은 불변 중쇄(CH) 도메인 및 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이다. IgG 항체의 맥락에서, IgG 이소형 각각은 3개의 CH 영역을 가진다. 따라서, IgG 맥락에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 Kabat 내에 있는 바와 같은 EU 인덱스에 따라 위치 118~220을 지칭한다. "CH2"는 Kabat 내에 있는 바와 같은 EU 인덱스에 따라 위치 237~340을 지칭하고 "CH3"은 카바트와 같은 EU 인덱스에 따라 위치 341~447을 지칭한다.
중쇄의 Ig 도메인의 다른 유형은 힌지 영역이다. "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "면역글로불린 힌지 영역"은 본원에서 항체의 제1 및 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 유연한 폴리펩티드를 의미한다.
구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 종결되고 IgG CH2 도메인이 EU 위치 237 잔기에서 시작한다. 따라서 IgG 항체의 경우, 힌지는 본원에서 위치 221(lgG1 내 D221) 내지 236(lgG1 내 G236)을 포함하는 것으로 정의되되, 번호는 Kabat 내에 있는 바와 같은 EU 인덱스를 따른다. 일부 구현예에서, 예를 들어 Fc 영역의 맥락에서, 저부 힌지가 포함되는데, "저부 힌지"는 일반적으로 위치 226 또는 230을 지칭한다.
본 발명에서 특히 관심 있는 것은 Fc 영역이다. 본원에서 사용된 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역 및 일부 사례에서, 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서 Fc는 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이러한 도메인에 대한 유연한 힌지 N 말단을 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3(Cγ2 및 Cγ3) 및 Cγ1(Cγ1) 및 Cγ2(Cγ2) 사이의 저부 힌지 영역을 포함한다. 비록 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 카복시 말단에 대한 잔기 C226 또는 P230을 포함하는 것으로 정의되되, 번호는 Kabat 내에 있는 바와 같은 EU 지수를 따른다. 아래에서 더욱 완전하게 기술되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 예를 들어, 하나 이상의 FcγR 수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 바꾸기 위해 아미노산 변형이 Fc 영역에 만들어진다.
일부 구현예에서, 항체는 전장이다. 본원에서 “전장 항체"는, 본원에 개략된 하나 이상의 변형을 포함하는, 가변 및 불변 영역을 포함하는 항체의 자연적인 생물학적 형태를 이루는 구조를 의미한다.
대안적으로, 항체는, 이에 제한되지는 않으나, 각각, 항체 단편, 단일 클론 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체(때때로 본원에서 "항체 모사체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 항체 융합(때때로 "항체 접합체"로 지칭됨), 및 각각의 단편을 포함하는 다양한 구조일 수 있다. 한 세트의 CDR의 용도에 따른 구조도 "항체"의 정의 내에 포함된다.
일 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 구체적인 항체 단편은, 이에 제한되지는 않으나, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 단일 가변 영역으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., 1989, Nature 341:544-546, 전체가 참조로서 포함됨), (v) 단리된 CDR 영역, (vi) 2개의 결합된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (vii) 단일 사슬 Fv 분자(scFv)로서, VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인이 항원 결합 자리를 형성하기 위해 결합하는 것을 가능하게 하는 펩티드 링커에 의해 결합된다(Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, 전체가 참조로서 포함됨), (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv(WO 03/1 1161, 참조로서 본원에 포함됨) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디" 또는 "트리아바디"(Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 모두 전체가 참조로서 포함됨)을 포함한다.
키메라 및 인간화 항체
일부 구현예에서, 항체는 상이한 종으로부터의 혼합, 예를 들어, 키메라 항체 및/또는 인간화 항체일 수 있다. 즉, 본 발명에서, CDR 세트는 본원의 서열에 구체적으로 기술된 것 외의 골격 및 불변 영역과 함께 사용될 수 있다.
일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화 항체"는 하나를 초과하는 종으로부터의 영역을 조합한 항체를 지칭한다. 예를 들어, "키메라 항체"는 통상적으로 마우스(또는 일부 경우에서 랫트)로부터의 가변 영역(들) 및 인간으로부터의 불변 영역(들)을 포함한다. "인간화 항체"는 일반적으로 인간 항체에서 발견되는 서열과 교환하기 위한 가변 도메인 골격 영역을 가졌던 비인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, CDR을 제외한 전체 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나 CDR을 제외하고는 이러한 항체와 동일하다. 일부 또는 전부가 비인간 유기체에서 기인한 핵산에 의해 코딩된 CDR이 인간 항체 가변 영역의 베타 시트 골격에 이식되어 항체의 특이성이 이식된 CDR에 의해 결정되는 항체가 생성된다. 이러한 항체의 생성은, 예를 들어, 문헌(WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536, 모두 전체가 참조로서 포함됨)에 기술되어 있다. 상응하는 공여자 잔기에 대한 선택된 수여자 골격 잔기의 "역돌연변이"가 종종 초기 이식 구조체에서 소실된 친화도를 재획득하기 위해 필요하다(US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, 모두 전체가 참조로서 포함됨). 또한, 인간화 항체는 최적으로는 통상적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역인 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이고, 이에 따라 통상적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 유전적으로 조작된 면역계를 가지는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. Roque 등(2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654) 그 전체가 참조로서 포함된다. 인간화 및 비인간 항체의 표면치환(reshaping)을 위한 다양한 기술 및 방법들은 당해 분야에 잘 알려져 있다(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA), 및 이에 인용된 참조, 모두 전체가 참조로서 포함됨). 인간화 방법은, 이에 제한되지는 않으나 문헌(Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160:1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 1 1:321-8, 모두 전체가 참조로서 포함됨)에 기술된 방법을 포함한다. 인간화 또는 비인간 항체 가변 영역의 면역원성을 낮추는 다른 방법은, 예를 들어, Roguska 등(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973, 전체가 참조로서 포함됨)에 기술된 표면 치환 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 모 항체는 당해 분야에 알려진 바와 같이 친화도 성숙된다. 예를 들어, USSN 1 1/004,590에 기술된 바와 같은 구조 기반 방법이 인간화 및 친화도 성숙을 위해 채용될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 문헌(Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10)753-759, 모두 전체가 참조로서 포함됨)에 기술된 방법을 포함하는 선택 기반 방법이 항체 가변 영역을 친화도 성숙시키고/시키거나 인간화시키기 위해 채용될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 문헌(USSN 09/810,510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084, 모두 전체가 참조로서 포함됨)에 기술된 방법을 포함하는 다른 인간화 방법은 CDR의 단지 일부만의 이식에 관련될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 다중특이적 항체, 특히, 때때로 "디아바디"로도 지칭되는 이중특이적 항체일 수 있다. 이러한 항체들은 2종(이상)의 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다. 디아바디는 당해 분야에 알려진 다양한 방식으로 제조될 수 있는데(Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449, 전체가 참조로서 포함됨), 예를 들어, 화학적으로 또는 혼성 하이브리도마로부터 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소화된 항체 유사 단백질이다. Hu 등(1996, Cancer Res. 56:3055-3061), 전체가 참조로서 포함됨. 일부 경우에서, scFv는 Fc 영역에 연결될 수 있고 일부 또는 전체 힌지 영역을 포함할 수 있다. 미니바디가 CDR의 전체 세트를 가지지 않는다는 사실에도 불구하고, 미니바디는 "항체"의 정의 내에 포함된다는 점을 주지하여야 한다.
본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 재조합된다. 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용될 때 "단리된"은 폴리펩티드가 발현되었던 세포 또는 세포 배양물로부터 식별되고/되거나 분리되고/되거나 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 따라서 단리된 항체는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체(예를 들어, LY75가 아닌 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 LY75에 특이적으로 결합하는 단리된 항체)를 지칭하고자 하는 의도이다. 따라서 "단리된" 항체는 자연계에서 보통 발견되지 않는 (예를 들어, 자연적으로 발생하지 않는) 형태로 발견되는 것이다. 본원에 정의된 단리된 항체는, 일 구현예에서, “자연적으로” 발생하는 항체에서는 발생하지 않는 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산은 첨가 또는 치환의 방식에 의해 도입될 수 있다. 도입된 아미노산은 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않는 아미노산일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 재조합 단백질, 단리된 단백질 또는 실질적으로 순수한 단백질이다. "단리된" 단백질은, 예를 들어 주어진 시료 내 총 단백질의 적어도 약 5%, 또는 적어도 약 50% 중량비를 구성하는, 자연적인 상태에서는 보통 결합되어 있는 물질의 적어도 일부를 동반하지 않는다. 단리된 단백질은 환경에 따라 총 단백질 함량의 5 내지 99.9% 중량비를 차지할 수 있다는 점이 이해된다. 예를 들어, 단백질은 단백질이 증가된 농도 수준으로 제조되도록 유도성 프로모터 또는 고발현 프로모터의 사용을 통해 유의하게 높은 농도로 제조된다. 재조합 단백질의 경우, 정의는, 재조합 단백질이 자연적으로 생성되지 않는, 매우 다양한 당해 분야에 알려진 유기체 및/또는 숙주 세포에서의 항체의 생성을 포함한다. 보통, 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가지는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 예를 들어, LY75에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 LY75가 아닌 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다.
상이한 특이성을 가지는 단리된 단일 클론 항체는 잘 정의된 조성물과 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 항체는, 아래에서 더 논의되는 바와 같이, 제형 내에 선택적이고 개별적으로 포함되거나 제외될 수 있다.
본 발명의 항-LY75 항체는 LY75(예를 들어, 서열 번호 15)에 특이적으로 결합한다. 특정 항원 또는 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"라는 것은 비특이적 상호작용과는 측정가능하게 다른 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 가지지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어, 적어도 약 10-4 M, 적어도 약 10-5 M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7 M, 적어도 약 10-8 M, 적어도 약 10-9 M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11 M, 적어도 약 10-12 M, 또는 그 이상의 항원 또는 에피토프에 대한 KD를 가지는 항체에 의해 나타낼 수 있는데, KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 통상적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 대하여 대조군 분자보다 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000- 배 이상 높은 KD를 가질 것이다. 그러나 본 발명에서, 본 발명의 LY75 항체의 ADC를 투여할 때 중요한 것은 KD가 유의한 부작용 없이 내재화 및 이에 따른 세포 사멸을 가능하게 하기에 충분하다는 것이다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적인 결합이, 예를 들어, 대조군에 비해 에피토프에 대해 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000- 배 이상 큰 항원 또는 에피토프에 대한 KA 또는 Ka를 가지는 항체에 의해 나타날 수 있되, KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도를 지칭한다.
예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, BIAcore® 검정 및 유세포 분석을 포함하는, LY75에 대한 항체의 결합능을 평가하기 위한 표준 검정법이 단백질 또는 세포 수준에서 수행될 수 있고 당해 분야에 알려져 있다. 적합한 검정법은 실시예에 자세히 기술되어 있다. 항체의 결합 역학(예를 들어, 결합 친화도)도 또한 Biacore® 시스템 분석과 같은 당해 분야에 알려진 표준 검정법에 의해 평가될 수 있다. Raji 또는 Daudi B 세포 종양 세포에 대한 결합을 평가하기 위해, Raji(ATCC 기탁 번호 CCL-86) 또는 Daudi(ATCC 기탁 번호 CCL-213) 세포는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)와 같은 대중적으로 이용가능한 공급원으로부터 수득할 수 있고, 유세포 분석과 같은 표준 검정법에서 사용할 수 있다.
LY75 항체
본 발명은 LY75(서열 번호 15)에 결합하고, 세포 표면에 LY75를 발현하는 세포와 접촉하면 내재화될 수 있거나 작동자 세포의 존재 하에 ADCC 반응을 유발할 수 있거나 작동자 세포의 존재 하에 세포독성 T 세포 반응을 유발할 수 있는 LY75 항체를 제공한다. 이러한 항체는 본원에서 "항-LY75" 항체 또는, 기술의 용이성을 위해, "LY75 항체"로 지칭된다.
LY75 항체는 표면에 LY75를 발현하는 세포, 특히 종양 세포와 접촉하면 내재화된다. 즉, 본원에서 정의된 약물 접합체도 포함하는 LY75 항체는 종양 세포에 의해 내재화되어, 약물의 방출 및 이어지는 세포 사멸을 초래하여 LY75 발현을 나타내는 암의 치료를 가능하게 한다. 이러한 맥락에서 내재화는 몇몇 방식으로 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 LY75 항체는 MAbZap과 같은 표준 검정법을 사용하여 세포, 예를 들어, 본원에 개략된 세포주와 접촉한다. MabZap 검정이 항체-약물 접합체(ADC)를 이용하여 나타날 것으로 기대되는 효과를 나타낸다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 후자의 경우, ADC가 내재화됨으로써 약물을 세포 내로 데려갈 수 있다. 독성 약물은 세포를 살상하는, 즉, 표적화된 암 세포를 살상하는 능력을 가질 수 있다. MabZap 검정으로부터의 데이터는 이미 당업자에게 대표적인 ADC 검정법으로 수용되고 있다(Kohls, M and Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, no. 1, 162-165).
이러한 시험관 내 검정법 구현예에서, 본 발명의 LY75 항체는 독소를 포함하는 항-LY75 항체와 함께 첨가되는데; 예를 들어, LY75 항체는 뮤라인 또는 인간화일 수 있고 항-LY75 항체는 항-뮤라인 또는 항-인간화일 수 있고 사포린과 같은 독소를 함유할 수 있다. [본 발명의 LY75 항체]-[항-LY75 항체-약물 접합체] 복합체의 형성 시, 복합체가 내재화되고 약물(예를 들어, 사포린)이 방출되어, 세포 사멸을 초래한다. 내재화 시에만 약물이 방출됨에 따라 세포는 내재화의 부재 시는 살아 있는 상태로 유지된다. 아래에 개략된 바와 같이, 이론에 얽매이지 않으면서, 치료적 적용에서, 항-LY75 항체는 독소를 함유하고, 내재화 시, 항체와 독소 사이의 결합이 절단되어 독소를 방출하고 세포를 살상한다.
또한, LY75 항체는 표면에 LY75를 발현하는 작동자 세포, 특히 종양 세포의 존재 하에, ADCC 반응을 유발한다.
일 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 특정한 항체(예를 들어, 본원에서"LY75_A1"으로 지칭됨)의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 또는 가변 영역(VR)을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 서열 번호 1에 나타낸 서열을 가지는 항체 LY75_A1의 중쇄 가변(VH) 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및 서열 번호 2에 나타낸 서열을 가지는 항체 LY75_A1의 경쇄 가변(VL) 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함한다.
다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR; 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR; 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR; 및 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 LY75에 결합하고 서열 번호 1, 및 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체는 서열 번호 2, 및 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 더 포함할 수 있다.
추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 LY75에 결합하고 각각 서열 번호 1 및/또는 2에 기재된 아미노산 서열, 및 이의 보존적 서열 변형을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본원에서 사용된, 보존적 서열 변형이라는 용어는, 예를 들어, 유사한 특성을 가지는 아미노산으로의 아미노산의 치환을 지칭한다. 어떠한 치환이 보존적이라고 간주될 수 있는지는 당업자에게는 상식이다. 보존적 서열 변형으로 간주될 수 있는 다른 변형은, 예를 들어, 당화를 포함한다.
임의의 위의 서열에 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 이상 서열 동일성을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 위에 언급된 값의 중간 범위, 예를 들어, 임의의 위의 서열에 적어도 80~85%, 85~90%, 90~95% 또는 95~100% 서열 동일성을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 영역도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 일 구현예에서, 항체는 서열 번호 1 또는 서열 번호 1에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 2 또는 서열 번호 2에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 16, 17 및 18을 포함하는, 서열 번호 1의 중쇄 가변 영역의 골격에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 골격 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 19, 20 및 21을 포함하는, 서열 번호 2의 경쇄 가변 영역의 골격에 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 골격 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 다음의 CDR을 포함하는 항-LY75 항체(본원에서 "LY75_A1"으로 지칭됨)뿐 아니라 제한된 수의 아미노산 변이체를 함유하는 변이체이다.
Figure pct00001
또한, 본 발명의 CDR 세트를 포함하는 가변 중쇄 및 경쇄뿐 아니라 전장 중쇄 및 경쇄(예를 들어, 불변 영역도 포함함)도 또한 본원에 개시된다. 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 본 발명의 CDR 세트는 뮤라인, 인간화 또는 인간 불변 영역(골격 영역을 포함함) 내에 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 모두 본 발명에서 사용되는 것으로 밝혀진 본원에 개시된 서열 번호에 적어도 약 90%~99%(90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 및 99%를 포함함) 동일한 가변 중쇄 및 경쇄를 제공한다.
본 발명의 LY75 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 LY75 단일 클론 항체와 인간 LY75 상 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 2종 이상의 항체를 언급할 때 "동일한 에피토프에 결합한다"라는 용어는 항체가 항원에 결합하기 위해 경쟁하고, 동일하거나 중첩되거나 포괄되는 연속 또는 불연속 아미노산의 세그먼트에 결합한다는 것을 의미한다. 당업자는 "동일한 에피토프에 결합한다"라는 문구가, 비록 일 구현예에서는 그렇게 정의될 수 있지만, 항체가 반드시 정확하게 동일한 아미노산에 결합한다는 것을 의미하지는 않는다는 것을 이해하고 있다. 다른 구현예에서, 항체가 결합하는 정확한 아미노산은 상이할 수 있다. 예를 들어, 제1 항체는 제2 항체에 의해 결합되는 아미노산의 세그먼트에 완전히 포함되는 아미노산의 세그먼트에 결합할 수 있다. 다른 예시에서, 제1 항체는 제2 항체에 의해 결합되는 하나 이상의 세그먼트에 유의하게 중첩되는 아미노산의 하나 이상의 세그먼트에 결합한다. 본원의 목적에서, 이러한 항체는 “동일한 에피토프에 결합한다"는 것으로 간주된다.
따라서, 본원에 기술된 특정 항체에 의해 인지되는 에피토프(예를 들어, 동일하거나 중첩되는 영역 또는 사이의 영역 또는 걸친 영역)의 전부 또는 일부를 포함하는, LY75 상의 에피토프에 결합하는 항체도, 또한, 본 발명의 일 구현예에 포함된다. 서열 번호 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 또는 이의 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 펩티드(들)에 특이적으로 결합하는 항체도 또한 본 발명에 포함되되, 상기 단편은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함한다. 추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프는 서열 번호 27, 29, 30, 34, 35, 36 또는 37 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 펩티드를 포함하되, 상기 단편은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함한다. 추가의 일 구현예에서, 본 발명의 항체에 의해 인지되는 에피토프는 서열 번호 30, 36 및 37 또는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드, 예를 들어, 1, 2 또는 3개의 펩티드를 포함하되, 상기 단편은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함한다.
동일한 에피토프에 결합하고/하거나 본원에 기술된 항체와 인간 LY75에 결합하기 위해 경쟁하는 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 동일한 에피토프를 인식하거나 결합하기 위해 경쟁하는 항체는 일상적인 기술을 사용하여 식별할 수 있다. 이러한 기술은, 예를 들어, 하나의 항체가 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 능력을 보여주는 면역검정, 즉, 경쟁적 결합 검정을 포함한다.
경쟁적 결합은 시험 중인 면역글로불린이 공통 항원, 예를 들어 LY75에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 저해하는 검정법에서 결정된다. 예를 들어, 다음과 같은 다수의 유형의 경쟁적 결합 검정이 알려져 있다: 고체상 직접 또는 간접 방사면역검정(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정(EIA), 샌드위치 경쟁 검정법(Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242(1983) 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Kirkland et al., J. Immunol . 137:3614(1986) 참조); 고체상 직접 표지 검정, 고체상 직접 표지 샌드위치 검정(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1988) 참조); I-125 표지를 사용한 고체상 직접 표지 RIA(Morel et al., Mol . Immunol . 25(1):7(1988) 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(Cheung et al, Virology 176:546(1990)); 및 직접 표지 RIA.(Moldenhauer et al., Scand . J. Immunol . 32:77(1990)). 통상적으로, 이러한 검정법은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 미표지 시험 면역글로불린 및 표지 참조 면역글로불린 중 하나를 지니는 세포의 사용과 관련된다. 경쟁적 저해는 시험 면역글로불린의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 대개 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 대개, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50~55%, 55~60%, 60~65%, 65~70% 70~75% 75~80% 80~85% 85~90% 90~95% 95~99% 이상만큼 저해할 것이다.
다른 기술은, 예를 들어, 에피토프의 원자적 결정을 제공하는 항원:항체 복합체의 x-선 분석과 같은 에피토프 맵핑 방법을 포함한다. 다른 방법은 항원의 돌연변이화 변이체 또는 항원 단편에 대한 항체의 결합을 모니터링하는데, 여기서 항원 서열 내 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 소실이 종종 에피토프 성분의 지표로 간주된다. 추가적으로, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법도, 또한, 사용될 수 있다. 이러한 방법은 조합된 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리로부터 특이적인 짧은 펩티드를 친화도 단리하는 관심 있는 항체의 능력에 의존한다. 그런 다음, 펩티드는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용하는 항체에 상응하는 에피토프의 정의를 위한 리드로 간주된다. 에피토프 맵핑의 경우, 형태적인 불연속 에피토프를 맵핑하는 것을 보여주는 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되었다.
특정한 일 구현예에서, 항체는 각각 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 이에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 LY75에 결합하기 위해 경쟁한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 1 및 2(LY75_A1)에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 LY75에 결합하기 위해 경쟁한다.
다른 본 발명의 항체는 본원에 기술된 항체에 의해 인지되는 LY75 상 에피토프에 결합한다. 다른 특정한 구현예에서, 항체는 각각 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열 또는 이에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 LY75 상 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는 서열 번호 1 및 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 LY75 상 에피토프(LY75)에 결합한다.
LY75에 대한 단일 클론 항체의 특성
본 발명의 단일 클론 항체는 다양한 알려진 기술을 이용하여 LY75에 대한 결합에 대하여 특성분석될 수 있다. 일반적으로, 항체는 우선 ELISA로 특성분석된다. 간략하게, 미세역가 플레이트는 PBS 중 정제된 LY75로 코팅될 수 있고, 그런 다음 PBS에 희석된 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 관련 없는 단백질로 차단될 수 있다. LY75로 면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액이 각각의 웰에 첨가되고 37℃에서 1~2시간 동안 인큐베이션된다. 플레이트를 PBS/트윈 20으로 세척한 다음 알칼라인 포스파타제에 접합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 다중 클론 시약으로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 ABTS 기질로 현상한 다음, 405의 OD에서 분석한다. 바람직하게, 가장 높은 역가를 나타낸 마우스가 융합을 위해 사용될 것이다.
전술된 ELISA 검정은 항체, 및 이에 따라 LY75 면역원에 양성 반응성을 나타내는 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는 높은 친화도로 LY75에 결합하는 하이브리도마를, 그런 다음, 서브 클로닝하고 더 특성분석할 수 있다. (ELISA에 의해) 모 세포의 반응성을 보유하는 각각의 하이브리도마로부터의 하나의 클론을, 그런 다음, 세포 은행 제조 및 항체 정제를 위해 선택할 수 있다.
항-LY75 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마는 회전병, 2리터 스피너 플라스크, 또는 다른 배양 시스템에서 성장할 수 있다. 단백질을 정제하기 위해, 상층액을 여과하고 단백질 A 세파로스(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 이용한 친화도 크로마토그래피 전에 농축할 수 있다. PBS로의 완충액 교환 후, 농도는 1.43 흡광 계수를 사용한 OD280 또는 바람직하게는 혼탁 분석에 의해 결정될 수 있다. IgG는 겔 전기영동 및 항원 특이적 방법에 의해 점검할 수 있다.
선택된 항-LY75 단일 클론 항체가 고유의 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 각각의 항체를 상업적으로 이용가능한 시약(Pierce, Rockford, IL)으로 비오틴화할 수 있다. 비오틴화된 MAb 결합은 스트렙트아비딘으로 표지된 프로브로 검출될 수 있다. 정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA가 당해 분야에 인지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세역가 플레이트의 웰이 10 μg/ml의 항-Ig로 4℃에서 밤새 코팅될 수 있다. 5% BSA로 차단한 후, 플레이트를 10 μg /ml의 단일 클론 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 그런 다음 웰은 IgGI 또는 다른 이소형 특이적 접합 프로브와 반응할 수 있다. 플레이트를 현상하고 전술한 바와 같이 분석한다.
LY75를 발현하는 살아있는 세포에 대한 단일 클론 항체의 결합을 시험하기 위해, 유세포 분석법이 사용될 수 있다. 간략하게, 막 결합 LY75를 발현하는 세포주 및/또는 인간 PBMC(표준 성장 조건 하에 성장함)을 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 단일 클론 항체와 4℃에서 1시간 동안 혼합한다. 세척 후, 세포를 일차 항체 염색과 동일한 조건 하에 플루오레세인으로 표지된 항- IgG 항체와 반응시킨다. 단일 세포에 대해 게이팅하기 위해 빛의 측방 산란 성질을 이용한 FACScan 기기로 시료가 분석될 수 있고 표지된 항체의 결합이 결정된다. 유세포 분석법(에 더하여 또는 대신에) 형광 현미경을 이용한 대안적인 검정법이 사용될 수 있다. 세포는 정확히 전술된 바와 같이 염색될 수 있고 형광 현미경으로 평가된다. 이러한 방법은 개별적인 세포의 시각화를 가능하게 하지만 항원의 밀도에 따라 감소된 민감성을 가질 수 있다.
