CN107227373B

CN107227373B - 一种粳稻抗倒伏基因的snp功能分子标记及应用

Info

Publication number: CN107227373B
Application number: CN201710640684.5A
Authority: CN
Inventors: 李文博; 曾秀红; 姚启伦; 李昌满; 谭永忠; 刘义华
Original assignee: Yangtze Normal University
Current assignee: Yangtze Normal University
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: CN107227373A

Abstract

本发明公开了一种粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记及应用，所述抗倒伏基因为SCM2，所述SNP功能分子标记为K_06g_SCM2‑1，位于水稻第6号染色体第27481645位碱基处，该SNP分子标记多态性为T/G，其序列如SEQ ID No.1所示，第55bp位点处的碱基为T或G，位于基因SCM2启动子区域。本发明的SNP功能分子标记可用于早期（苗期或胚胎期）预测水稻粳亚种材料抗倒伏能力，可进行准确地筛选，促进了粳稻抗倒伏性状的遗传改良和育种。本发明采用KASP方法检测SNP位点，检测方法准确可靠，操作简便，适用于高通量商业化分子育种应用。

Description

一种粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记及应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记及应用。

背景技术

传统系谱法选育是水稻育种家们普遍采用的方法，通过育种家们的多年努力，培育和创制了大量高产、高抗和优质的水稻新品种。然而，结合表型鉴定的传统育种模式存在表型把控不准、遗传群体需求量大、人力成本高、育种周期长等缺陷，很难实现大规模商业化集成育种或材料遗传改良。伴随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助选择育种(Molecular Assisted Selectoin，MAS)显现了巨大的技术优势，实现了遗传基础与目标性状的结合，选择含有目标基因的材料(单株)进行组配，实现了目标性状的精准改良，能有效回避传统育种方法的技术壁垒。

单个核苷酸变异(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)在物种的基因组上广泛存在，包括：单个碱基的转换或颠换、单个碱基(片段)***或缺失等形式，针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的SNP分子标记技术。针对控制目标性状的基因开发功能SNP标记，将性状与基因型相关联进而实现高效、精准育种。现阶段，适用于SNP检测的手段主要有凝胶电泳和荧光定量PCR，但检测过程需要酶切、电泳及测序等，操作复杂，而且PCR产物的气溶胶和EB对人体的危害，对环境的污染。竞争性等位基因PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。

种植水稻的时候，水稻倒伏是一个极常见的问题，水稻倒伏严重影响水稻生产品质和制约产量的提高：一是植株早衰，产量降低。水稻倒伏后，植株相互重叠，受光面积减少；同时由于透风透光差，加之田间湿度较大，下部叶片枯黄腐烂，功能叶面积下降。此外，由于机械损伤，植株营养物质交换受阻，进一步加强了根系和叶片的早衰，影响光合作用，光合物质减少，导致灌浆不饱满，千粒重下降，秕谷增加，结实率降低。二是米质下降。由于灌浆不足，稻米心腹白比例较大，碎米率增加。稻穗长期处于高湿环境中，部分稻粒发生霉变、发芽，稻米的光泽度较差，品质产重下降。但在水稻抗倒伏育种工作中，传统的表型鉴定需要在作物拔节后或农作物生育的中后期才能进行鉴定；这些因素都极大了限制了水稻抗倒伏性状的育种和遗传改良进度，而且费时费力。因此，开发出适用于苗期高通量鉴定植株基因型的功能SNP分子标记，助力大规模商业化分子育种具有广泛的应用前景和经济价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记，解决现有粳稻抗倒伏表型鉴定耗时长和高人力投入的问题。

本发明还提供了用于检测SNP功能分子标记的引物组和KASP方法，解决了实验操作不安全、操作复杂和人工鉴定结果不准确等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记，其特征在于，所述抗倒伏基因为SCM2，所述SNP功能分子标记为K_06g_SCM2-1，位于水稻第6号染色体第27481645位碱基处，属于基因SCM2启动子区域，该SNP分子标记多态性为T/G，其序列如SEQ ID No.1所示，第57bp位点处的碱基为T或G。

