CN112618610A - 木瓜发酵汁液以及其用于改善肌肤状况的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种木瓜发酵汁液，是藉由一包含下列步骤的制备方法制得：将木瓜果实与水混合以得到培养液，以及将培养液及复数菌种进行发酵1‑5日以得到木瓜发酵汁液。本发明另提供一种将木瓜发酵汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途。
Description
技术领域
本发明关于一种木瓜发酵汁液，特别是关于一种以复数菌种进行发酵所得的木瓜发酵汁液。
背景技术
自有机及天然成分肌肤保养品概念兴起后，生技公司及保养品相关业者积极投入关于天然植物的相关产品的研发。为使植物类相关产品对身体健康助益有科学验证的基础，植物的成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。
木瓜(学名为Carica papaya)，又名番木瓜，是番木瓜科的植物。原产于热带美洲，目前在中国台湾主要栽种于台南、屏东及南投等地区，近年来成为研究开发的天然植物的一。
发明内容
有鉴于此，研究或开发一种天然植物成分的能改善肌肤状况的组合物来有效提升生物体的肌肤状态是有其需求的。
本发明的一目的在于提供一种木瓜发酵汁液，是藉由一包含下列步骤的制备方法制得：(a)将葡萄糖、木瓜果实与水混合以得到一培养液，其中水的重量为木瓜果实总重的1-5倍；以及(b)将所述培养液及复数菌种进行发酵1-5日以得到所述木瓜发酵汁液，其中所述复数菌种由相对于所述培养液为0.01-0.5wt％的酵母菌以及相对于所述培养液为0.01-0.25wt％的乳酸菌组成。
在一些实施例中，于(a)得到培养液的步骤中，葡萄糖的添加量为木瓜果实与水总重的8-10wt％。
在一些实施例中，于(b)将培养液及复数菌种进行发酵以得到木瓜发酵汁液的步骤的步骤包括：(b1)于所述培养液中加入酵母菌进行发酵0.5-2日后形成一初发酵汁液；以及(b2)于所述初发酵汁液中加入乳酸菌进行发酵0.5-2日后形成所述木瓜发酵汁液。
在一些实施例中，其中酵母菌为啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，乳酸菌为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
在一些实施例中，木瓜发酵汁液的pH值为3.2-4.2，且其糖度为4.0以下。
在一些实施例中，木瓜发酵汁液的总多酚含量为100-150ug/mL。
在一些实施例中，木瓜发酵汁液的总多酚含量/所述培养液的总多酚含量的比值为1.5-1.7。
根据一些实施例，本发明提供一种将木瓜发酵汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途。
在一些实施例中，组合物是同时具有以下所述功能的至少其中两种：提升肌肤保湿、减少肌肤油脂以及减少肌肤毛孔。
在一些实施例中，若所述组合物减少肌肤油脂及减少肌肤毛孔，则所述组合物含有1.0vol％的所述木瓜发酵汁液。
根据一些实施例，本发明提供一种将木瓜发酵汁液用于制备提升转麸酰胺酸酶(Transglutaminase，TGM)基因、角蛋白(keratin，KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)基因及玻尿酸合成酶(hyaluronan synthase，HAS)基因的组合物的用途。
在一些实施例中，转麸酰胺酸酶基因为转麸酰胺酸酶1(Transglutaminase 1，TGM1)，所述水通道蛋白基因为水通道蛋白3(Aquaporin 3，AQP3)基因，所述玻尿酸合成酶基因是玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2，HAS2)基因。
在一些实施例中，角蛋白基因为角蛋白1(keratin，KRT)基因、角蛋白10(keratin，KRT基因或其组合。
在一些实施例中，组合物含有至少0.5vol％的所述木瓜发酵汁液。
综上，根据任一实施例的木瓜发酵汁液，可用以改善肌肤状况以及调控保湿相关基因。在一实施例中，在发酵过程中分次依序加入复数菌种并且控制使用各菌种的发酵时间，以使得菌种能有最佳的生长，并且进一步提升木瓜发酵汁液中有效成分浓度。
附图说明
图1是总多酚含量测试结果的比较数据图。
图2是保湿相关基因相对表现比例的结果数据图。
图3是肌肤含水量的测试结果数据图。
图4是肌肤毛孔量的测试结果数据图。
图5是肌肤油脂量的测试结果数据图。
图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
具体实施方式
以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
本案使用Excel软体进行统计分析。数据以平均值±标准差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
本文中所使用的用语「Gene ID」即代表基因编号，代表为美国国家生物技术资讯中心(National Center for Biotechnology Information，简称NCBI)对于各生物体的基因所建立的分类编码。