항-LY75 IgG는 웨스턴 블롯팅으로 LY75 항원과의 반응성에 대해 더 시험할 수 있다. 간략하게, LY75를 발현하는 세포로부터 세포 추출물을 제조할 수 있고 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 거칠 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고, 20% 마우스 혈청으로 차단하고 시험할 단일 클론 항체로 탐지할 것이다. IgG 결합은 항-IgG 알칼라인 포스파타제를 사용하여 검출되고 BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 현상될 수 있다.
다양한 항-LY75 항체의 결합 친화도, 교차 반응성, 및 결합 역학을 분석하는 방법은 당해 분야에 알려진 표준 검정법, 예를 들어, Biacore™ 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)를 이용하는 Biacore™ 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 포함한다.
일 구현예에서, 항체는 서열 번호 15를 포함하는 인간 LY75에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 높은 친화도로 인간 LY75에 결합한다.
바람직하게, 본 발명의 항체는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 2 x 10-8 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 5 x 10-9 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 4 x 10-9 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 3 x 10-9 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 2 x 10-9 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 1 x 10-9 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 5 x 10-10 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합하거나, 또는 1 x 10-10 M 이하의 KD로 LY75 단백질에 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 특정 항-LY75 항체(예를 들어,_LY75_A1)와 LY75에 결합하기 위해 경쟁(예를 들어, 교차 경쟁)한다. 이러한 경쟁 항체는 표준 LY75 결합 검정에서 하나 이상의 mAb의 LY75에 대한 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체의 능력에 기반하여 식별할 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간 LY75 단백질이 플레이트에 고정된 표준 ELISA 검정이 사용될 수 있는데 항체 중 하나는 형광으로 표지되고, 표지된 항체의 결합과 경쟁하는 비표지 항체의 능력을 평가한다. 추가적으로 또는 대안적으로, BIAcore 분석이 항체의 교차 경쟁능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항-LY75 항체의 인간 LY75에 대한 결합을 저해하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 인간 LY75에 결합하기 위해 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증한다.
일 구현예에서, 경쟁 항체는 본원에 기술된 특정 항-LY75 단일 클론 항체(예를 들어, LY75_A1)와 인간 LY75 상 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다., x-선 결정학 및 2-차 핵 자기 공명과 같은 표준 에피토프 맵핑 기술이, 항체가 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed.(1996)에서 에피토프 맵핑 프로토콜 참조).
일 구현예에서, LY75에 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 인간 LY75 상 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 항체이다.
일단 본원에 기술된 원하는 성질을 가지는 단일한, 전형적인 항-LY75 mAb가 단리되면, 유사한 성질을 가지는, 예를 들어, 동일한 에피토프를 가지는 다른 mAb가 생성될 수 있다. 예를 들어, 마우스를 본원에 기술된 바와 같이 LY75로 면역화하고, 하이브리도마를 생성하고, 얻어진 mAb를 LY75에 결합하기 위해 전형적인 mAb와 경쟁하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 마우스는 또한 전형적인 mAb가 결합하는 에피토프를 함유하는 LY75의 더 작은 단편으로 면역화될 수 있다. 에피토프는, 예를 들어, LY75에 걸쳐진 일련의 중첩 펩티드를 스크리닝함으로써 국소화될 수 있다. 대안적으로, Jespers 등(Biotechnology 12:899, 1994)의 방법이 전형적인 mAb와 동일한 에피토프 및 이에 따라 유사한 성질을 가지는 mAb의 선택을 안내하기 위해 사용될 수 있다. 파지 디스플레이를 이용하여, 우선 전형적인 항체의 중쇄를 (바람직하게는 인간) 경쇄의 레퍼토어와 쌍을 이루어 LY75-결합 mAb를 선택하고, 그런 다음, 새로운 경쇄는 (바람직하게는 인간) 중쇄의 레퍼토어와 쌍을 이루어 전형적인 mAb와 동일한 에피토프를 가지는 (바람직하게는 인간) LY75-결합 mAb를 선택한다. 전형적인 mAb의 대안적인 변이체는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 돌연변이 유발에 의해 수득할 수 있다.
예를 들어, Champe 등((1995) J. Biol. Chem. 270:1388-1394)에 기술된 바와 같은 에피토프 맵핑이 항체가 관심 있는 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 수행될 수 있다. Cunningham 및 Wells((1989) Science 244: 1081-1085)에 의해 기술된 바와 같이 인간 LY75에서 “알라닌 스캐닝 돌연변이 유발”, 또는 아미노산 잔기의 일부 다른 형태의 점 돌연변이 유발이 또한 본 발병의 항-LY75 항체에 대한 기능적 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 돌연변이 유발 연구는, LY75의 전체적인 3차 구조에는 중요하지만 항체-항원 접촉에는 직접적으로 관련되지 않는 아미노산 잔기를 밝혀낼 수도 있으므로 따라서 이러한 방법을 사용하여 결정된 기능적 에피토프를 확인하기 위해 다른 방법이 필요할 수 있다.
특이적 항체에 의해 결합된 에피토프는 또한 인간 LY75의 단편을 포함하는 펩티드에 대한 항체의 결합을 평가함으로써 결정될 수 있다. LY75의 서열을 포함하는 일련의 중첩 펩티드가 합성될 수 있고, 예를 들어, 직접적 ELISA, 경쟁적 ELISA(펩티드를 미세역가 플레이트의 웰에 결합된 LY75에 대한 항체의 결합을 방지하는 능력에 대해 평가함), 또는 칩 상에서 결합에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 펩티드 스크리닝 방법은 일부 불연속적 기능적 에피토프, 즉 LY75 폴리펩티드 사슬의 일차 서열에 따라 연속하지 않은 아미노산 잔기와 관련된 기능적 에피토프를 검출할 수 없을 수 있다.
본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프는 또한 구조적 방법, 예를 들어, X-선 결정 구조 결정(예를 들어, WO2005/044853), 분자 모델링 및 관심 있는 항체를 포함하는 복합체 내에서 유리되거나 결합될 때 LY75 내 불안정한 아미드 수소의 H-D 교환율의 NMR 결정을 포함하는 핵 자기 공명(NMR) 분광학에 의해 결정될 수 있다(Zinn-Justin et al.(1992) Biochemistry 31, 11335-11347; Zinn-Justin et al.(1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
X-선 결정학을 고려하여, 결정화는 미세배치(예를 들어, Chayen(1997) Structure 5: 1269-1274), 현적 증기 확산(예를 들어, McPherson(1976) J. Biol. Chem. 251:6300-6303), 접종 및 투석을 포함하는 당해 분야에 알려진 임의의 방법(예를 들어, Giege et al.(1994) Acta Crystallogr. D50:339-350; McPherson(1990) Eur. J. Biochem. 189:1-23)을 이용하여 달성될 수 있다. 적어도 약 1 mg/mL 및 바람직하게는 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 농도를 가지는 단백질 제제를 사용하는 것이 바람직하다. 결정화는 약 10% 내지 약 30%(w/v) 범위의 농도로 플리에틸렌 글리콜 1000-20,000(PEG; 약 1000 내지 약 20,000 Da 범위의 평균 분자량), 바람직하게는 약 5000 내지 약 7000 Da, 더욱 바람직하게는 약 6000 Da을 함유하는 침전 용액에서 가장 잘 달성될 수 있다. 또한, 단백질 안정화제, 예를 들어, 약 0.5% 내지 약 20% 범위의 농도로 글리세롤을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1000 mM 범위의 농도인, 적합한 염, 예를 들어, 염화나트륨, 염화리튬 또는 시트르산 나트륨이 또한 침전 용액에서 바람직할 수 있다. 침전액은, 바람직하게는 약 3.0 내지 약 5.0, 바람직하게는 약 4.0의 pH로 완충된다. 침전 용액에서 유용한 특정한 완충액은 다양할 수 있고, 당해 분야에 잘 알려져 있다(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed.,(1994) Springer-Verlag, New York). 유용한 완충액의 예는, 이에 제한되지는 않으나, HEPES, Tris, MES 및 아세테이트를 포함한다. 결정은 2℃, 4℃, 8℃ 및 26℃를 포함하는 다양한 범위의 온도에서 자랄 수 있다.
항체:항원 결정은 잘 알려진 X-선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고 X-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 분포됨; 예를 들어, Blundell & Johnson(1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; U.S. 특허 가출원 공개 번호 2004/0014194 참조), 및 BUSTER(Bricogne(1993) Acta Cryst. D49:37-60; Bricogne(1997) Meth. Enzymol. 276A:361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al.(2000) Acta Cryst. D56:1313-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 정교화될 수 있고, 그 개시 내용 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 기술된 항체 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는"지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 통상적으로, 제2 항체가 과량이고 제1이 모든 자리를 포화시킨 조건 하에 제2 항체에 의해 에피토프와 상호작용하는 것으로 알려진 항체의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 경쟁이 항체가 "동일한 에피토프에 결합한다"라는 것을 나타낸다. 2종의 항체 사이의 경쟁의 수준을 평가하기 위해, 예를 들어, 방사면역검정 또는 항체에 대한 다른 표지를 이용한 검정이 사용될 수 있다. 예를 들어, LY75 항원은 동일한 양의 제2 미표지 항-LY75 항체의 존재 하에 표지된 화합물(예를 들어, 3H, 25l, 비오틴, 또는 루비듐)에 접합된 포화량의 제1 항-LY75 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 인큐베이션될 수 있다. 미표지 차단 항체의 존재 하에 항원에 결합된 표지된 항체의 양을, 그런 다음, 평가하고 미표지 차단 항체의 부재 하 결합과 비교한다. 경쟁은 차단 항체의 부재시와 비교하여 미표지 차단 항체의 존재 하 결합 신호에서의 백분율 변화에 의해 결정된다. 따라서 차단 항체의 부재 하 결합과 비교하여 차단 항체의 존재 하에 표지된 항체의 결합의 50%가 저해되면, 두 항체 사이에 50% 경쟁이 존재한다. 따라서 제1 및 제2 항체 사이의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예를 들어, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 경쟁에 대한 언급은 제1 항체가 항원에 대한 제2 항체의 결합(또는 그 반대)을 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상(제1 항체 부재 하에 제2 항체에 의한 항원의 결합에 비교함) 저해한다는 것을 의미한다. 따라서 50%, 60%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 제2 항체에 의한 항원에 대한 제1 항체의 결합의 저해는 2종의 항체가 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
항체 변형
본 발명은, 때때로 "항체 유도체" 또는 "항체 유사체"라고도 지칭되는 변이체 항체를 더 제공한다. 즉, 이에 제한되지는 않으나, CDR 내 아미노산 변형(친화도 성숙), 골격 영역 내 아미노산 변형, Fc 영역 내 아미노산 변형, 당화 변이체, (예를 들어, 약물 접합체의 부착을 위한) 다른 유형의 공유결합적 변형을 포함하는 본 발명의 항체에 만들어질 수 있는 다수의 변형이 존재한다.
본원에서 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드 서열을 의미한다. 이러한 경우 모 폴리펩티드는 각각 서열 번호 1 또는 2에 열거된 전장 가변 중쇄 또는 경쇄, 또는 서열 번호 5~10 및 16~21에 열거된 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역 또는 골격 영역이다. 아미노산 변형은 치환, 삽입 및 결손을 포함할 수 있고, 많은 경우 전자를 선호한다. 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적 치환(보존적 치환이 선호됨)일 수 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 상기 치환은 자연적 또는 비자연적으로 발생하는 아미노산을 이용하는 치환일 수 있다.
일반적으로, 변이체는 본원에 기술된 항체의 기능이 여전히 존재하는 한 임의의 수의 변형을 포함할 수 있다. 즉, LY75_A1, 예를 들어, 항체는 여전히 인간 LY75에 특이적으로 결합해야 한다. 유사하게, 아미노산 변이체가 Fc 영역을 이용하여 생성되는 경우, 예를 들어, 변이체 항체는 항체의 특정 적용 또는 지시를 위해 필요한 수용체 결합 기능을 유지해야 한다.
이러한 경우에서 "변이체"는 항체의 열거된 CDR 서열, 골격 또는 Fc 영역에 만들어질 수 있다.
그러나 일반적으로 목표가 종종 최소 수의 변형으로 기능을 바꾸는 것이기 때문에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환이 일반적으로 활용된다. 일부 경우에서, 많은 구현예에서 용도가 밝혀진, 1~2, 1~3 및 1~4개를 포함하는, 1 내지 5개의 변형(예를 들어, 개별적인 아미노산 치환, 삽입 또는 결손)이 존재한다. 변형의 수는 변형될 영역의 크기에 좌우될 수 있는데; 예를 들어, 일반적으로, CDR 영역 내에서는 더 적은 수의 변형이 바람직하다. CDR 영역 내에서조차 변형의 위치는 효과를 유의하게 바꿀 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 일 구현예에서, 변형이 중쇄 및/또는 경쇄의 임의의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 만들어질 수 있다. 추가의 일 구현예에서, 변형은 중쇄 및/또는 경쇄의 임의의 CDR1 또는 CDR2에 만들어진다. 또 다른 일 구현예에서, 변형은 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR1에 위치한다.
다수의 아미노산 변형이 기능적 도메인 내에 존재할 수 있다는 것에 주목해야 한다: 예를 들어, 야생형 또는 조작된 단백질의 Fc 영역 내 1 내지 5개의 변형뿐 아니라, 예를 들어, Fv 영역 내 1 내지 5개의 변형이 바람직할 수 있다. 변이체 폴리펩티드 서열은, 바람직하게는, 모 서열(예를 들어, LY75_A1의 가변 영역, 불변 영역, 및/또는 중쇄 및 경쇄 서열 및/또는 CDR)에 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 것이다. 서열의 크기에 따라, 백분율 동일성은 다수의 아미노산에 의존할 것이라는 점을 주목해야 한다.
본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산(자연적 또는 비자연적으로 발생하는 아미노산일 수 있음)으로의 교체를 의미한다. 예를 들어, 치환 S100A는 위치 100번에서의 세린이 알라닌으로 교체된 변이체 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩티드 서열 내 특정 위치에서 아미노산의 첨가를 의미한다. 본원에서 사용된 "아미노산 결손" 또는 "결손"은 모 폴리펩티드 서열 내 특정 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다.
본원에서 사용된 "모 폴리펩티드", "모 단백질", "전구체 폴리펩티드", 또는 "전구체 단백질"은 비변형 폴리펩티드를 의미하고, 변이체를 생성하기 위해 순차적으로 변형된다. 일반적으로, 본원에서 모 폴리펩티드는 LY75_A1이다. 따라서, 본원에서 사용된 "모 항체"는 변이체 항체를 생성하기 위해 변형된 항체를 의미한다.
본원에서 "야생형" 또는 "WT" 또는 "자연적인"은 대립 변이체를 포함하는 자연에서 발견되는, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질, 폴리펩티드, 항체, 면역글로불린, IgG, 등은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에서 "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 야생형 Fc 서열과 상이한 Fc 서열을 의미한다. Fc 변이체는 Fc 폴리펩티드 자체, Fc 변이체 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
일부 구현예에서, LY75_A1의 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 아미노산 변형이 만들어진다. 일반적으로, 단지 1 또는 2 또는 3개의 아미노산이 임의의 단일 CDR에서 치환되고, 일반적으로 한 세트의 6개의 CDR내에 4, 5, 6, 7, 8 9 또는 10개를 넘지 않는 변형이 만들어진다.
그러나 임의의 CDR 내에서 치환이 없거나, 1, 2 또는 3개의 치환의 임의의 조합은 임의의 다른 치환과 독립적이고 선택적으로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 치환은 6개의 CDR 중 임의의 것에 만들어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 일 구현예에서, 치환은 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR1에 만들어진다.
일부 경우, CDR 내 아미노산 변형은 "친화도 성숙"으로 지칭된다. "친화도 성숙" 항체는 하나 이상의 CDR 내 하나 이상의 변형(들)을 가지는데 이러한 변형은 이러한 변형(들)을 가지지 않는 모 항체에 비하여 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래한다. 일부 경우에서, 드물기는 하지만, 그의 항원에 대한 항체의 친화도를 낮추는 것이 바람직할 수 있지만, 이는 일반적으로 선호하지 않는다.
친화도 성숙은 항원에 대한 항체의 결합 친화도를 "모" 항체와 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150% 이상, 또는 1, 2, 3, 4 내지 5배 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 알려진 절차에 의해 생성된다. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기술한 Marks 등(1992, Biotechnology 10:779-783)을 참조한다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위화 돌연변이 유발이 다음에 기술되어 있다: 예를 들어, Barbas 등(1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813); Shier 등(1995, Gene 169:147-155); Yelton 등(1995, J. Immunol. 155:1994-2004); Jackson 등(1995, J. Immunol. 154(7):3310-9); 및 Hawkins 등(1992, J. Mol. Biol. 226:889-896).
대안적으로, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 유의하게 바꾸지 않는 “침묵“ 아미노산 변형이 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR에 만들어질 수 있다. 이는 (본 발명의 항체를 코딩하는 핵산에 대하여 수행될 수 있는 바와 같은) 발현의 최적화를 포함하는 다수의 이유로 만들어질 수 있다.
따라서 CDR 및 본 발명의 항체의 정의 내에 변이체 CDR 및 항체가 포함되는데; 즉, 본 발명의 항체는 LY75_A1의 하나 이상의 CDR에서 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 또한, 아래에 개략된 바와 같이, 아미노산 변형은, 또한, 본원에 기술된 골격 및 불변 영역을 포함하는 CDR의 외부의 임의의 영역 내에 독립적이고 선택적으로 만들어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-LY75 항체는 변이체 Fc 도메인으로 구성된다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, 항체의 Fc 영역은 다수의 Fc 수용체 및 리간드와 상호작용하여, 효과기 기능으로 지칭되는 다수의 중요한 기능적 능력을 부여한다. 이러한 Fc 수용체는, 이에 제한되지는 않으나, (인간에서) 이소형 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 이소형 FcγRlla(동종이형 H131 및 R131을 포함함), FcγRllb(FcγRllb-1 및 FcγRllb-2를 포함함), 및 FcγRllc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 이소형 FcγRllla(항체 의존성 세포독성(ADCC)에 관련된 동종이형 V158 및 F158를 포함함) 및 FcγRlllb(동종이형 FcγRlllb-NA1 및 FcγRlllb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16), FcRn(신생아 수용체), C1q(보체 의존성 세포독성(CDC)에 관련된 보체 단백질) 및 FcRn(혈청 반감기에 관련된 신생아 수용체)를 포함한다. 적합한 변형은, 예를 들어, 이들 모두가 그 전체가 참조로서 명백하게 포함된 미국 특허 출원 11/841,654 및 이에 인용된 참조, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341,769, 미국 특허 번호 6,737,056, 미국 특허 번호 7,670,600, 미국 특허 번호 6,086,875에 일반적으로 개략된 하나 이상의 위치에 만들어질 수 있고 특히 Fc 수용체에 대한 결합을 증가시키는 특이적인 아미노산 치환을 위한 것이다.
위에 개략된 변형에 더하여, 다른 변형이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 다리의 삽입으로 인해 안정화될 수 있다(Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245, 전체가 참조로서 포함됨).
또한, 아래에 더 기술된 항체-약물 접합체(ADC) 적용에서 시스테인에서의 변형이 특히 유용하다. 일부 구현예에서, 항체의 불변 영역이 특히 "티올 반응성"인 하나 이상의 시스테인을 함유하도록 조작될 수 있어서, 더욱 특이적이고 조절되는 약물 모이어티의 배치를 가능하게 한다. 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 미국 특허 번호 7,521,541을 참조한다.
또한, 아래에 개략된 바와 같이 만들어질 수 있는 항체의 다양한 공유결합적 변형이 존재한다.
항체의 공유결합적 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되고, 항상 그런 것은 아니지만 일반적으로는 번역 후 수행된다. 예를 들어, 항체의 몇몇 유형의 공유결합적 변형이 항체의 특정한 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내에 도입된다.
시스테이닐 잔기는 가장 흔하게는 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은, α-할로아세테이트(및 상응하는 아민)과 반응하여, 카복시메틸 또는 카복실아미도에틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸 등과의 반응에 의해 유도체화될 수 있다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5~7.0에서 디에틸피로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화되는데, 이는 이러한 제제가 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모페나실 브로마이드도 또한 유용하다; 이러한 반응은 바람직하게는 pH 6.0에서 0.1 M 소디움 카코딜레이트 내에서 수행된다.
라이시닐 및 아미노 말단 잔기는 숙신 또는 다른 카복실산 무수물과 반응한다. 이러한 제제로의 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 가진다. 알파 아미노를 함유하는 잔기를 유도체화시키기 위한 다른 적합한 시약은 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜타디온; 및 글리옥실레이트로의 트랜스아미나제 촉매 반응과 같은 이미도에스테르를 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 몇몇 통상적인 시약(이들 중 페닐글리옥살, 2,3-부타디온, 1,2-사이클로헥산디온, 및 닌히드린)과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용기의 높은 pKa로 인해 알칼라인 조건에서 반응이 수행되는 것이 요구된다. 더욱이, 이러한 시약은 아르기닌 엡실론 아미노기뿐 아니라 라이신의 기와 반응할 수 있다.
티로실 잔기의 특이적 변형이 만들어질 수 있는데, 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의한 티로실 잔기 내로의 스펙트럼 표지의 도입에 특별한 관심을 가진다. 가장 흔하게, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄이 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성하기 위해 사용된다. 방사면역검정에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해 티로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요오드화되는데, 전술된 클로라민 T 방법이 적절하다.
카복실 측 기(아스파르틸 또는 글루타밀)은 카보디이미드(R'― N=C=N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형되는데, R 및 R'는 선택적으로 상이한 알킬기, 예를 들어 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리닐-4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드이다. 더욱이, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타밀 잔기로 전환된다.
이중기능적 제제로의 유도체화는, 아래에 기술된 방법에 더하여 다양한 방법에서 사용하기 위해 항체를 불용성 지지 매트릭스 또는 표면에 가교 결합시키는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산을 가지는 에스테르, 디숙신이미딜 에스테르, 예를 들어 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)를 포함하는 동종이중기능적 이미도에스테르, 및 이중기능적 말레이미드, 예를 들어 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 광의 존재 하에 가교 결합을 형성할 수 있는 광활성 중간체를 산출한다. 대안적으로, 이들 모두 전체가 참조로서 포함된 미국 특허 번호 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; 및 4,330,440에 기술된 반응성 기질 및 시노몰구소겐(cynomolgusogen) 브로마이드 활성화 탄수화물과 같은 불용성 매트릭스가 단백질 고정화를 위해 채용된다.
글루타밀 및 아스파라기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 종종 탈아미드화된다. 대안적으로, 이러한 잔기는 가벼운 산성 조건 하에 탈아미드화된다. 이러한 잔기의 형태 둘 다 본 발명의 범주 내이다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 수산화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983], 전체가 참조로서 포함됨), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실기의 아미드화를 포함한다.
또한, 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 표지(형광, 효소, 자기, 방사성 등을 포함함)가 모두 항체(뿐만 아니라 본 발명의 다른 조성물)에 첨가될 수 있다.
이중특이적 분자
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-LY75 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위는 적어도 2개의 상이한 결합 자리 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성하기 위해 유도체화되거나 다른 기능적 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 다른 항체 또는 리간드)에 결합될 수 있다. 본 발명의 항체는 사실 2개를 초과하는 상이한 결합 자리 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하기 위해 유도체화되거나 하나를 초과하는 다른 기능적 분자에 결합될 수 있는데; 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에서 사용된 "이중특이적 분자"라는 용어에 의해 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자가 초래되도록 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 결합 또는 기타에 의해) 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어, 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모사체에 기능적으로 결합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 표적 에피토프(즉, LY75)에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 제2 표적 에피토프는 제1 결합에 특이성에 의해 결합된 단백질과 동일한 표적 단백질 상에 존재할 수 있거나; 제2 표적 에피토프가 제1 결합 특이성에 의해 결합된 제1 단백질에 결합된 것과는 상이한 표적 단백질로 존재할 수 있다. 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프(즉, LY75)와 동일한 세포 상에 존재할 수 있거나; 제2 표적 에피토프가 제1 표적 에피토프를 나타내는 세포에 의해 나타나지 않는 표적 상에 존재할 수 있다. 본원에서 사용된, '결합 특이성'이라는 용어는 적어도 하나의 항체 가변 도메인을 포함하는 모이어티를 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR를 발현하는 작동자 세포(예를 들어, 단핵구, 대식구 또는 다형핵 세포(PMN))에 결합할 수 있고 LY75를 발현하는 세포를 표적으로 할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 LY75를 발현하는 세포를 작동자 세포로 표적화시키고 Fc 수용체-매개 작동자 세포 활성, 예를 들어, LY75를 발현하는 세포의 식세포작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 사이토카인 방출, 또는 과산화 음이온의 생성을 유발한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 제2 표적 에피토프는 CD3 또는 CD5이다. 따라서, 본 발명은 CD3 또는 CD5를 발현하는 작동자 세포(예를 들어, CD3 또는 CD5를 발현하는 세포독성 T 세포)에 결합할 수 있고 LY75를 발현하는 세포를 표적으로 할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 LY75를 발현하는 세포를 작동자 세포로 표적화하고 CD3 또는 CD5 매개 작동자 세포 활성, 예를 들어, T 세포 클론 확장 및 T 세포 세포독성을 유발한다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 총 2개 또는 3개의 항체 가변 도메인을 가질 수 있되, 이중특이적 항체의 제1 부위는 인간 면역 작동자 세포 상에 위치한 작동자 항원(작동자 항원은 인간 CD3 항원 또는 인간 CD5 항원임)에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 작동자 세포의 활성을 동원할 수 있는데, 하나의 항체 가변 도메인으로 이루어진 상기 제1 부위 및 이중특이적 항체의 제2 부위는 작동자 항원이 아닌 표적 항원, 예를 들어, LY75에 특이적으로 결합할 수 있되, 상기 표적 항원은 상기 인간 면역 작동자 세포가 아닌 표적 세포에 위치하고 상기 제2 부위는 하나 또는 두 개의 항체 가변 도메인을 포함한다.