一种用于检测权利要求1所述SNP功能分子标记的引物组，包括特异性引物序列为：

Specific-allele X：TAGCCATGCCAAAGCTAAA

Specific-allele Y：TAGCCATGCCAAAGCTAAC

通用引物序列为：

Primer Common：GCTTTGCTTAGATTGCGATT。

进一步，含有上述引物组合的试剂或试剂盒，用于检测水稻抗倒伏、粳稻种质资源鉴定或粳稻遗传改良。

进一步，所述粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记的引物组的应用，包括以下步骤：

1)基因组提取：采用简化CTAB法，从水稻叶片中提取基因组DNA，首先将水稻叶片冻干或烘干，取适量叶片放入2.0mL离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；再加入750μL CTAB溶液，震荡匀浆，65℃震荡温浴0.5-1h；冷却至室温，在通风橱中加入750μL氯仿与异戊醇的混合溶液颠倒3-4次混匀，所述氯仿与异戊醇的体积比为24︰1；12000rmp离心10min，取上清500μL转移至新的1.5mL离心管中；加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，弃上清；加入1mL70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；加300μLH2O，溶解备用；

2)KASP反应：以步骤1)获得的水稻基因组DNA为模板，利用荧光特异性引物进行PCR反应，所述荧光特异性引物的正向引物为所述特异性引物的5’端分别连接不同荧光标签序列，反向引物为所述通用引物；

其中荧光标签序列为：

FAM-tail：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT

VIC-tail：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT

正向引物序列为：

Primer X：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGCCATGCCAAAGCTAAA

Primer Y：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGCCATGCCAAAGCTAAC

3)荧光检测：若只检测到引物Specific-allele X所连荧光序列对应的荧光信号，则待测水稻为不含抗倒伏基因SCM2，若只检测到引物Specific-allele Y所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测水稻含抗倒伏基因SCM2，若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带SCM2基因的杂合型，选择检测到引物Specific-allele X所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。

携有SCM2的近等基因系具有茎秆强度增强、穗数增加的表型，与该基因的过量表达突变体APO1相比无异常表型。实验证实，SCM2基因型水稻材料基因相对表达水平是scm2基因型的2-3倍；而SCM2过量表达突变体APO1基因相对表达量是SCM2的数十倍，过量表达会引起水稻穗发育畸形。只有SCM2基因处于中等表达水平时植株茎秆较粗、茎秆机械强度较大，植株表现出抗倒伏。因此，针对基因表达调控序列1.5Kb左右启动子区域和1.5Kb左右3’-UTR区域进行PCR平行测序，序列分析结果显示：多个连锁遗传位点可将测试抗性材料和敏感材料区分开，并表现出籼-粳分化的特征，亦可用于籼粳稻种质资源鉴定。

本发明从上述多个连锁遗传的SNP位点，选择其中一个SNP变异位点开发分子标记，即分子标记K_06g_SCM2-1，其属于基因SCM2启动子区域，位于水稻第6号染色体第27481645位碱基处，该SNP分子标记多态性为T/G，其序列如SEQ ID No.1所示，第57bp位点处的碱基为T或G，提取位点左右两侧各57bp序列，利用Batch Primer 3进行引物设计。得到用于检测SNP功能分子标记的引物组包括特异性引物Specific-allele X和Specific-allele Y，通用引物Primer Common，其中Specific-allele X为不抗倒伏基因型特异引物，Specific-allele Y为抗倒伏基因型特异引物。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供了一种用于检测粳稻抗倒伏基因SCM2的SNP功能分子标记，SNP功能分子标记位于基因内部(基因启动子区域)，检测基因型与表型紧密相关，无需复杂和较长周期的表型鉴定过程，节省了大量的人力、物力资源；该方法适用于水稻苗期、胚胎期等较早时期高通量的SCM2基因鉴定及分子辅助选择育种，大大的的降低人力成本、缩短育种周期长等优点，助力大规模商业化分子育种具有广泛的应用前景。

2、本发明所开发的标记适用于KASP方法检测SNP位点，与常规凝胶电泳标记检测结果相比，该标记和方法具有检测结果准确可靠、实验操作过程安全和大幅减少人力投入，并且可以进行高通量操作，符合大规模高效商业化分子育种市场需求，如：前景选择、种质资源鉴定等。

3、本发明证实了SCM2基因在籼稻中普遍缺失，SCM2主要适用于粳稻的抗倒伏性遗传改良。同时，该标记可作为一个水稻籼-粳分化功能标记，用于水稻亚种种质资源鉴定和遗传育种等方向，将进一步提升我国北方粳稻生产品质和产量，有巨大的经济价值。本发明SNP功能分子标记适用范围广，对促进SCM2基因商业化分子育种的应用具有重要意义。

附图说明

图1为利用分子标记K_06g_SCM2-1检测自然群体基因型分型图；

图2为利用分子标记K_06g_SCM2-1检测F2分离群体基因型分型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：SNP标记K_06g_SCM2-1的自然遗传材料表型验证

选取23份自然遗传材料进行验证，包括11份较抗倒伏材料和12份倒伏敏感材料。

1、采用简化CTAB法，从粳稻叶片中提取基因组DNA。

(1)将粳稻叶片冻干或烘干，取适量叶片放入2.0mL离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；

(2)加入750μL CTAB溶液，震荡匀浆，65℃震荡温浴0.5-1h；

(3)冷却至室温，在通风橱中加入750μL氯仿︰异戊醇(24︰1)颠倒3-4次混匀；

(4)12000rmp离心10min，取上清500μL转移至新的1.5mL离心管中；

(5)加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，弃上清；

(6)加入1mL70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；

(7)加300μLH₂O，溶解备用。

2、KASP反应测试

KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入步骤1获得的粳稻基因组DNA样品(20ng/μL)1.0-1.5μL，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表1；PCR扩增在水浴热循环仪中完成，PCR条件为：94℃15min；94℃20sec，65-57℃1min，每个循环降低1℃，共10个循环；94℃20sec，57℃1min，共26个循环。

表1

反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，Specific-allele X与荧光序列FAM相连，Specific-allele Y与荧光序列VIC相连。若只检测到荧光序列VIC对应的荧光信号，则测试材料在标记K_06g_SCM2-1测试位点碱基型为G，判定其为抗倒伏材料；若只检测到荧光序列FAM对应的荧光信号，则测试材料的SCM2基因在标记K_06g_SCM2-1测试位点碱基型为T，判定其为不抗倒伏材料；若同时检测到两种荧光，则判断测试材料为携带该基因型的杂合型。荧光扫描的结果会自动转化成图形(图1)。23份测试材料标记分型结果见表2。

本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。

表2：23份自然遗传材料标记K_06g_SCM2-1测试结果

注：“R”表示植株表型为抗倒伏；“S”表示植株表型为倒伏敏感。

由表2可以看出，所检测23份材料中，含11份抗倒伏，12份倒伏敏感材料。其中，倒伏敏感材料的SCM2基因在标记K_06g_SCM2-1测试位点碱基型为T，均属于水稻粳亚种；抗性材料的SCM2基因在标记K_06g_SCM2-1测试位点碱基型为G，均属于水稻籼亚种。进一步，我们放大自然遗传群体进行测试，也获得了相同的结论(数据未展示)。证实SCM2基因广泛存在于籼稻中，在粳稻中暂未发现，说明SCM2基因仅可用于粳稻的抗倒伏性状遗传改良。初步确定了基因SCM2的SNP标记与表型具有高度关联性，判定该基因适用于粳稻抗倒伏性状遗传改良；同时，该标记可作为水稻籼-粳亚种分化的重要分子标记。

实施例2 SNP标记K_06g_SCM2-1的F2分离群体表型验证

检测供体亲本Habataki与受体亲本Sasanishiki杂交的F2分离群体单株基因型；

1、基因型鉴定方法同实施例1。80份F2分离群体单株基因型分型结果见图2。

2、选取两种纯合基因型单株进行表型鉴定，在水稻孕穗期至即将抽穗期间，去掉植株顶端叶片，测定植株茎秆的机械强度和直径，综合评价植株的抗倒伏性状。

纯合单株基因型和表型数据见表3。

表3标记K_06g_SCM2-1的F2分离群体表型鉴定结果

由表3可以看出，F2分离群体基因型纯合单株表型鉴定结果与基因型分型结果高度对应，G碱基型单株具有较强抗倒伏能力，T碱基型单株倒伏敏感，再次验证了本发明的可行性和准确性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记及应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K_06g_SCM2-1

<400> 1

gctttgctta gattgcgatt ctcaaattta atcatgaatt ctcatatatg cataccttta 60

gctttggcat ggctagcctc acatgaatta atcccttggc atctcgagta ca 112

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Specific-allele X

<400> 2

tagccatgcc aaagctaaa 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Specific-allele Y

<400> 3

tagccatgcc aaagctaac 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer Common

<400> 4

gctttgctta gattgcgatt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FAM-tail

<400> 5

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VIC-tail

<400> 6

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer X

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc ttagccatgc caaagctaaa 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer Y

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat ttagccatgc caaagctaac 40

<210> 9

<211> 1564

<212> DNA

<213> Oryza.sativa L.

<220>

<223> SCM2启动子

<400> 9

tgtactggat atactaggga tttagtgttc ttttgaaaca caaatgttga aaaaacttag 60

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atccttcaaa aagtggagga aagaaaggat tcctatgaaa attttcttga aaggaatcct 180

atgaaaattt tctaaccaaa tcattcaaac catatgtctc cctagctagg aaaattttca 240

atagtatttc aatcctacaa ctttccttta aaaacccttt gtttcaaaag agcctttaat 300

ggaggggagg ggggggcaga gagaagatgc gttggcctca ccaaacacag gatcataaaa 360

acgcatgaat gatcataaaa acacagaaat aaaaaaaaaa tacaggtttg gagtacccct 420

accacttcaa atcctatgca ggaaaactgc atgaatccgt ttagatggag cgcaggaaac 480

acacaggaat cagttcataa gagtgaaaga cacaaatgat atttttccaa taggttgtac 540

ctcatgtcaa aattcctata ctttgaacca atccaaggaa tttggtagga ttttcggatg 600

gaaatttcct ttgattcata ggaccatgta taaaaatttt ccttaggatt gagttccttc 660

aaatttctta caaacctgtc ccaaaggagc actaaaataa gatttgagct catatatagt 720

aaaaaaaatt tccaatggaa gtgatgcata ggataacagt ccatagaaaa ttgtcatgtt 780

catatccttt gttccaaaac acactagata tatataggaa aaaatccttc aaaattcctt 840

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gatatttttt gaggaaatga tgaacactgt ccaacaaatt gtttaaaatc aaccactgcc 960

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gagacaaacc aaaaccggcg ttgcgctacc cagacaacaa caacaacatg tcaacaactg 1080

ctactctact ccatatccaa tcctttcccc tctcaaattt aattacgcaa gaacacacag 1140

tccatcgata tccatcatcc atttatataa ctgttgcttt gcttagattg cgattctcaa 1200

atttaatcat gaattctcat atatgcatac cgttagcttt ggcatggcta gcctcacatg 1260

aattaatccc ttggcatctc gagtacaagc tagtaccaca gtttcactat catttgctcg 1320

cagctgccac ttcacagctg cctcactcca ctccacttca cccttgaaaa ttttcagctc 1380

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gctgccgcct ctgccgtcgt cgacgtcgtc cgcctcggca gcggacgaca tggacccgcg 1500

cgtgtggcgc cggctgccgc agccgctggt ggaccgcgtc ctggcgtgcc tcccgacgcc 1560

gtcg 1564

<210> 10

<211> 1557

<212> DNA

<213> Oryza.sativa L.

<220>

<223> scm2启动子

<400> 10

tgtactggat atactaggga tttagtgttc ttttgaaaca caaatgttga aaaaacttag 60

ggatatgcat tgagcttctg aaaggaaatc aaaaccatga ggtttgagct tatgtttgaa 120

atccttcaaa aagtggagga aagaaaggat tcctatgaaa attttcttga aaggaatcct 180

atgaaaattt tctaaccaaa tcattcaaac catatgtctc cctagctagg aaaattttca 240

atagtatttc aatcctacaa ctttccttta aaaacccttt gtttcaaaag agcctttaat 300

ggaggggagg gggggggggg cagagagaag atgcgttggc ctcaccaaac acaggatcat 360

aaaaacgcat gaatgatcat aaaaacacag aaatagaaaa aaaaatacag gtttggagta 420

cccctaccac ttcaaatcct atgcaggaaa actgcatgaa tccgtttaga tggagcgcag 480

gaaacacaca ggaatcagtt cataagagtg aaagacacaa atgatatttt tccaataggt 540

tgtacctcat gtcaaaattc ctatactttg aaccaatcca aggaatttgg taggattttc 600

ggatggaaat ttcctttgat tcataggacc atgtataaaa attttcctta ggattgagtt 660

ccttcaaatt tcttacaaac ctgtcccaaa ggagcactaa aataagattt gagctcatat 720

atagtaaaaa aaatttccaa tggaagtgat gcatatgata acagtccata gaaaattgtc 780

atgttcatat cctttgttcc aaaacacact agatatatat aggaaaaaat ccttcaaaat 840

tcctttgtgg gctcctttgg aacaatgtcc aacactttca aaggaatttt aaagaaaaat 900

ccgaagatat tttttgagga aatgatgaac actgtccaac aaattgttta aaatcaacca 960

ctgccgtgtg caaaaaataa aaataaaaat gcatagaata acagatcaga gctgagacaa 1020

accaaaaccg gcgttgcgct acccagacaa caacaacaac atgtcaacaa ctgctactct 1080

actccatatc caatcctttc ccctctcaaa tttaattacg caagaacaca cagtccatcg 1140

atatccatca tccatttata taactgttgc tttgcttaga ttgcgattct caaatttaat 1200

catgaattct catatatgca tacctttagc tttggcatgg ctagcctcac atgaattaat 1260

cccttggcat ctcgagtaca agctagtacc acagtttcac tatcatttga tcgcagctgc 1320

cgcttcacag ctgcctcact ccactccact tcacccttga aaattttcag ctcacgcagc 1380

tgcagctgac gacgccgcgc gccgacgacg acgaccatga tgaaccctcg ccggctgccg 1440

cctctgccgt cgtcgacgtc gtccgcctcg gcagcggacg acatggaccc gcgcgtgtgg 1500

cgccggctgc cgcagccgct ggtggaccgc atcctggcgt gcctcccgac gccgtcg 1557

<210> 11

<211> 1406

<212> DNA

<213> Oryza.sativa L.

<220>

<223> SCM2的3’-UTR

<400> 11

tgtgcttttt tgtgcatgct gcctgcatca actaatcaat ttgttatggc ctagggcatg 60

catacacatg ttcatgagca agctaggttt gtggtgtatt aaagttgttt cagcaatggg 120

gatcatatgt taatttctta tgagcaatta agtgtgttat atgataggtt aggtatgaga 180

attagcatga ttctagctag tagtatgtgc aagttagtag tatgtactag gtagcttaat 240

taattaatta ggttgtattt gtcatctgag ttggtagtgt gctagattga cagtggtctg 300

aactctgaag tggtttcatc tctgttaatt cagaaaacac taataattca gaaaacctac 360

tgaagggttt ctactcaaca actactacta ctttgatctt gccatgagat ctgttgaaga 420

atattcatgc atgtgatttt ctgaagagtg ttgatttaga tggtttatca tgatcacatg 480

aagcctacaa cagtatgtga tcatttgagt atgatcttct ggccagcatg actttgtctg 540

ttgaatccac ctcagatcgg tatatagttt ctcagtttgg atatgcattt ctttcatata 600

tttgcttaat attcacacat acttatgtgt gtggttgcat ctttcttgtg agtgaaatta 660

gtacgacctc tattaaataa agctagatac tctgaaaaag taagatgccc aaacttagtt 720

tatgtagcgc ccttggtcga tcaaatttta tggccaatct tttttttttc ttttgcaagc 780

ttactctagc tagaattgta ctcctaacat agacattgta tatatgtaaa catagttttc 840

ccgatcgatc gagttgttga ttcagtatat catgcatctc tggggaagca gtaacaagca 900

ccagagatat ggtggttcag atctttagcc acccccaacc aggttctaat cacatccatt 960

taattttaaa aatcatgtgt aagtaatata ctgctagtat atatagtatg ttctaaagat 1020

ctcaatagga ttgtagaaat cccaaaggaa ctaaactgca aaacatgcta cgaactgatt 1080

attacagtca tttggaacac actacgaagt gatcatgcat gcatgcatga aactgatgaa 1140

agtaacttgt gtatatttca gcagactctg aataaaagag catatgtgtt tcagaaccat 1200

gaaattgtac gtcttctgtt tttctgttgc aaagtatgac ttcactagct tgtagagtat 1260

actccatcgc actaactatc aaattgcatt ttgacatata accatccagt agcaaatatc 1320

tactgtacta tatatcttca gatactggac gcactagtga ataaattttc ggagaatata 1380

tctaacatac gtaccatctg gtccta 1406

<210> 12

<211> 1406

<212> DNA

<213> Oryza.sativa L.

<220>

<223> scm2的3’-UTR

<400> 12

tgtgcttttt tgtgcatgct gcctgcatca actaatcaat ttgttatggc ctagggcatg 60

catacacatg ttcatgagca agctaggttt gtggtgtatt aaagttgttt cagcaatggg 120

gatcatatgt taatttctta tgagcaatta agtgtgttat atgataggtt aggtatgaga 180

attagcatga ttctagctag tagtatgtgc aagttagtag tatgtactag gtagcttaat 240

taattaatta ggttgtattt gtcatctgag ttggtagtgt gctagattga cagtggtctg 300

aactctgaag tggtttcatc tctgttaatt cagaaaacac taataattca gaaaacctac 360

tgaagggttt ctactcaaca actactacta ctttgatctt gccatgagat ctgttgaaga 420

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aagcctacaa cagtatgtga tcatttgagt atgatcttct ggccagcatg actttgtctg 540

ttgaatccac ctcagatcgg tatatagttt ctcagtttgg atatgcattt cttccatata 600

tttgcttaat attcacacat acttatgtgt gtagttgcat ctttcttgtg agtgaaatta 660

gtacgacctc tattaaataa agctagatac tctgaaaaag taagatgccc aaacttagtt 720

tatgtagcgc ccttggtcga tcaaatttta tggccaatct tttttttttc ttttgcaagc 780

ttactctagc tagaattgta ctcctaacat agacattgta tatatgtaaa catagttttc 840

ccgatcgatc gagttgttga ttcagtatat catgcatctc tggggaagca gtaacaagca 900

ccagagatat ggtggttcag atctttagcc acccccaacc aggttctaat cacatccatt 960

taattttaaa aatcatgtgt aagtaatata ctgctagtat atatagtatg ttctaaagat 1020

ctcaatagga ttgtagaaat cccaaaggaa ctaaactgca aaacatgcta cgcactgatt 1080

attacagtca tttggaacac actacgaagt gatcatgcat gcatgcatga aactgatgaa 1140

agtaacttgt gtatatttca gcagactctg aataaaagag catatgtgtt tcagaaccat 1200

gaaattgtac gtcttctgtt tttctgttgc aaagtatgac ttcactagct tgtagagtat 1260

actccatcgc actaactatc aaattgcatt ttgacatata accatccagt agcaaatatc 1320

ttctgtacta tatatcttca gatactggac gcactagtga ataaattttc ggagaatata 1380

tctaacatac gtaccatctg gtccta 1406

Claims

1.一种用于检测粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括

特异性引物序列为：

Specific-allele X：TAGCCATGCCAAAGCTAAA；

Specific-allele Y：TAGCCATGCCAAAGCTAAC；

通用引物序列为：

Primer Common：GCTTTGCTTAGATTGCGATT；

所述抗倒伏基因为SCM2，所述SNP功能分子标记为K_06g_SCM2-1，位于水稻第6号染色体第27481645位碱基处，属于基因SCM2启动子区域，该SNP分子标记多态性为T/G，其序列如SEQ ID No.1所示，第57bp位点处的碱基为T或G。

2.一种包含权利要求1所述引物组的试剂或试剂盒。

3.一种如权利要求1所述粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记的引物组的应用，其特征在于，

包括以下步骤：

1）基因组提取：采用简化CTAB法，从水稻叶片中提取基因组DNA，首先将水稻叶片冻干或烘干，取适量叶片放入2.0mL离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；再加入750µL CTAB溶液，震荡匀浆，65℃震荡温浴0.5-1h；冷却至室温，在通风橱中加入750µL氯仿与异戊醇的混合溶液颠倒3-4次混匀，所述氯仿与异戊醇的体积比为24︰1；12000rmp离心10min，取上清500µL转移至新的1.5mL离心管中；加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，弃上清；加入1mL70%乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；加300µL H₂O，溶解备用；

2）KASP反应：以步骤1）获得的水稻基因组DNA为模板，利用荧光特异性引物进行PCR反应，所述荧光特异性引物的正向引物由权利要求1所述的特异性引物并在其5’端分别连接不同荧光标签序列而得到，反向引物为权利要求1所述的通用引物；

3）荧光检测：若只检测到引物Specific-allele X所连荧光序列对应的荧光信号，基因型为T，则待测水稻不含抗倒伏基因SCM2；若只检测到引物Specific-allele Y所连荧光序列对应的荧光信号，基因型为G，则判定待测水稻含抗倒伏基因SCM2；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带SCM2基因的杂合型，选择检测到引物Specific-allele X所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。

4.根据权利要求3所述粳稻抗倒伏基因的SNP功能分子标记的引物组的应用，其特征在于，

所述荧光标签序列为：

FAM-tail: GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；

VIC-tail: GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；

所述正向引物序列为：

Primer X： GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGCCATGCCAAAGCTAAA；

Primer Y： GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGCCATGCCAAAGCTAAC。