CN115725420A - 一株产黄酮类化合物的工业***内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株产黄酮类化合物的工业***内生真菌及其应用，涉及微生物领域，具体涉及一株工业***内生真菌及其应用。是要解决现有黄酮类化合物的获取方法浪费工业***资源，反应条件影响环境的问题。该工业***内生真菌为轮层炭菌属(Daldinia loculata)HMX03，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2022年5月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2022722。本发明的工业***内生真菌具有良好的抗菌活性，并能够发酵产黄酮类化合物。本发明的微生物用于抗菌及产黄酮类化合物。

Description

一株产黄酮类化合物的工业***内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株工业***内生真菌及其应用。

背景技术

黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，常以苷与苷元的形式广泛存在于植物体内。黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎镇痛、抗肿瘤、保肝护肝及抗病毒等多种药理活性，对人类一些常见的慢性疾病具有一定的治疗作用，如癌症、糖尿病、阿尔茨海默症、心脑血管疾病等，在医药、功能食品中具有广阔的应用前景。

从植物原料中提取黄酮类化合物,是目前黄酮类化合物的主要生产方式，但这种方式的操作工艺复杂，产物常为混合体系，纯化过程不仅会增加生产成本，浪费工业***资源，还会造成产品的损失与活性降低。

此外，黄酮类化合物也可以通过化学合成的方式，化学合成能实现部分黄酮类化合物的全合成，但反应条件对环境影响较大，如高温、强酸、强碱等条件，阻碍了化学合成方法规模化和商业化的应用。另外，反应条件有时也会造成黄酮类化合物降解或产生两种立体异构体混合物。

发明内容

本发明是要解决现有黄酮类化合物的获取方法浪费工业***资源，反应条件影响环境的问题，提供一株产黄酮类化合物的工业***内生真菌及其应用。

本发明提供一株产黄酮类化合物的工业***内生真菌，它为轮层炭菌属(Daldinia loculata)HMX03，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2022年5月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2022722。

本发明工业***内生真菌HMX03的菌落初期呈白色，渐变为黑色，菌丝疏松；基质为白色。

将本发明的工业***内生真菌HMX03的ITS rDNA测序结果提交至NCBI数据库，利用BLAST分析并进行比对，采用MEGA 7软件构建工业***内生真菌HMX03的***发育树，该工业***内生真菌HMX03与Daldinia loculata(KU683789.1)的相似性达到了100％。综合菌落及孢子形态学观察结果，将工业***内生真菌HMX03鉴定为轮层炭菌属(Daldinialoculata)

本发明还提供工业***内生真菌HMX03在制备抑菌药物中的应用。

进一步的，所述菌为细菌和真菌。

进一步的，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌，所述真菌为白假丝酵母。

本发明还提供工业***内生真菌HMX03在发酵产黄酮类化合物中的应用。

进一步的，所述黄酮类化合物为槲皮素和木犀草素。

本发明的有益效果：

本发明在工业***中分离提纯一株内生真菌HMX03，经鉴定为轮层炭菌属(Daldinia loculata)。该菌株具有良好的抗菌活性，其中对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌及白假丝酵母具有较好的抑制作用。

本发明中工业***内生真菌HMX03其次生代谢物中含有两种黄酮类化合物，分别是槲皮素和木犀草素。采用工业***内生真菌发酵法生产黄酮类化合物，能够节省植物资源，同时也为黄酮类化合物的生产提供新的方法，发酵方法反应条件温和，利于规模化生生产。因此，工业***内生真菌HMX03具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为工业***内生真菌HMX03的菌落形态；

图2为工业***内生真菌HMX03的菌丝显微形态；

图3为工业***内生真菌HMX03的ITS rDNA PCR结果；

图4为工业***内生真菌HMX03的***发育树；

图5为工业***内生真菌HMX03的发酵液HPLC分析结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

本实施例产黄酮类化合物的工业***内生真菌为轮层炭菌属(Daldinialoculata)HMX03，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2022年5月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2022722。

本实施例工业***内生真菌HMX03的获取方法为：

取工业***(Cannabis sativa L.)叶(龙麻5号，采自黑龙江省农科院绥化分院科技创新农场)，表面消毒，消毒程序为：75％酒精30s—无菌水洗—NaClO 5min—无菌水洗—75％酒精30s—无菌水洗，用无菌手术刀将消毒后的实验材料切开，切成边长5mm正方形小块，置于PDA培养基中，于28℃恒温培养5～7d；取消毒程序最后一次水洗液，涂布接种于PDA培养基中。并将消毒后不切块的实验材料置于PDA培养基上，滚动一圈后取出，同内生真菌分离培养基共同培养，作为对照。最后从工业***叶中分离得到内生真菌HMX03，阴性对照无任何菌长出，多次重复均如此，从而证明所分离到的菌株是工业***内生真菌。

马铃薯固体培养基(PDA)制法：称取新鲜去皮的马铃薯块100g放置于沸水中，保持沸腾30min，过滤，向滤液中加入配方中葡萄糖20g、琼脂粉16g，待其完全溶解后，以水将培养基总体积补至1L，pH自然，分装、灭菌(121℃，0.1MPa，30min)、放冷备用。

实施例2：工业***内生真菌HMX03的鉴定

采用菌落及孢子形态学观察及ITS rDNA序列分析法进行菌株鉴定。

工业***内生真菌HMX03的菌落形态如图1所示，菌丝显微形态如图2所示。工业***内生真菌HMX03的菌落初期呈白色，渐变为黑色，菌丝疏松；基质为白色。

提取工业***内生菌HMX03的的基因组DNA，对DNA进行PCR扩增，获得长度为514bp的ITS rDNA序列，结果如图3所示，图中1表示Marker，2表示菌株HMX03。委托上海生工生物工程公司对菌株HMX03的ITS rDNA进行测序，ITS rDNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明工业***内生真菌HMX03的ITS rDNA序列：

CCTACCTAATCCGAGGTCAACCACTAGAAATATAGGGGTTTAACGGCAAGCCGCCAGGACAACTACAGAAGCGAGAAGAATATTACTACGCTTAGAGTATGCCCTAACTCCGCCGATCACTTTAAGGAACTGCCCTATAAATACAGGGCAGATTCCCAACACTAAGCAACTAGGCTTAAGGGTTGAAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTAGAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTTATTAAGTTGAAGCATTCAGAGATACAGTAGTAAAATAGAATTTAGTGGTCCACCGGCGGGCTTGGAGCGCACCTACCGGGTAGCTACAGGGTAGCTACAGGGTAAGTACAGCCCGCCGAGGCAACGACGGTAAGGTTCACAAAGGGTTGGGAGTTTAGATTAACT。

将测序结果提交至NCBI数据库，利用BLAST分析并进行比对，比对后采用MEGA7软件构建工业***内生真菌HMX03的***发育树，如图4所示。从图4可知，工业***内生真菌HMX03与Daldinia loculata(KU683789.1)的相似性达到了100％。综合菌落及孢子形态学观察结果，将工业***内生真菌HMX03鉴定为轮层炭菌属(Daldinia loculata)。

实施例3：工业***内生真菌HMX03的抑菌活性分析：

1、工业***内生真菌HMX03活化：

取工业***内生真菌HMX03，于无菌条件下接种至含有PDA培养基的试面上，在28℃恒温培养3d，备用。

2、工业***内生真菌HMX03发酵液制备：

取已活化工业***内生真菌HMX03，在无菌条件下挑取菌丝接种于50mL PDB培养基中，于28℃、120r/min条件下摇床振荡培养3d，制成1×10⁷CFU/mL的种子液；将种子液以20％(v/v)的接种量转接至3L灭菌后的PDB培养基中，28℃、120r/min摇床培养14d，过滤取发酵液。

3、供试品溶液的制备：

取工业***内生真菌HMX03发酵液于50℃条件下减压浓缩至50mL后，加甲醇50mL，超声提取3次，得提取液，减压浓缩至干，加甲醇10mL溶解后，作为供试品溶液备用。取适量链霉素和制霉素对照品，分别加入甲醇适量溶解，制成200μg/mL阳性对照液，备用。

4、含受试菌株平板的制备

取已活化供试细菌：金黄色葡萄球菌(StapHlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、粪肠球菌(Enterococcus facalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，分别接种于NA斜面培养基中，37℃培养1d；取已活化供试真菌白假丝酵母(Candida albicans)，接种于PDA斜面培养基中，28℃培养3d，备用。上述供试菌株购于黑龙江省微生物研究所。

分别取上述活化后的受试菌株，加入适量无菌水，震摇，使各菌株稀释为1×10⁷CFU/mL的菌悬液，倒入各自相应的培养基中，并分装到放有牛津杯的无菌平板，待其凝固后，取出牛津杯，备用。

5、抑菌活性分析：

向上述制备好的含菌平板的两孔中精密加入150μL供试品溶液、阳性对照液、阴性对照液。将含有细菌的平板于37℃恒温培养1d，然后测量抑菌圈直径(n＝3)；将含有真菌的平板于28℃恒温培养3d，然后测量抑菌圈直径(n＝3)。

实验结果：

工业***内生真菌HMX03的抑菌活性结果见表1。

表1工业***内生真菌HMX03发酵液抑菌活性结果

注：A：大肠杆菌；B：枯草芽孢杆菌；C：金黄色葡萄球菌；D：短小芽孢杆菌；E：铜绿假单孢菌；F：单增李斯特菌；G：肺炎克雷伯菌；H：鲍曼不动杆菌；I：屎肠球菌；J：粪肠球菌；K：白假丝酵母；Str：链霉素；Nys：制霉素。

从表1结果可以看出，工业***内生真菌HMX03对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、白假丝酵母具有较好的抑制作用，说明工业***内生真菌HMX03具有较好的抑菌活性。

实施例4：工业***内生真菌HMX03发酵液HPLC分析：

1、供试品溶液的制备

取已活化工业***内生真菌HMX03，在无菌条件下挑取菌丝接种于50mL PDB培养基中，于28℃、120r/min条件下摇床振荡培养3d，制成1×10⁷CFU/mL的种子液；将种子液以20％(v/v)的接种量转接至3L灭菌后的PDB培养基中，28℃、120r/min摇床培养14d，过滤取发酵液。

将发酵液于50℃条件下减压浓缩，将浓缩后的发酵液以乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，合并萃取液，50℃低温浓缩至干，用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液，备用。

2、对照药材溶液的制备

精确称取工业***叶5g，粉碎，各按1：50的料液比加入95％的乙醇，50℃超声提取3次(3×250mL)，过滤，合并提取液，50℃减压浓缩至100mL后，用乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，得萃取液。合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，1mL色谱甲醇溶解，备用。

3、对照品溶液的制备

分别精密称取槲皮素及木犀草素对照品各0.5mg，置于1mL离心管中，加入1mL色谱甲醇溶解，制成对照品溶液备用。

取PDB培养液300mL于50℃条件下减压浓缩，将浓缩后的PDB培养液以乙酸乙酯萃取3次(3×100mL)，合并萃取液，50℃低温浓缩至干，用1mL甲醇溶解后作为空白对照液，备用。

4、HPLC条件

色谱柱：Venusil XBP-C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm，USA)流动相：甲醇-0.1％甲酸(65∶35)流速：1mL·min^-1；柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10μL。

实验结果：

采用HPLC分析内生真菌HMX03发酵液，以槲皮素及木犀草素为对照品，HPLC结果如图5。图5中A表示HMX03发酵液，B表示槲皮素对照品，C表示木犀草素对照品，D表示对照药材(叶)，E表示PDB样品。

由图5可知，内生真菌HMX03发酵液供试品、对照药材液及槲皮素、木犀草素对照品在相同的保留时间内有相同的色谱峰，且空白对照(PDB)无干扰。采用标准加入法，将槲皮素及木犀草素对照品加入到内生真菌HMX03供试品溶液中，经HPLC分析，结果在与对照品槲皮素及木犀草素相同的保留时间位置仍为一单一色谱峰，因此初步确定在内生真菌HMX03发酵液中含有槲皮素及木犀草素，由此推测，内生真菌HMX03为黄酮类化合物槲皮素及木犀草素产生菌。

工业***内生真菌HMX03不仅具有较好的抑菌活性，还是黄酮类化合物产生菌，上述研究为采用工业***内生真菌HMX03发酵的方法生产黄酮类化合物奠定了基础，工业***内生真菌HMX03是一株值得深入研究的内生真菌。

Claims (6)

1.一株产黄酮类化合物的工业***内生真菌，其特征在于该工业***内生真菌为轮层炭菌属(Daldinia loculata)HMX03，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2022年5月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2022722。

2.如权利要求1所述的工业***内生真菌在制备抑菌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述抑菌为抑制细菌和真菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌，所述真菌为白假丝酵母。

5.如权利要求1所述的工业***内生真菌在发酵产黄酮类化合物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述黄酮类化合物为槲皮素和木犀草素。

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