이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 일 구현예에서, 분자는 항-Fc 결합 특이성 또는 항-CD3 또는 항-CD5 결합 특이성 및 항-LY75 결합 특이성에 더하여 제3 결합 특이성을 더 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제3 결합 특이성은 항-향상 인자(EF) 부위, 예를 들어, 세포독성 활성에 관련된 표면 단백질에 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-향상 인자 부위"는 주어진 분자, 예를 들어, 항원 또는 수용체에 결합함으로써 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정부의 효과의 증진을 초래하는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드이다. "항-향상 인자 부위"는 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항-향상 인자 부위는 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 엔티티와 상이한 엔티티에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-향상 인자 부위는 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대해 증가된 면역 반응을 초래하는 다른 면역 세포를 통해)세포독성 T 세포에 결합할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 분자는, 결합 특이성으로서, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb 또는 단일 사슬 Fv를 포함하는 적어도 하나의 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 항체는, 또한, 예를 들어, 그 내용이 명백하게 참조로서 포함된 미국 특허 번호 4,946,778에 기술된 바와 같이 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편, 예를 들어 Fv 또는 단일 사슬 구조체일 수 있다.
일 구현예에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이성은 단일 클론 항체에 의해 제공되는데, 이의 결합은 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서 사용된, "IgG 수용체"라는 용어는 염색체 1에 위치한 8개의 γ-사슬 유전자 중 임의의 것을 지칭한다. 이러한 유전자는 3개의 Fcγ 수용체 부류인 FcγRI(CD64), FCγRII(CD32), 및 FcγRIII(CD16)로 그룹화되는 총 12개의 경막 또는 수용성 수용체 이소형을 코딩한다. 바람직한 일 구현예에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화도 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 높은 친화도(108~109 M-1)를 나타내는 72 kDa 분자이다.
일정한 바람직한 항-Fcγ 단일 클론 항체의 생성 및 특성 분석은 PCT 공개 WO 88/00052 및 미국 특허 번호 4,954,617(그 교시가 참조로서 완전히 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 이러한 항체는 수용체의 Fcγ 결합 자리와는 상이한 자리에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 따라서 이들의 결합은 IgG의 생리학적 수준에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에서 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생성하는 하이브리도마는 미국 미생물 보존 센터(ATCC 접근 번호 HB9469)로부터 입수가능하다. 다른 구현예에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 단일 클론 항체 22(H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생성 및 특성 분석이 Graziano, R.F. 등((1995) J. lmmunol 155(10): 4996-5002) 및 PCT 공개 WO 94/10332에 기술되어 있다. H22 항체를 생성하는 세포주는 HA022CL1이라는 명칭 하에 미국 미생물 보존 센터에 기탁되었고 접근 번호 CRL 11177을 가진다.
또 다른 바람직한 구현예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fc-알파 수용체 [FcαRI(CD89)]에 결합하는 항체에 의해 제공되는데, 결합은 바람직하게는 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. "IgA 수용체"라는 용어는 염색체 19에 위치한 하나의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 생성물을 포함하고자 한다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 몇몇 대안적으로 스플라이싱된 경막 이소형을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)는 단핵구/대식구, 호산구 및 호중구 과립구 상에서 항시적으로 발현되지만, 비작동자 세포 군집에서는 발현되지 않는다. FcαRI는 lgA1 및 lgA2에 대하여 중간 친화도(
Figure pct00002
5 x 107 M- 1)를 가지는데, 친화도는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인에 노출되면 증가한다[Morton, H.C. et al.(1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. IgA 리간드 결합 도메인 외부의 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 식별된 4개의 FcαI-특이적 단일 클론 항체가 [Monteiro, R.C. et al.(1992) J. Immunol. 148:1764]에 기술되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI는 본 발명의 이중특이적 분자에서 사용하기 위한 바람직한 유발자 수용체인데, 이는 이들이 (1) 면역 작동자 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에 주로 발현하고; (2) 높은 수준(예를 들어, 세포 당 5,000~100,000)으로 발현되고; (3) 세포독성 활성(예를 들어, ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 이들에 표적화된 자가 항원을 포함하는 항원의 향상된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
본 발명의 이중특이적 분자에 채용될 수 있는 항체는 뮤라인, 인간, 키메라 및 인간화 단일 클론 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 구조적 결합 특이성, 예를 들어, 항-FcR, 항-CD3 항-CD5 및 항-LY75 결합 특이성을 당해 분야에 알려진 방법을 사용하여 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 각각의 이중특이적 분자의 결합 특이성이 개별적으로 생성되고 그런 다음 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 다양한 커플링 또는 가교 결합제가 공유 접합을 위해 사용될 수 있다. 가교 결합제의 예는 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 및 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)[예를 들어, Karpovsky et al.(1984) J. Exp . Med. 160:1686; Liu, MA et al.(1985) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 82:8648 참조]를 포함한다. 다른 방법은 다음에 기술된 방법을 포함한다: Paulus(1985) Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al.(1985) Science 229:81-83, 및 Glennie et al.(1987) J. Immunol. 139:2367-2375. 바람직한 접합제는 SATA 및 술포-SMCC인데, 둘 다 Pierce Chemical 사(Rockford, IL)로부터 입수가능하다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설포히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특히 바람직한 일 구현예에서, 힌지 영역은 접합 이전에 홀수의 설포히드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 두 결합 특이성이 동일한 벡터 내에 코딩되고 발현되고 동일한 숙주 세포 내에 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체 및 결합 결정부를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 2개의 결합 결정부를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하기 위한 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; 및 5,482,858(이들 모두가 본원에 참조로서 명백하게 포함됨)에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 이중 특이적 T 세포 체결자(BiTE)일 수 있다. BiTE는 인공적인 이중특이적 단일 클론 항체의 한 부류이다. 이들은 숙주 면역계, 보다 구체적으로는 T 세포의 세포독성 활성을 암 세포로 유도한다. BiTE는 일반적으로 단일 펩티드 사슬 상, 바람직하게는 약 55 킬로달톤인, 상이한 항체의 2개의 단일 사슬 가변 단편(scFv), 또는 4개의 상이한 유전자로부터의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질이다. 바람직하게, scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통하여 T 세포에 결합하고, 나머지는 종양 특이적 분자를 통해 종양 세포에 결합한다.
그들의 특이적인 표적에 대한 이중특이적 분자의 결합은, 예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), FACS 분석, 생물검정(예를 들어, 성장 저해), 또는 웨스턴 블롯 검정으로 확인할 수 있다. 이러한 검정 각각은 일반적으로 관심 있는 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 채용함으로써 특히 관심 있는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는, 예를 들어, 효소에 결합된 항체 또는 항체-FcR 복합체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 복합체는 임의의 다양한 다른 면역검정법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 방사성으로 표지되고 방사면역검정(RIA)(예를 들어, 참조로서 본원에 포함된, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조)에 사용될 수 있다. 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광계수기의 사용과 같은 수단 또는 방사능 사진촬영에 의해 검출될 수 있다.
당화
다른 유형의 공유결합적 변형은 당화에서의 변형이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 하나 이상의 조작된 글리코형 (glycoform)을 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 "조작된 글리코형"은 항체에 공유 부착된 탄수화물 조성물을 의미하되, 이러한 탄수화물 조성물은 모 항체의 탄수화물 조성물과는 화학적으로 상이하다. 조작된 글리코형은, 이에 제한되지는 않으나 작동자 기능의 향상 또는 감소를 포함하는, 다양한 목적에 유용할 수 있다. 예를 들어, 무당화 항체(즉 당화가 결여된 항체)가 제조될 수 있다. 당화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내 하나 이상의 당화 자리를 변형함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 골격 당화 자리의 제거를 초래함으로써 이러한 자리에서의 당화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 만들어질 수 있다. 이러한 무당화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등에 의한 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에 더 자세히 기술되어 있고, 위치 297에서의 아스파라긴을 제거함으로써 달성될 수 있다.
조작된 글리코형의 바람직한 형태는 무푸코실화로서, 아마도 FcγRIIIa 수용체에 대한 더 단단한 결합을 통해 ADCC 기능의 증가와 상호연관되는 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, "무푸코실화"는 숙주 세포에서 생성되는 항체의 대다수에서 실질적으로 푸코스가 결여되어 있다는 것, 예를 들어, 90~95~98%의 생성된 항체가 항체의 탄수화물 모이어티(일반적으로 Fc 영역 내 N297에서 부착됨)의 구성요소로서 감지될 만한 푸코스를 가지지 않는다는 것을 의미한다. 정의된 기능적으로 무푸코실화된 항체는 일반적으로 FcγRIIIa 수용체에 대해 적어도 50% 이상의 친화도를 나타낸다.
조작된 글리코형은 당해 분야에 알려진 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1, 이들 모두 전체가 참조로서 포함됨; POTELLIGENT® 기술 [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb® 당화 조작 기술 [Glycart Biotechnology AG, Zurich, 스위스). 이러한 기술 중 다수는, 예를 들어, 다양한 유기체 또는 세포주, 조작되거나 기타, 예를 들어 Lec-13 CHO 세포 또는 랫트 하이브리도마 YB2/0 세포에서 IgG를 발현시키거나, 당화 경로(예를 들어 FUT8 [α1,6-푸코실트랜세라제] 및/또는 β1-4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III [GnTIII])에 관련된 효소를 조절하거나, IgG가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형함으로써 Fc 영역에 공유 부착된 올리고당을 양분하고/하거나 푸코실화의 수준을 조절하는 것을 기반으로 한다. 예를 들어, "당 조작된 항체" 또는 Seattle Genetics의 "SEA 기술"은 생산 중 푸코실화를 저해하는 변형된 당류를 첨가함으로써 작용하는데; 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 US2009/0317869를 참조한다. "조작된 글리코형"은 통상적으로 당화 기술의 부재 하에 제조된 항체와 비교하여 상이한 탄수화물 또는 올리고당류를 지칭하며; 따라서 항체는 조작된 글리코형을 포함할 수 있다.
대안적으로, 조작된 글리코형은 상이한 탄수화물 또는 올리고당을 포함하는 IgG 변이체를 지칭할 수 있다. 당해 분야에 알려진 바와 같이, 당화 패턴은 단백질의 서열(예를 들어, 아래에서 논의되는 특정 당화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생성된 숙주 세포 또는 유기체에 좌우될 수 있다. 특정 발현 시스템이 아래에서 논의된다.
폴리펩티드의 당화는 통상적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린이 아닌 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서 폴리펩티드 내 이러한 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 당화 자리를 생성한다. O-결합 당화는, 비록, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신도 사용될 수 있지만, 하이드록시아미노산, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다.
항체에 대한 당화 자리의 첨가는 (N-결합 당화 자리의 경우) 아미노산 서열이 하나 이상의 전술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변형함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 이러한 변형은 (O-결합 당화 자리의 경우) 시작 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 치환 또는 이의 첨가에 의해 만들어질 수 있다. 편의를 위해, 항체 아미노산 서열은 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 표적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이화함으로써 바람직하게는 DNA 수준에서 변화를 통해 변형된다.
항체 상 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드의 단백질에 대한 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이러한 절차는 N- 및 O-결합 당화를 위해 당화능을 가지는 숙주 세포 내 단백질의 생산을 필요로 하지 않기 때문에 유리하다. 사용된 커플링 양상에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설포히드릴기, (d) 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록실기, (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이러한 방법들은 전체가 참조로서 포함된 WO 87/05330 및 문헌(Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306)에 기술되어 있다.
출발 항체 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 (예를 들어, 번역 후) 제거는 화학적 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 단백질을 화합물 트리플루오로메탄설폰산, 또는 등가의 화합물에 노출시키는 것을 필요로 한다. 이러한 처리는 결합당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 전체 당의 절단을 초래하는 반면, 폴리펩티드는 원래의 상태로 놔둔다. 화학적 탈당화는, Hakimuddin 등(1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52) 및 Edge 등(1981 , Anal. Biochem. 118:131)(둘 다 전체가 참조로서 포함됨)에 의해 기술되어 있다. 폴리펩티드 상 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은, 전체가 참조로서 포함된, Thotakura 등(1987, Meth. Enzymol. 138:350)에 의해 기술된 바와 같이, 당해 분야에 알려진 바와 같이 푸코시다제 효소를 사용한 푸코스 잔기의 제거를 포함하는, 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 잠재적인 당화 자리에서의 당화는 전체가 참조로서 포함된, Duskin 등(1982, J. Biol. Chem. 257:3105)에 기술된 바와 같이 화합물 투니카마이신의 사용에 의해 방지할 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코시드 결합의 형성을 차단한다.
다른 유형의 항체의 공유결합 변형은, 예를 들어, Nektar Therapeutics(Nektar 웹사이트에서 입수가능함)로부터의 2005-2006 PEG 카탈로그 및 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4, 179,337(모두 전체가 참조로서 포함됨)에 기재된 방식으로, 이에 제한되지는 않으나, 다양한 폴리올, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌을 포함하는 다양한 비 단백질성 폴리머에 항체를 결합시키는 것을 포함한다. 또한, 당해 분야에 알려진 바와 같이, 아미노산 치환은 PEG와 같은 폴리머의 첨가를 용이하게 하기 위해 항체 내 다양한 위치에 만들어질 수 있다. 예를 들어, 전체가 참조로서 포함된 U.S. 공개 번호 2005/0114037A1을 참조한다.
추가적인 구현예에서, 예를 들어, 진단 또는 검출 목적으로 본 발명의 항체의 사용에서, 항체는 표지를 포함할 수 있다. 본원에서 "표지된"은 화합물이 화합물의 검출을 가능하게 하기 위해 부착된 적어도 하나의 요소, 동위원소 또는 화학적 화합물을 가진다는 것을 의미한다. 비록 표지가 효소 및 자성 입자와 같은 입자도 포함하지만, 일반적으로 표지는 다음의 3개의 부류이다: a) 방사성 또는 중동위 원소일 수 있는 동위원소 표지; b) 자기, 전기, 열; 및 c) 색상 또는 발광 염료. 바람직한 표지는, 이에 제한되지는 않으나, 형광 란탄족 복합체(유로품 및 테르븀의 것을 포함함), 및 이에 제한되지는 않으나, 양자점, 플루오레세인, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, 캐스케이드 블루, 텍사스 레드, 알렉사 염로, Cy 염료, 및 명백하게 참조로서 본원에 포함된 Richard P. Haugland의 문헌(6th Edition of the Molecular Probes Handbook)에 기술된 기타를 포함하는 형광 표지를 포함한다.
항체-약물 접합체
일부 구현예에서, 본 발명의 항-LY75 항체는 항체-약물 접합체(ADC)를 형성하기 위해 약물과 접합된다. 일반적으로, ADC는 세포독성 또는 세포정지제의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체의 사용이 종양으로의 약물 모이어티의 표적화된 전달을 가능하게 하는 종양학적 응용에서 사용되는데, 이는 더 높은 효능, 더 낮은 독성 등을 가능하게 할 수 있다. 이러한 기술의 개요가 문헌(Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21:5-13(2010), Carter et al., Cancer J. 14(3):154(2008) and Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13:235-244(2009), 이들 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)에 제공된다.
따라서 본 발명은 약물에 접합된 항-LY75 항체를 제공한다. 일반적으로, 접합은, 아래에 더 기술된 바와 같이, 항체에 대한 공유 부착으로 수행되고, 일반적으로, 링커, 종종 펩티드 결합(아래에 기술된 바와 같이, 표적 자리에서의 프로테아제에 의한 절단에 민감하거나 그렇지 않도록 설계될 수 있음)에 의존한다. 또한, 전술된 바와 같이, 링커-약물 단위(LU-D)의 결합은 항체 내 시스테인에 대한 부착에 의해 수행될 수 있다. 당해 분야에서 이해될 것인 바와 같이, 항체 당 모이어티의 수는 반응의 조건에 따라 변할 수 있고, 1:1 내지 10:1 약물:항체로 다양화될 수 있다. 당해 분야에서 이해될 것이 바와 같이, 실제 수는 평균이다.
따라서 본 발명은 약물에 접합된 항-LY75 항체를 제공한다. 아래에 기술된 바와 같이, 이에 제한되지는 않으나, 화학요법제, 성장 저해제, 독소(예를 들어, 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사접합체)와 같은 세포독성제를 포함하는 임의의 수의 제제일 수 있는 ADC의 약물이 제공된다. 다른 구현예에서, 본 발명은 ADC를 사용하는 방법을 더 제공한다.
본 발명에서 사용하기 위한 약물은 세포독성 약물, 특히 암 치료요법에 사용되는 약물을 포함한다. 이러한 약물은, 일반적으로, DNA 손상제, 항-대사제, 자연적인 산물 및 이들의 유사체를 포함한다. 세포독성제의 예시적인 부류는 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제, 및 티미딜레이트 합성효소 저해제와 같은 효소 저해제, DNA 삽입제, DNA 절단제, 위상이성질화효소 저해제, 약물의 안트라사이클린 패밀리, 빙카(vinca) 약물, 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycine), 세포독성 뉴클레오시드, 약물의 프테리딘 패밀리, 디이넨(diynene), 포도필로톡신(podophyllotoxins), 돌라스타틴(dolastatin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 분화 유도제, 및 탁솔(taxol)을 포함한다.
이러한 부류의 구성원은, 예를 들어, 탁솔, 메토트렉세이트(methotrexate), 메토프테린(methopterin), 디클로로메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 멜팔란(melphalan), 레우로신(leurosine), 레우로시데인(leurosideine), 액티노마이신(actinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin) C, 미토마이신 A, 카미노마이신(caminomycin), 아미노프테린(aminopterin), 탈리소마이신(tallysomycin), 포도필로톡신 및 포도필로톡신 유도체, 예를 들어, 에토포시드(etoposide) 또는 에토포시드 포스페이트, 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 탁솔, 탁소터(taxotere) 레티노산을 포함하는 탁산(taxane), 뷰티르산, N8-아세틸 스페르미딘(spermidine), 캄포테신(camptothecin), 칼리케아미신(calicheamicin), 에스페라미신(esperamicin), 엔-디인, 두오카마아신(duocarmycin) A, 두오카마아신 SA, 칼리케아미신, 캄프토테신(camptothecin), 헤미아스테를린(hemiasterlin), 메이탄시노이드(DM1을 포함함), 모노메틸아우리스타틴 E(monomethylauristatin E, MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 및 메이탄시노이드(DM4) 및 이들의 유사체를 포함한다.
독소는 항체-독소 접합체로 사용될 수 있고 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신과 같은 식물 독소, 겔다나마이신(geldanamycin)(Mandler et al(2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드(EP 1391213; Liu et al.,(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리케아미신(Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al(1993) Cancer Res. 53:3336-3342), 헤미아스테를린(WO2004/026293; Zask et al.,(2004) J. Med. Chem, 47:4774-4786)과 같은 소분자 독소를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 위상이성질화효소 저해를 포함하는 기전에 의해 그들의 세포독성 및 세포정지 효과를 발휘할 수 있다.
항-LY75 항체의 접합체 및 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 및 CC1065, 및 독소 활성을 가지는 이러한 독소의 유도체도 또한 사용될 수 있다.
메이탄시노이드
메이탄시노이드 약물 모이어티로 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 알려진 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리되거나, 유전적 조작 기술(Yu et al(2002) PNAS 99:7968-7973 참조), 또는 알려진 방법에 따라 합성적으로 제조된 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체를 사용하여 생성될 수 있다. 아래에 기술된 바와 같이, 약물은 항체에 접합하기 위한 티올 또는 아민기와 같은 기능적으로 활성인 기의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는, C-19-데클로로(미국 특허 번호 4,256,746)(안사미토신(ansamytocin) P2의 리튬 알루미늄 하이드라이드 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(U.S. 특허 번호 4,361,650 및 4,307,016)(스트렙토미세스 또는 액티노미세스를 이용한 탈메틸화 또는 LAH를 이용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(-OCOR), +/-데클로로(미국 특허 번호 4,294,757)(아실 클로라이드를 이용한 아실화에 의해 제조됨)과 같은 변형된 방향족 고리를 가지는 모이어티 및 변형 다른 위치에서 변형을 가지는 모이어티를 포함한다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한, C-9-SH(미국 특허 번호 4,424,219)(H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응으로 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 번호 4,331,598); C-14-하이드록시 메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 번호 4,450,254)(Nocardia로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 번호 4,364,866)(스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시(미국 특허 번호 4,313,946 및 4,315,929)(트레비아 누들플로라(Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸(미국 특허 번호 4,362,663 및 4,322,348)(스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시(미국 특허 번호 4,371,533)(메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의해 제조됨)와 같은 변형을 가지는 것을 포함한다.
특히 DM1(참조로서 포함된 미국 특허 번호 5,208,020에 개시됨) 및 DM4(참조로서 포함된 미국 특허 번호 7,276,497에 개시됨)가 사용된다. 또한, 5,416,064, WO/01/24763, 7,303,749, 7,601,354, USSN 12/631,508, WO02/098883, 6,441,163, 7,368,565, WO02/16368 및 WO04/1033272(이들 모두는 그 전체가 명백하게 참조로서 포함됨)에 기술된 다수의 추가적인 메이탄시노이드 유도체 및 방법도 참조한다.
메이탄시노이드를 함유하는 ADC, 이의 제조 방법, 및 이의 치료적 용도가, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1(이들의 개시 내용은 명백하게 참조로서 본원에 포함됨)에 개시되어 있다. Liu 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996))은 인간 직장결장암에 대해 유도된 단일 클론 항체 C242에 결합된 DM1으로 지정된 메이탄시노이드를 포함하는 ADC를 기술하고 있다. 이러한 접합체는 배양된 대장암 세포에 대해 매우 세포독성인 것으로 밝혀졌고 생체 내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 나타낸다.
Chari 등(Cancer Research 52:127-131(1992))은 메이탄시노이드가 이황화 링커를 통해 인간 대장암 세포주 상 항원에 결합된 뮤라인 항체 A7, 또는 HER-2/neu 종양 유전자에 결합된 다른 뮤라인 단일 클론 항체 TA.1에 접합되었던 ADC를 기술하고 있다. TA.1-메이탄소노이드(maytansonoid) 접합체의 세포독성을 시험관 내에서 세포 당 3 x 105 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3 상에서 시험하였다. 약물 접합체는 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 정도의 세포독성을 달성하였는데, 이는 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 나타내었다.
아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 구현예에서, ADC는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴(dolostatin) 펩티드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴(미국 특허 번호 5,635,483; 5,780,588)에 접합된 항-LY75 항체를 포함한다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 동역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 나타났고(Woyke et al(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), 항암(미국 특허 번호 5,663,149) 및 항진균 활성(Pettit et al(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 가진다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 구현예는, 그 개시 내용 전체가 명백하게 참조로서 포함된 "Senter 등(Proceedings of the American Association for Cacner Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented Mar. 28, 2004)에 기술되고 미국 특허 공개 번호 2005/0238648(그 개시내용 전체가 명백하게 참조로서 포함됨)에 기술된 N-말단 결합된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
예시적인 아우리스타틴 구현예는 MMAE(물결선이 항체 약물 접합체의 링커(L)에 대한 공유 부착을 나타내는 도 10에 도시됨; 그 전체가 명백하게 참조로서 포함된 미국 특허 번호 6,884,869 참조)이다.
다른 예시적인 아우리스타틴 구현예는 물결선이 항체 약물 접합체의 링커(L)에 대한 공유 부착을 나타내는 도 10에 도시된 MMAF이다(그 전체가 명백하게 참조로서 포함된 US 2005/0238649, 5,767,237 및 6,124,431):
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 구성요소(본원에서 추가로 기술됨)를 포함하는 추가적인 예시적인 구현예는 다음의 구조 및 약어를 가진다(여기서 Ab는 항체를 의미하고 p는 1 내지 약 8이다):
통상적으로, 펩티드 기반 약물 모이어티는 둘 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은, 예를 들어, 펩티드 화학의 분야에 잘 알려진 액체상 합성법(E. Schroder and K. Lubke, "The peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press 참조)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 미국 특허 번호 5,635,483; 미국 특허 번호 5,780,588; Pettit 등 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit 등 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G. R. 등 Synthesis, 1996, 719-725; Pettit 등(1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; 및 Doronina(2003) Nat Biotechnol 21(7)778-784의 방법에 따라 제조될 수 있다.
칼리케아미신
다른 구현예에서, ADC는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 예를 들어, 마일로타그(Mylotarg)는 최초의 상업적인 ADC 약물이고 칼리케아미신 γ1을 페이로드로 활용한다(그 전체가 참조로서 포함된 미국 특허 번호 4,970,198 참조). 추가적인 칼리케아미신 유도체는 미국 특허 번호 5,264,586, 5,384,412, 5,550,246, 5,739,116, 5,773,001, 5,767,285 및 5,877,296(모두 명백하게 참조로서 포함됨)에 기술되어 있다. 항생제의 칼리케아미신 패밀리는 피코몰보다 낮은 농도에서 이중 가닥 DNA 파단을 생성할 수 있다. 칼리케아미신 패밀리의 접합체의 제조를 위해, 미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296(모두 American Cyanamid Company)를 참조한다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는, 이에 제한되지는 않으나, γ1l, α2l, α2l, N-아세틸-γ1l, PSAG 및 θl1(Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342(1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928(1998) 및 전술된 American Cyanamid의 미국 특허)을 포함한다. 항체가 접합될 수 있는 다른 항-종양 약물은 엽산길항제인 QFA이다. 칼리케아미신 및 QFA는 세포 내 작용의 자리를 가지며, 혈장막을 쉽게 건너지 못한다. 따라서, 항체 매개 내재화를 통한 이러한 제제의 세포 흡수는 이들의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
두오카마아신
CC-1065(참조로서 포함된 4,169,888 참조) 및 두오카마아신은 ADC에서 활용되는 항종양 항생제의 패밀리의 구성원이다. 이러한 항생제는 아폽토시스를 초래하는 이벤트의 캐스캐이드를 개시하는 마이너 그루브 내 아데닌의 N3에서 서열-선택적 알킬화 DNA를 통해 작용하는 것으로 보인다.
두오카마아신에 속하는 주요 구성원은 두오카마아신 A(참조로서 포함된 미국 특허 번호 4,923,990) 및 두오카마아신 SA(참조로서 포함된 미국 특허 번호 5,101,038)를 포함하며, 미국 특허 번호 7,517,903, 7,691,962, 5,101,038; 5,641,780; 5,187,186; 5,070,092; 5,070,092; 5,641,780; 5,101,038; 5,084,468, 5,475,092, 5,585,499, 5,846,545, WO2007/089149, WO2009/017394A1, 5,703,080, 6,989,452, 7,087,600, 7,129,261, 7,498,302, 및 7,507,420(이들 모두가 명백하게 참조로서 포함됨)에 기술된 다수의 유사체를 포함한다.
피롤로벤조디아제핀
피롤로벤조디아제핀(PBD)(Journal of Medicinal Chemistry 2001, 44, 737-748)은 유의한 세포독성을 가지는 DNA 상호작용제이다. 안트라마이신(anthramycin), 마제트라마이신(mazethramycin), 포로트라마이신(porothramycin), 프로트라카신(prothracarcin), 시바노마이신(sibanomycin), 토마마이신(tomaymycin), 시비로마이신(sibiromycin), 친카마이신(chicamycin) A, 네오트라마이신(neothramycin) A, B, 및 DC-81(Medicinal Chemistry and Drug Design, ISBN: 978-953-51-0513-8, Ahmed Kamal et al. DOI: 10.5772/38869)와 같은 화합물을 포함하는 13가지 구조의 이러한 패밀리가 단리되었다. 이러한 패밀리의 다른 유사체가 제조되었고 특허 번호 WO2011/130598 및 WO2011/130616(명백하게 참조로서 포함됨)에 기술된 항체에 접합되었다.
기타 세포독성제
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조이신(streptozoicin), 빈크리스틴(vincristine) 및, 미국 특허 번호 5,053,394, 5,770,710에 기술된 LL-E33288 복합체로 집합적으로 알려진 제제의 패밀리인 5-플루오로우라실뿐만 아니라 에스페라미신(esperamicin)(미국 특허 번호 5,877,296)을 포함한다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 에루지노사로부터의) 외독소 A 사슬, 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파-사르신(sarcin), 아로라이트 포디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca Americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모디카 차란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(neomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232를 참조한다.
본 발명은 항체와 핵산 분해 활성을 가지는 화합물(예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클라제, 예를 들어 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 ADC를 더 포함한다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도로 방사성인 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사-접합 항체의 생성에서 이용가능하다. 예시는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
방사- 또는 다른 표지는 알려진 방식으로 접합체 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성되거나, 예를 들어, 수소를 대체하는 플루오린-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. Tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 펩티드 내 시스테인 잔기를 통하여 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통하여 부착될 수 있다. IODOGEN 방법(Fraker et al(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)이 요오드-123을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 문헌(" Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy"(Chatal, CRC Press 1989))에 다른 방법이 자세히 기술되어 있다.
복수의 항체를 포함하는 조성물의 경우, 약물 로딩은 항체 당 약물 분자의 평균 수인 p로 나타낸다. 약물 로딩은 항체 당 1 내지 20 약물(D) 범위일 수 있다. 접합 반응의 제제에서 항체 당 약물의 평균 수는 질량 분광법, ELISA 검정, 및 HPLC와 같은 통상적인 수단에 의해 특성 분석될 수 있다. p를 고려하여 항체-약물-접합체의 정량적인 분포가 또한 결정될 수 있다.
일부 사례에서, p가 다른 약물 로딩을 가지는 항체-약물-접합체로부터의 일정한 값인 동종 항체-약물-접합체의 분리, 정제 및 특성 분석은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 구현예에서, p는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이의 분수이다.
항체-약물 접합체 화합물의 생성은 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 간략하게, 항체-약물 접합체 화합물은 항체 단위로서 항-LY75 항체, 약물, 및 선택적으로 약물 및 결합제를 연결하는 링커를 포함할 수 있다.
다수의 상이한 반응이 결합제에 약물 및/또는 링커를 공유 부착하기 위해 이용가능하다. 이는 결합제, 예를 들어, 라이신의 아민기, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카복실기, 시스테인의 설프하이드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티를 포함하는 항체 분자의 아미노산 잔기의 반응에 의해 달성될 수 있다. 흔히 사용되는 공유 부착의 비특이적 방법은 화합물의 카복시(또는 아미노)기를 항체의 아미노(또는 카복시)기에 결합시키는 카보디이미드 반응이다. 추가적으로 디알데하이드 또는 이미도에스테르와 같은 이중기능적 제제가 화합물의 아미노기를 항체 분자의 아미노기에 결합시키기 위해 사용되고 있다.
결합제에 대한 약물의 부착을 위해 이용가능한 것은 또한 쉬프(Schiff) 염기 반응이다. 이러한 방법은 글리콜 또는 하이드록시기를 함유하는 약물의 과옥소산염 산화 및 이에 따른 알데하이드를 형성과 관련되고, 알데하이드는 그런 다음 결합제와 반응한다. 부착은 결합제의 아미노기와의 쉬프 염기의 형성을 통해 발생한다. 이소티오시아네이트도 또한 약물을 결합제에 공유 부착시키기 위한 커플링제로 사용될 수 있다. 다른 기술들도 당업자에게 알려져 있고, 본 발명의 범주 이내이다.
일부 구현예에서, 링커의 전구체인 중간체는, 적절한 조건 하에 약물과 반응한다. 다른 구현예에서, 반응성 기가 약물 및/또는 중간체 상에 사용된다. 약물과 중간체, 또는 유도체화 약물 사이의 반응의 생성물은 적절한 조건 하에 순차적으로 본 발명의 항-LY75 항체와 반응한다.
본 발명의 접합체를 제조하기 위한 목적으로 화합물의 반응을 더욱 편리하게 하기 위해 원하는 화합물에 화학적 변형도 또한 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 작용기, 예를 들어, 아민, 하이드록실, 또는 설프하이드릴은, 약물의 활성 또는 다른 성질에 대해 최소 또는 수용가능한 효과를 가지는 위치에서 약물에 부가될 수 있다.
링커 유닛
통상적으로, 항체-약물 접합체 화합물은 약물 유닛과 항체 유닛 사이에 링커 유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 세포 내 또는 세포 외 조건 하에 절단가능하여, 링커의 절단이 적절한 환경에서 항체로부터 약물 유닛을 방출한다. 예를 들어, 일정한 프로테아제를 분비하는 고체 종양이 절단가능한 링커의 표적으로서의 역할을 수행할 수 있다; 다른 구현예에서, 활용되는 것은 세포 내 프로테아제이다. 또 다른 구현예에서, 링커 유닛은 절단가능하지 않고, 약물이, 예를 들어, 리소좀 내 항체 분해에 의해 방출된다.
일부 구현예에서, 링커는 세포 내 환경(예를 들어, 리소좀 또는 엔도솜 또는 소포 내)에 존재하는 절단제에 의해 절단가능하다. 링커는, 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나, 리소좀 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하는 세포 내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이 이상이다.
절단제는, 제한 없이, 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있는데, 이들 모두는 디펩티드 약물 유도체를 가수분해하여 표적 세포 내로 활성 약물을 방출하는 결과를 가져오는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 참조). LY75를 발현하는 세포에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있는 펩티딜 링커. 예를 들어, 암성 조직에서 많이 발현되는 티올 의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단될 수 있는 펩티딜 링커(예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커(서열 번호 X))가 사용될 수 있다. 이러한 링커의 다른 예시는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,34(그 전체가 사실상 참조로서 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 세포 내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit 링커 또는 Phe-Lys 링커(예를 들어, val-cit 링커를 가지는 독소루비신의 합성을 기술한 미국 특허 번호 6,214,345를 참조)이다.
다른 구현예에서, 절단가능한 링커는 pH에 민감한데, 즉, 일정한 pH 값에서의 가수분해에 민감하다. 통상적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건 하에 가수분해가능하다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해가능한 산 불안정 링커(예를 들어, 하이드라존(hydrazone), 세미카바존(semicarbazone), 티오세미카바존(thiosemicarbazone), 시스-아코니트 아미드(cis-aconitic amide), 오르토에스테르, 아세탈, 케탈, 등)가 사용될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik 및 Walker(1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123); Neville 등(1989, Biol. Chem. 264:14653-14661)을 참조한다. 이러한 링커는 혈액 내와 같은 중성 pH 조건 하에서는 상대적으로 안정하지만, 리소좀의 대략적인 pH인 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 일정한 구현예에서, 가수분해 가능한 링커는 (예를 들어, 아실하이드라존 결합에 의해 치료제에 부착된 티오에테르와 같은) 티오에테르 링커이다(예를 들어, 미국 특허 번호 5,622,929 참조).
또 다른 구현예에서, 링커는 환원 조건 하에 절단가능하다(예를 들어, 이황화 링커). 예를 들어, N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트(SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(SPDB) 및 N-숙신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔(SMPT)-, SPDB 및 SMPT를 이용하여 형성될 수 있는 것을 포함하는 다양한 이황화 링커가 당해 분야에 알려져 있다. (예를 들어, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987을 참조한다. 또한 미국 특허 번호 4,880,935도 참조한다).
다른 구현예에서, 링커는 말로네이트 링커(Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), 말레이미도벤조일 링커(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), 또는 3'-N-아미드 유사체(Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12)이다.
또 다른 구현예에서, 링커 유닛은 절단가능하지 않고 약물은 항체 분해에 의해 방출된다. (그 전체가 사실상 참조로서 본원에 포함된 미국 공개 번호 2005/0238649 참조).
많은 구현예에서, 링커는 자가 희생적이다. 본원에서 사용된, "자가 희생 스페이서"라는 용어는 2개의 간격이 있는 화학적 모이어티를 안정한 3자 분자로 공유 결합시킬 수 있는 이중기능적 화학적 모이어티를 지칭한다. 자가 희생 스페이서는 제1 모이어티에 대한 결합이 절단되면 제2 화학적 모이어티로부터 자발적으로 분리될 것이다. 예를 들어, 약물 및 절단가능한 기질이 자가 희생 링커를 통해 선택적으로 결합된 약물-절단가능한 기질 접합체에 관한 WO 2007/059404A2, WO06/110476A2, WO05/112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 및 WO02/083180(모두 명백하게 참조로서 포함됨)을 참조한다.
종종 링커는 세포 외 환경에 실질적으로 민감하지 않다. 링커의 맥락에서 본원에서 사용된, " 세포 외 환경에 실질적으로 민감하지 않은,"은 항체-약물 접합체 화합물의 시료 내 약 20%, 15%, 10%, 5%, 3% 이하 또는 약 1% 이하의 링커가 항체-약물 접합체 화합물이 세포 외 환경(예를 들어, 혈장 내)에 존재할 때 절단된다는 것을 의미한다.
링커가 세포 외 환경에 실질적으로 민감하지 않은지 여부는, 예를 들어, 혈장과 항체-약물 접합체 화합물을 사전결정된 시간(예를 들어, 2, 4, 8, 16 또는 24시간)동안 인큐베이션한 다음 혈장 내 존재하는 유리 약물의 양을 정량함으로써 결정할 수 있다.
다른, 비상호 배타적인 구현예에서, 링커는 세포 내재화를 촉진하다. 일정한 구현예에서, 링커는 치료제(즉, 본원에 기술된 항체-약물 접합체 화합물의 링커-치료제 모이어티의 환경 내)에 접합될 때 세포 내재화를 촉진한다. 또 다른 구현예에서, 링커는 아우리스타틴 화합물 및 본 발명의 항-LY75 항체에 접합될 때 세포 내재화를 촉진한다.
본 조성물과 함께 사용될 수 있는 다양한 예시적인 링커 및 방법이 WO 2004/010957, 미국 공개 번호 2006/0074008, 미국 공개 번호 20050238649, 및 미국 공개 번호 2006/0024317(각각 그 전체가 사실상 참조로서 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
약물 로딩 (Drug Loading)
약물 로딩은 p로 나타내고 분자 내 항체 당 약물 모이어티의 평균 수이다. 평균 수가 종종 분수 또는 소수일 수 있지만, 약물 로딩("p")은 항체 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 개이상 모이어티(D)일 수 있다. 일반적으로, 1 내지 4의 약물 로딩이 대개 유용하고, 1 내지 2도 또한 유용하다. 본 발명의 ADC는 1 내지 20, 예를 들어, 1~15, 1~10, 2~9, 3~8, 4~7, 5~6개의 다양한 약물 모이어티에 접합된 항체의 수집물을 포함한다. 접합 반응으로부터 ADC의 제제에서 항체 당 약물 모이어티의 평균 수는 질량 분광법 및 ELISA 검정과 같은 통상적인 수단에 의해 특성 분석될 수 있다.
P를 고려하여 ADC의 정량적인 분포도 또한 결정될 수 있다. 일부 경우에서, p가 다른 약물 로딩을 가지는 ADC로부터의 일정한 값인 동종 ADC의 분리, 정제 및 특성 분석은 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체의 경우, p는 항체 상의 부착 자리의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 위의 예시적인 구현예에서처럼 부착이 시스테인 티올인 경우 항체는 단 하나 또는 몇몇 시스테인 티올기를 가질 수 있거나, 단 하나 또는 몇몇 충분히 반응성인 티올기를 가질 수 있고 이를 통해 링커가 부착될 수 있다. 일정한 구현예에서, 더 높은 약물 로딩, 예를 들어, p>5는 일정한 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 내 투과성의 소실을 유발할 수 있다. 일정한 구현예에서, 본 발명의 ADC를 위한 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4; 약 3.1 내지 약 3.9; 약 3.2 내지 약 3.8; 약 3.2 내지 약 3.7; 약 3.2 내지 약 3.6; 약 3.3 내지 약 3.8; 또는 약 3.3 내지 약 3.7의 범위이다. 실제로, 일정한 ADC의 경우, 항체 당 약물 모이어티의 최적비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 나타났다. US 2005/0238649 A1(그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)을 참조한다.
일정한 구현예에서, 약물 모이어티의 이론적인 최대치보다 더 적은 양이 접합 반응 중 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들어, 아래에서 논의되는 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 라이신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 결합될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올기를 함유하지 않는데; 실제로 항체 내 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화 가교로서 존재한다. 일정한 구현예에서, 항체는 부분적 또는 전체적 환원 조건 하에 디티오트레톨(DTT) 또는 트리카보닐에틸포스핀(TCEP)과 같은 환원제로 환원되어 반응성 시스테인 티올기를 생성할 수 있다. 일정한 구현예에서, 항체는 라이신 또는 시스테인과 같은 반응성 친핵성기를 드러내기 위해 변성 조건을 거친다.
ADC의 로딩(약물/항체 비)은 상이한 방식, 예를 들어 (i) 항체에 대한 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰 초과를 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건, (iv) 시스테인 잔기의 수 및 위치가 링커-약물 부착(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이 제조되고 그 전체가 참조로서 본원에 포함된 WO2006/034488에서와 같은 티오Mab 또는 티오Fab)의 수 및/또는 위치의 조절을 위해 변형되도록 항체의 아미노산 서열을 재조합 기술에 의한 조작에 의해 조절될 수 있다.
하나를 초과하는 친핵기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약, 뒤이어 약물 모이어티 시약과 반응하는 경우, 얻어진 생성물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 가지는 ADC 화합물의 혼합물이라는 것이 이해된다. 항체 당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정을 통해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개별적인 ADC 분자는 질량 분광법으로 혼합물 내에서 식별되고 HPLC, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피로 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 로딩 값을 가지는 동종 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
ADC의 세포독성 효과를 결정하는 방법
약물 또는 항체-약물 접합체가 세포에 대해 세포정지 및/또는 세포독성 효과를 발휘하는지를 결정하는 방법은 알려져 있다. 일반적으로, 항체 약물 접합체의 세포독성 또는 세포정지 활성은 항체 약물 접합체의 표적 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에 노출시키고, 세포를 약 6시간 내지 약 5일의 기간 동안 배양하고, 세포 생존성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 세포 기반 시험관 내 검정은 항체 약물 접합체의 생존성(증식), 세포독성, 및 세포자살(카스파제 활성화)의 유도를 측정하는 데 사용될 수 있다.
항체 약물 접합체가 세포정지 효과를 발휘하는지를 결정하기 위해, 티미딘 삽입 검정법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트의 5,000 세포/웰의 밀도로 표적 항원을 발현하는 암 세포를 72시간 동안 배양하고 72시간 중 최종 8시간 동안 0.5 μCi의 3H-티미딘에 노출시킬 수 있다. 3H-티미딘의 배양물의 세포 내로의 삽입이 항체 약물 접합체의 존재 및 부재 하에 측정된다.
세포독성을 결정하기 위해, 괴사 또는 세포자살(프로그램화 세포 사멸)이 측정될 수 있다. 괴사는 통상적으로 혈장막의 증가된 투과성; 세포의 팽윤, 및 혈장막의 파괴에 의해 달성된다. 세포자살은 통상적으로 막 수포형성, 세포질의 응축, 및 내인성 엔도뉴클라제의 활성화를 특징으로 한다. 암 세포에 대한 임의의 이러한 효과의 결정은 항체 약물 접합체가 암의 치료에 유용하다는 것을 나타낸다.
세포 생존성은 뉴트랄 레드, 트립판 블루, 또는 ALAMAR™ 블루와 같은 염료의 흡수를 세포 내에서 결정함으로써 측정될 수 있다(예를 들어, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476 참조). 이러한 검정에서, 세포는 염료를 함유하는 배지에서 배양되고, 세포를 세척하고, 염료의 세포 흡수를 나타내는 잔류 염료를 분광광도적으로 측정한다. 단백질-결합 염료 설포로다민 B(SRB)가 또한 세포독성을 측정하기 위해 사용될 수 있다(Skehan et al., 1990, J. Natl. Cacer Inst. 82:1 107-12).
대안적으로, 테트라졸륨 염, 예를 들어 MTT는 죽은 세포가 아닌 살아 있는 세포를 검출함으로써, 포유동물 세포 생존 및 증식에 대한 정량적인 비색 검정법에서 사용된다(예를 들어, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63 참조).
세포자살은, 예를 들어, DNA 단편화를 측정함으로써 정량될 수 있다. DNA 단편화의 정량적인 시험관 내 결정을 위한 상업적인 측광법이 이용가능하다. TUNEL(단편화 DNA 내 표지된 뉴클레오티드의 삽입을 검출) 및 ELISA 기반 검정을 포함하는 이러한 검정의 예가 문헌(Biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37(Roche Molecular Biochemicals))에 기술되어 있다.
세포자살은 또한 세포에서 형태학적 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 괴사에서처럼, 혈장막 온전성의 소실이 일정한 염료(예를 들어, 아크리딘 오렌지 또는 에티디움브로마이드과 같은 형광 염료)의 흡수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 세포자살 세포 수를 측정하기 위한 방법은 Duke 및 Cohen에 의한 문헌(Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16)에 기술되어 있다. 세포는 또한 DNA 염료(예를 들어, 아크리딘 오렌지 또는 에티디움브로마이드, 또는 요오드화 프로피디움)로 표지될 수 있고 세포를 염색체 응축 및 내핵막을 따른 주변화에 대하여 관찰될 수 있다. 세포자살을 결정하기 위해 측정될 수 있는 다른 형태학적 변화는, 예를 들어, 세포질 응축, 증가된 막 수포형성, 및 세포 수축을 포함한다.
세포자살 세포의 존재는 배양물의 부착된 및 “부유하는” 구획 모두에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 양 구획은 상층액을 제거하고, 부착된 세포를 트립신화하고, 원심분리 세척 단계(예를 들어, 2000 rpm에서 10분) 후 제제를 조합하고, (예를 들어, DNA 단편화를 측정함으로써) 세포자살을 검출함으로써 수집될 수 있다. (예를 들어, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:31 10-16 참조).
본 발명의 항-LY75 항체의 치료적 조성물의 시험관 내 효과를 적합한 동물 모델에서 평가할 수 있다. 예를 들어, 외인성 암 모델이 사용될 수 있되, 암 외식편 또는 계대된 이종이식 조직이 면역 약화 동물, 예를 들어 누드 또는 SCID 마우스(Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408) 내로 도입된다. 종양 형성, 종양 회귀 또는 전이 등의 저해를 측정하는 검정을 사용하여 효능이 측정될 수 있다.
전술된 방법의 실행 시 사용되는 치료적 조성물은 원하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 약학 조성물 내에 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 치료적 조성물과 조합될 때 치료적 조성물의 항-종양 기능을 보유하고 일반적으로 환자의 면역계와는 반응하지 않는 임의의 물질을 포함한다. 예시는, 이에 제한되지는 않으나, 멸균 인산 완충 염 용액, 정균수 등과 같은 다수의 임의의 표준 약학적 담체를 포함한다(일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980 참조).
본 발명의 항체의 제조 방법
본 발명은 개시된 항-LY75 항체를 생성하기 위한 방법을 더 제공한다. 이러한 방법은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산(들)을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 당업자에게 이해될 것인 바와 같이, 이러한 방법은 항체의 성질에 따라 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체가 통상적인 전장 항체인 경우, 예를 들어, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 항체가 생성되는 조건 하에 단리될 수 있다.
LY75_A1의 가변 중쇄 및 경쇄(단백질 및 핵산 서열)가 본원에 개시되어 있고; 당해 분야에서 이해될 것인 바와 같이, LY75_A1의 가변 중쇄 및 경쇄는 전장 중쇄 및 경쇄를 생성하기 위해 용이하게 증폭될 수 있다. 즉, 본원에 개략된 VH 및 VK 세그먼트를 코딩하는 DNA 단편을 제공함으로써, 이러한 DNA 단편은, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자, 또는 scFv 유전자로 전환하기 위해 표준 재조합 DNA 기술로 더 조작될 수 있다. 이러한 조작에서, VK- 또는 VH를 코딩하는 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 유연한 링커와 같은 다른 단백질을 코딩하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 결합된다. 본 맥락에서 사용된 "작동가능하게 결합된”이라는 용어는, 2개의 DNA 단편이 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 프레임에 맞게 남아있도록 연결된다는 것을 의미하고자 하는 것이다.
VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH를 코딩하는 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1 , CH2 및 CH3)을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 뮤라인 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 알려져 있고[예를 들어, Kabat, E. A., et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조], 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
중쇄 불변 영역은 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 lgG1 또는 lgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH를 코딩하는 DNA는 단지 중쇄 CH1 불변 영역만 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합될 수 있다.
VL/VK 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL을 코딩하는 DNA를 경쇄 불변 영역인 CL을 코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 결합시킴으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 뮤라인 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 알려져 있고[예를 들어, Kabat, E. A., et al.(1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조] 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 구축하기 위해, VH- 및 VL/VK를 코딩하는 DNA 단편은 유연한 링커, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 결합되어, VH 및 VL/VK 서열이 유연한 링커에 의해 연결된 VL/VK 및 VH 영역을 가지는 연속 단일-사슬 단백질로 발현될 수 있다[예를 들어, Bird et al.(1988) Science 242:423-426; Huston et al.(1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883; McCafferty et al.,(1990) Nature 348:552-554 참조].
일반적으로, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산이 제공된다. 비록 본원에 기술된 조성물에 따르는 다른 조합도 본 발명에 포함되지만, 이러한 폴리뉴클레오티드는 각각의 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변 영역을 코딩한다. 본 발명은 또한 개시된 폴리뉴클레오티드 및 이러한 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 단편을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA, cDNA, 유전체 DNA, 핵산 유사체, 및 합성 DNA의 형태인 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 범주 내이다. DNA는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 만일 단일 가닥이라면 코딩(센스) 가닥 또는 논코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열은 본원에 제공된 코딩 서열과 동일할 수 있거나 상이한 코딩 서열일 수 있는데, 유전자 코드의 축퇴성 또는 중복성의 결과로, 이러한 서열은 본원에 제공된 DNA와 동일한 폴리펩티드를 코딩한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산(들)은 염색체 외일수 있거나 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포의 게놈 내에 삽입되도록 설계될 수 있는 발현 벡터 내로 삽입된다. 발현 벡터는 임의의 수의 적절한 조절 서열(이에 제한되지는 않으나, 전사 및 번역 조절 서열, 프로모터, 리보솜 결합 자리, 인핸서, 복제 원점 등을 포함함) 또는 다른 구성요소(선택 유전자 등)를 함유할 수 있는데, 이들 모두는 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이 작동가능하게 결합된다. 일부 경우에, 2종의 핵산이 사용되고 각각은 상이한 발현 벡터(예를 들어, 제1 발현 벡터 내 중쇄, 제2 발현 벡터 내 경쇄) 내에 넣어지거나 대안적으로 2종의 핵산이 동일한 발현 벡터 내에 넣어질 수 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터(들)의 설계는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 좌우될 것이라는 점이 당업자에게 이해될 것이다.
일반적으로, 핵산 및/또는 발현은 재조합 숙주 세포를 생성하기 위해 선택된 숙주 세포에 적합한 임의의 방법(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)을 사용하여 핵산 분자(들)이 (예를 들어, 벡터 내, 세포 내 가공에 의해 생성된 구조체 내, 숙주 세포 게놈에 삽입된) 하나 이상의 발현 조절 인자에 작동가능하게 연결되도록 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 얻어진 재조합 숙주 세포는 발현에 적합한 조건(예를 들어, 유도인자의 존재 하, 적합한 인간이 아닌 동물 내, 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충체 등으로 보충된 적합한 배양 배지 내)하에 유지될 수 있는데, 여기서 코딩된 폴리펩티드(들)가 생성된다. 일부 경우, 중쇄가 하나의 세포에서 생성되고 경쇄는 다른 세포에서 생성된다.
발현을 위한 숙주로 이용가능한 포유동물 세포주는 당해 분야에 알려져 있고, 이에 제한되지는 않으나 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, HEK 293 세포, NSO 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 원승이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), 및 다수의 다른 세포주를 포함하는, 미국 미생물 보존 센터(ATCC, Manassas, VA)로부터 입수가능한 많은 불멸 세포주를 포함한다. 이에 제한되지는 않으나 박테리아, 효모, 곤충, 및 식물을 포함하는 비포유동물 세포도 또한 재조합 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 소 또는 닭과 같은 형질전환 동물에서 생성될 수 있다.
항체 분자 생물학, 발현, 정제, 및 스크리닝을 위한 일반적인 방법은 잘 알려져 있는데, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567, 4,816,397, 6,331,415 및 7,923,221 뿐 아니라 문헌(Antibody Engineering, edited by Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 and 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; and Morrison, S.(1985) Science 229:1202)을 참조한다.
약학 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 조성물, 예를 들어, 하나의 본 발명의 LY75 항체 또는 이의 항원 결합 부위(들) 또는 이의 조합을 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 하나의 본 발명의 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자, 또는 (예를 들어, 2종 이상의 상이한) 본 발명의 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 표적 항원 상 상이한 에피토프에 결합하거나 상보적인 활성을 가지는 항체(또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 조합 요법으로, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 항-종양제, 또는 항염증 또는 면역억제제와 조합된 본 발명의 항-항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에서 사용될 수 있는 예시적인 치료제는 아래의 본 발명의 항체의 용도 섹션에 훨씬 자세하게 기술되어 있다.
본원에서 사용된, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다. 투여의 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 다른 자연적인 조건으로부터 화합물을 보호하기 위해 물질 내에 코팅될 수 있다.
본 발명의 약학적 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 임의의 원치 않는 독성학적 효과는 부여하지 않는 염을 지칭한다[예를 들어, Berge, S.M., et al.(1977) J. Pharm . Sci. 66:1-19 참조]. 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성 무기염으로부터 유래된 염뿐 아니라 지방족 모노- 및 디카복실산, 페닐-치환 알카논산, 하이드록시 알카논산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기 부가 염은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속으로부터 유래된 염뿐 아니라, Ν,Ν'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소디움 비설페이트, 소디움 메타비설파이트, 소디움 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물 내에 채용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올류(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물, 식물성 유지류, 예를 들어, 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 어쥬번트를 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 위의 멸균 절차 및 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제를 조성물에 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용이 당해 분야에 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 맞지 않는 경우를 제외하고, 본 발명의 약학 조성물 내 이의 사용이 포함된다. 추가적인 활성 화합물이 또한 조성물 내에 삽입될 수 있다.
치료적 조성물은 통상적으로 멸균되어야 하고 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 고차 구조로 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유하는 용매 또는 분산 매질 및 이의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨과 같은 폴리알코올을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
주사가능한 멸균 용액은, 필요에 따라, 위에 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합을 포함하는 적절한 용매 내에 활성 화합물을 요구되는 양으로 포함시킨 후 멸균 미세여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기 분산 매질 및 위에 열거된 성분 중 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 포함시킴으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조(동결감압건조)로서 이전에 멸균 여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 원하는 성분에 더해진 활성 성분의 분말을 산출한다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상 및 투여의 특정한 양상에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질에 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료적 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중, 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 이러한 양은 활성 성분의 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 범위, 바람직하게는 활성 성분의 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 범위일 것이다.
최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하기 위해 투여 계획이 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇 나눠진 용량이 일정한 시간 동안 투여될 수 있거나 치료 상황의 긴박함에 따라 지시되는 대로 용량이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체를 위한 일원화된 투여량으로 물리적으로 구분된 단위를 지칭하는데; 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 사양은 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정한 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 이러한 활성 화합물의 배합 분야에 내재하는 제한에 직접적으로 좌우되고 이에 의해 구술된다.
항체의 투여를 위해, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 0.001 내지 50 mg/kg, 0.005 내지 20 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg 그리고 보다 흔하게는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.05 mg/kg 체중, 0.1 mg/kg 체중, 0.3 mg/kg 체중, 0.3 mg/kg 체중, 0.5 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 2 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 4 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 6 mg/kg 체중, 7 mg/kg 체중, 8 mg/kg 체중, 9 mg/kg 체중, 10 mg/kg 체중, 12 mg/kg 체중, 15 mg/kg 체중, 20 mg/kg 체중, 25 mg/kg 체중, 30 mg/kg 체중일 수 있거나 0.1~20 mg/kg, 0.5~15 mg/kg, 1~10 mg/kg, 2~8 mg/kg, 3~7 mg/kg, 4~6 mg/kg의 범위 이내일 수 있다. 예시적인 치료 계획은 매일 1회, 2일마다 1회, 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 매월 1회, 6주마다 1회, 3달마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 항-LY75 항체를 위한 바람직한 투여 계획은 정맥 내 투여를 통한 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하되, 항체는 다음의 투여 일정 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 4주마다 6개의 투여량, 그런 다음 3개월 마다; (ii) 3주 마다; (iii) 3 mg/kg 체중 1회 이후 3주마다 1 mg/kg 체중.
일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가지는 2종 이상의 단일 클론 항체가 동시에 투여되는데, 이 경우 투여되는 각각의 항체의 투여량은 지시된 범위 이내이다. 항체는 대개 다중 상황으로 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은, 예를 들어, 매일, 주 2회, 매주, 매월, 3개월마다, 6개월마다, 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시됨으로 불규칙적일 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1~1000 μg/ml, 5~750 μg/ml, 10~600 μg/ml, 15~500 μg/ml, 20~400 μg/ml 및 일부 방법에서 약 25~300 μg /ml의 혈장 항체 농도를 달성하기 위해 조정된다.
대안적으로, 항체는 지연 방출 제형으로 투여될 수 있는데, 이러한 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 항체의 환자 내 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체가 이어진다. 투여의 용량 및 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서는 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 긴 기간에 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 삶 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질환의 진행이 감소되거나 중단될 때까지, 그리고 바람직하게는 환자가 질환의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 상대적으로 짧은 빈도로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방적 계획으로 투여받을 수 있다.
특정 환자, 조성물, 및 투여의 양상에서, 환자에게 독성이 없으면서 원하는 치료적 반응을 달성하는 데 효과적인 양의 활성 성분이 얻어지도록 본 발명의 약학 조성물 내 활성 성분의 실제 투여량 수준은 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 채용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여 시간, 채용될 특정 화합물의 배출률, 치료의 지속 기간, 다른 약물, 채용된 특정 조성물과 조합하여 사용되는 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적 건강 및 이전의 의료 이력 및 의학 분야에 잘 알려진 유사한 인자들을 포함하는 다양한 약동력학력 인자에 좌우될 것이다.
본 발명의 항-LY75 항체의 "치료적으로 유효한 투여량"은 바람직하게는 질환 증상의 중증도의 감소, 질환의 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 원인으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 초래한다. 예를 들어, LY75 매개 종양의 치료를 위해, "치료적으로 유효한 투여량"은, 바람직하게는, 세포 성장 또는 종양 성장을, 미치료 대상체에 비하여, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 적어도 약 70% 그리고 여전히 더 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%만큼 저해한다. 종양 성장을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 성질은 세포 성장을 저해하는 화합물의 능력을 검증함으로써 평가할 수 있는데, 이러한 저해는 숙련에 의사에게 알려진 검정법에 의해 시험관 내에서 측정될 수 있다. 치료적 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소시키거나, 또는 그렇지 않으면 대상체에서 증상을 개선할 수 있다. 당업자 중 한 명은 대상체의 크기, 대상체의 증상의 중증도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여의 경로와 같은 인자들에 기반하여 이러한 양을 결정할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 알려진 하나 이상의 다양한 방법을 이용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에게 이해될 것이 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 양상은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체를 위한 바람직한 투여 경로는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 정맥 내, 근육 내, 진피 내, 복강 내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 사용된 "비경구 투여"라는 문구는, 대개 주사에 의한, 장 내 및 국소 투여 외의 투여 양상을 의미하고, 제한 없이, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척추강 내, 관절낭 내, 안 내, 심장 내, 진피 내, 복강 내, 경기관, 피하, 각피 하층, 관절 내, 피막하, 지주막하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 경로, 예를 들어, 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어, 비강 내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
활성 화합물은, 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 빠른 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해가능하고, 생체적합한 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 많은 방법이 특허 출원되어 있거나 당업자에게 일반적으로 알려져 있다[예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y 참조].
치료적 조성물은 당해 분야에 알려진 의료적 디바이스로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 치료적 조성물은 미국 특허 번호 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 디바이스와 같은 니들이 없는 피하 주사 디바이스로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 제어되는 속도로 약제를 분배하기 위한 이식가능한 미세 주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 약제를 투여하기 위한 치료적 디바이스를 개시한 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입률로 약제를 전달하기 위한 약제 주입 펌프를 개시한 미국 특허 번호 4,447,233; 지속적인 약물 전달을 위한 이식가능한 가변 유동 이식물 주입 장치를 개시한 미국 특허 번호 4,447,224; 다중 챔버 구획을 가지는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시한 미국 특허 번호 4,475,196. 이러한 특허들은 참조로서 본원에 포함된다. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템, 및 모듈이 당업자에게 알려져 있다.
일정한 구현예에서, 본 발명의 단일 클론 항체는 적절한 생체 내 분배를 보장하도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 혈뇌 장벽(BBB)은 많은 고친수성 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료적 화합물이 (원하는 경우) BBB를 건너는 것을 보장하기 위해, 화합물은, 예를 들어, 리포솜 내에 제형화될 수 있다. 리포솜을 제조하는 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331을 참조한다. 리포솜은 특이적 세포 또는 기관으로 선택적으로 이동됨으로써, 표적화된 약물 전달을 증진할 수 있는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다[예를 들어, V.V. Ranade(1989) J. Clin . Pharmacol. 29:685 참조]. 예시적인 표적화 모이어티는 폴레이트 또는 비오틴(예를 들어, 미국 특허 5,416,016 참조); 만노시드[Umezawa et al.(1988) Biochem . Biophys . Res. Commun. 153:1038]; 항체[P.G. Bloeman et al.(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al.(1995) Antimicrob . Agents Chemother. 39:180]; 계면활성제 단백질 A 수용체[Briscoe et al.(1995) Am. J. Physiol. 1233:134]; p120[Schreier et al.(1994) J. Biol . Chem. 269:9090]을 포함하고; 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen(1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler(1994) Immunomethods 4:273도 참조한다.
용도 및 방법
본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 LY75 매개 장애의 진단 및 치료와 관련된 다수의 시험관 내 및 생체 내 진단 및 치료 활용성을 가진다.
일부 구현예에서, 이러한 분자는 다양한 장애를 치료하고, 예방하고 진단하기 위해 시험관 내 또는 생체 외 배양물에서 세포에, 또는, 예를 들어, 생체 내로 인간 대상체에 투여될 수 있다. 본원에서 사용된, "대상체"라는 용어는 인간 및 인간이 아닌 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 인간이 아닌 동물은 모든 척추 동물, 예를 들어, 포유동물 및 비포유동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류를 포함한다. 바람직한 대상체는 LY75 활성에 의해 매개되는 장애를 가지는 인간 환자를 포함한다. 방법은 이상 LY75 발현과 연관된 장애를 가지는 인간 환자를 치료하기에 특히 적합하다. LY75에 대한 항체가 다른 제제와 함께 투여될 때, 2종은 어떠한 순서로도 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 항체의 LY75에 대한 특이적인 결합을 고려할 때, 본 발명의 항체는 세포의 표면 상 LY75 발현을 특이적으로 검출하는 데 사용될 수 있고, 더욱이, 면역친화도 정제를 통해 LY75를 정제하는데 사용될 수 있다.
더욱이, 종양 세포 상 LY75의 발현을 고려할 때, 본 발명의 항체, 항체 조성물 및 방법은 종양 형성 장애, 예를 들어, LY75를 발현하는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 장애를 가지는 대상체를 치료하거나, 예를 들어 위암, 신장암, 갑상선암, 식도암, 두경부암, 피부암, 간암, 췌장암, 직장결장암, 방광암, 전립선암, 유방암(3중 음성 유방암을 포함함), 난소암, 폐암, 골수종, 백혈병(만성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 포함함), 비호지킨 림프종(DLBCL, B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포 T 세포 림프종을 포함함)을 포함하는 이러한 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. LY75는, 아래의 실시예 5 및 7에 예시된 바와 같이, 항체 결합을 내재화시킴으로써 본 발명의 항체가 임의의 작용의 페이로드 기전, 예를 들어, ADC 접근, 방사면역접합체, 또는 ADEPT 접근에 사용될 수 있게 하는 것으로 입증되었다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 단일 클론 항체, 항체 단편, 나노바디®, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물 등)는 LY75의 수준, 또는 그들의 막 표면에 LY75를 함유하는 세포의 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있는데, 그런 다음 이러한 수준은 일정한 질환의 증상에 연관될 수 있다. 대안적으로, 일반적으로 ADC로 투여되는 항체는, LY75 기능을 저해하거나 차단하기 위해 사용될 수 있고, 결국, 일정한 질환 증상의 예방 또는 개선에 연결될 수 있음으로써, 질환의 매개인자로서의 LY75를 시사한다. 이는 시료 및 대조군 시료를 항체와 LY75 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 항-LY75 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 LY75 사이에 형성된 임의의 복합체가 검출되고 시료 및 대조군에서 비교된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 처음에는 시험관 내 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 아래의 실시예에 기술된 유세포 분석 검정을 사용하여 시험할 수 있다.
본 발명의 항체(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자, 면역접합체 및 조성물)은 LY75 관련 질환의 치료요법 및 진단에서 추가적인 유용성을 가진다. 예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 면역접합체는 생체 내 또는 시험관 내에서 다음의 생물학적 활성 중 하나 이상을 유발하기 위해 사용될 수 있다: LY75를 발현하는 세포의 성장을 저해하고/하거나 이를 살상; 인간 작동자 세포의 존재 하에 LY75를 발현하는 세포의 식세포 작용 또는 ADCC를 매개, 또는 LY75에 대한 LY75 리간드의 결합을 차단.
특정한 일 구현예에서, 항체(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 생체 내에서 다양한 LY75 관련 질환을 치료하거나, 예방하거나 진단하기 위해 사용된다. LY75 관련 질환의 예는, 그 중에서, 위암, 직장결장암, 전립선암, 유방암, 난소암 신장암, 갑상선암, 식도암, 두경부암, 피부암, 간암, 췌장암, 방광암, 골수종, 백혈병(만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병을 포함함), 비호지킨 림프종(DLBCL, B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종을 포함함) 및 폐암을 나타내는 인간암 조직을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 투여하기에 적합한 생체 내 및 시험관 내 경로는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 (예를 들어, 정맥 내 또는 피하) 주사에 의해 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물 농도 및/또는 제형에 좌우될 것이다.
이전에 기술된 바와 같이, 본 발명의 항-LY75 항체는 하나 이상의 다른 치료제, 예를 들어, 세포독성제, 방사독성제 또는 면역억제제와 함께 공동투여될 수 있다. 항체는 (면역복합체로서) 제제에 결합될 수 있거나 제제와는 별개로 투여될 수 있다. 후자(별개 투여)의 경우, 항체는 제제 전, 후, 또는 동시에 투여될 수 있거나 다른 알려진 치료요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어, 방사선과 공동 투여될 수 있다. 이러한 치료제는, 그 중에서, 그들 스스로는 환자에게 독성 또는 아독성인 수준에서만 효과적인, 항-신생제, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신(adriamycin)), 시스플라스틴 블레오마이신 설페이트(cisplatin bleomycin sulfate), 카무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil) 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아를 포함한다. 시스플라스틴은 100 mg/kg 용량으로 4주마다 1회 정맥 내로 투여되고 아드리아마이신은 60~75 mg/ml 용량으로 21일마다 1회 정맥 내로 투여된다. 본 발명의 항체와 공동 투여하기에 적합한 다른 제제는 암, 예를 들어, 위암, 직장결장암, 전립선암, 유방암, 난소암 또는 폐암의 치료를 위해 사용되는 다른 제제, 예를 들어 아바스틴(Avastin®), 5FU 및 젬시타빈(gemcitabine)를 포함한다. 본 발명의 항-LY75 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 화학요법제와의 공동 투여는 상이한 기전을 통해 작용하는, 인간 종양 세포에 대한 세포독성 효과를 야기하는 2종의 항암제를 제공한다. 이러한 공동 투여는 항체에 미반응성이 되도록 할 수 있는 약물에 대한 내성의 발달 또는 종양 세포의 항원성의 변화에 의한 문제를 해결할 수 있다.
표적 특이적 작동자 세포, 예를 들어, 본 발명의 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 결합된 작동자 세포는 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화를 위한 작동자는 세포 인간 백혈구, 예를 들어, 대식세포, 호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포는 호산구, 자연 살상 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체를 지니는 세포를 포함한다. 바람직하다면, 작동자 세포는 치료될 대상체로부터 수득될 수 있다. 표적 특이적 작동자 세포는 생리학적으로 허용가능한 용액 중 세포의 현탁액으로 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 세포 대략 108~109일 수 있지만 치료 목적에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 표적 세포, 예를 들어, LY75를 발현하는 종양 세포로의 국소화를 얻고, 예를 들어, 식세포작용에 의해 세포를 살상하는 효과를 얻기에 충분할 것이다. 투여의 경로도 또한 다양할 수 있다.
표적 특이적 작동자 세포로의 치료요법은 표적화된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및/또는 이러한 조성물로 무장된 작동자 세포를 사용하는 항-종양 치료요법이 화학요법과 함께 사용될 수 있다. 추가적으로, 조합 면역요법이 종양 세포 거절을 위해 2종의 상이한 세포독성 작동자 군집을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 Rl 또는 항-CD3에 결합된 항-LY75 항체가 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 작동자 세포 상 FcγR 또는 FcγR의 수준을 조절, 예를 들어, 세포 표면 상 수용체의 캡핑 및 제거를 위해 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물이 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
보체에 결합하는 lgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM으로부터의 일부와 같은 보체 결합 자리를 가지는 본 발명의 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 또한 보체의 존재 하에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 표적 세포를 포함하는 세포의 군집의 본 발명의 결합제 및 적절한 작동자 세포로의 생체 외 처리는 보체 또는 보체를 함유하는 혈청의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포작용은 보체 단백질의 결합에 의해 개선될 수 있다. 다른 구현예에서 본 발명의 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 또한 보체에 의해 용해될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 일정한 구현예에서, 본 개시는 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 보체가 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 인접하게 위치할 때 유리할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청은 개별적으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 조성물(예를 들어, 단일 클론 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체) 및 사용 안내를 포함하는 키트도 본 발명의 범주 이내이다. 키트는 면역억제 시약, 세포독성제 또는 방사독성제, 또는 하나 이상의 추가적인 본 발명의 항체(예를 들어, 제1 항체와는 다른 LY75 항원 내 에피토프에 결합하는 상보적인 활성을 가지는 항체)와 같은 하나 이상의 추가적인 시약을 더 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자는 항체의 치료 효과를 증진하거나 증가시키는 다른 치료제, 예를 들어, 세포독성 또는 방사독성제를 (본 발명의 항체의 투여 이전, 이와 동시에, 또는 이후에) 추가적으로 투여받을 수 있다.
다른 구현예에서, 대상체는, 예를 들어, 대상체를 사이토카인으로 치료함으로써 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어, 증진시키거나 저해하는 제제로 추가적으로 치료될 수 있다. 다중특이적 분자로의 치료 중 투여하기에 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 또한 FcγR 또는 LY75를 발현하는 세포를 표적화, 예를 들어, 이러한 세포를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 결합제가 검출될 수 있는 분자에 연결될 수 있다. 따라서 본 발명은 Fc 수용체, 예를 들어 FcγR, 또는 LY75를 발현하는 세포의 생체 외 또는 시험관 내 국소화를 위한 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자일 수 있다.
특정한 일 구현예에서, 본 발명은, 시료 및 대조군 시료를 항체 또는 이의 일부와 LY75 사이의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 LY75에 특이적으로 결합하는 단일 클론 항체, 또는 이의 항원 결합 부위에 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료 내 LY75 항원의 존재를 검출하거나, LY75 항원의 양을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 그런 다음, 복합체의 형성을 검출하되, 대조군 시료와 비교하여 시료에서의 상이한 복합체 형성이 시료 내 LY75 항원의 존재의 지표이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 LY75 매개 장애, 예를 들어, 위암, 신장암, 갑상선암, 식도암, 두경부암, 피부암, 간암, 췌장암, 직장결장암, 방광암, 전립선암, 유방암(3중 음성 유방암을 포함함), 난소암, 폐암, 골수종, 백혈병(만성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 포함함), 및 비호지킨 림프종(DLBCL, B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종을 포함함)을 포함하는 인간암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 모든 구현예에서, 바람직한 암은 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 3중 음성 유방암 방광암 및 췌장암을 포함한다.
제한 없이, 모든 논문, 간행물, 특허, 특허 출원, 프리젠테이션, 문헌, 보고서, 원고, 브로셔, 책, 인터넷 포스팅, 저널 기사, 정기 간행물, 제품 자료표 등을 포함하는 본 명세서에서 인용된 모든 참조 문헌은, 여기에서 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되는 것이다. 본원에서 참조 문헌의 논의는 단지 그들의 저자에 의해 제시된 주장을 요약하기 위한 것이며 임의의 참조 문헌이 선행 기술을 구성하고, 출원인이 인용된 참조 문헌의 정확성 및 적절성에 대해 이의를 제기할 권리가 있다는 허가를 하는 것이 아니다.
비록 전술된 발명이 이해를 명확하게 하기 위한 목적으로 도해 및 예시의 방식으로 자세히 기술되었지만, 본 발명의 교시에 관하여, 청구 범위의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않으면서 일정한 변경 및 변형이 만들어질 수 있다는 점이 당업자에게 이미 명확할 것이다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되는데, 이는 더 제한하고자 함이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: LY75- 항원에 대한 인간 단일 클론 항체의 생성
표준 절차에 따라서, 마우스(이종마우스 lgG1)를 전장 LY75로 형질감염된 CHO 세포로 면역화하였다.
LY75에 대항하여 발생한 항체의 특이성을 LY75로 형질감염된 HEK293 세포, 이어서 LY75를 발현하는 HT29 세포에서 유세포 분석법으로 시험하였다. 세포 표면 LY75 단백질에 결합하는 항체의 능력을 시험하기 위해, 항체를 LY75를 발현하는 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액(DPBS, 2% FBS)내에서 세척하고, 원심분리하고 100 μl의 희석된 1차 LY75 항체(또한 FACS 완충액에 희석됨)에 재현탁하였다. 항체-세포주 복합체를 얼음에서 60분간 인큐베이션한 다음 전술된 바와 같이 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포-항체 펠렛을 100 μl의 희석된 이차 항체(또한 FACS 완충액에 희석됨)에 재현탁하였고 얼음에서 60분간 인큐베이션하였다 펠렛을 이전처럼 세척하였고, 200 μl FACS 완충액에 재현탁하였다. 시료를 BD FACScanto II 유세포 분석기에 로딩하였고, BD FACSdiva 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다(결과 미도시).
실시예 2: LY75에 대한 단일 클론 항체의 구조적 특성 분석
LY75_A1 단일 클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA 서열을 표준 PCR 기술을 사용하여 얻었고 표준 DNA 시퀀싱 기술을 사용하여 시퀀싱하였다.
항체 서열은 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되어 생식계열 잔기로 복귀될 수 있다.
LY75_A1의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 3 및 1에 나타나 있다.
LY75_A1의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열 번호 4 및 2에 나타나 있다.
알려진 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열에 대한 LY75_A1 중쇄 면역글로불린 서열의 비교는 LY75_A1 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-15로부터의 VH 세그먼트 및 인간 생식계열 JH JH4로부터의 JH 세그먼트를 활용한다는 것을 입증하였다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용한 LY75_A1 VH 서열의 추가적인 분석은 각각 서열 번호 5, 6 및 7에 나타낸 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 도해를 유도하였다. 생식계열 VH 3-15 및 생식계열 JH JH4 서열에 대한 LY75_A1 CDR1, CDR2 및 CDR3 VH 서열의 정렬이 도 1에 나타나 있다.
알려진 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열에 대한 LY75_A1 경쇄 면역글로불린 서열의 비교는 LY75_A1 경쇄가 인간 생식계열 VK 012로부터의 VK 세그먼트 및 인간 생식계열 JK JK4로부터의 JK 세그먼트를 활용한다는 것을 입증하였다. 카바트 시스템의 CDR 영역 결정을 이용한 LY75_A1 VK 서열의 추가적인 분석은 각각 서열 번호 8, 9 및 10에 나타낸 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 도해를 유도하였다. 생식계열 VK 012 및 생식계열 JK JK4 서열에 대한 LY75_A1 CDR1, CDR2 및 CDR3 VK 서열의 정렬이 도 2에 도시되어 있다.
실시예 3: LY75에 대한 단일 클론 항체를 사용한 면역조직화학
LY75에 특이적인 인간 단일 클론 항체를 사용하여, FFPE HT-29 및 A549 세포 펠렛, FFPE 비호지킨 림프종 및 췌장암 어레이, 및 신선하게 동결된 림프종/백혈병 종양, 난소암, 췌장암, 및 유방암 절편 및 정상 조직 어레이에 대하여 면역조직화학을 수행하였다.
재료 및 방법
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 자일렌(X5P-1 gal).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 Histoprep 100% 에탄올(HC-800-1 GAL).
Thermo Scientific(MA, USA)으로부터의 열 유도 에피토프 회복을 위한 10x 시트레이트 완충액(AP9003125).
Thermo Scientific(MA, USA)으로부터의 Thermo Scientific* Pierce* 페록시다제 억제제(35000).
Dako(CA, USA)로부터의 무혈청 단백질 차단제(X0909)
Jackson Immunoresearch(PA, USA)로부터의 이차 항체: 염소 항-인간 IgG Fab-FITC 접합됨(109-097-003)
Jackson Immunoresearch(PA, USA)로부터의 크롬 순수 인간 IgG, 전체 분자(09-000-003)
Abeam(MA, USA)로부터의 3차 항체: 마우스 항-FITC(ab10257)
R&D Systems(MN, USA) 정제된 인간 IgG 이소형 대조군(1 -001A)
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 Tween-20(BP337-100)
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 아세톤(BP2403-4)
Dako(CA, USA)로부터의 이중 결합 EnVision+ HRP 접합 폴리머, 마우스 및 토끼(K4063).
Invitrogen(NY, USA)으로부터의 DAB 2-용액 키트(882014).
Fisher Scientific(PA, USA)로부터의 해리스 헤마톡실린(23-245-677).
Dako(CA, USA)로부터의 파라마운트 봉입 매질 (S302580).
조직 절편 및 어레이는 US Biomax Inc.(MD, USA) 또는 Origene(MD, USA)에서 구입하였다.
FFPE 슬라이드의 제조: 탈파라핀화 및 재수화
FFPE 슬라이드를 자일렌(2 x 3분)에서 탈파라핀화 한 다음 1:1 자일렌: 100% 에탄올(1 x 3분), 100% 에탄올(2 x 3분), 95% 에탄올(1 x 3분), 70% 에탄올(1 x 3분), 50% 에탄올(1 x 3분), 및 수돗물(1 x 3분)을 통해 재수화하였다.
FFPE 슬라이드의 제조: 항원 복구(마이크로파).
LY75 항원을 50 mL 1x 시트레이트 완충액에서 끓을 때까지 높은 동력의 마이크로파 열을 사용한 다음 낮은 동력으로 10분간 코플린 자(Coplin jar)에서 복구하였다. 그런 다음 슬라이드를 상온으로 냉각되도록 추가 15분간 방치한 다음, 3분간 수돗물로 세척하였다. 소수성 장벽 펜으로 각각의 조직 절편/TMA 주위에 원을 그린 다음 슬라이드를 PBS에서 각 세척 당 3분으로 3회 세척하였다.
FF 슬라이드의 제조
슬라이드를 -80C의 저장고로부터 꺼냈고 상온에서 흄 후드(fume hood)에서 20~30분간 건조되도록 하였다. 슬라이드를 -20C의 얼음으로 냉각된 아세톤에서 10분간 고정한 다음 상온에서 흄 후드 내에서 20분간 건조되도록 하였다. 슬라이드를 PBS에서 세척하고 재수화하였는데, 각각 3분간 3회 세척하였다. 소수성 장벽 펜으로 절편의 윤곽을 나타냈다.
항체 복합체의 제조
최종적으로 원하는 농도보다 20배 더 큰 농도(최종 1 μg/mL의 경우 20 μg /mL)를 가지는 용액을 얻기 위해 일차 항-LY75 항체를 무혈청 단백질 차단제(SFPB)에 희석하였다. 이차 항체인 염소 항-인간 면역글로불린 G(IgG) 항원 결합 단편(Fab)을 SFPB에서 유사하게 제조하여 동일한 농도의 용액을 생성하였다.
동일한 부피의 일차 및 이차 항체를 라벨링된 튜브에서 조합하고, 부드럽게 혼합하고, 상온에서 3분간 인큐베이션하여, 원하는 최종 농도보다 10배 더 큰 일차 항체 농도(최종 1 μg/mL의 경우 10 μg/mL)를 얻었다. 이러한 혼합물을 SFPB로 1:5로 희석하고, 부드럽게 혼합하고, 상온에서 30분간 인큐베이션하여, 원하는 최종 농도의 두배인 일차 항체 농도(최종 1 μg/mL의 경우 2 μg/mL)를 얻었다.
최종 염색 복합체를 생성하기 위해, 인간 IgG의 1%(10 μg/μL) 용액을 SFPB에 제조하였고 동일한 부피로 일차/이차 항체 혼합물에 첨가되었다. 이러한 조합을 부드럽게 혼합하고 상온에서 30분간 인큐베이션하였고, 일차/이차 항체 혼합물의 일차 항체 농도의 절반으로 희석하여 원하는 최종 일차 항체 농도(1 μg/mL)를 얻었다.
면역염색
한편, 가습 챔버 내에서 조직을 RT로 페록시다제 억제제와 5~10분간 인큐베이션함으로써 내인성 조직 페록시다제 활성을 차단하였다. 그런 다음 슬라이드를 PBS(3 x 3분(각 세척당))에서 세척하였다. 조직을 가습 챔버 내에서 상온으로 30분간 SFPB 내에서 인큐베이션하였다. 최종 염색 복합체를 각 조직 절편 및/또는 마이크로어레이에 적용하였고, 슬라이드를 가습 챔버 내에서 30분간 상온으로 인큐베이션하였다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 1회, PBST(PBS+0.125% Tween-20)로 1회(각 세척 당 3분) 세척하였다. 3차 항체 마우스 항-FITC를 2 μg/mL 농도로 가습 챔버 내 상온에서 30분간 적용하였다. 그런 다음 절편을 PBS에서 1회 PBST에서 1회(각 세척 당 3분) 세척하였다. 이중 결합 EnVision+ 항-마우스/토끼-HRP-접합 폴리머를, 그런 다음, 조직에 적용하였고 슬라이드를 가습 챔버 내에서 상온으로 30분간 인큐베이션하였다. 그런 다음 슬라이드를 PBS에서 1회 PBST에서 1회(각 세척 당 3분) 세척하였다. 조직을 상온에서 제조자의 지시에 따라 제조된 DAB 용액에서 10분간 인큐베이션하였다. 슬라이드를, 그런 다음 흐르는 수돗물로 2분간 1회 및 PBS로 3분간 1회 세척하였다. 슬라이드를 상온에서 30초간 헤마톡실린으로 대비염색하고, 흐르는 수돗물로 세척하였다. 슬라이드를 상온에서 30분간 건조하였고 파라마운트 봉입 매질(Faramount mounting media)을 사용하여 커버슬립을 슬라이드 상에 봉입하였다.
결과
LY75_A1는 FFPE 3중 음성 유방암 시료에서 양성을 나타냈는데, 77%의 절편이 양성 염색을 나타내었고 55%는 강한(+++) 염색을 나타냈다.
FF 정상 조직에서 LY75에 대한 염색은 일반적으로 없거나 낮다. 유방의 도관 표피, 침샘, 및 췌장은 현저하게 낮은 염색 내지는 중간의 염색을 나타냈고, 비장은 낮은 양성으로 염색되었다. 따라서 LY75에 대해 유도된 항체는 시험된 암의 일부 및 가능하게는 LY75의 발현을 나타내는 다른 암 유형의 진단 및 치료제로서 유용성을 가질 수 있다.
실시예 4: HT-29 세포에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛 으로 스핀 다운시켰다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같은 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도로 재현탁하였다.
50ul/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3a에 도시된 결과는 HT-29 세포의 세포 살상을 유도할 수 있는 LY75에 결합하는 것으로 알려진 항체의 하위군집을 나타낸다. 이는, 항체가 LY75에 결합할 수 있지만, 단지 소수만이 DM1에 접합될 때 효능을 나타낸다는 것을 시사한다. 그런 다음 추가적인 세포독성 활성 분석을 위해 하위군집으로부터 항체가 선택된다.
실시예 5: 직장결장암 세포에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell titer glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3b는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 HT-29 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도 및 독소에 접합된 다른 항-LY75 항체(실시예 1로부터 선택됨)에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 6: 림프종 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3c는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 RAJI 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3d는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 Namalwa 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3e는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 Karpas 299 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도 및 다른 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체(실시예 1로부터 선택됨)에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 7: 췌장암 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT- 10-041 -CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3f는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 BxPC3 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3g는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 HupT4 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3h는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 HPAFFII 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도 및 다른 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체(실시예 1로부터 선택됨)에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 8: 만성 림프구성 백혈병 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 셀 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10Oul Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3i는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 EHEB 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3j는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 Mec-1 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도 및 다른 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체(실시예 1로부터 선택됨)에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 9: 급성 단핵구성 백혈병 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT- 10-041 -CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함)하였다. 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3k는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 AML-193 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도 및 다른 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체(실시예 1로부터 선택됨)에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 10: 유방암 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3l은 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 HCC 70(ER 음성, PR 음성 및 Her2 음성) 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3m은 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 HCC 1806(ER 음성, PR 음성 및 Her2 음성) 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3n은 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 MDA-MB-468 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 11: 방광암 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-04 -CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함)하였다. 100ul/웰 PBS 및 10Oul Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3o는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 RT4 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3p는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 5637 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3q는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 SW780 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 12: 두경부암 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT- 10-041 -CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3r은 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 SCC-9 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 13: 식도암 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
물질
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3s는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 OE 19 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 14: 난소암 세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT- 10-041 -CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척하였다(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함). 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3t는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 OVCAR-3 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3u는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 SK-OV-3 세포에서의 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 15: 다발성 골수종세포주에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
재료
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 세포 스트리퍼(Cell stripper)(비효소적 세포 해리)(MT-25-056CI).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 PBS pH 7.4(1X)(SH30028LS).
Fisher Scientific(PA, USA)으로부터의 RPMI 1640 배지(MT-10-041-CM).
Promega(Wl, USA)로부터의 Cell Titer Glo(G7572).
방법
세포를 세포 스트리퍼를 사용하여 해리하고 계수하였다. 5e3 세포/웰을 펠렛으로 스핀다운하였다(현탁 세포의 경우, 세포의 배가 시간에 따라, 10e3 세포/웰과 같이 더 많은 양이 사용될 수 있음). 펠렛을 배양 배지에 1 e5 세포/mL의 농도까지 재현탁하였다.
50 ㎕/웰 세포 현탁액을 96-웰 백색 측면, 투명 바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 항체를 희석하였고 0~20 nM 사이의 농도(시험 농도의 2배)에 상응하는 8개의 지점으로 적정(3배 적정)하였다. 희석된 항체 또는 (미처리 시료의 경우) 배지(50 ㎕/웰)를 적절한 웰에 첨가하였다. 증발을 방지하기 위해 과량의 배지(200 ㎕/웰)를 플레이트의 바깥쪽 행 및 열에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 상온에서 30분간 인큐베이션하였다. 한편, Cell Titer Glo 용액을 해동하였다. 플레이트를 털고 100 ㎕/웰 PBS로 1x 세척(현탁 세포의 경우, 우선 플레이트를 펠렛 세포로 원심분리함)하였다. 100 ㎕/웰 PBS 및 10O ㎕ Cell titer glo를 각각의 웰에 첨가하였고 분쇄하여 혼합하였다. 플레이트를 어둠 속에서 15분간 상온으로 인큐베이션하였고, 발생한 효과적인 세포 용해를 보장하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 그런 다음 플레이트를 Glomax 광도계에서 판독하였다.
결과
도 3v는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 MOLP-8 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 도 3w는 DM1 및 DM4에 접합된 항-LY75 항체의 RPMI8226 세포에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 이러한 결과는 항체 농도에 비례하는 세포독성 활성에서의 증가를 입증하는 것이다.
실시예 16: Raji 이종이식 모델에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
LY75_DM1 및 LY75_DM4의 효능을 피하 Raji 버킷 림프종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다.
면역 결핍 SCID 마우스에 Raji(인간 버킷 림프종) 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 확립되도록 하였고 마우스를 군 당 3~6 마우스의 5개의 처리군으로 분류하였다. 평균 종양 용적이 군 당 129~132 mm3의 평균 크기에 도달하면, 각 군을 지시된 투여량으로 정맥 내로 투여된 다음의 화합물 중 하나로 처리하였다: 군 1(비히클; 인산 완충 염수(PBS)); 군 2(LY75_DM1; 10 mg/kg), 군 3(이소형 대조군-DM1; 10 mg/kg), 군 4(LY75_DM4; 5 mg/kg), 군 5(이소형 대조군-SPBDDM4; 5 mg/kg). 제2 용량을 1주일 후에 투여하였다. 체중(BW)을 모니터링하였고, 마우스의 건강 및 해로운 부작용에 대하여 자주 평가하였고, 종양을 매주 2회 측정하였다. 마우스의 종양이 2000 mm3의 종양 용적 종료점에 도달한 때나 60일 후(어느 쪽이든 먼저 오는 쪽), 마우스를 안락사시켰다. ADC로 처리된 마우스 대 PBS로 처리된 마우스에서 종양 성장 지연(TGD), 종료점까지의 시간(TTE) 중앙값에서의 증가 및 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선의 차이의 로그 순위 분석으로부터 효능을 결정하였다. 종료점에 도달한 처음 다섯 마리의 비히클로 처리된 대조군 마우스를 종양에 대한 시료(포르말린 고정 및 파라벤 포매로 가공됨)로 사용하였다.
결과
도 4a는 LY75_DM1 및 LY75_DM4 각각이 Raji 버킷 림프종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 대조군에 비하여 유의한 항-종양 활성 및 유의하게 연장된 생존을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다; 그러나, 5 mg/kg LY75_DM4 용량이 LY75_DM1의 10 mg/kg 용량보다 유의하게 더욱 효과적이었는데, 6 마우스 중 5 마리에서 완전하지만 일시적인 종양 퇴행을 초래하였다. 모든 치료는 잘 관용되었고 어떠한 임상적인 독성의 징후도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 LY75에 대하여 유도된 ADC, 예를 들어 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 인간 비호지킨 림프종 암 환자의 치료에 임상적 혜택을 제공할 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 17: Namalwa 이종이식 모델에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
LY75_DM1 및 LY75_DM4의 효능을 피하 Namalwa 버킷 림프종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다.
면역 결핍 SCID 마우스에 Namalwa(인간버킷 림프종) 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 확립되도록 하였고 마우스를 군 당 6마리의 마우스의 5개의 치료군으로 분류하였다. 평균 종양 용적이 군 당 114 mm3의 평균 크기에 도달하면, 각 군을 지시된 투여량으로 정맥 내로 투여되는 다음의 화합물 중 하나로 처리하였다: 군 1(비히클; 인산 완충 염수(PBS)); 군 2(LY75_DM1; 10 mg/kg), 군 3(이소형 대조군-DM1; 10 mg/kg), 군 4(LY75_DM4; 5 mg/kg), 군 5(이소형 대조군-SPBDDM4; 5 mg/kg). 체중(BW)을 모니터링하였고, 마우스의 건강 및 해로운 부작용에 대하여 자주 평가하였고, 종양을 매주 2회 측정하였다. 마우스의 종양이 2000 mm3의 종양 용적 종료점에 도달할 때, 또는 60일 후(어느 쪽이든 먼저 오는 쪽), 마우스를 안락사시켰다. ADC로 처리된 마우스 대 PBS로 처리된 마우스에서 종양 성장 지연(TGD), 종료점까지의 시간(TTE) 중앙값에서의 증가, 및 카플란 마이어 생존 곡선에서의 차이의 로그순위 분석으로부터 효능을 결정하였다. 종료점에 도달한 처음 다섯 마리의 비히클로 처리된 대조군 마우스를 종양에 대한 시료(포르말린 고정 및 파라벤 포매로 가공됨)로 사용하였다.
결과
도 4b는 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 각각 Namalwa 버킷 림프종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 대조군에 비하여 유의한 항-종양 활성 및 생존 연장을 나타냈다는 것을 보여주는 것이다; 그러나 5 mg/kg LY75_DM4 용량은 LY75_DM1의 10 mg/kg 용량보다 유의하게 더욱 효과적이었는데, 종양 용적에서 잠시 동안의 감소를 유발하였다. 모든 치료는 잘 관용되었고 어떠한 임상적인 독성의 징후도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 LY75에 대하여 유도된 ADC, 예를 들어, LY75_DM1 및 LY75_DM4가 인간 비호지킨 림프종 암 환자의 치료에 임상적인 혜택을 제공할 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 18: 췌장암 이종이식 모델에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
LY75_DM1 및 LY75_DM4의 효능을 피하 HPAFII 췌장 선암종 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다.
면역결핍 무흉선 누드 마우스에 HPAFII(인간 췌장 선암종) 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 확립되도록 하였고 마우스를 군 당 6마리의 마우스의 5개의 치료군으로 분류하였다. 평균 종양 용적이 약 114 m3m/군의 평균 크기에 도달하면, 각 군을 지시된 투여량으로 정맥 내로 투여되는 다음의 화합물 중 하나로 처리하였다: 군 1(비히클; 인산 완충 염수(PBS)); 군 2(LY75_DM1; 10 mg/kg), 군 3(이소형 대조군-DM1; 10 mg/kg), 군 4(LY75_DM4; 5 mg/kg), 군 5(이소형 대조군-SPBDDM4; 5 mg/kg). 체중(BW)을 모니터링하였고, 마우스의 건강 및 유해한 부작용에 대하여 자주 평가하였고, 종양을 매주 3회 측정하였다. 마우스의 종양이 2000 mm3의 종양 용적 최종점에 도달할 때 또는 90일 후(어느 쪽이든 먼저 오는 쪽) 마우스를 안락사시켰다. ADC로 처리된 마우스 또는 PBS로 처리된 마우스에서 종양 용적에 대한 치료의 효과 및 카플란 마이어 생존 곡선에서의 차이의 로그순위 분석으로부터 효능을 결정하였다. 종양을 비히클로 처리된 대조군 마우스로부터 시료화하였고 포르말린 고정 및 파라벤 포매로 가공하였다.
결과
도 4c는 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 HPAFII 누드 마우스 이종이식 모델에서 대조군에 비하여 유의하고 유사한 강한 항종양 활성 및 생존 연장을 나타내었다는 것을 보여주는 것이다. 모든 치료는 잘 관용되었고 어떠한 임상적인 독성의 징후도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 LY75에 대하여 유도된 ADC, 예를 들어 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 인간 췌장암 환자의 치료에서 임상적인 혜택을 제공할 가능성을 시시하는 것이다.
실시예 19: 방광암 이종이식 모델에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
LY75_DM1 및 LY75_DM4의 효능을 피하 SW780 인간 방광 암종 SCID 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다.
면역결핍 무흉선 누드 마우스에 HPAFII(인간 췌장 선암종) 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 확립되도록 하였고 마우스를 군 당 6마리의 마우스의 5개의 치료군으로 분류하였다. 평균 종양 용적이 약 114 mm3/군의 평균 크기에 도달하면, 각 군을 지시된 투여량으로 정맥 내로 투여되는 다음의 화합물 중 하나로 처리하였다: 군 1(비히클; 인산 완충 염수(PBS)); 군 2(LY75_DM1; 1 mg/kg), 군 3(LY75_DM1; 2.5 mg/kg), 군 4(LY75_DM1; 5 mg/kg), 군 5(LY75_DM4; 1 mg/kg) ), 군 6(LY75_DM4; 2.5 mg/kg) ), 군 7(LY75_DM4; 5 mg/kg) ), 군 8(이소형 대조군-SPBDDM4; 5 mg/kg). 체중(BW)을 모니터링하였고, 마우스의 건강 및 유해한 부작용에 대하여 자주 평가하였고, 종양을 주 3회 측정하였다. 마우스의 종양이 2000 mm3의 종양 용적 종료점에 도달할 때 또는 90일 후(어느 쪽이든 먼저 오는 쪽), 마우스를 안락사시켰다. ADC로 처리된 마우스 또는 PBS로 처리된 마우스에서 종양 용적에 대한 치료 효과 및 카플란 마이어 생존 곡선에서의 차이의 로그순위 분석으로부터 효능을 결정하였다. 종양은 비히클로 처리된 대조군 마우스로부터 시료화되었고 포르말린 고정 및 파라벤 포매로 가공되었다.
결과
도 4d는 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 SW780 누드 마우스 이종이식 모델에서 대조군에 비하여 유의하고 유사한 강한 항종양 활성 및 생존 연장을 나타냈다는 것을 보여주는 것이다. 모든 치료는 잘 관용되었고 어떠한 임상적인 독성의 징후도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 LY75에 대하여 유도된 ADC, 예를 들어, LY75_DM1 및 LY75_DM4가 인간 방광암 환자의 치료에서 임상적인 혜택을 제공할 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 20: 유방암 이종이식 모델에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체의 효능
LY75_DM1 및 LY75_DM4의 효능을 피하 MDA-MB-468 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다.
면역결핍 무흉선 누드 마우스에 MDA-MB-468(인간 3중 음성 유방 선암종) 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 확립되도록 하였고 마우스를 군 당 10마리의 마우스의 7개의 치료군으로 분류하였다. 평균 종양 용적이 군 당 167 mm3의 평균 크기에 도달하면, 각 군을 지시된 투여량으로 정맥 내로 투여되는 다음의 화합물 중 하나로 처리하였다: 군 1(비히클; 20 mM 숙신산 나트륨, pH 5.0, 6% 트레할로스, 0.04% 폴리소르베이트); 군 2(LY75_DM1; 5 mg/kg), 군 3(LY75_DM1; 10 mg/kg), 군 4(LY75_DM4; 5 mg/kg), 군 5(LY75_DM4; 2.5 mg/kg), 군 6(LY75_DM4; 1 mg/kg), 군 7(이소형 대조군-DM4; 5 mg/kg). 체중(BW)을 모니터링하였고, 마우스의 건강 및 유해한 부작용에 대하여 자주 평가하였고, 종양을 매주 2회 측정하였다. 종양 접종 82일 후 마우스를 안락사시켰다. ADC로 처리된 마우스 대 PBS로 처리된 마우스에서 항-종양 활성(치료군 내 평균 종양 크기/대조군 내 평균 종양 크기 x 100) 및 종료점까지의 시간(TTE) 평균에서의 증가로부터 효능을 결정하였다. 접종 후 71일에 비히클로 처리된 대조군 마우스에서 5개의 가장 큰 종양을 시료화하였고 포르말린 고정 및 파라벤 포매로 가공하였다.