本文中所使用的用语「糖度」所指为白利糖度(Degrees Brix，符号°Bx)，是测量糖度的单位，代表在20℃情况下，每100克水溶液中溶解的蔗糖克数，可用于判断发酵过程中糖份被转换的程度。
在一些实施例中，木瓜发酵汁液中为使用木瓜的果实进行发酵，其中木瓜学名为Carica papaya，为番木瓜科(Caricaceae)植物，又称番木瓜，原产于热带美洲，目前在中国台湾主要栽种于台南、屏东及南投等地区，其果实呈长圆形、卵形或洋梨型，单果重量为0.5-2.5公斤。本发明使用的来自中国台湾高雄地区的木瓜果实，但木瓜的产地本发明并不加以限制。
本发明所指的用语「木瓜果实」可以包括其果肉/果实、含有果皮的果肉/果实、或含有籽的果肉/果实。
本发明所指的木瓜发酵汁液，如同前述，在一些实施例中是指以水浸提含木瓜果实得到木瓜培养液后，再将此木瓜培養液经过特定发酵程序，形成木瓜发酵汁液。
在一些实施例中，木瓜发酵汁液可经由其他合适的处理步骤，得到木瓜发酵汁液中所含有的木瓜发酵物。举例而言，「木瓜发酵物」可为由木瓜发酵汁液经干燥而得的粉末。
在一些实施例中，木瓜发酵汁液藉由一包含下列步骤的制备方法制得：(a)将葡萄糖以及木瓜果实与水混合以得到培养液，其中水的重量为木瓜果实总重的1-5倍；以及(b)将培养液及复数菌种进行发酵1-5日以得到木瓜发酵汁液。
在一些实施例中，葡萄糖的添加量为木瓜果实与水总重的8-10wt％。藉由添加葡萄糖，使培养液中具有足够的糖度以确保发酵时菌种可以有足够的养份，让后续发酵可顺利进行。
在一些实施例中，先将木瓜果实与水混合，于80-100℃下浸泡0.5-1.5小时以进行浸提，得到一木瓜的水萃液；再将葡萄糖加入至木瓜的水萃液中得到培养液。
而在另一些实施例中，可先将葡萄糖、木瓜果实与水一起混合，形成混合液；再将混合液于80-100℃下浸提0.5-1.5小时以得到培养液。藉由将葡萄糖与木瓜果实同时混合来进行浸提程序，由于不需再开启浸提设备添加葡萄糖、且加入的葡萄糖可再经过高温环境处理，有助于葡萄糖的溶解且可降低原料受污染风险。
在获得培养液后，可将培养液及复数菌种进行发酵1-5日以得到木瓜发酵汁液。其中，复数菌种包括相对于培养液为0.01-0.5wt％的酵母菌及相对于培养液为0.01-0.25wt％的乳酸菌。在一些实施例中，培养液不另滤除其内部的固形物(浸提后的木瓜果实)而直接于其中加入菌种进行发酵(此时培养液的总重为固形物与液态的重量)，藉以利用菌种进一步提取固形物中的活性成分。在另一些实施例中，可先滤除培养液内部的固形物，再添加菌种进行发酵(此时培养液的总重为液态的重量)，藉此可避免当后续发酵反应过度时，产生其他较复杂且非所欲的成分而可较佳地控制浸提物品质。
在一些实施例中，将培养液及复数菌种进行发酵以得到木瓜发酵汁液的步骤中，酵母菌以及乳酸菌可以同时加入至培养液中。
在一些实施例中，将培养液及复数菌种进行发酵以得到木瓜发酵汁液的步骤中，是将酵母菌以及乳酸菌以此特定顺序进行分批发酵。举例而言，在一些实施例中，先于培养液中加入酵母菌进行发酵0.5-2日后形成初发酵汁液；再于初发酵汁液中加入乳酸菌进行发酵0.5-2日后形成木瓜发酵汁液。
藉由先于培养液中添加酵母菌，可先将培养液中的糖份(例如葡萄糖)经发酵转化为乙醇，而乙醇有助于浸提木瓜内的有效成分。而后，于初发酵汁液中加入乳酸菌，可使初发酵汁液内尚未反应的糖份经发酵而转化为乳酸，以进一步消耗其中的糖份，进而降低初发酵汁液所含糖度。由于在初发酵汁液中产生了乳酸，其将会进一步改变整体反应环境(例如使初发酵汁液的pH值下降)，对于浸提木瓜内的有效成分亦有影响与助益(使溶于酸性溶液的有效成分更易浸提出)，糖度进一步降低。在一些实施例中，木瓜发酵汁液的糖度为4.0以下，以确保发酵反应完全。在一些实施例中，木瓜发酵汁液的pH值约为3.2-4.5，糖度约为3.0-4.0°Bx。
在一些实施例中，酵母菌以及乳酸菌可于25-40℃下进行发酵反应。若温度超过40℃，则将会使菌种失去活性；若温度低于25℃，则发酵反应的速率将过低、甚至无法进行发酵反应，不利于木瓜发酵汁液的取得。在一些实施例中，酵母菌以及乳酸菌可于28-32℃下进行发酵反应。
在一些实施例中，所使用的酵母菌可以是市售的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。举例而言，可为向财团法人食品工作发展研究所采购的寄存编号BCRC20271(国际寄存编号ATCC26602)菌株的啤酒酵母。
在一些实施例中，所使用的乳酸菌可以是为市售的瑞士乳酸菌(Streptococcusthermophilus)、嗜热链球菌(Lactobacillus plantarum)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)或植物乳杆菌。举例而言，可采用瑞士乳酸菌TCI357(财团法人食品工作发展研究所寄存编号BCRC910846、国际寄存编号DSM33107)、寄存编号BCRC910805(国际寄存编号DSM33108)菌株的嗜热链球菌TCI028、寄存编号BCRT910760(国际寄存编号DSM32451)菌株的嗜热链球菌TCI378、或寄存编号BCRC910636(国际寄存编号DSM28121)菌株的嗜热链球菌TCI633。
在一些实施例中，当培养液完成所有菌种的发酵步骤后，将先得到木瓜发酵原液。而后，将此木瓜发酵原液经过滤，再得到木瓜发酵汁液。举例而言，在一些实施例中，可将培养液及复数菌种进行发酵1-5日后所得到木瓜发酵原液，经适当孔洞大小的滤网(例如200-400目筛网)过滤，以得到木瓜发酵汁液。
将此木瓜水萃液经过特定发酵程序后所形成的木瓜发酵汁液可具有较高的总多酚含量。举例而言，在一些实施例中，木瓜发酵汁液的总多酚含量为100-150μg/ml，而木瓜培养液的总多酚含量为60-90μg/ml。据此可知，藉由本案发酵方式所得的木瓜发酵汁液，其总多酚含量可被大幅提升1.63倍，故本案的发酵方式确实可有效改变木瓜水萃液中的所含成分，有效提升活性成分。在一些实施例中，此总多酚含量亦可作为木瓜发酵汁液的检验基准，此外，在一些实施例中，木瓜发酵汁液的总多酚含量/所述培养液的总多酚含量的比值为1.5-1.7，在一较佳实施例中，木瓜发酵汁液的总多酚含量/所述培养液的总多酚含量的比值为1.63。
根据本案的一些实施例，以水浸提木瓜果实所得到的木瓜培养液，在经过特定发酵程序后所形成的木瓜发酵汁液，可改善肌肤状况。故此木瓜发酵汁液可用于制备改善肌肤状况组合物的用途。
根据本案的一些实施例，以水浸提木瓜果实所得到的木瓜培养液，在经过特定发酵程序后所形成的木瓜发酵汁液，可提升转麸酰胺酸酶(Transglutaminase，TGM)基因、角蛋白(keratin，KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)基因及玻尿酸合成酶(hyaluronansynthase，HAS)基因。故此木瓜发酵汁液可用于制备改善提升转麸酰胺酸酶(Transglutaminase，TGM)基因、角蛋白(keratin，KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)基因及玻尿酸合成酶(hyaluronan synthase，HAS)基因组合物的用途。
在一些实施例中，前述的各组合物可为医药组合物、保养品组合物、食品组合物、保健食品组合物。
医药组合物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于经肠道地(enterally)、非经肠道地(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型。例如可为：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)或其他类似物。
医药组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列一种或多种载剂：乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似的物。有关这些载剂的选用与数量是熟习此项技术人员可视情况进行选择的。
在一些实施例中，医药上可接受的载剂可包含下列一种溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(alcohol containing aqueous solution)以及其他任何合适的溶剂。
在一些实施例中，所述医药组合物可由下列所述的任一种非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，医药组合物可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)。举例而言，其可为下列所述的任一种，但不限于此：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
在一些实施例中，外部制剂是藉由将医药组合物与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而制成。
在一些实施例中，所述基底可包含下列一种或多种的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸
微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，保养品中可包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，所述可接受的佐剂可包含下列一种或多种佐剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。可根据实际需求对这些试剂的选用与数量进行合适的调整。
在一些实施例中，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，其可为下列中的任一种，但不限于此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansing products)等，本发明并不加以限制。
在一些实施例中，保养品亦可与下列中的已知活性的外用剂(external useagents)的一种或多种一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，医药组合物可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
在一些实施例中，食品的种类可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
下列范例中的实验步骤若无特别叙明，即在室温(25±5℃)、常压(1atm)下进行。
[例1]木瓜发酵汁液的制备
首先将木瓜(Carica papaya)彻底清洗，将其全果实打碎成粒径12mm以下的木瓜颗粒。将木瓜颗粒与水以1:1-5的比例混合均匀以得到原料混合液，其中一较佳实施例为将木瓜颗粒与水以1:2的比例混合均匀以得到原料混合液。然后，根据原料混合液的总重，添加7.5wt％(重量百分比)的葡萄糖于木瓜的原料混合液中，将原料混合液在80℃-100℃下浸提0.5～1小时，其中一较佳实施例为将原料混合液在95℃下浸提0.5小时，得到木瓜培养液，培养液此时的糖度值为8.0°Bx。
待培养液冷却至室温后，进行发酵程序，先添加相对于培养液0.1wt％的啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(购自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(BCRC)，寄存编号BCRC20271)于培养液中，进行发酵0.5-2天以形成初发酵汁液，再添加相对于培养液为0.05wt％的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(购自BCRC，寄存编号BCRC910636)于初发酵汁液内，进行发酵0.5-2天以得到木瓜发酵汁液，其中一较佳实施例中。前述各发酵阶段皆于30℃下进行。木瓜发酵汁液设定的规格为pH值为3.5，糖度值为4.0°Bx，如检验符合所述些规格，则判定发酵完成并得到木瓜发酵汁液，显示大部分的糖份皆已反应。再另一较佳实施例中，木瓜发酵汁液会以200目筛网过滤进行过滤，去除发酵汁液的果粒残渣。
在本发明的一实施例中，发酵程序可为先添加啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，再添加嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，也可将啤酒酵母菌及嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)一并添加共同发酵，本发明并不以此为限。
在本发明的一实施例中，在发酵中所采用的菌种也可为啤酒酵母菌之外的其他同属不同种的酵母菌菌种，以及嗜热链球菌之外的其他同属不同种的链球菌菌种，本发明并不以此为限。
[例2]总多酚含量测试
标准曲线绘制：
首先，将10mg的没食子酸(gallic acid，GA)(购自Sigma，料号：G7384)溶于水中，并添加10mL的体积至量瓶中，得到1000μg/mL浓度的没食子酸溶液后，将所述溶液储存于-20℃作为储备溶液。之后，将储备溶液稀释10倍至100μg/mL的浓度，而未使用完的液体则储存于-20℃的环境。接着，于玻璃试管中分别配制0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的没食子酸标准溶液，配制方式显示如下表一：
表一：没食子酸标准溶液配置方法
之后，添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)(购自Merck，料号：1.09001.0100)、混合均匀并静置3分钟，接而添加400μL的7.5％碳酸钠(sodium carbonate)(Sigma 31432，溶于水中)、混合均匀并反应30分钟。接着，经由涡旋(vortex)确保无气泡后取200μL的标准溶液于750nm下测量吸光值，并绘制标准曲线。
样品总多酚定量实验：
另外，将例1所得的A组木瓜发酵汁液为样本，并以例1所得的B组木瓜培养液(未发酵)为比较组。将各组分别以水稀释20倍至1200μL并取100μL的体积至玻璃试管中，每组样品需三重复。之后，添加500μL的佛萧酚试剂、混合均匀并静置3分钟。
接而添加400μL的7.5％碳酸钠、混合均匀并反应30分钟～1小时。再经由涡旋确保无气泡后取200μL的各组反应溶液于750nm下测量吸光值，并以内差法算出浓度后再回乘稀释倍数以取得原浓度。
图1是本发明木瓜发酵汁液的总多酚含量检测数据图。由图1可見，B组(比较组，未经过发酵的木瓜培养液)的总多酚含量为77ug/mL，A组(木瓜发酵汁液，有经过发酵)的总多酚含量为126ug/mL；与比较组(B组)相较之下，A组的总多酚含量有显著的提升；与比较组相较之下，A组的总多酚含量提升1.63倍。本实施例的结果显示，进过发酵步骤，本发明的木瓜发酵汁液大量释出总多酚。由于A组木瓜发酵汁液的总多酚含量最高，因此以所述组的制备方式所得的木瓜发酵汁液进行后续实验。
[例3]保湿相关基因的细胞实验
此范例以RNA萃取套组、反转录酶、KAPA 
FAST qPCR试剂组配合定量PCR仪，测定人类初代皮肤角质细胞受经木瓜发酵汁液处理后，细胞中保湿相关基因的变化。
举例来说，保湿相关为TGM1基因(Gene ID:7051)、KRT1基因(Gene ID:3848)、KRT10基因(Gene ID:3858)、KRT14基因(Gene ID:3861)、AQP3基因(Gene ID:360)、HAS2基因(Gene ID:3037)。
其中，TGM1基因能编码转麸酰胺酸酶1(transglutaminase 1)，为一种形成角质细胞膜防水不可或缺的酵素。详细而言，转麸酰胺酸酶1存在于构成皮肤最外层(表皮)的细胞中。转麸酰胺酸酶1参与了角质化细胞包膜(cornified cell envelope)的形成，所述结构是围绕皮肤细胞的结构，有助于在身体及其周围环境之间形成保护性屏障(protectivebarrier)。具体而言，转麸酰胺酸酶1在组成角化细胞包膜的结构蛋白之间形成强键，称为交联。这种交联为表皮提供强度和稳定性，可减少表皮的水分散失。
KRT1基因能编码角蛋白1(keratin 1)、KRT10能编码角蛋白10(keratin 10)、KRT14能编码角蛋白14(keratin 14)；角蛋白1、角蛋白10及角蛋白14皆为角蛋白家族的成员，角蛋白是一种坚韧的纤维状蛋白质，形成称为角质形成细胞(keratinocytes)的细胞的结构框架，这些细胞构成皮肤、头发和指甲。角蛋白1在皮肤外层(表皮)的角质形成细胞中产生，包括手掌和脚底的皮肤。
角蛋白1与另一种角蛋白(角蛋白10)结合在一起，形成称为角蛋白中间丝的分子。这些细丝组装成牢固的网路，为皮肤提供强度和弹性，保护其免受摩擦和其他日常物理应力的损害，可减少水分散失。
AQP3基因能编码水通道蛋白3(aquaporin 3)，是一种细胞膜上跨膜运输水，甘油和尿素等小分子物质的转运蛋白。AQP3参与皮肤水合、皮肤屏障功能以及创伤愈合，维持角质细胞内水的通透性，以提高角质细胞的含水量。
HAS2基因能编码玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2)，此合成酶会促进角质细胞分泌玻尿酸的能力，并使皮肤角质层结构完整且提升皮肤屏障功能，能使皮肤保水力提升。
因此，例3中以TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、KRT14基因、AQP3基因、HAS2基因作为分析标的。
材料与仪器
1.细胞株：细胞株：人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermalkeratinocytes)(购于CELLnTEC公司(瑞士)，编号HPEK-50)。
2.培养基：Keratinocyte-SFM(1X)(Thermo)。
3.RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Lot No.FC24015-G)
4.反转录酶(
III Reverse Transcriptase)(Invitrogen公司，美国，编号18080-051)
5.测量标的基因引子，其中包含TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、KRT14基因、AQP3基因、HAS2基因，另包括内部控制组(TBP基因)。
6.KAPA 
FAST qPCR试剂组(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)
7.ABI StepOnePlusTM即时PCR***(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))。
8.木瓜发酵汁液：此实验中所使用的木瓜发酵汁液是透过如上例1所获得。
9.木瓜培养液：此实验中所使用的木瓜培养液(又称：培养液)是透过如上例1所获得，未经过发酵处理。
实验步骤
首先，取1.5x105个人类初代皮肤角质细胞至每孔含有2毫升上述培养基的六孔细胞培养盘中，于37℃下培养24小时，将每孔培养后的人类初代皮肤角质细胞依据下列测试条件分为控制组(A组)以及实验组(B组)(共二组)来处理每孔培养后的人类初代皮肤角质细胞。
测试条件
| 组别 | 添加成分 | 细胞实验浓度 | 处理时间 |
| A组 | 无 | 无 | 24小时 |
| B-1组 | 木瓜培养液 | 0.5％(体积百分比) | 24小时 |
| B-2组 | 木瓜发酵汁液 | 0.5％(体积百分比) | 24小时 |
详细来说，A组是单纯使用2毫升上述细胞培养基(Keratinocyte-SFM)来培养人类初代皮肤角质细胞，未再加入其他添加成分，用于做为实验控制组。
B-1组是将含有如上例1所制备的木瓜培养液0.5％(体积百分比)浓度的培养基2ml(即为0.01ml的木瓜培养液加上1.99ml的培养基)，培养人类初代皮肤角质细胞24小时。
B-2组是将含有如上例1所制备的木瓜发酵汁液0.5％(体积百分比)浓度的培养基2ml(即为0.01ml的木瓜发酵汁液加上1.99ml的培养基)，培养人类初代皮肤角质细胞24小时。
以上A组及B组，每组进行四重复。
将处理后的人类初代皮肤角质细胞(即A组、B-1、B-2组)以细胞裂解液分别破细胞膜以形成三组的细胞溶液。接着，以RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，LotNo.FC24015-G)分别萃取三组细胞溶液内的RNA。接着，每组取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作为模板，透过
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)将萃取出的RNA反转录为相应的cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM即时PCR***(ABIStepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国))、KAPASYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)及表1的引子(SEQ ID NO:1及SEQ IDNO:12)对六组的cDNA进行定量即时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-timereverse transcription polymerase chain reaction)以观察二组的人类初代皮肤角质细胞内的TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、KRT14基因、AQP3基因、HAS2基因的表现量。定量即时反转录聚合酶连锁反应的仪器设定条件为95℃反应20秒，接着95℃反应3秒，60℃反应30秒，并重复40个回圈，并使用2-ΔCt方法进行基因定量。于此，藉由cDNA进行定量即时反转录聚合酶连锁反应可间接定量TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、KRT14基因、AQP3基因、HAS2基因的mRNA表现量，进而推断TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、KRT14基因、AQP3基因、HAS2基因编码的蛋白质的表现量。
表1
| 引子名称 | 序列编号 | 引子序列 |
| TGM1-F | SEQ ID NO:1 | GATCGCATCA CCCTTGAGTT AC |
| TGM1-R | SEQ ID NO:2 | GCAGGTTCAGATTCTGCCC |
| KRT1-F | SEQ ID NO:3 | AGAGTGGACC AACTGAAGAG T |
| KRT1-R | SEQ ID NO:4 | ATTCTCTGCA TTTGTCCGCTT |
| KRT10-F | SEQ ID NO:5 | TCCTACTTGG ACAAAGTTCG GG |
| KRT10-R | SEQ ID NO:6 | CCCCTGATGT GAGTTGCCA |
| KRT14-F | SEQ ID NO:7 | TTCTGAACGA GATGCGTGAC |
| KRT14-R | SEQ ID NO:8 | GCAGCTCAAT CTCCAGGTTC |
| AQP3-F | SEQ ID NO:9 | GGGGAGATGC TCCACATCC |
| AQP3-R | SEQ ID NO:10 | AAAGGCCAGG TTGATGGTGAG |
| HAS2-F | SEQ ID NO:11 | CGGTGCTCCA AAAAGGCAA A |
| HAS2-R | SEQ ID NO:12 | ACACAATGAG TTGGGCGAGA |
*R为REVERSE反向，F为FORWARD顺向。
需要特别说明的是，下文述及的图式中显示的TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、KRT14基因、AQP3基因、HAS2基因的相对基因表现是以相对倍率呈现，其中使用Excel软体的STDEV公式计算标准差，并在Excel软体中以单尾学生t检验(Student t-test)分析是否具有统计上的显著差异。图式中「*」代表p值小于0.05，「**」代表p值小于0.01，以及「***」代表p值小于0.001。当「*」越多时，代表统计上的差异越显著。
参阅图2，将控制组(A组)的TGM1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B-1组，木瓜培养液)相对于控制组的TGM1基因的表现量为1.14(即114％，但无显著差异)，实验组(B-2组，木瓜发酵汁液)相对于控制组的TGM1基因的表现量为1.20(即120％)，也就是说，相较于控制组(A组)，实验组(B-2组)的TGM1基因的表现量显著地高约1.2倍。
参阅图2，将控制组(A组)的KRT1基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B-1组，木瓜培养液)相对于控制组的KRT1基因的表现量为1.44(即144％，但无显著差异)，实验组(B-2组，木瓜发酵汁液)相对于控制组的KRT1基因的表现量为1.93(即193％)，也就是说，相较于控制组(A组)，实验组(B-2组)的KRT1基因的表现量显著地高约1.93倍。
参阅图2，将控制组(A组)的KRT10基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B-1组，木瓜培养液)相对于控制组的KRT10基因的表现量为0.6(即60％)，实验组(B-2组，木瓜发酵汁液)相对于控制组的KRT10基因的表现量为1.7(即170％)，也就是说，相较于控制组(A组)，实验组(B-1组)的KRT10基因的表现量反而显著地减少，实验组(B-2组)的KRT10基因的表现量显著地高约1.72倍。
参阅图2，将控制组(A组)的KRT14基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B-1组，木瓜培养液)相对于控制组的KRT14基因的表现量为1.11(即111％，但无显著差异)，实验组(B-2组，木瓜发酵汁液)相对于控制组的KRT10基因的表现量为1.25(即125％，但无显著差异)，也就是说，相较于控制组(A组)，实验组(B-1组)及实验组(B-2组)的KRT10基因的表现量均无显著改变。
参阅图2，将控制组(A组)的AQP3基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B-1组，木瓜培养液)相对于控制组的AQP3基因的表现量为1.49(即149％，但无显著差异)，实验组(B-2组，木瓜发酵汁液)相对于控制组的AQP3基因的表现量为1.64(即164％)，也就是说，相较于控制组(A组)，实验组(B-2组)的AQP3基因的表现量显著高约1.64倍。
参阅图2，将控制组(A组)的HAS2基因的表现量视为1(即100％)时，实验组(B-1组，木瓜培养液)相对于控制组的HAS2基因的表现量为1.22(即122％，但无显著差异)，实验组(B-2组，木瓜发酵汁液)相对于控制组的HAS2基因的表现量为1.29(即129％)，也就是说，相较于控制组(A组)，实验组(B-2组)的HAS2基因的表现量显著高约1.29倍。
由此可知，当人类初代皮肤角质细胞以含有0.5％木瓜发酵汁液处理后，人类初代皮肤角质细胞的TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、AQP3基因、HAS2基因显著的上升。
由于TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、AQP3基因、HAS2基因肌肤保湿呈现正相关；因此，当肌肤保湿相关基因的表现量上降时，肌肤保湿的程度也上升，因此本发明的木瓜发酵汁液具有提升肌肤保湿的潜力。
[例4]肌肤状态人体实验-以外用方式使用木瓜发酵汁液
为探讨本发明的木瓜发酵汁液对于人体肌肤状态的影响，因此以外用方式检测受试者使用木瓜发酵汁液的各项肌肤数值变化。
使用样品：含木瓜发酵汁液面膜(以面膜布浸泡于含有木瓜发酵汁液的精华液中，使其充分吸收后制得)以及安慰剂面膜(以相同型号的面膜布浸泡于与前述精华液中，但其中的木瓜发酵汁液替换成等重的水)，再使其充分吸收后制得。于此实施例中，各面膜是含20mL的对应精华液。
含有木瓜发酵汁液的精华液成分：馨鲜酮0.6wt％、1,3-丁二醇5wt％、三乙醇胺0.1wt％、己二醇0.6wt％、木瓜发酵汁液1.0wt％，其余为水。其中，此木瓜发酵汁液是由例1的制备方式而得。
受试者人数：8位25-55岁的受试者。
测试时长：共四周，每天早晚共使用两次。
实验方式：受试者将全脸清洁后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录左右半脸于使用面膜前的数值(使用前数据)。而后，受试者在每日早晨及晚间睡前洗完脸后，分别将木瓜发酵汁液面膜以及安慰剂面膜贴敷于受试者的右半脸及左半脸上，经15分钟后取下，，每日两次，为期4周，再以对应的仪器及测量方式，进行测量(使用后数据)，再与自身原左半脸、或右半脸的数值进行对照(使用前与使用后欲进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。
检测项目：将分别对肌肤进行肌肤含水量、肌肤毛孔状态、肌肤油脂含量的检测。
1.肌肤含水量
使用购自德国Courage+Khazaka electronic公司的肌肤含水量检测探头
CM825(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)对同一受试者在使用面膜前与后的面部肌肤进行检测。所述检测探头是基于电容的原理进行测量。当水分含量发生变化时，皮肤的电容值亦发生变化，故可通过测定皮肤电容值，分析皮肤表面的含水量。
请参阅图3，所述图3是受试者在使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜4周后的肌肤(上脸颊处)含水量改善情况，具体而言，将使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜前的肌肤含水量视为1(即100％)，使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜(测试组)后，受试者肌肤含水量显著提升14.7％，而使用安慰剂面膜的使用前及使用后的肌肤含水量未有显著差异。
由此可见，本发明的木瓜发酵汁液能提升肌肤含水量，因此具提升肌肤保湿的效果。
2.肌肤毛孔状态
使用美国Canfield所贩售的VISIA高阶数位肤质检测仪进行检测，透过高解析度的相机镜头对同一受试者在使用面膜前与后的面部肌肤进行检测。藉由标准白光照射，造成毛孔凹陷处产生阴影，毛孔会比周围的肤色更黑，故可以此检测毛孔，然后利用仪器内建软体根据毛孔数目、面积分析得到数值，而数值越高则显示其毛孔数量、面积较多。
请参阅图4，所述图是受试者在使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜4周后的肌肤毛孔状态改善情况，具体而言，将使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜前的肌肤毛孔数量视为1(即100％)，使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜(测试组)后，受试者肌肤毛孔数量显著减少11.0％，而使用安慰剂面膜的使用前及使用后的肌肤毛孔数量未有显著差异。
由此可见，本发明的木瓜发酵汁液具降低毛孔数量的效果。
3.肌肤油脂含量
使用德国Courage+Khazaka electronic公司的肌肤油脂含量检测探头
SM815(C+K Multi Probe Adapter System,Germany)对同一受试者在使用前与使用后的面部肌肤进行检测。所述仪器是利用光度计原理，先以探头中的试纸吸取皮肤油脂后，根据试纸透光度计算出皮肤油脂含量。测量数值越高，说明皮肤油脂含量越高。
请参阅图5，所述图是受试者在使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜4周后的肌肤油脂含量改善情况，具体而言，将使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜前的肌肤油脂含量视为1(即100％)，使用含本案木瓜发酵汁液的精华液的面膜(测试组)后，受试者肌肤油脂含量显著减少29.5％，而使用安慰剂面膜的使用前及使用后的肌肤油脂含量则只有减少15.3。
由此可见，本发明的木瓜发酵汁液具减少肌肤油脂的效果。
综合以上，透过例2可知，经过发酵步骤，本发明的木瓜发酵汁液大量释出总多酚，总多酚数值含量明显高于未经过发酵的木瓜培养液。透过例3可知，相较于未经过发酵的木瓜培养液，本发明的木瓜发酵汁液能提升保湿相关基因，即为TGM1基因、KRT1基因、KRT 10基因、AQP3基因、HAS2基因，具有提升肌肤保湿的能力。透过例4所述的人体实验可知，本发明的木瓜发酵汁液能提升肌肤含水量、减少肌肤毛孔以及减少肌肤油脂含量。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
【序列表】
<110> 大江生医股份有限公司
<120> 木瓜发酵汁液以及其用于改善肌肤状况的用途
<130> 2119--TW-UT001
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> HAS2-R
<400> 12
ACACAATGAGTTGGGCGAGA 20
Claims (14)
1.一种木瓜发酵汁液，其特征在于，是藉由一包含下列步骤之制备方法制得：
(a)将葡萄糖、木瓜果实与水混合以得到一培养液，其中水之重量为木瓜果实总重的1-5倍；以及
(b)将所述培养液及复数菌种进行发酵1-5日以得到所述木瓜发酵汁液，其中所述复数菌种由相对于所述培养液为0.01-0.5wt％的酵母菌以及相对于所述培养液为0.01-0.25wt％的乳酸菌组成。
2.如权利要求1所述的木瓜发酵汁液，其中所述(a)步骤之得到所述培养液的步骤中，葡萄糖的添加量为木瓜果实与水总重的8-10wt％。
3.如权利要求1所述的木瓜发酵汁液，其中所述(b)将所述培养液及所述复数菌种进行发酵以得到所述木瓜发酵汁液的步骤包括：
(b1)于所述培养液中加入酵母菌进行发酵0.5-2日后形成一初发酵汁液；
(b2)于所述初发酵汁液中加入乳酸菌进行发酵0.5-2日后形成所述木瓜发酵汁液。
4.如权利要求1所述的木瓜发酵汁液，其中酵母菌为啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，乳酸菌为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
5.如权利要求1所述的木瓜发酵汁液，其中所述木瓜发酵汁液的pH值为3.2-4.2，且其糖度为4.0以下。
6.如权利要求1所述的木瓜发酵汁液，其中所述木瓜发酵汁液的总多酚含量为100-150ug/mL。
7.如权利要求1所述的木瓜发酵汁液，其中所述木瓜发酵汁液的总多酚含量/所述培养液的总多酚含量之比值为1.5-1.7。
8.一种将如权利要求1至7中任一项所述的木瓜发酵汁液用于制备改善肌肤状况的组合物的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述组合物是同时具有以下所述功能的至少其中两种：提升肌肤保湿、减少肌肤油脂以及减少肌肤毛孔。
10.如权利要求8所述的用途，其中若所述组合物减少肌肤油脂及减少肌肤毛孔，则所述组合物含有1.0vol％的所述木瓜发酵汁液。
11.一种将如权利要求1至7中任一项所述的木瓜发酵汁液用于制备提升转麸酰胺酸酶(Transglutaminase，TGM)基因、角蛋白(keratin，KRT)基因、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)基因及玻尿酸合成酶(hyaluronan synthase，HAS)基因的组合物的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述转麸酰胺酸酶基因为转麸酰胺酸酶1(Transglutaminase 1，TGM1)，所述水通道蛋白基因为水通道蛋白3(Aquaporin 3，AQP3)基因，所述玻尿酸合成酶基因是玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase 2，HAS2)基因。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述角蛋白基因为角蛋白1(keratin，KRT)基因、角蛋白10(keratin，KRT基因或其组合。
14.如权利要求11所述的用途，其中所述组合物含有至少0.5vol％的所述木瓜发酵汁液。
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