결과
도 4e는 LY75_DM1 및 LY75_DM4 각각이 대조군에 비하여 MDA-MB-468 누드 마우스 이종이식 모델에서 급격한 항-종양 활성을 보였다는 것을 나타내는 것이다. LY75_DM4로 용량 의존적 활성이 관찰되었는데, 2.5 및 5 mg/kg이 1 mg/kg보다 훨씬 더 강력하였다. 5 mg/kg에서, LY75_DM1 및 LY75_DM4가 유사하게 효과적이었다. 평균 종양 용적에서의 지속적인 퇴행은 10 및 5 mg/kg의 LY75_DM1 및 5 및 2.5 mg/kg의 LY75_DM4에서 관찰되었다. 모든 치료는 잘 관용되었고 어떠한 임상적인 독성의 징후도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 LY75에 대하여 유도된 ADC, 예를 들어LY75_DM1 및 LY75_DM4가 인간 3중 음성 유방암 환자의 치료에서 임상적인 혜택을 제공할 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 21: 직장결장암 이종이식 모델에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 항체의 효능
LY75_DM1 및 LY75_DM4의 효능을 피하 COLO205 직장결장 선암종 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 시험하였다.
면역결핍 무흉선 누드 마우스에 COLO205(인간 직장결장 선암종) 종양 세포를 피하로 접종하였다. 종양이 확립되도록 하였고 마우스를 군 당 6마리의 마우스의 5개의 치료군으로 분류하였다. 평균 종양 용적이 군 당 117 mm3의 평균 크기에 도달하면, 각 군을 지시된 투여량으로 정맥 내로 투여되는 다음의 화합물 중 하나로 처리하였다: 군 1(비히클; 인산 완충 염수(PBS)); 군 2 LY75_DM1; 10 mg/kg), 군 3(이소형 대조군-DM1; 10 mg/kg), 군 4(LY75_DM4; 5 mg/kg), 군 5(이소형 대조군-DM4; 5 mg/kg). 제2 용량을 제1 용량 투여 12일 후 투여하였다. 체중(BW)을 모니터링하였고, 마우스의 건강 및 유해한 부작용에 대하여 자주 평가하였고, 및 종양을 매주 2회 측정하였다. 마우스의 종양이 1000 mm3의 종양 용적 종료점에 도달할 때 또는 60일 후(어느 쪽이든 먼저 오는 쪽), 마우스를 안락사시켰다. ADC로 처리된 마우스 대 PBS로 처리된 마우스에서 종양 성장 지연(TGD), 종료점까지의 시간(TTE) 중앙값에서의 증가 및 카플란 마이어 생존 곡선에서의 차이의 로그순위 분석으로부터 효능을 결정하였다. 종료점에 도달한 처음 다섯 마리의 비히클로 처리된 대조군 마우스를 종양에 대한 시료(포르말린 고정 및 파라벤 포매로 가공됨)로 사용하였다.
결과
도 4f는 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 COLO205 직장결장 선암종 누드 마우스 이종이식 모델에서 대조군에 비하여 유사한 중등도의 항-종양 활성 및 생존 연장을 나타냈다는 것을 보여주는 것이다. 모든 치료는 잘 관용되었고 어떠한 임상적인 독성의 징후도 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 LY75에 대하여 유도된 ADC, 예를 들어 LY75_DM1 및 LY75_DM4가 인간 직장결장암 환자의 치료에서 임상적 혜택을 제공할 가능성을 시사하는 것이다.
실시예 22: 시노몰구스 원숭이에서 DM1에 접합된 항-LY75 단일 클론 항체 및 DM4에 접합체된 항-LY75 단일 클론 항체의 독성
6마리의 수컷 원숭이를 2마리 원숭이/군으로 연구에 할당하였다. 비히클(PBS), LY75_DM4(절단가능) 또는 LY75_DM1(절단가능하지 않음)을 0 mg/kg/용량(PBS, 비히클), 5 mg/kg/용량(LY75_DM4, 절단가능) 또는 10 mg/kg/용량(LY75_DM1, 절단가능하지 않음)으로 15분 정맥 내 주입으로 2회(1일 및 29일) 투여하였다. 독성역학 평가를 위해 투여 개시(1일) 이전, 및 각 투여 후 1, 2, 3, 7, 14, 21 및 28일에 혈액 시료를 수집하였다. 임상 병리학 분석을 위한 혈액 시료를 투여 개시(1일) 이전, 및 각 투여 1, 3, 7, 14, 21 및 28일 후(제1 투여 후 28일이 제2 투여에 대한 사전 투여 시점으로서의 역할을 함) 수집하였다. 57일에 최종 혈액 수집 후 모든 시험 동물을 안락사시키고 부검하였다. 각 혈액 흐름으로부터 분리된 혈장을 단리하고, 동결하고, ELISA로 ADC 농도를 분석하기 위해 Oxford BioTherapeutics, Inc로 운송하였다.
치료와 관련된 임상 병리학적 발견은 가벼운 재생성 빈혈 및 혈액 림프구 프로파일, 가장 현저하게는 호중구 계수에서의 일시적인 감소를 포함하였다. 빈혈은 5 mg/kg LY75_DM4으로 처리된 두 마리 동물 및 10 mg/kg LY75_DM1으로 처리된 두 마리 동물 중 한 마리에서 관찰되었다. 최저값을 가지는 중증 호중성백혈구감소증이 투여 후 1주에 관찰되었고 계수에서의 빠른 회복이 모든 동물에서 관찰되었는데; 절대 호중구 계수에서의 최저값은 LY75_DM4 처리된 동물에서 더 낮았다. APTT 및 PT 응집 파라미터에 대해서는 시험 물질과 관련된 효과가 없었다. 혈청 화학 변화는 5 mg/kg LY75_DM4 및 10 mg/kg LY75_DM1의 투여 후 AST, CK, LDH(각 치료군 내 2마리의 동물 중 1마리) 및 글로빈에서의 일시적인 증가를 포함하였다. 또한, 간 특이적 효소 ALT에서의 일시적인 증가가 LY75_DM4 처리된 동물에서만 관찰되었다. 혈청 화학 파라미터에서의 증가의 짧은 지속기간 및/또는 범위는 이들이 유해하지 않았다는 것을 시사한다. 시험 물질과 관련된 요검사에서의 발견은 없었다. 부검으로의 평가 시, 4주의 회복 기간 후, 치료 관련 육안적 병리학적 발견 또는 절대적 및 상대적 장기 중량에서의 변화는 없었다. 갑상샘(소포 내 콜로이드 형태에서의 변형) 및 신장(외피 내 확장된 소관)에서만 조직병리학적 발견이 최소 중증도로 평가되었는데; 다른 연구 파라미터에서의 변화와는 관련되지 않았고; 최소의 독성학적 유의성을 가지며 유해하지 않았다. 결론: 5 mg/kg LY75_DM4 또는 10 mg/kg LY75_DM1의 2가지 용량의 반복 용량 치료는 시노몰구스 원숭이에서 잘 관용되었다. 모든 치료와 관련된 독성 발견은 4주 회복 기간 후 역전가능하였다.
실시예 23: 경쟁적 형광 활성화 세포 분류( FACS ) 결합 분석에 의한 LY75 A1 의 에피토프 특성 분석
방법
COLO205 세포(ATCC, 카탈로그 # CCL-222)를 세포 스트리퍼(Cell Stripper)(Cellgro, 카탈로그 # MT-25-056CI)로 조직배양 플라스크로부터 떼어내었다. 세포를 FACS 완충액(PBS + 2% FBS)으로 세척하고 여기에 재현탁하고, 성장 배지에서 중화하고, 계수하였다. 세포를 V 바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 50,000 세포로 평판배양하였다. 세포를 FACS 완충액(PBS(Fisher, 카탈로그 # SH30028-03) + 2% FBS)으로 1회 세척하였다. 250 nM에서부터 시작하여 3배로 계대 희석된 항-LY75-mAb(실시예 1로부터 선택됨) 또는 LY75_A1을 웰에 첨가하였고 45분간 얼음에서 관련된 웰에 적용하였다. 시험한 모든 조건에서 최종 염색이 동시에 완료되는 것을 보장하기 위해, 단일 또는 다중 염색 단계를 필요로 하는 시험 웰을, 적절하게, FACS 완충액에 방치하였다. 대조군으로서 2개의 웰을 염색하지 않은 채로 FACS 완충액에 방치하였다.
차단 항체와의 인큐베이션 후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 MCC-DM1에 접합된 항-LY75-mAb(1 nM)를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁하였고 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 세포를 전술된 바와 같이 세척하였고 1 ug/ml 마우스 항-메이탄신(maytansine) 항체가 추가된 FACS 완충액에 재현탁하였고 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 세포를 전술된 바와 같이 세척하였고 2 ug/ml 염소 항-마우스 카파 RPE를 함유하는 FACS 완충액에 재현탁하였다. 세포를 얼음에서 45분간 인큐베이션한 다음 전술된 바와 같이 세척하였다. 세포를 웰 당 200 ㎕로 FACS 완충액에 재현탁하였다. 각 시료의 평균 형광 강도를 Guava EasyCyte Plus HT 유세포 분석기(96 웰 플레이트 형식)를 사용하여 결정하였고 미처리 데이터를 Guava Cytosoft를 사용하여 분석하였다.
결과
도 5a는 항-LY75-mAb-MCC-DM1으로의 차단이 항-LY75-mAb의 결합을 감소시켰다는 것을 보여주는 것이다. COLO205 세포에 대한 LY75_A1의 결합의 분석은 LY75_A1이 항-LY75-mAb-MCC-DM1의 결합을 차단할 수 없다는 것을 보여주었다(도 5b 참조). 따라서 항-LY75-mAb 및 LY75_A1이 비경쟁적 항체이고 LY75_A1은 다른 항-LY75 항체의 에피토프와는 상이하고 고유한 LY75의 에피토프를 인식한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 24 펩티드 마이크로 어레이 검정에 의한 LY75 A1의 에피토프 특성 분석.
방법
펩티드 마이크로어레이 분석을 LC Sciences(Houston TX)로 수행하였는데, 간략하게, 이러한 방법은 다음의 단계들을 포함하였다:- 전장 LY75 단백질의 잔기 216 내지 1666에 걸쳐진 하나의 아미노산 중첩을 가지는 LY75 단백질의 연속 8머(mer) 펩티드를 합성하고 마이크로어레이 칩 상에 고정하였다. 칩은 실험이 3반복으로 수행될 수 있도록 3개의 패널로 구성되었다. 항체가 결합하는 펩티드를 식별하기 위해 마이크로어레이를 LY75_A1로 다루었다. 다음의 조건 하에 결합 검정을 수행하였다:- 3반복으로 연속 펩티드를 포함하는 마이크로어레이를 1 ml의 결합 완충액으로 4℃에서 20분간 세척하였다. 그런 다음, 마이크로어레이를 결합 완충액(pH 7.0)에서 1 μg/mL LY75_A1과 함께 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 어레이를 다시 0.5 ml의 세척 완충액으로 4℃에서 30분간 세척한 다음 결합 완충액(pH 7.0) 내에서 25 ng/mL 항-인간 IgG 알렉사 647 접합체와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 어레이를 다시 0.5 ml의 세척 완충액으로 4℃에서 30분간 세척하였다.
그런 다음 어레이를 PMT 500에서 635 nm에서 스캔하였고 신호 강도를 기록하였다. 만일 펩티드가 적어도 2/3 합법적 복제로 존재한다면 펩티드를 검출가능한 것으로 분류하였다. 복제물의 평균 신호 강도를 최종 신호 강도로 보고하였다.
결과
도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 항체 LY75_A1는 어레이 상에 위치한 다수의 펩티드에 특이적 결합을 나타내었다. LY75_A1 결합에 대하여 나타난 최대 신호는 25000(척도 1-65535)이었는데, 어레이 상 모든 점에 대한 평균 신호는 약 885였다. 3000의 신호 강도가 비특이적 결합에 배경 컷 오프 지점으로 설정되었다. 나타난 항체 결합 신호 강도의 수준에 기반하여 LY75_A1에 대한 에피토프를 형성하는 잠재적인 서열을 식별하였다. 이러한 영역은 도 6a 내지 6j에 서열 번호 22~31로 나타나 있다.
실시예 25 LY75 A1 펩티드 풀 다운 검정
방법
1.1 풀 다운 검정
재조합 LY75 단백질을 비드 상 트립신 단백질 가수분해(Promega, US)로 분해하였다. 얻어진 분해된 펩티드를 C18 포획 컬럼(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 회수하였다. 그런 다음 정제된 펩티드를 LY75A1 항체에 가교 결합된 200 μl의 단백질 A 비드와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 미결합 펩티드를 수집하였고, 비드를 1 ml의 PBS로 2회 세척하였다. 펩티드에 결합된 항체를 100 μl의 PBS에서 90℃로 5분간 가열하여 비드로부터 용리하였다. 이러한 용리 단계를 반복하였다.
1.2 질량 분광분석
시료를 nanoACQUITY UPLC BEH 130 C18 컬럼(75 μm x 250 mm(186003545)에 맞춰진 Waters nanoACQUITY UPLC 시스템 및 LTQ Orbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 액체 크로마토그래피-질량 분광분석으로 분석하였다. 펩티드를 120분에 걸쳐서 3%에서부터 35%로 증가하는 아세토니트릴을 이용한 300 nl/분 구배로 용리하였다. 전체 스캔 질량 스펙트럼을 Orbitrap에서 400~2000 m/z 질량 범위 사이에서 60000 해상도로 획득하였다. 각 주기에서, 20개의 가장 강한 펩티드를 기기에 맞춰진 나노분무 이온 공급원을 가지는 선형 이온 트랩에서 CID MS/MS 스캔을 위하여 선택하였다.
1.3 펩티드의 아미노산 서열 분석
LTQ Orbitrap Velos로부터 생성된 미처리 데이터를, 오염물 단백질 서열과 함께, Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html), IPI(www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) 및 SwissProt(http://www.uniprot.org)로 이루어진 서열 데이터베이스에 대하여 검색함으로써 피크 목록으로부터의 아미노산 서열을 추론하기 위해 Mowse 알고리즘(Curr Biol. 1993 Jun 1 ;3(6):327-3)를 사용하는 Mascot 소프트웨어(Matrix Science)를 통해 가공하였다. 펩티드 식별을 위한 범주는 트립신 분해, 2개까지의 소실된 절단 자리 및 다양한 생물학적 및 화학적 변형(산화된 메티오닌, MMTS 또는 아이오도아세트아미드에 의한 시스테인 변형 및 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화)을 포함하였다. 0.05% 이하의 예상치, 28 이상의 이온 점수를 가지는 1번으로 순위 매겨진 펩티드를 우리의 OGAP 데이터베이스에 로딩하였다
1.4 LY75와 관련된 펩티드의 구분
LY75를 식별하기 위한 프로세스는 공개된 인간 게놈 서열에서 코딩 엑손을 식별하고 구조화하기 위해 전술된 바와 같이 질량 분광분석기에 의해 실험적으로 수득된 자연적으로 발생하는 인간 단백질의 펩티드 서열을 사용하였다. 이러한 실험적으로 결정된 서열을 가공 및 펩티드 질량, 펩티드 특성, EST 및 국제 특허 출원 W02009/087462에 기술된 바와 같은 공개된 도메인 유전체 서열 데이터의 삽입에 의해 순응된 OGAP® 데이터베이스와 비교하였다.
결과
항체 LY75_A1를 사용한 펩티드 풀다운 검정의 결과가 아래의 표 1 및 도 7에 나타나 있다. 풀다운 검정에서의 펩티드 용리액 1a 및 1b 마이크로어레이 검정 모두에서 식별되었던 펩티드를 에피토프를 형성할 가능성이 가장 높은 후보로 간주하였다.
Figure pct00003
표 1은 다수의 중첩하는 LY75 펩티드 영역이 펩티드 마이크로어레이 검정 및 펩티드 풀 다운 검정 용리액 1 a 및 1 b 모두에서 식별되었다는 것을 보여준다. 이러한 영역은 이들이 채용된 두 가지 기술에 의해 시험된 LY75_A1에 결합하기 때문에 항체 LY75_A1에 의해 인지되는 에피토프를 함유할 가능성이 가장 높은 것으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioTherapeutics <120> Antibodies <130> OB00135PCT <150> US 61/890104 <151> 2013-10-11 <150> US 61/890098 <151> 2013-10-11 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Human <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Ile Phe Gly Val Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Human <400> 2 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Human <400> 3 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cgggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggctt cacttacagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgca aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtacgatt 300 tttggagtgg ttagctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Human <400> 4 gacgtccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc gactatttaa gttggtatca gcagagacca 120 gggaaagccc ctaacctcct gatctatgct gcatccaatt taaagactgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcac tctgcaacct 240 gaagattttg caacgtacta ctgtcaacag agttacaggt ccccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acga 324 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Human <400> 5 Asn Ala Trp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Human <400> 6 Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro 1 5 10 15 Val Gln Gly <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 7 Phe Gly Val Val Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 8 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Human <400> 9 Ala Ala Ser Asn Leu Lys Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 10 Gln Gln Ser Tyr Arg Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 11 <211> 104 <212> PRT <213> Human <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Thr Thr Val Thr 100 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Human <400> 12 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 93 <212> PRT <213> Human <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser 85 90 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Human <400> 14 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 1722 <212> PRT <213> Human <400> 15 Met Arg Thr Gly Trp Ala Thr Pro Arg Arg Pro Ala Gly Leu Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Phe Trp Phe Phe Asp Leu Ala Glu Pro Ser Gly Arg Ala Ala 20 25 30 Asn Asp Pro Phe Thr Ile Val His Gly Asn Thr Gly Lys Cys Ile Lys 35 40 45 Pro Val Tyr Gly Trp Ile Val Ala Asp Asp Cys Asp Glu Thr Glu Asp 50 55 60 Lys Leu Trp Lys Trp Val Ser Gln His Arg Leu Phe His Leu His Ser 65 70 75 80 Gln Lys Cys Leu Gly Leu Asp Ile Thr Lys Ser Val Asn Glu Leu Arg 85 90 95 Met Phe Ser Cys Asp Ser Ser Ala Met Leu Trp Trp Lys Cys Glu His 100 105 110 His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Asp Gly 115 120 125 His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val Trp Lys Lys Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr Thr Arg 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ser Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Phe Pro Phe Leu Ile Asp 165 170 175 Gly Thr Trp His His Asp Cys Ile Leu Asp Glu Asp His Ser Gly Pro 180 185 190 Trp Cys Ala Thr Thr Leu Asn Tyr Glu Tyr Asp Arg Lys Trp Gly Ile 195 200 205 Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn Trp Glu Lys Asn Glu 210 215 220 Gln Phe Gly Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Thr Gln Thr Ala Leu Ser Trp 225 230 235 240 Lys Glu Ala Tyr Val Ser Cys Gln Asn Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser 245 250 255 Ile Asn Ser Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Gly Ile 260 265 270 Ala Lys Ile Phe Trp Ile Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ser Ala Arg Gly 275 280 285 Trp Glu Trp Ser Asp His Lys Pro Leu Asn Phe Leu Asn Trp Asp Pro 290 295 300 Asp Arg Pro Ser Ala Pro Thr Ile Gly Gly Ser Ser Cys Ala Arg Met 305 310 315 320 Asp Ala Glu Ser Gly Leu Trp Gln Ser Phe Ser Cys Glu Ala Gln Leu 325 330 335 Pro Tyr Val Cys Arg Lys Pro Leu Asn Asn Thr Val Glu Leu Thr Asp 340 345 350 Val Trp Thr Tyr Ser Asp Thr Arg Cys Asp Ala Gly Trp Leu Pro Asn 355 360 365 Asn Gly Phe Cys Tyr Leu Leu Val Asn Glu Ser Asn Ser Trp Asp Lys 370 375 380 Ala His Ala Lys Cys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ile Ser Ile His 385 390 395 400 Ser Leu Ala Asp Val Glu Val Val Val Thr Lys Leu His Asn Glu Asp 405 410 415 Ile Lys Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys Asn Ile Asn Ile Pro Thr 420 425 430 Leu Phe Gln Trp Ser Asp Gly Thr Glu Val Thr Leu Thr Tyr Trp Asp 435 440 445 Glu Asn Glu Pro Asn Val Pro Tyr Asn Lys Thr Pro Asn Cys Val Ser 450 455 460 Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys Val Gln Ser Cys Glu Glu Lys 465 470 475 480 Leu Lys Tyr Val Cys Lys Arg Lys Gly Glu Lys Leu Asn Asp Ala Ser 485 490 495 Ser Asp Lys Met Cys Pro Pro Asp Glu Gly Trp Lys Arg His Gly Glu 500 505 510 Thr Cys Tyr Lys Ile Tyr Glu Asp Glu Val Pro Phe Gly Thr Asn Cys 515 520 525 Asn Leu Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Glu Tyr Leu Asn Asp Leu 530 535 540 Met Lys Lys Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Lys Tyr Phe Trp Thr Gly Leu 545 550 555 560 Arg Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn Trp Ala Thr Val Gly Gly 565 570 575 Arg Arg Arg Ala Val Thr Phe Ser Asn Trp Asn Phe Leu Glu Pro Ala 580 585 590 Ser Pro Gly Gly Cys Val Ala Met Ser Thr Gly Lys Ser Val Gly Lys 595 600 605 Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala Leu Ser Ile Cys Lys 610 615 620 Lys Met Ser Gly Pro Leu Gly Pro Glu Glu Ala Ser Pro Lys Pro Asp 625 630 635 640 Asp Pro Cys Pro Glu Gly Trp Gln Ser Phe Pro Ala Ser Leu Ser Cys 645 650 655 Tyr Lys Val Phe His Ala Glu Arg Ile Val Arg Lys Arg Asn Trp Glu 660 665 670 Glu Ala Glu Arg Phe Cys Gln Ala Leu Gly Ala His Leu Ser Ser Phe 675 680 685 Ser His Val Asp Glu Ile Lys Glu Phe Leu His Phe Leu Thr Asp Gln 690 695 700 Phe Ser Gly Gln His Trp Leu Trp Ile Gly Leu Asn Lys Arg Ser Pro 705 710 715 720 Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr Pro Val Ser Thr 725 730 735 Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr Asp Ile Arg Asp Cys 740 745 750 Ala Ala Val Lys Val Phe His Arg Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe 755 760 765 Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro Phe Ala Cys Asp Thr 770 775 780 Lys Leu Glu Trp Val Cys Gln Ile Pro Lys Gly Arg Thr Pro Lys Thr 785 790 795 800 Pro Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Arg Ala Gly Ile His Gly Pro Pro Leu 805 810 815 Ile Ile Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Phe Val Ala Asp Leu His Leu Asn 820 825 830 Tyr Glu Glu Ala Val Leu Tyr Cys Ala Ser Asn His Ser Phe Leu Ala 835 840 845 Thr Ile Thr Ser Phe Val Gly Leu Lys Ala Ile Lys Asn Lys Ile Ala 850 855 860 Asn Ile Ser Gly Asp Gly Gln Lys Trp Trp Ile Arg Ile Ser Glu Trp 865 870 875 880 Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe 885 890 895 Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys Thr Trp 900 905 910 Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys Leu Pro Phe 915 920 925 Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu Lys Tyr Ser Pro Asp 930 935 940 Ser Ala Ala Lys Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp Ile Pro Phe Gln Asn 945 950 955 960 Lys Cys Phe Leu Lys Ile Lys Pro Val Ser Leu Thr Phe Ser Gln Ala 965 970 975 Ser Asp Thr Cys His Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Pro Ser Val Leu Ser 980 985 990 Gln Ile Glu Gln Asp Phe Ile Thr Ser Leu Leu Pro Asp Met Glu Ala 995 1000 1005 Thr Leu Trp Ile Gly Leu Arg Trp Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Asn 1010 1015 1020 Lys Trp Thr Asp Asn Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro 1025 1030 1035 Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile Pro Glu Asn Phe Phe Glu 1040 1045 1050 Glu Glu Ser Arg Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys 1055 1060 1065 Ser Pro Phe Thr Gly Thr Trp Asn Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg 1070 1075 1080 His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val Lys Ser Arg 1085 1090 1095 Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn 1100 1105 1110 Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys 1115 1120 1125 Arg Glu Cys Leu Lys Ser Asn Met Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp 1130 1135 1140 Pro Tyr Gln Gln Ala Phe Leu Ser Val Gln Ala Leu Leu His Asn 1145 1150 1155 Ser Ser Leu Trp Ile Gly Leu Phe Ser Gln Asp Asp Glu Leu Asn 1160 1165 1170 Phe Gly Trp Ser Asp Gly Lys Arg Leu His Phe Ser Arg Trp Ala 1175 1180 1185 Glu Thr Asn Gly Gln Leu Glu Asp Cys Val Val Leu Asp Thr Asp 1190 1195 1200 Gly Phe Trp Lys Thr Val Asp Cys Asn Asp Asn Gln Pro Gly Ala 1205 1210 1215 Ile Cys Tyr Tyr Ser Gly Asn Glu Thr Glu Lys Glu Val Lys Pro 1220 1225 1230 Val Asp Ser Val Lys Cys Pro Ser Pro Val Leu Asn Thr Pro Trp 1235 1240 1245 Ile Pro Phe Gln Asn Cys Cys Tyr Asn Phe Ile Ile Thr Lys Asn 1250 1255 1260 Arg His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr Lys Cys Gln 1265 1270 1275 Lys Leu Asn Pro Lys Ser His Ile Leu Ser Ile Arg Asp Glu Lys 1280 1285 1290 Glu Asn Asn Phe Val Leu Glu Gln Leu Leu Tyr Phe Asn Tyr Met 1295 1300 1305 Ala Ser Trp Val Met Leu Gly Ile Thr Tyr Arg Asn Lys Ser Leu 1310 1315 1320 Met Trp Phe Asp Lys Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His Trp Arg Ala 1325 1330 1335 Gly Arg Pro Thr Ile Lys Asn Glu Lys Phe Leu Ala Gly Leu Ser 1340 1345 1350 Thr Asp Gly Phe Trp Asp Ile Gln Thr Phe Lys Val Ile Glu Glu 1355 1360 1365 Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu Ala Cys Lys Ile Glu 1370 1375 1380 Met Val Asp Tyr Lys Glu Glu Tyr Asn Thr Thr Leu Pro Gln Phe 1385 1390 1395 Met Pro Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr Ser Val Ile Gln Lys Lys Val 1400 1405 1410 Thr Trp Tyr Glu Ala Leu Asn Met Cys Ser Gln Ser Gly Gly His 1415 1420 1425 Leu Ala Ser Val His Asn Gln Asn Gly Gln Leu Phe Leu Glu Asp 1430 1435 1440 Ile Val Lys Arg Asp Gly Phe Pro Leu Trp Val Gly Leu Ser Ser 1445 1450 1455 His Asp Gly Ser Glu Ser Ser Phe Glu Trp Ser Asp Gly Ser Thr 1460 1465 1470 Phe Asp Tyr Ile Pro Trp Lys Gly Gln Thr Ser Pro Gly Asn Cys 1475 1480 1485 Val Leu Leu Asp Pro Lys Gly Thr Trp Lys His Glu Lys Cys Asn 1490 1495 1500 Ser Val Lys Asp Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Pro Thr Lys Ser Lys 1505 1510 1515 Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys Pro Ala Ala Lys 1520 1525 1530 Glu Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys 1535 1540 1545 Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser Glu Ala Lys Lys Leu Cys 1550 1555 1560 Ser Lys His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu 1565 1570 1575 Asp Glu Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Met Arg Glu Asn Asn Asn 1580 1585 1590 Ile Thr Met Arg Val Trp Leu Gly Leu Ser Gln His Ser Val Asp 1595 1600 1605 Gln Ser Trp Ser Trp Leu Asp Gly Ser Glu Val Thr Phe Val Lys 1610 1615 1620 Trp Glu Asn Lys Ser Lys Ser Gly Val Gly Arg Cys Ser Met Leu 1625 1630 1635 Ile Ala Ser Asn Glu Thr Trp Lys Lys Val Glu Cys Glu His Gly 1640 1645 1650 Phe Gly Arg Val Val Cys Lys Val Pro Leu Gly Pro Asp Tyr Thr 1655 1660 1665 Ala Ile Ala Ile Ile Val Ala Thr Leu Ser Ile Leu Val Leu Met 1670 1675 1680 Gly Gly Leu Ile Trp Phe Leu Phe Gln Arg His Arg Leu His Leu 1685 1690 1695 Ala Gly Phe Ser Ser Val Arg Tyr Ala Gln Gly Val Asn Glu Asp 1700 1705 1710 Glu Ile Met Leu Pro Ser Phe His Asp 1715 1720 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Human <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ser 20 25 30 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Human <400> 17 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 1 5 10 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Human <400> 18 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile 20 25 30 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 19 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Human <400> 20 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Human <400> 21 Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Human <400> 22 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Thr Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 23 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 24 Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 25 Pro Ala Ser Leu Ser Cys Tyr Lys Val Phe His Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 26 Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr 1 5 10 15 Leu Arg Pro Phe 20 <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Human <400> 27 Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe Pro Val 1 5 10 15 Thr Phe Gly <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 28 Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Human <400> 29 Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr 1 5 10 15 Ser <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Human <400> 30 Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Ile Ile 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 31 Glu Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Human <400> 32 Lys Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Cys 1 5 10 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 33 Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys Ser Asp 1 5 10 15 Gln Ala Leu His 20 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Human <400> 34 Ile Ser Glu Trp Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro 1 5 10 15 Trp His Arg Phe Pro Val Thr Phe Gly 20 25 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Human <400> 35 Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Lys Ile Ile 20 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Human <400> 36 Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro 1 5 10 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Human <400> 37 Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys 1 5 10 15

Claims (37)

  1. 단리된 항체 (isolated antibody) 또는 이의 항원 결합 부위로서,
    (a) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 의해 인지되는 LY75 상의 에피토프에 결합하거나,
    (b) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와, LY75에 대한 결합에 대해 경쟁하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  2. LY75에 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 항원 결합 부위로서,
    상기 항체는,
    a) i) 서열 번호 5를 포함하는 제1 vhCDR;
    ii) 서열 번호 6을 포함하는 제2 vhCDR; 및
    iii) 서열 번호 7을 포함하는 제3 vhCDR
    을 포함하는 중쇄 가변 영역과,
    b) i) 서열 번호 8을 포함하는 제1 vICDR;
    ii) 서열 번호 9를 포함하는 제2 vICDR; 및
    iii) 서열 번호 10을 포함하는 제3 vICDR
    을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    선택적으로, 상기 서열 번호들 중 하나 이상은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 부가 또는 결손을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 1에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 중쇄 및 서열 번호 2에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공유 부착된 모이어티를 더 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  5. 제4항에 있어서, 상기 모이어티가 약물인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약물이 메이탄시노이드(maytansinoid), 돌라스타틴(dolastatin), 헤미아스테를린(hemiasterlin), 아우리스타틴(auristatin), 트리코테센(trichothecene), 칼리케아미신(calicheamicin), CC1065 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약물이 DM4 및 DM1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 메이탄시노이드인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 유도하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체가 Fc 수용체에 대해 증가된 결합성 및/또는 ADCC에 대한 증가된 효능을 가지는 조작된 항체(engineered antibody), 및/또는 이중특이적 항체(bispecific antibody)인, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 포함하는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 중쇄를 코딩하는 핵산.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 경쇄를 코딩하는 핵산.
  13. 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 제11항의 핵산 및/또는 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 제12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  14. 하기 (i) 또는 (ii)를 포함하는 숙주 세포:
    (i) 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 제11항의 핵산과 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 제12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터; 또는
    (ii) 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 제11항의 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터 및 하나 이상의 조절 인자에 작동가능하게 연결된 제12항의 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터.
  15. 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 제조하는 방법으로서,
    제14항에 따른 숙주 세포를 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계, 및 선택적으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 LY75를 발현하는 세포에 의해 내재화되는, 암 치료 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 부위가 공유 부착된 약물 접합체를 포함하는, 암 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 공유 부착된 약물 접합체가 메이탄시노이드, 바람직하게는 DM4인, 암 치료 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 항체가 항체 의존성 세포 매개 독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 독성(CDC)을 유도하는, 암 치료 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 췌장암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 피부암, 갑상선암, 폐암, 신장암, 간암, 두경부암, 방광암, 위암, 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병, 골수종, 바람직하게는 다발성 골수종 및 림프종, 바람직하게는 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종(Mantle Cell Lymphoma), 점막 관련 림프조직(Mantle Cell Lymphoma, MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종(T-Cell/Histiocyte-Rich B-Cell Lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt's Lymphoma), 림포형질세포 림프종(Lymphoplasmacytic Lymphoma), 소림프구 림프종(Small Lymphocytic Lymphoma), 변연부 림프종(Marginal Zone Lymphoma), T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종(Anaplastic Large Cell Lymphoma) 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종(AngioImmunoblastic T-Cell Lymphoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 치료 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암이 방광암, 췌장암, 3중 음성 유방암(triple-negative breast cancer) 및 DLBCL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암 치료 방법.
  23. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  24. 제22항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 LY75를 발현하는 세포에 의해 내재화되는, 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 공유 부착된 약물 접합체를 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  26. 제25항에 있어서, 상기 공유 부착된 약물 접합체가 메이탄시노이드, 바람직하게는 DM4인, 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  27. 제23항에 있어서, 상기 항체가 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도하는, 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 췌장암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 피부암, 갑상선암, 폐암, 신장암, 간암, 두경부암, 방광암, 위암, 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병, 골수종, 바람직하게는 다발성 골수종 및 림프종, 바람직하게는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프 조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  29. 제28항에 있어서, 상기 암이 방광암, 췌장암, 3중 음성 유방암 및 DLBCL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
  30. 암의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위가 LY75를 발현하는 세포에 의해 내재화되는. 용도.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 부위가 공유 부착된 약물 접합체를 포함하는, 용도.
  33. 제32항에 있어서, 상기 공유 부착된 약물 접합체가 메이탄시노이드, 바람직하게는 DM4인, 용도.
  34. 제30항에 있어서, 상기 항체가 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 유도하는, 용도.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 췌장암, 난소암, 유방암, 직장결장암, 식도암, 피부암, 갑상선암, 폐암, 신장암, 간암, 두경부암, 방광암, 위암, 백혈병, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병 또는 만성 림프구성 백혈병, 골수종, 바람직하게는 다발성 골수종 및 림프종, 바람직하게는 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 점막 관련 림프조직(MALT)의 림프종, T 세포/조직구 풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림포형질세포 림프종, 소림프구 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역행성 대세포성 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  36. 제35항에 있어서, 상기 암이 방광암, 췌장암, 3중 음성 유방암 및 DLBCL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  37. 치료 요법 (therapy)에 사용하거나 또는 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위.
KR1020167009799A 2013-10-11 2014-10-10 암을 치료하기 위한 ly75에 대한 접합 항체 KR102357173B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361890104P 2013-10-11 2013-10-11
US201361890098P 2013-10-11 2013-10-11
US61/890,098 2013-10-11
US61/890,104 2013-10-11
PCT/GB2014/053057 WO2015052537A1 (en) 2013-10-11 2014-10-10 Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160065872A true KR20160065872A (ko) 2016-06-09
KR102357173B1 KR102357173B1 (ko) 2022-01-27

Family

ID=51795649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167009799A KR102357173B1 (ko) 2013-10-11 2014-10-10 암을 치료하기 위한 ly75에 대한 접합 항체

Country Status (33)

Country Link
US (3) US10081682B2 (ko)
EP (1) EP3055331B1 (ko)
JP (1) JP6657075B2 (ko)
KR (1) KR102357173B1 (ko)
CN (1) CN105745224B (ko)
AU (1) AU2014333563B9 (ko)
BR (1) BR112016007402B1 (ko)
CA (1) CA2926324C (ko)
CL (1) CL2016000770A1 (ko)
CR (1) CR20160156A (ko)
CU (1) CU24320B1 (ko)
CY (1) CY1124006T1 (ko)
DK (1) DK3055331T3 (ko)
DO (1) DOP2016000072A (ko)
EA (1) EA036927B1 (ko)
ES (1) ES2859604T3 (ko)
HK (1) HK1222869A1 (ko)
HR (1) HRP20210410T1 (ko)
HU (1) HUE055190T2 (ko)
IL (1) IL244884B (ko)
LT (1) LT3055331T (ko)
MX (1) MX365742B (ko)
MY (1) MY174562A (ko)
PE (1) PE20160561A1 (ko)
PH (1) PH12016500580B1 (ko)
PL (1) PL3055331T3 (ko)
PT (1) PT3055331T (ko)
RS (1) RS61620B1 (ko)
SG (1) SG11201602460QA (ko)
SI (1) SI3055331T1 (ko)
TW (1) TWI649334B (ko)
UA (1) UA119047C2 (ko)
WO (1) WO2015052537A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190129056A (ko) * 2017-03-10 2019-11-19 베를린-케미 악티엔 게젤샤프트 항-ly75 항체를 포함하는 약학적 조합물

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
US10260109B2 (en) 2015-05-29 2019-04-16 Universiteit Maastricht Method for identifying subjects with aggressive melanoma skin cancer at diagnosis
US20200347138A1 (en) * 2017-10-27 2020-11-05 Indian Institute Of Science Dendritic cells-targeting vaccine
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
IL308545A (en) 2021-05-26 2024-01-01 Oxford Biotherapeutics Ltd A medical preparation that includes an anti-CD205 antibody and an immune checkpoint inhibitor
WO2023089314A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Oxford Biotherapeutics Limited Pharmaceutical combinations
WO2024040195A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996023882A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-08 The Rockefeller University IDENTIFICATION OF DEC, (DENTRITIC AND EPITHELIAL CELLS, 205 kDa), A RECEPTOR WITH C-TYPE LECTIN DOMAINS, NUCLEIC ACIDS ENCODING DEC, AND USES THEREOF
WO2009061996A2 (en) * 2007-11-07 2009-05-14 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (dec-205)

Family Cites Families (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4169888A (en) 1977-10-17 1979-10-02 The Upjohn Company Composition of matter and process
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
WO1987006265A1 (en) 1986-04-17 1987-10-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel compounds dc-88a and dc-89a1 and process for their preparation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
IL106992A (en) 1988-02-11 1994-06-24 Bristol Myers Squibb Co Noble hydrazonic history of anthracycline and methods for their preparation
US5084468A (en) 1988-08-11 1992-01-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Dc-88a derivatives
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JP2598116B2 (ja) 1988-12-28 1997-04-09 協和醗酵工業株式会社 新規物質ｄｃ１１３
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5187186A (en) 1989-07-03 1993-02-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrroloindole derivatives
JP2510335B2 (ja) 1989-07-03 1996-06-26 協和醗酵工業株式会社 Ｄｃ―８８ａ誘導体
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991017158A1 (en) 1990-05-07 1991-11-14 Scripps Clinic And Research Foundation Intermediates in the formation of the calicheamicin and esperamicin oligosaccharides
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5264586A (en) 1991-07-17 1993-11-23 The Scripps Research Institute Analogs of calicheamicin gamma1I, method of making and using the same
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
DE69434136T2 (de) 1993-10-01 2005-12-01 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Dolastatin-derivate
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5641780A (en) 1994-04-22 1997-06-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Pyrrolo-indole derivatives
JPH07309761A (ja) 1994-05-20 1995-11-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd デュオカルマイシン誘導体の安定化法
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
JP3865418B2 (ja) * 1994-07-13 2007-01-10 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体
US6048972A (en) * 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
US5550246A (en) 1994-09-07 1996-08-27 The Scripps Research Institute Calicheamicin mimics
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US20040258688A1 (en) 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
JP2000503639A (ja) 1995-12-22 2000-03-28 ブリストル―マイヤーズ スクイブ カンパニー 分枝ヒドラゾンのリンカー類
ATE332372T1 (de) 1996-05-29 2006-07-15 Derek Nigel John Hart Rezeptor von dendritischen zellen.
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6939545B2 (en) 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
CA2385528C (en) 1999-10-01 2013-12-10 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US7303749B1 (en) 1999-10-01 2007-12-04 Immunogen Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE
AU3087801A (en) 2000-02-04 2001-08-14 Molecular Dynamics Inc Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for analysis of geneexpression in human breast and hbl 100 cells
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6900016B1 (en) 2000-09-08 2005-05-31 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with inflammatory autoimmune disease, methods of detection and uses thereof
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
IT1320715B1 (it) 2000-10-19 2003-12-10 Cselt Centro Studi Lab Telecom Modulo generatore di circuiti per la decodifica di codiciconvoluzionali, metodo per la generazione di tale tipo di circuito e
EP2341060B1 (en) 2000-12-12 2019-02-20 MedImmune, LLC Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2444661A1 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Use of cd23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
JP4588296B2 (ja) 2001-04-05 2010-11-24 ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ キメラワクチン
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
CA2451465A1 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Eos Biotechnology Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
CA2453822C (en) 2001-08-03 2011-02-22 Tyco Healthcare Group Lp Tissue marking apparatus and method
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2005536186A (ja) 2002-03-07 2005-12-02 ルードビッヒ、インスティテュート、フォー、キャンサー、リサーチ リンパ管および血管内皮細胞遺伝子
US20040014194A1 (en) 2002-03-27 2004-01-22 Schering Corporation Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
AU2003256240A1 (en) 2002-08-29 2004-03-19 National University Of Singapore Recombinant nucleic acid useful for inducing protective immune response against allergens
EP2444409A2 (en) 2002-09-16 2012-04-25 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
AU2003275126A1 (en) 2002-09-20 2004-04-08 Wyeth Holdings Corporation Hemiasterlin derivatives for treating resistant tumors
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
US20040146948A1 (en) 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
EP1560599A1 (en) 2002-11-14 2005-08-10 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
AU2002953223A0 (en) 2002-12-06 2003-01-02 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland Novel therapeutic molecules and uses thereof
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US7610156B2 (en) 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
CA2526339A1 (en) 2003-05-19 2005-02-24 Duke University Polyvalent immunogen
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
FR2855046B1 (fr) 2003-05-23 2005-07-22 Oreal Composition tinctoriale comprenant au moins un precurseur de colorant et un coplolymere sequence amphiphile
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
KR101520209B1 (ko) 2003-11-06 2015-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
WO2005067667A2 (en) 2004-01-07 2005-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
EP1747021B1 (en) 2004-05-19 2015-09-09 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Self-immolative linkers and drug conjugates
US7691962B2 (en) 2004-05-19 2010-04-06 Medarex, Inc. Chemical linkers and conjugates thereof
US8273357B2 (en) 2004-07-16 2012-09-25 Massachusetts Institute Of Technology Antigen-carbohydrate conjugates
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
EP1695981A1 (de) 2005-02-25 2006-08-30 Forschungsverbund Berlin e.V. Verfahren zum Redox-Potential-abhängigen Nachweis von Targetmolekülen durch wechselwirkende Polypeptide
US7608413B1 (en) 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
US7714016B2 (en) 2005-04-08 2010-05-11 Medarex, Inc. Cytotoxic compounds and conjugates with cleavable substrates
WO2007018431A2 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
WO2007030571A2 (en) 2005-09-06 2007-03-15 Molecular Image Inc. Identification of targets and development of reagents for testing and molecular imaging of human disease
US7842466B1 (en) 2005-09-16 2010-11-30 Celera Corporation Colon disease targets and uses thereof
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
WO2007059404A2 (en) 2005-11-10 2007-05-24 Medarex, Inc. Duocarmycin derivatives as novel cytotoxic compounds and conjugates
RU2489423C2 (ru) 2006-02-02 2013-08-10 Синтарга Б.В. Водорастворимые аналоги сс-1065 и их конъюгаты
GB0611116D0 (en) 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
WO2008016356A2 (en) 2006-08-02 2008-02-07 Genizon Biosciences Genemap of the human genes associated with psoriasis
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
US8680293B2 (en) 2007-08-01 2014-03-25 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
AU2013201417B2 (en) 2007-11-07 2015-05-21 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (DEC-205)
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
US8540998B2 (en) 2007-12-24 2013-09-24 Oxford Biotherapeutics Ltd. Methods for treating cancer using ephrin type-A receptor 10 antibodies conjugated to cytotoxic agents
ES2458541T3 (es) 2008-05-02 2014-05-06 Seattle Genetics, Inc. Métodos y composiciones para elaborar anticuerpos y derivados de anticuerpos con fucosilación del núcleo reducida
EP2159291A1 (en) 2008-09-01 2010-03-03 Agendia B.V. Means and method for determining tumor cell percentage in a sample
HUE035798T2 (en) 2008-11-03 2018-05-28 Syntarga Bv CC-1065 analogues and conjugates
JP2013500474A (ja) 2009-07-23 2013-01-07 アデランス リサーチ インスティテュート，インコーポレイティド 発毛性真皮細胞を検出する／富化する方法、毛髪脱落を処置する方法における細胞およびその使用
WO2011044452A2 (en) 2009-10-08 2011-04-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for amelioration of autoimmune disease using fusion proteins of anti-dendritic cell receptor antibody to peptide sequences
KR101738203B1 (ko) 2010-04-15 2017-05-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
AU2011239525B2 (en) 2010-04-15 2015-04-09 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
AR085633A1 (es) 2011-03-08 2013-10-16 Baylor Res Inst Coadyuvantes basados en anticuerpos que son dirigidos directamente a las celulas presentadoras en antigenos
GB201220010D0 (en) 2012-11-07 2012-12-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic amd diagnostic target
CN103044552B (zh) 2012-12-11 2019-01-29 中国医学科学院病原生物学研究所 人源化的抗树突状细胞表面dec-205分子的单克隆抗体
PT3055331T (pt) 2013-10-11 2021-04-05 Oxford Bio Therapeutics Ltd Anticorpos conjugados contra ly75 para o tratamento de cancro
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996023882A1 (en) * 1995-01-31 1996-08-08 The Rockefeller University IDENTIFICATION OF DEC, (DENTRITIC AND EPITHELIAL CELLS, 205 kDa), A RECEPTOR WITH C-TYPE LECTIN DOMAINS, NUCLEIC ACIDS ENCODING DEC, AND USES THEREOF
WO2009061996A2 (en) * 2007-11-07 2009-05-14 Celldex Therapeutics Inc. Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (dec-205)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190129056A (ko) * 2017-03-10 2019-11-19 베를린-케미 악티엔 게젤샤프트 항-ly75 항체를 포함하는 약학적 조합물

Also Published As

Publication number Publication date
BR112016007402B1 (pt) 2023-03-28
CA2926324C (en) 2023-10-03
PH12016500580A1 (en) 2016-05-30
TW201605898A (zh) 2016-02-16
EA036927B1 (ru) 2021-01-15
AU2014333563B2 (en) 2020-03-05
SG11201602460QA (en) 2016-04-28
AU2014333563B9 (en) 2020-04-02
CY1124006T1 (el) 2022-05-27
DK3055331T3 (da) 2021-03-22
US20190106506A1 (en) 2019-04-11
CN105745224B (zh) 2019-11-05
PH12016500580B1 (en) 2016-05-30
MX365742B (es) 2019-06-12
JP6657075B2 (ja) 2020-03-04
US20210371541A1 (en) 2021-12-02
US20160257760A1 (en) 2016-09-08
MX2016004304A (es) 2016-11-10
UA119047C2 (uk) 2019-04-25
CU24320B1 (es) 2018-02-08
PE20160561A1 (es) 2016-06-03
HRP20210410T1 (hr) 2021-04-30
CR20160156A (es) 2016-11-01
AU2014333563A1 (en) 2016-04-28
PL3055331T3 (pl) 2021-09-06
IL244884B (en) 2021-12-01
KR102357173B1 (ko) 2022-01-27
DOP2016000072A (es) 2016-06-15
LT3055331T (lt) 2021-03-25
SI3055331T1 (sl) 2021-04-30
CU20160042A7 (es) 2016-08-31
ES2859604T8 (es) 2022-01-11
CA2926324A1 (en) 2015-04-16
PT3055331T (pt) 2021-04-05
ES2859604T3 (es) 2021-10-04
RS61620B1 (sr) 2021-04-29
WO2015052537A1 (en) 2015-04-16
BR112016007402A2 (pt) 2017-09-12
JP2016533711A (ja) 2016-11-04
EA201690599A1 (ru) 2016-07-29
EP3055331A1 (en) 2016-08-17
EP3055331B1 (en) 2021-02-17
HUE055190T2 (hu) 2021-12-28
CN105745224A (zh) 2016-07-06
HK1222869A1 (zh) 2017-07-14
MY174562A (en) 2020-04-26
CL2016000770A1 (es) 2017-01-27
NZ718617A (en) 2022-03-25
TWI649334B (zh) 2019-02-01
US10081682B2 (en) 2018-09-25
IL244884A0 (en) 2016-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9228023B2 (en) Anti-ROR1 antibodies and methods of use for treatment of cancer
US20210371541A1 (en) Conjugated antiboides against ly75 for the treatment of cancer
EP2658870B1 (en) Conjugated anti-cd38 antibodies
US20220289851A1 (en) Pharmaceutical combinations comprising an anti-ly75 antibody
US9932411B2 (en) Antibodies
KR20210021489A (ko) 약학적 배합물
TERRETT et al. Patent 2929402 Summary
NZ718617B2 (en) Conjugated antibodies against ly75 for the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant