JP7354306B2 - 新規ｉｃｏｓ抗体及びそれらを含む腫瘍標的化抗原結合分子 - Google Patents

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Description

本発明は、新規ＩＣＯＳ抗体及びそれらを含む腫瘍標的化アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、並びにがんの処置における免疫調節剤としてのそれらの使用に関する。
免疫阻害経路の調節は、がん処置における最近の大きなブレークスルーである。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４、ＹＥＲＶＯＹ／イピリムマブ）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＯＰＤＩＶＯ／ニボルマブ又はＫＥＹＴＲＵＤＡ／ペンブロリズマブ）、それぞれのＰＤ－Ｌ１（アテゾリズマブ）を標的とするチェックポイント遮断抗体は、様々な腫瘍適応症の患者において許容される毒性、有望な臨床応答、永続的な疾患制御、及び改善された生存を実証した。しかしながら、免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）療法に対する永続的応答を経験する患者はごく少数であり、残りの患者は一次耐性又は二次耐性を示し、より多くの患者に生存利益を提供するために追加の経路を調節する明確な必要性を示している。したがって、治療上の利益を改善するために、併用戦略が必要である。
ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）は、誘導可能なＴ細胞共刺激因子であり、Ｂ７／ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４免疫グロブリンスーパーファミリーに属する（Ｈｕｔｌｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９９，３９７）。その発現は主にＴ細胞に限定され、ＮＫ細胞上では発現が弱いようである（Ｏｇａｓａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，１６９及びＮＫ細胞を使用した未公開の独自データ）。Ｔ細胞上に構成的に発現されるＣＤ２８とは異なり、ＩＣＯＳは、ナイーブＴＨ１及びＴＨ２エフェクターＴ細胞集団（Ｐａｕｌｏｓ ＣＭ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１０，２）上ではほとんど発現されないが、静止期ＴＨ１７細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上では発現される。しかしながら、ＩＣＯＳは、以前の抗原プライミング、それぞれのＴＣＲ／ＣＤ３係合時に全てのＴ細胞サブセットで強く誘導される（Ｗａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１３，１１０）。
ＩＣＯＳ経路を介したシグナル伝達は、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞及びＴＮＦ－αで処理された非免疫細胞上に発現されるそのリガンド、いわゆるＩＣＯＳ－Ｌ（Ｂ７ｈ、Ｂ７ＲＰ－１、ＣＤ２７５）の結合時に起こる（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１０，２２）。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４のリガンドであるＢ７－１もＢ７－２も、ＩＣＯＳに結合することも活性化することもできない。それにもかかわらず、ＩＣＯＳ－Ｌは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４の両方に弱く結合することが示されている（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１１，３４）。活性化すると、ジスルフィド結合ホモ二量体であるＩＣＯＳは、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路を介してシグナルを誘導する。ＣＤ２８とは対照的に、ＩＣＯＳは、ユニークなＹＭＦＭ ＳＨ２結合モチーフを有し、これは、ＣＤ２８によって動員されるアイソフォームと比較して脂質キナーゼ活性が上昇したＰＩ３Ｋバリアントを動員する。結果として、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）－三リン酸のより大きな産生及びＡＫＴシグナル伝達の付随する増加を観察することができ、Ｔ細胞生存におけるＩＣＯＳの重要な役割を示唆している（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１０，２２）。
Ｓｈａｒｐｅ（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２００９，２２９）によって概説されるように、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳリガンド経路は、エフェクターＴ細胞応答、Ｔ依存性Ｂ細胞応答を刺激すること、及びＩＬ－１０産生Ｔｒｅｇを制御することによってＴ細胞寛容を調節することにおいて重要な役割を有する。さらに、ＩＣＯＳは、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体５（ＣＸＣＲ５）＋濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）、胚中心反応及び体液性免疫を調節する独特のＴ細胞サブセットの生成に重要である。ＩＣＯＳ欠損マウスにおける最近の研究は、ＩＣＯＳがインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）産生を調節することができ、これが次にＴヘルパー（Ｔｈ）１７型（ＴＨ１７）細胞及びＴＦＨの増殖を調節することを示している。これに関連して、ＩＣＯＳは、ＣＤ４ Ｔ細胞をＴＨ１様ＴＨ１７表現型に二極化することが記載されており、これは、黒色腫、初期卵巣がん等を含むいくつかのがん適応症における患者の生存率の改善と相関することが示されているＲｉｔａ Ｙｏｕｎｇ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６，７）。
ＩＣＯＳ欠損マウスは、胚中心形成の障害を示し、ＩＬ－１０及びＩＬ－１７の産生の減少を示し、これらは、糖尿病（ＴＨ１）、気道炎症（ＴＨ２）及びＥＡＥ神経炎症モデル（ＴＨ１７）等の様々な疾患モデルにおける自己免疫表現型の発達障害において明らかになる（Ｗａｒｎａｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００６）。これと一致して、変異したＩＣＯＳを有するヒトの一般的な可変免疫不全患者は、著しい低ガンマグロブリン血症及び乱れたＢ細胞恒常性を示す（Ｓｈａｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２００９，２２９）。ＩＣＯＳ受容体を介した効率的な共刺激シグナル伝達は、同時ＴＣＲ活性化シグナルを受け取るＴ細胞でのみ起こることに留意することは重要である（Ｗａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１３，１１０）。
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子は、対応するＴ細胞受容体によるＭＨＣＩペプチドの認識の必要性を回避するが、細胞表面腫瘍関連抗原に対するポリクローナルＴ細胞応答を可能にすることから（Ｙｕｒａｓｚｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１７，１０１）、魅力的な免疫細胞エンゲージャー（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）である。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体であるＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、がんに対する免疫系に関与する治験中の免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｔ細胞二重特異性抗体である。ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、ＣＲＣ（結腸直腸がん）、ＧＣ（胃がん）、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん）及びＢＣ（乳がん）を含む様々ながん細胞によって発現される、Ｔ細胞上のヒトＣＤ３ε及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）への同時結合によってＴ細胞を腫瘍細胞に再指向するように設計されている。Ｔ細胞及び腫瘍細胞の架橋は、ＣＤ３／ＴＣＲの下流シグナル伝達をもたらし、免疫シナプスの形成、Ｔ細胞活性化、細胞傷害性顆粒及び他のサイトカインの分泌をもたらし、最終的には腫瘍細胞の用量及び時間依存性溶解をもたらす。さらに、ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、Ｔ細胞浸潤を増加させ、高度に炎症を起こした腫瘍微小環境を生成することが提案されており、免疫チェックポイント遮断療法（ＩＣＢ）、特に十分な内因性の適応性及び機能性免疫浸潤を欠くためにＩＣＢに対する一次耐性を示す腫瘍の理想的な組合せパートナーになる。しかしながら、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における機能不全Ｔ細胞上の４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ及びＯＸ４０等のいくつかの共刺激受容体の逆説的な発現を考えると、Ｔ細胞上の単一又は複数の阻害経路を遮断することによるブレーキの解除は十分ではないかもしれない。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、すなわちＣＥＡ ＴＣＢを腫瘍標的化アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子と組み合わせると、より良好な抗腫瘍効果が達成されることが見出された。Ｔ細胞二重特異性抗体は、初期ＴＣＲ活性化シグナル伝達をＴ細胞に提供し、次いで、腫瘍標的アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子との組合せは、抗腫瘍Ｔ細胞免疫の更なる増強をもたらす。
ＩＣＯＳに関して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞上のＣＤ２７８を係合させることが抗腫瘍能を有するという考えを実際に裏付ける文献が増えている。ＩＣＯＳ－ＩＣＯＳ－Ｌシグナル伝達の活性化は、いくつかの同系マウスモデルにおいて、単剤療法として、並びに抗ＣＬＴＡ４処置の状況において、有効な抗腫瘍応答を誘導し、ＩＣＯＳ下流シグナル伝達の活性化は、抗ＣＴＬＡ４療法の有効性を有意に増加させた（Ｆｕ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１，７１ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開第２０１１／０４１６１３号Ａ２，２００９）。抗ＣＴＬＡ４抗体で処置された患者からの新たなデータはまた、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞上のＩＣＯＳ発現の持続的な上昇レベルと、例えば転移性黒色腫、尿路上皮がん、乳がん又は前立腺がんを有する腫瘍患者の全生存率の改善との相関関係を示している（Ｇｉａｃｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３，６２；Ｃａｒｔｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，１６；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，１６；Ｌｉａｋｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８，１０５ ａｎｄ Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，１６）。したがって、ＩＣＯＳ陽性Ｔエフェクター細胞は、イピリムマブ応答の陽性予測バイオマーカーとして見られる。ヒト化抗ＩＣＯＳ ＩｇＧ１抗体ＪＴＸ ２０１１（ボプラテリマブ）が、進行した非小細胞肺がん又は尿路上皮がんを有する患者において現在試験されている。その作用機序はＦｃγ架橋に依存する。最近、アテゾリズマブと組み合わせた完全ヒト抗ＩＣＯＳ ＩｇＧ４抗体であるＫＹ１０４４の臨床試験が開始された（ＮＣＴ０３８２９５０１）。しかしながら、疾患、特にがんを処置するための他の治療剤との併用処置に特に適したアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が依然として必要とされている。
本発明は、新規ＩＣＯＳ抗体、並びに腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、当該新規ＩＣＯＳ抗体を含むＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子に関する。本発明はまた、これらの新たなアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、及び他の治療剤、特にＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた、特にがんの処置又は進行の遅延における使用のためのそれらの使用に関する。本明細書中に記載される併用療法は、抗ＣＤ３二重特異性抗体単独での処置よりも、初期Ｔ細胞活性化の誘導、Ｔ細胞増殖、Ｔメモリー細胞の誘導、並びに最終的には腫瘍成長の強力な阻害及び腫瘍細胞の排除においてより効果的であることが見出されている。
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。
更なる態様では、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む、上に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。特に、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書において先に定義した腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。
一態様では、上に定義される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインである、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。一態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特定の一態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
別の態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、上に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特に、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
更なる態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインである、請求項１～３のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。一態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。特定の一態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
別の態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、該ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。特定の態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。更なる態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
さらに、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
したがって、一態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、マウス免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、配列１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。特に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、マウス免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ウサギ免疫に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。一態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。別の態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。更に別の態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。
一態様では、本発明は、本明細書において前に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。特に、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書において前に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。特に、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
特定の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインはクロスＦａｂ断片である。
更なる態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体であって、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子、特に抗体が提供される。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体は、マウス免疫化に由来し、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。別の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体は、ウサギ免疫に由来し、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）と、を含む。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体が提供される。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は全長抗体である。別の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子はＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である。特定の態様において、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子はヒト化抗体である。
本発明の別の態様によれば、本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原又はＩＣＯＳ抗体への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子をコードする単離核酸が提供される。本発明は更に、ベクター、特に、本発明の単離核酸と、単離核酸又は本発明のベクターを含む宿主細胞とを含むベクターを提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
別の態様では、本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を製造する方法であって、本発明の宿主細胞をアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及び宿主細胞から抗原結合分子を回収する工程を含む、方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって製造される本明細書に記載の腫瘍関連抗原又はＩＣＯＳ抗体への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を包含する。
本発明は更に、本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。特に、医薬組成物は、がんの処置に使用するためのものである。
医薬として使用するための、本明細書中で先記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子又は腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を含む医薬組成物も本発明に包含される。
一態様では、以下において使用するための、本明細書中で先記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子又は腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を含む医薬組成物が提供される：
（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生残の支持、
（ｉｉｉ）感染の処置、
（ｉｖ）がんの処置、
（ｖ）がんの進行の遅延、又は
（ｖｉ）がんを患う患者の生存の延長。
具体的な態様では、がんの処置に使用するための、本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子又は本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を含む医薬組成物が提供される。
別の具体的な態様では、本発明は、がんの処置に使用するための本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法において使用するための他の薬剤との組合せでの投与のためのものである、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。
一態様では、がんの処置に使用するための、本明細書に記載の腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。特に、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
更なる態様では、がんの処置に使用するための本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与するためのものである、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より特定的には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペムブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブである。
更なる態様では、本発明は、個体において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、有効量の、本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子又は本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を含む医薬組成物を個体に投与して、腫瘍細胞の成長を阻害することを含む、方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体においてがんを処置する方法であって、本明細書中で先に記載される腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む有効量のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を個体に投与することを含む、方法を提供する。
疾患の処置を必要とする個体における疾患の処置のための医薬の製造のための、特にがんの処置のための医薬の製造のための、本明細書において先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子の使用もまた提供される。上記態様のいずれかにおいて、個体は哺乳動物、特にヒトである。
二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子の概略図。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、１＋１フォーマットの異なるタイプのＦＡＰ－ＩＣＯＳ二重特異性抗体が示される（１＋１は、ＩＣＯＳ並びにＦＡＰに対する一価結合を意味する）。図１Ｂに示すフォーマットは、１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌとも呼ばれる。ＦＡＰのＶＨドメイン及びＶＬドメインが各々、各ＦｃドメインのＣ末端に結合している、２＋１フォーマットのＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗体（腫瘍関連標的について一価）を図１Ｃに示し、図１Ｄ及び図１Ｅには、ＦＡＰ抗原結合ドメインを含むＦａｂドメインがＩＣＯＳ ＩｇＧのＦａｂドメインに融合されている（図１Ｄ）か、又はＩＣＯＳ Ｆａｂドメインの１つがＦＡＰ ＦａｂドメインのＮ末端に融合されている（逆位、図１Ｅ）２つの異なるタイプの２＋１フォーマットを示す。１＋１フォーマットの異なるタイプのＣＥＡ－ＩＣＯＳ二重特異性抗体を図１Ｆ、図１Ｇ及び図１Ｈに示す。 ＣＨＯ－ｈｕＩＣＯＳ細胞又はＳＲ細胞上に発現されたＩＣＯＳへのＩｇＧ対ＪＭａｂ１３６ ＩｇＧ（分子１）として選択された全ての親リードクローンの結合。図２Ａは、組換えＣＨＯ細胞上のヒトＩＣＯＳに対するＩＣＯＳ抗体の用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。図２Ｂは、ＳＲ細胞上のヒトＩＣＯＳに対するＩＣＯＳ抗体の用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。試験したクローンは、ＩＣＯＳ（００９）（分子１４）、ＩＣＯＳ １１３８（分子１８）、１１４３（分子２０）及び１１６７（分子８）である。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 それぞれヒトＩＣＯＳに対するリードクローン００９ｖ１、１１４３ｖ２及び１１３８の選択されたヒト化バリアントの結合。組換えＣＨＯ細胞上のヒトＩＣＯＳに対する３つの異なるａＩＣＯＳ分子についてのヒト化バリアントの用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 選択された全ての親リードクローンのＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴアッセイからの用量応答曲線をＩｇＧ対ＪＭａｂ１３６として示す。 それぞれリードクローン００９ｖ１、１１４３ｖ２及び１１３８（ＩｇＧとして）のヒト化バリアントについてのＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーターアッセイからの用量応答曲線。３つの異なるａＩＣＯＳ分子について漸増用量のヒト化バリアントで処理したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞の用量依存的活性化についての１秒あたりのカウント（ＣＰＳ）を示す用量応答曲線を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 ｈｕ ＩＣＯＳへの二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。図６Ａは、組換えＣＨＯにおけるＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のヒトＩＣＯＳへの用量依存的な結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。異なるＩＣＯＳクローン００９ｖ１（分子１５）、１１３８（分子１９）、１１４３ｖ２（分子２２）及び１１６７（分子９）を有する２＋１フォーマットの二重特異性抗体を比較する。図６Ｂは、組換えＣＨＯ細胞におけるＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のヒトＩＣＯＳへの用量依存的な結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。以下のＩＣＯＳクローン１１６７を含む異なるフォーマットを比較する：分子９（２＋１、図１Ｃを参照されたい）、分子１０（１＋１、図１Ａを参照されたい）及び分子１１（１＋１＿ＨＴ、図１Ｂを参照されたい）。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 ｈｕ ＦＡＰ（ＮＩＨ３Ｔ３－ｈＦＡＰ）への二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。図７Ａは、組換え３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞におけるＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のヒトＦＡＰへの用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。異なるＩＣＯＳクローン００９ｖ１（分子１５）、１１３８（分子１９）、１１４３ｖ２（分子２２）及び１１６７（分子９）を有する２＋１フォーマットの二重特異性抗体を比較する。図７Ｂは、組換え３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞におけるＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のヒトＦＡＰへの用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。以下のＩＣＯＳクローン１１６７を含む異なるフォーマットを比較する：分子９（２＋１、図１Ｃを参照されたい）、分子１０（１＋１、図１Ａを参照されたい）及び分子１１（１＋１＿ＨＴ、図１Ｂを参照されたい）。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 活性化ＰＢＭＣ上のカニクイザルＩＣＯＳへの二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。異なるＩＣＯＳクローン００９ｖ１（分子１５）、１１３８（分子１９）、１１４３ｖ２（分子２２）、１１６７（分子９）及びＪＭａｂ１３６（分子２）を含むＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。図８Ａ及び８Ｂは、それぞれＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットに対する結合を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。図８Ｃ及び８Ｄ：活性化ＰＢＭＣ上のカニクイザルＩＣＯＳへの二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。ＩＣＯＳクローン１１６７を含む異なるフォーマットを含むＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線が示される：分子９（２＋１、図１Ｃを参照されたい）、分子１０（１＋１、図１Ａを参照されたい）及び分子１１（１＋１＿ＨＴ）。図８Ｃ及び８Ｄは、それぞれＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットに対する結合を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 組換えＣＨＯ細胞上のマウスＩＣＯＳへの二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。図９Ａには、ＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のマウスＩＣＯＳへの用量依存的結合についてのＩＣＯＳ＋細胞の頻度（％）を示す用量応答曲線が示される。図９Ｂは、マウスＦＡＰに対するＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の用量依存的結合についてのＩＣＯＳ＋細胞の頻度（％）を示す用量応答曲線を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。ＩＣＯＳクローン１１６７を含む異なるフォーマットを有するＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子についてのデータを提供する。分子９（２＋１、図１Ｃを参照されたい）、分子１０（１＋１、図１Ａを参照されたい）及び分子１１（１＋１＿ＨＴ）。 ヒトＩＣＯＳ（予め活性化したＰＢＭＣ）及びヒトＦＡＰ（ＮＩＨ ３Ｔ３－ｈＦＡＰ）に対するクローン１１６７を含む二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。図１Ａ（分子１０）、図１Ｄ（分子１２）及び図１Ｅ（分子１３）のフォーマットのデータを示す。図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれＣＤ４＋及びＣＤ８＋のサブセットについての活性化ＰＢＭＣ上のヒトＩＣＯＳに対するＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の用量依存的結合を示す。図１０Ｃは、組換え３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞におけるＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のヒトＦＡＰへの用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 ヒトＩＣＯＳ（ヒトＰＢＭＣのＣＤ４及びＣＤ８サブセット）及びヒトＣＥＡ（ＭＫＮ－４５）への二重特異性ＣＥＡ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合。ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＩＣＯＳ（１１６７）１＋１（分子４１）、ＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＩＣＯＳ（Ｈ００９ｖ１＿２）（分子４２）及びＣＥＡ（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）－ＩＣＯＳ（１１４３ｖ２＿１）（分子４３）についてのデータを示す。図１１Ａ及び１１Ｂは、活性化ＰＢＭＣ（それぞれＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセット）上のヒトＩＣＯＳへのＣＥＡ－ＩＣＯＳ分子の用量依存的結合について、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。図１１Ｃは、ＭＫＮ－４５細胞上のＣＥＡ－ＩＣＯＳ分子のヒトＣＥＡへの用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す用量応答曲線を示す。グラフは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。 二重特異性フォーマットのリードバインダーの生殖細胞系列バリアントの選択。クローン００９及びクローン１１４３の異なる生殖細胞系列バリアントを、２＋１フォーマットの二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗体として試験した（図１Ｃ）。図１２Ａは、ＳＲ細胞上に発現されたＩＣＯＳに対する分子の結合を示し、用量応答曲線は、ＳＲ細胞上のヒトＩＣＯＳに対するＩＣＯＳ抗体の用量依存的結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を表す。図１２１Ｂは、ヒトＦＡＰ（ＮＩＨ３Ｔ３－ｈＦＡＰ）に対する二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合を示す。用量応答曲線は、組換え３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞におけるヒトＦＡＰへの用量依存的な結合についての蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を表す。図１２Ｃは、一次ＰＭＢＣアッセイにおけるリードクローンの生殖細胞系列バリアントの選択を示す。各ドットは個々のドナーを表す。値は、濃度範囲にわたるＣＤ４＋Ｔ細胞上のＭＦＩ ＣＤ６９の最大値を示す。 二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の存在下におけるＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増大。５ｐＭのＭＣＳＰ ＴＣＢの存在下、及び漸増濃度のＦＡＰ－ＩＣＯＳの存在下、５：１のＥ：ＴでのヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＶ３腫瘍細胞の共インキュベーションの４８時間後の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）ＣＤ２５陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。グラフは、各分子について３人のドナーの最大応答を示す。図１３Ａは、異なるＩＣＯＳクローンの比較を示す。図１３Ｂは、クローン１１６７を含む異なるフォーマットの比較を示す。 二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の存在下におけるＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増大。ヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ－４５腫瘍細胞及びＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９線維芽細胞を、漸増濃度のＦＡＰ－ＩＣＯＳの存在下、８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢの存在下、５：１：１のＥ：Ｔで４８時間共インキュベートした後の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。図１４Ａ及び１４Ｂは、２人のドナーの用量反応グラフを示す。ドットは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。図１４Ｃは、各分子に対する２人のドナーの最大応答を示す。各ドットは、技術的三連の平均を表す。 ＦＡＰ－ＩＣＯＳと比較して、二重特異性ＣＥＡ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の存在下でのＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増加。ヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ－４５腫瘍細胞及びＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９線維芽細胞を、８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢ及び漸増濃度のＦＡＰ－ＩＣＯＳの存在下で、５：１：１のＥ：Ｔで４８時間共インキュベートした後の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。図１５Ａ及び１５Ｂは、２人のドナーの用量反応グラフを示す。ドットは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。図１５Ｃ：グラフは、各分子に対する２人のドナーの最大応答を示す。各ドットは、技術的三連の平均を表す。 二重特異性ＣＥＡ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の存在下におけるＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増大。ヒトＰＢＭＣエフェクター、ＭＫＮ－４５腫瘍細胞及びＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９線維芽細胞を、８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢ及び漸増濃度のＣＥＡ－ＩＣＯＳの存在下で、５：１：１のＥ：Ｔで４８時間共インキュベートした後の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。図１６Ａ及び１６Ｂは、２人のドナーの用量反応グラフを示す。ドットは技術的三連の平均を示し、エラーバーはＳＤを示す。図１６Ｃ：グラフは、各分子に対する３人のドナーの最大応答を示す。各ドットは、技術的三連の平均を表す。 ＮＳＧマウスにおける単回注射後の（異なる形フォーマットの）ＩＣＯＳクローン１１６７を含む二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子の３つの薬物動態学的プロファイル（実施例９．１） ヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢと組み合わせた３つの二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗原結合分子を用いた有効性試験の試験計画及び処置群（実施例９．２）。 同じ用量のヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片における異なるフォーマットのＦＡＰ－ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢの組合せによる有効性研究。平均腫瘍体積（図１９Ｆ）又はｙ軸にプロットした個々のマウスにおける腫瘍の成長（図１９Ａ～１９Ｅ）を示す。個々のマウスについてプロットした５０日目の腫瘍重量を図１９Ｇに要約する。全てのＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の存在下において、ＴＣＢ媒介性の腫瘍退縮が増大していることが分かる。 同じ用量のヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片における異なるフォーマットのＦＡＰ－ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢの組合せによる有効性研究。腫瘍及び脾臓におけるＩｍｍｕｎｏＰＤデータを示す。 異なる用量のヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片における１＋１フォーマットのＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子及びＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢの組合せを用いた用量応答研究。平均腫瘍体積（図２１Ｆ）又はｙ軸にプロットした個々のマウスにおける腫瘍の成長（図２１Ａ～２１Ｅ）を示す。個々のマウスについてプロットした５０日目の腫瘍重量を図２１Ｇに要約する。最低用量のＦＡＰ－ＩＣＯＳの存在下では、ＴＣＢ媒介性の腫瘍退縮が増大していることが分かる。 異なる用量のヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片における、１＋１フォーマットのＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子とのＦＡＰ－ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢの組合せを用いた用量応答研究。腫瘍及び脾臓におけるＩｍｍｕｎｏＰＤデータを示す。 サイトカイン分析：ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＭＫＮ４５及び３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞の同時移植モデルにおける、種々の用量のＦＡＰ－ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢとの併用療法時の選択されたケモカイン及びサイトカイン発現の腫瘍内変化。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様において、抗原結合領域は、その標的細胞抗原を介してシグナル伝達を活性化することが可能である。特定の態様において、抗原結合ドメインは、標的部位、例えば、特定の種類の腫瘍細胞、又は抗原決定基を有する腫瘍間質に結合する構成要素（例えばＩＣＯＳアゴニスト）を指令することができる。標的細胞抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される抗体及びその断片を含む。更に、標的細胞抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）を含む。
抗体又はその断片に関連して、用語「標的細胞抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む分子の一部を意味する。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは例えば、１つ以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により、提供されることができる。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様において、「標的細胞抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はクロスＦａｂ断片でもあり得る。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体を除き、かかるバリアントは、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。
「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用する場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。
本出願の中で用いられる「－価」という用語は、１つの異なる抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内で、１つの異なる抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定の数、存在することを意味する。そのため、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗原結合分子においてそれぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明の特定の態様において、本発明に従った二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であることができる（当該抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味する）か、又は特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であることができる（このことは当該抗原決定基に対してそれぞれ、２つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する）。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプに更に分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類の１つに割り当てられてもよい。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号及び米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を含む抗体断片であり、例えば、ＥＰ ４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に説明されている。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更に、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用する場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数の場合がある）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。
「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、クロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの順序のうちの１つを有し、かつ当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。当該一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。これに加え、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の（ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及び（ｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬの順序のうちの１つを有し、ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。これに加え、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、更に安定化されるであろう。
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて連結された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で連結することができる。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６－９６）に記載されている。これに加え、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されてきた。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体β－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群より選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。更なる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８（１－２）、３１－４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性βシート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、１６０～１８０アミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２：３３７－３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号Ｂ１及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つの螺旋形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５－４６２及び欧州特許出願公開第１６４１８１８号Ａ１を参照されたい。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）、１５５６－１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９－９１７（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。更なる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４、２４０６６－２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の接着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαらせんとβターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のαらせん及びβターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９－５０３（２００３）、ＰＮＡＳ １００（４）、１７００－１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５－１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号Ａ１を参照されたい。一本鎖ドメイン抗体は、一本のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。βサンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。更なる詳細について、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５－４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号Ｂ１を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細について、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３－７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３～４のシステイン架橋を含む、２５～５０アミノ酸長の天然に存在するミクロタンパク質に由来し、ミクロタンパク質の例としては、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが挙げられる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全てに特異的に結合し、かつ相補性である領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと称する。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用する場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸で構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本発明の抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」の未処理のタンパク質、及び細胞の処理から得られるタンパク質の任意の形態を包含する。この用語は、タンパク質の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。
「特異的結合」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗原結合分子が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当該技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態において、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）である。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
本明細書で使用する場合、「腫瘍関連抗原」又はＴＡＡは、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。ある特定の実施形態では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施形態では、ＴＡＡは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される。特に、腫瘍関連抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）又は癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られている、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＦＡＰを意味する。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＦＡＰ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＦＡＰの任意の形態を包含する。この用語は、ＦＡＰの天然に存在する変異形、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＦＡＰへの特異的結合能を有する。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２５４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６０まで伸びている。Ｈｉｓタグ付ヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号２５５に示される。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号２５６）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位置２６から７６１まで伸びている。配列番号２５７は、Ｈｉｓタグ付マウスＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。配列番号２５８は、Ｈｉｓタグ付カニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸配列を示す。好ましくは、抗本発明のＦＡＰ結合分子はＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号２５９）に示されている。ＣＥＡは長らく、腫瘍関連抗原として識別されている（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１２１：４３９－４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７－２２０７，２００２）。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は主に、胃腸、呼吸、及び泌尿器管の細胞、並びに、結腸、子宮頸、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、元々上皮に存在する（Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，９（２－３）：１４５－５３，１９８８；Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２（８）：２３２９－２３３３９，１９９２）。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡ自身が存在することは、がん性細胞への形質転換を意味するものではないものの、ＣＥＡが分布していることを示している。健常な組織において、ＣＥＡは一般的に、細胞の先端面にて発現し（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（２）：６７－８１（１９９９））、血流にて抗体に接近できなくなる。健常な組織とは対照的に、ＣＥＡは、がん性細胞の全面にわたって発現する（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｓ．，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．９（２）：６７－８１（１９９９））。発現パターンのこの変化により、ＣＥＡが、がん性細胞内で抗体結合をしやすくなる。さらに、ＣＥＡの発現は、がん性細胞にて増加する。さらに、ＣＥＡの発現が増加することにより、細胞間の接着性が増加し、転移につながり得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｊ．，Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，３０（ａ Ｓｕｐｐｌ．８）：３０－６，２００３）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般に非常に高い。公開されたデータに一致して、組織サンプルにて実施した自身の分析により、その高い有症率が確認され、結腸癌腫（ＣＲＣ）において約９５％、膵がんにおいて９０％、胃がんにおいて８０％、非小細胞肺がん（ＨＥＲ３と同時発現するＮＳＣＬＣ）において６０％、及び乳がんにおいて４０％であり、小細胞肺がん及びグリア芽腫においては低い発現が確認された。
ＣＥＡは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から、直接又はリンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清ＣＥＡの濃度は、がん診断のための臨床マーカー、及び、がん、特に結腸直腸がんの再発のためのスクリーニングとして使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ Ｄ Ｍ．，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ，７：１８３－１８８，１９９２；Ｃｈａｕ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２２：１４２０－１４２９，２００４；Ｆｌａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１２（２３）：６９８５－６９８８，２００６）。
「ＦｏｌＲ１」という用語は、葉酸受容体アルファを指し、いくつかのがんにおける可能性のある予後及び治療の標的として同定されている。ＦｏｌＲ１は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＦｏｌＲ１を指す。ヒトＦｏｌＲ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５３２８（配列番号２６０）に示され、マウスＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３５８４６（配列番号２６１）のアミノ酸配列を有し、カニクイザルＦｏｌＲ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｇ７ＰＲ１４（配列番号２６２）に示されるアミノ酸配列を有する。ＦｏｌＲ１は、細胞の原形質膜上に発現されるＮ－グリコシル化タンパク質である。ＦｏｌＲ１は、葉酸及びいくつかの還元型葉酸誘導体に対して高い親和性を有し、生理学的葉酸塩である５－メチルテトラヒドロ葉酸塩の細胞内部への送達を媒介する。ＦｏｌＲ１は、卵巣がんの大部分、並びに多くの子宮がん、子宮内膜がん、膵臓がん、腎臓がん、肺がん及び乳がんで過剰発現されるが、正常組織でのＦｏｌＲ１の発現は、腎臓近位尿細管、肺の肺胞肺細胞、膀胱、精巣、脈絡叢及び甲状腺の上皮細胞の頂端膜に限定されるため、ＦｏｌＲ１指向性がん治療の望ましい標的である。最近の研究では、ＦｏｌＲ１発現がトリプルネガティブ乳がんにおいて特に高いことが同定されている（Ｎｅｃｅｌａ ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ２０１５，１０（３），ｅ０１２７１３３）。
コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られている、「黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号２６３）に示されている。ＭＣＳＰは、Ｎ結合型２８０ｋＤａ糖タンパク質成分及び細胞膜上に発現される４５０ｋＤａコンドロイチン硫酸プロテオグリカン成分からなる高グリコシル化内在性膜コンドロイチン硫酸プロテオグリカンである（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８３，２２５：３７０－３８）。ＭＣＳＰは、多くの正常細胞及び形質転換細胞においてより広く分布している。特に、ＭＣＳＰは表皮のほとんど全ての基底細胞に見られる。ＭＣＳＰは、黒色腫細胞において差次的に発現され、分析された良性母斑及び黒色腫病変部の９０％超において発現されることが見出された。ＭＣＳＰはまた、基底細胞癌腫、神経堤起源の様々な腫瘍を含む非メラニン形成細胞起源の腫瘍、及び乳癌腫において発現されることが見出されている。
原型癌遺伝子ｃ－ＥｒｂＢ－１又は受容体チロシン－プロテインキナーゼＥｒｂＢ－１という名もある、「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」という用語は、特に断りのない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＥＧＦＲを意味する。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号２６４）に示されている。癌原遺伝子「ＨＥＲ２」（ヒト上皮増殖因子受容体２）は、ヒト上皮増殖因子受容体に関連し、ある程度相同であるタンパク質チロシンキナーゼ（ｐ１８５ＨＥＲ２）をコードする。ＨＥＲ２は、この分野ではｃ－ｅｒｂＢ－２としても知られており、ラットホモログ、ｎｅｕと呼ばれることもある。ＨＥＲ２の増幅及び／又は過剰発現は、複数のヒト悪性腫瘍に関連し、ヒト乳がん及び卵巣がんの２５～３０％の進行に一体的に関与していると思われる。更に、増幅の程度は、観察された患者生存期間の中央値と逆相関している（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７－７１２（１９８９））。ヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０４６２６（バージョン２３０、配列番号２６５）に示されている。本明細書で使用される場合、「ｐ９５ＨＥＲ２」という用語は、「６１１－ＣＴＦ」又は「１００～１１５ｋＤａ ｐ９５ＨＥＲ２」としても知られるＨＥＲ２受容体タンパク質のカルボキシ末端断片（ＣＴＦ）を指す。ｐ９５ＨＥＲ２断片は、全長ＨＥＲ２分子のコドン位置６１１でのＨＥＲ２ ｍＲＮＡの翻訳開始によって細胞内で生成される（Ａｎｉｄｏ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ ２５；３２３４－４４（２００６））。これは１００～１１５ｋＤａの分子量を有し、細胞膜で発現され、そこで分子間ジスルフィド結合によって維持されるホモ二量体を形成することができる（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２９，３３１９－３１（２００９））。ヒトｐ９５ＨＥＲ２領域の例示的な配列は、配列番号２６６で与えられる。
「ＩＣＯＳ」（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）という用語は、特に明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の誘導性Ｔ細胞共刺激タンパク質を指す。ＡＩＬＩＭ又はＣＤ２７８とも呼ばれるＩＣＯＳは、ＣＤ２８スーパーファミリー（ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４細胞表面受容体ファミリー）のメンバーであり、初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞上に特異的に発現される。ＩＣＯＳはまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７を含む他のＴ細胞サブセットの発達及び機能において役割を果たす。特に、ＩＣＯＳは、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞の両方に関連するＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を共刺激する。したがって、ＩＣＯＳ ＫＯマウスは、糖尿病（Ｔｈ１）、気道炎症（Ｔｈ２）及びＥＡＥ神経炎症（Ｔｈ１７）のモデルを含む様々な疾患モデルにおいて自己免疫表現型の発達障害を示す。Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞機能の調節におけるその役割に加えて、ＩＣＯＳはまた、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を調節する。ＩＣＯＳはＴｒｅｇ上で高レベルで発現され、Ｔｒｅｇホメオスタシス及び機能に関与している。活性化すると、ジスルフィド結合ホモ二量体であるＩＣＯＳは、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路を介してシグナルを誘導する。その後のシグナル伝達事象は、系統特異的転写因子（例えば、Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３）の発現、ひいてはＴ細胞の増殖及び生存に対する影響をもたらす。この用語は、ＩＣＯＳの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント、又は対立遺伝子バリアントも包含する。ヒトＩＣＯＳのアミノ酸配列をＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９Ｙ６Ｗ８（配列番号１）に示す。
先に記載されたように、Ｂ７スーパーファミリーのメンバーでもあるＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ；Ｂ７－Ｈ２；Ｂ７ＲＰ－１；ＣＤ２７５；ＧＬ５０）は、ＩＣＯＳに対する膜結合天然リガンドであり、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞の細胞表面に発現される。ＩＣＯＳ－Ｌは、ＩＣＯＳとの相互作用において、細胞表面上の非共有結合的に連結されたホモ二量体として機能する。ヒトＩＣＯＳ－Ｌはまた、ヒトＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に結合することが報告されている（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３４：７２９－７４０））。ｈｕＩＣＯＳ－Ｌの外部ドメインの例示的なアミノ酸配列を配列番号２１５に示す。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変性であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。
一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ中にあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬ中にある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））、
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））が挙げられる。
特に断りのない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記のＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムを定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）に記載されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、抗体可変領域中の特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングに関する言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う。
本明細書で使用する場合、抗原結合分子（例えば、抗体）に関連して「親和性成熟」という用語は、例えば変異によって、参照抗原結合分子に由来する、参照抗体と同じ抗原に結合する、好ましくは同じエピトープに結合する抗原結合分子を指し、参照抗原結合分子よりも抗原に対して高い親和性を有する。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ以上のＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸残基の改変を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、初期参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中において以下の配列で現れる。ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含む、キメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域から更に修飾されるか、又は変更されているものである。
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。
「ＣＨ１ドメイン」という用語は、おおよそＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ１ドメインは、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号２６７）のアミノ酸配列を有する。通常、ＥＰＫＳＣ（配列番号２６８）のアミノ酸配列を有するセグメントは、続いてＣＨ１ドメインをヒンジ領域に連結する。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを結合する抗体重鎖ポリペプチドの一部（例えば、ＫａｂａｔのＥＵナンバーシステムにより、約２１６の位置から約２３０の位置まで、又は約２２６の位置から約２３０の位置まで）を表す。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定することができる。ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般に、２５個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、関連する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中央、及び下部ヒンジドメイン（例えば、Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８）４０８３を参照されたい）の３つのドメインに細分することができる。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、又はＡｌａ２３１から重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよい、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に断りのない場合には、Ｃ末端のグリシン－リシンジペプチドを含まずに本明細書で示される。一態様では、本発明の抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、さらなるＣ末端のグリシン－リシンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。一態様では、本発明に従った抗体に含まれる、本明細書で明記したＦｃ領域を含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインとを含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約ＥＵ位置２３１のアミノ酸残基から約ＥＵ位置３４０のアミノ酸残基（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）まで延在する。一態様では、ＣＨ２ドメインは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰ ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ ＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号２６９）のアミノ酸配列を有する。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合されないという点で特有である。むしろ、インタクトネイティブＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ－ｌｉｎｋｅｄ分岐炭水化物鎖が介在している。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）１６１－２０６．一態様では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメイン又はバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側の残基のストレッチを含み、およそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ３ドメインは、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫ ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧ（配列番号２７０）のアミノ酸配列を有する。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメイン又はバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。このようなバリアントＣＨ３ドメインを使用し、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端のリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、しない場合もある。本明細書で特に明記しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ等のＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。
「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、米国特許第７，６９５，９３６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうちの１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーを更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子バリアント及び置換、付加又は欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失されていてもよい。かかるバリアントは、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０（１９９０）を参照されたい）。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化。
Ｆｃ受容体結合に依存したエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、並びに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、及び対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１－５２４を参照されたい）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７－４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５－３４；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０－３４１；及びＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１－２４８に記載されている。
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を引き起こす。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、単量体ＩｇＧに高い親和性で結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球にて発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された、位置２３３～２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０3倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧに中程度から低度の親和性で結合し、幅広く発現する。受容体は、２つのサブタイプ：ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは主に、殺傷に関与する多くの細胞（例えばマクロファージ、単球、好中球）にて発見され、殺傷プロセスを活性化可能であるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスで役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球で発見されている。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、及び、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球及び肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化を抑制することを補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）はＩｇＧに、中程度～低度の親和性で結合し、２つの種類として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡはＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で発見されており、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上に高度に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害」とは、Ｆｃ受容体結合により媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下における、本明細書で報告される抗体による、標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。特に、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による連結の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７，ｖｅｒｓｉｏｎ １４１を参照）。
「外部ドメイン」は、細胞外空間（すなわち、標的細胞の外側の空間）に伸長する膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。
「ペプチドリンカー」という用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２～２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載される。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に、１～１０、典型的には２～４、特に２の数字であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号２７１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７２）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７３）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２７４）からなる群より選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号２７５）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２７６）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２７７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号２７８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号２７９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号２８０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号２８１）、ＧＧＳＧ（配列番号２８２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号２８３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号２８４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号２８５）もまた含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号２７１）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７２）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号２７６）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２７７）である。
「アミノ酸」というの用語は、本明細書中で使用される場合、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード）Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の一群を示す。
「融合した」、又は「連結された」とは、構成成分（例えば、ポリペプチド及び当該ＴＮＦリガンドファイミリーメンバーの細胞外ドメイン）が直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかで、ペプチド結合により連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、公的に入手可能なＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ等のコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で達成され得る。ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性に等しくないことが理解されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されているように得られる。
特定の実施形態では、本明細書において提供する、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のアミノ酸配列バリアントが想到される。例えば、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組合せは、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。置換による突然変異生成のための目的部位としては、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下に更に記載される。アミノ酸置換は、目的の分子及び所望な活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
「アミノ酸配列バリアント」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られたバリアント（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基は、突然変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態において、置換、挿入又は欠失は、このような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてよい。突然変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。かかる接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに１つ以上のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。挿入の例としては、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドへのＮ末端又はＣ末端への融合を有するアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書において提供するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。１つ以上のグリコシル化部位が作製される、又は取り除かれるように、アミノ酸配列を改変することにより、分子のグリコシル化バリアントを便利に入手することができる。アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子がＦｃドメインを含む場合、Ｆｃドメインに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ－連結によって一般的に結合された分岐した二分オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態において、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子中のオリゴ糖の改変は、特定の改良された特性を有するバリアントを作製するために行われてもよい。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）接続するフコースを欠いた炭水化物構造を有するアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のバリアントが提供される。このようなフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照。本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の更なるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に接続した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。このようなバリアントは、フコシル化の低下及び／又はＡＤＣＣ機能の向上を有していてもよく、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと。Ｆｃ領域に接続したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改良されたＣＤＣ機能を有する場合があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）、国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載される。
特定の実施形態では、本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のシステイン操作バリアント、例えば、分子の１つ以上の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定的な実施形態では、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基は、抗体の接近可能な部位に位置しており、これを使用し、抗体を他の部分（例えば、薬物部分又はリンカー－薬物部分）に対してコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作成してもよい。特定の実施形態では、任意の１つ以上の下記の残基が、システインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作成されてもよい。
特定の態様では、本明細書中に提供されるアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、当該分野で公知であり、容易に入手可能である更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は、さまざまであってもよく、１つより多いポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定の条件下で使用されるか等を含む限定事項に基づいて決定することができる。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の複合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長を有していてもよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書において提供するアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の免疫コンジュゲートを得ることができる。「免疫コンジュゲート」は、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含む、１つ以上の異種分子にコンジュゲートされている抗体である。
「ポリヌクレオチド」といの用語は、単離された核酸分子又は構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドが意図するのは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然の染色***置とは異なる染色***置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成によって産生されるこのような分子を更に含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節要素であってもよく、又は調節要素を含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、若しくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、又は参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置若しくは３’末端位置で、又は５’末端位置と３’末端位置との間の、参照配列内の残基間で個々にか若しくは参照配列内での１つ以上の連続した基においてかのいずれかに点在しているどこかで起こってもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」という用語は、組換えによって、又は合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、標的細胞中で作用可能に会合した特異的遺伝子の発現を導入及び誘導するのに使用されるＤＮＡ分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子又は遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は同じ意味で用いられ、外因性核酸が導入された細胞を意味し、かかる細胞の後代を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、変異を含んでもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか若しくは選択されるのと同じ機能、又は生物活性を有する突然変異型の後代が本発明に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量及び必要な期間を指す。作用剤の治療有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は被験体は、ヒトである。
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、製剤が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。
「薬学的に許容可能な賦形剤」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、被験体にとって毒性ではない成分を指す。薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、バッファー、安定化剤又は防腐剤が挙げられる。
「パッケージ添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、かかる治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
本明細書で使用する場合、「処置」（及びその文法的な変形語、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の分子を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺胞細胞性肺がん、骨腫瘍、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、消化器がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫尿道のがん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫及びユーイング肉腫（上述のいずれかのがんの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ以上の組合せを指す。
本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性等の、特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。
腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む例示的なアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。
したがって、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、既知のＩＣＯＳ抗体と比較して改善された特性を有する新規ＩＣＯＳ抗原結合ドメインを含むことを特徴とする。
一態様では、本発明は、そのような二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃドメインとを含む、二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。
特定の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、エフェクター機能を低下させるか又は失わせる変異を含むＦｃドメインを含む。エフェクター機能を低下又は無効にする変異を含むＦｃドメインの使用は、Ｆｃ受容体を介した架橋による非特異的アゴニズムを防ぎ、ＩＣＯＳ＋細胞のＡＤＣＣを防ぐ。
したがって、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む、上に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。特に、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む。
本明細書に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、典型的にはがん細胞又は腫瘍間質である標的細胞で免疫応答を選択的に誘導するという点で、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する従来の抗体に勝る利点を有する。一態様では、腫瘍関連抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、葉酸受容体アルファ（ＦｏｌＲ１）、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）及びｐ９５ＨＥＲ２からなる群より選択される。特に、腫瘍関連抗原はＦＡＰ又はＣＥＡである。特定の一態様では、腫瘍関連抗原はＦＡＰである。別の特定の態様では、腫瘍関連抗原はＣＥＡである。
一態様では、上に定義される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインである、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。一態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むか、又は（ｂ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特定の一態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
別の態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、上に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。特に、ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む。
更なる態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインである、請求項１～３のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。一態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。特定の一態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、（ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
別の態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、該ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は（ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。特定の態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。更なる態様では、ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む。
さらに、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
したがって、一態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、マウス免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、配列１０のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。特に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、マウス免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
特定の態様では、配列番号２９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、マウス免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。別の態様では、そのヒト化バリアント、すなわち、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが提供される。
別の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ウサギ免疫に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、配列１８のアミノ酸配列に少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。特に、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。
更なる態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。特に、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。一態様では、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９及び配列番号１４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域Ｈ、並びに配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、そのヒト化バリアントが提供される。
更なる態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。特定の一態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。更なる態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号２９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。別の態様では、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号３００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。一態様では、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに配列番号１５２及び配列番号１５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、そのヒト化バリアントが提供される。
一態様では、本発明は、本明細書において前に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する１つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。特に、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書において前に定義されるアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子であって、
（ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片と、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。特に、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
特定の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインはクロスＦａｂ断片である。
本発明の例示的アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体
更なる態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体であって、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体を提供する。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体は、マウス免疫化に由来し、（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。別の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体は、ウサギ免疫に由来し、（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は（ｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と、（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）と、を含む。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体が提供される。
したがって、一態様では、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、マウス免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子、特に抗体が提供される。特に、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、マウス免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
特定の態様では、配列番号２９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、マウス免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子が提供される。別の態様では、そのヒト化バリアント、すなわち、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが提供される。
別の態様では、本発明は、ウサギ免疫に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、ウサギ免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子を提供する。特に、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。
更なる態様では、ウサギ免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。特に、ウサギ免疫化に由来するＩＣＯＳへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。一態様では、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９及び配列番号１４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域Ｈ、並びに配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、そのヒト化バリアントが提供される。
更なる態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。特定の一態様では、ウサギ免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。更なる態様では、ウサギ免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、配列番号２９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び、配列番号２９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。別の態様では、ウサギ免疫化に由来するアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、配列番号３００のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む。一態様では、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに配列番号１５２及び配列番号１５３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、そのヒト化バリアントが提供される。
一態様において、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は全長抗体である。別の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子はＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片である。特定の態様において、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子はヒト化抗体である。
本発明の例示的な二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子
一態様において、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃドメインとを含む、二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。したがって、この場合、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、ＩＣＯＳへの結合については一価であり、腫瘍関連抗原への結合については一価である（１＋１フォーマット）。
特定の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片と、（ｃ）互いに安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、（ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）互いに安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインのＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、ＶＨ及びＶＬの他方が、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。そのような分子は、１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌと呼ばれる。
別の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃドメインとを含む、二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。したがって、この場合、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、ＩＣＯＳへの結合については二価であり、腫瘍関連抗原への結合については一価である（２＋１フォーマット）。
一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片と、（ｂ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）互いに安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインのＶＨドメイン及びＶＬドメインの一方が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣ末端に融合されており、ＶＨ及びＶＬの他方が、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣ末端に融合されている、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。そのような分子は２＋１と呼ばれる。
別の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片と、（ｃ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第３のＦａｂ断片と、（ｄ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、第２のＦａｂ断片（ｂ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ断片（ａ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、そのＣ末端において第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されており、標的細胞抗原への特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片（ｉ）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置換されている、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。
更に別の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片と、（ｃ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第３のＦａｂ断片と、（ｄ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、第１のＦａｂ断片（ａ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ断片（ｂ）のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、そのＣ末端において第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合され、第３のＦａｂ断片（ｃ）が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合されており、標的細胞抗原への特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片（ｉ）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域ＶＬ及びＶＨが互いに置換されている、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を提供する。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメイン改変
本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、二量体であり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。
したがって、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。より具体的には、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、望ましい組織－血液分布比を含め、望ましい薬物動態特性を与える。しかし、同時に、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。したがって、特定の態様では、本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、低下したＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を示す。一態様では、ＦｃドメインはＦｃ受容体に実質的に結合せず、及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下の１つ以上が挙げられ得る：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、直接的なシグナル伝達誘発性アポトーシスの低下、樹状細胞成熟の低下、又はＴ細胞プライミングの低下。
特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃドメインに導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントを作製する。Ｆｃ領域バリアントは、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。
特定の態様では、本発明は、Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体に対する、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。
一態様において、本発明の抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１つ以上のアミノ酸変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵナンバリング）及び／又は３２９（ＥＵナンバリング）の位置にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、ＩｇＧ重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む本発明による抗体が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組合せは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、そのような突然変異型Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能等のその特性を決定する方法も記載している国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載される。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃドメインの残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有する抗体も挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
別の態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下と、エフェクター機能の低下を示す。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８（Ｋａｂａｔナンバリング）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング）を含む、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメインバリアント及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７－５９３及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９－２４３４）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃバリアントは、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するバリアントを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８８）７３８－７４０；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。適切なかかる結合アッセイを本明細書に記載する。或いは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野において既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するのに適したアッセイを本明細書に記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。
以下の章は、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン改変を含む、本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメイン（ＦｃドメインがＦｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する抗体の結合親和性を減少させる１つ以上のアミノ酸置換を含む）とに関する。別の態様では本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）標的細胞抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、Ｆｃドメインが、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子に関する。特定の態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインである。
本発明の一態様では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５位及びＰ３２９位にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメイン中にアミノ酸置換Ｄ２６５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「ＤＡＰＧ」）を含む。そのような一実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域、特にマウスＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。ＤＡＰＧ変異は、例えば国際公開第２０１６／０３０３５０号Ａ１に記載されており、マウスＦｃガンマ受容体への抗原結合分子の結合を消失させるために重鎖のＣＨ２領域に導入することができる。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン改変
本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量体化が、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組合せをもたらす。組換え産生における本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）互いに安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。したがって、一態様において前記改変はＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様では、当該修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。したがって、本発明は、（ａ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）互いに安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインであって、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはホールを含む、Ｆｃドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子に関する。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、もっと大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一又は同様のサイズの代償的空洞が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、一態様において、本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異誘発によって又はペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）。
なお更なる態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、二量体を更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５）。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットは３９２位及び４０９位にアスパラギン酸残基（Ｄ）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットは位置３５６位及び３９９位にリジン残基（Ｋ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットにおいて、３９２位及び４０９位のリジン残基はアスパラギン酸残基で置換され（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）、Ｆｃ領域の第２のサブユニットにおいて、３５６位のグルタミン酸残基及び３９９位のアスパラギン酸残基はリジン残基で置換される（Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ）。「ＤＤＫＫ」ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）技術は、例えば国際公開第２０１４／１３１６９４号Ａ１に記載されており、相補的アミノ酸残基を提供するサブユニットを担持する重鎖の構築に有利である。
代替的な態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０８９００４号に記載されている静電ステアリング効果を媒介する改変を含む。一般に、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましくなるように、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの界面での１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
本明細書に報告されるような二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうちの１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一態様において、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短くなったＣ末端である。一態様では、本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様において、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。本明細書に報告される全ての態様のうちの一実施形態において、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明の例示的なアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子
一態様では、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
より具体的には、二重特異性抗原結合分子であって、当該分子が、
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、第２のＦａｂ断片と、を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含むＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
より具体的には、（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片、並びに（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様において、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、配列番号９５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
更なる態様では、分子は、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片を含む。特定の態様では、分子であって、
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰへの特異的結合能を有する第１の抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片であって、それぞれが、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、２つのＦａｂ断片と、を含む分子が提供される。
特定の態様では、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号９６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号９４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の特定の態様では、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号９９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の特定の態様では、配列番号９８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の特定の態様では、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
更に別の態様では、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の態様では、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の態様では、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
さらなる態様では、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片及びＦＡＰへの特異的結合能を有するＦａｂ断片を含む分子が提供される。
更なる態様では、分子は、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片を含む。
特定の態様では、分子であって、
（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含むか、又は配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、ＦＡＰへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片であって、それぞれが、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、２つのＦａｂ断片と、を含む分子が提供される。
一態様では、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
別の態様では、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む２つの第１の軽鎖と、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
一態様では、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含むＣＥＡの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
より具体的には、二重特異性抗原結合分子であって、当該分子が、
（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＣＥＡへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片と、
（ｉｉ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片であって、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｃ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、又は
（ｄ）配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含む、第２のＦａｂ断片と、を含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様では、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）を含むＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
より具体的には、（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）とを含む、ＦＡＰへの特異的結合能を有する第１のＦａｂ断片、及び（ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）と配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）とを含む、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する第２のＦａｂ断片を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様において、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号２０４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
一態様において、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
別の態様では、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ１）と、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖（ＨＣ２）と、配列番号２０７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号２１１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子が提供される。
本発明で使用するための例示的な抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体
本発明は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及びアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子と組み合わせたそれらの使用、特に、がんを処置する又は進行を遅延させるための、より具体的には固形腫瘍を処置する又は進行を遅延させるための方法におけるそれらの使用に関する。本明細書で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＣＥＡに結合する第２の抗原結合ドメインと、を含む二重特異性抗体である。
したがって、本明細書で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインと、を含む。
特定の態様では、組合せにおける使用のための抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２１８のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２１９のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号２２０のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号２２１のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２２２のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２２３のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号２２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号２２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は全長抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、より具体的にはＦａｂ分子である。特定の態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換えられる）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ３に特異的に結合する抗体はヒト化抗体である。
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号２２６のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２２７のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２２８のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２２９のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３０のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２３１のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号２３４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２３５のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２３６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２３７のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３８のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２３９のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。
より詳しくは、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第２の抗原結合ドメインを含む。
別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＣＥＡに結合する第３の抗原結合ドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号２２６のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２２７のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２２８のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２２９のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３０のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２３１のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
（ｂ）配列番号２３４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２３５のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２３６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２３７のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３８のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２３９のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第３の抗原結合ドメインを含む。
より詳しくは、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２３３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第３の抗原結合ドメインを含む。別の特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２４１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、及び／又は配列番号２４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、第３の抗原結合ドメインを含む。
更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されたクロスＦａｂ分子であり、第２及び第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、従来のＦａｂ分子である。
別の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は二重特異性抗体であり、（ｉ）第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されており、又は（ｉｉ）第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
複数のＦａｂ分子はＦｃドメインに、又は互いに、直接、又は、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含む、１つ以上のアミノ酸を含む、ペプチドリンカーを介して、融合することができる。ペプチドリンカーは、当技術分野に知られており、本明細書に説明されている。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施形態では、上記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施形態では、５～１００アミノ酸長、更なる実施形態では、１０～５０アミノ酸長を有する。一実施形態では、前記リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、更なる実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２である。一実施形態では、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖に接続するのに好適な、例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子がＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、さらなるペプチドリンカーを伴い又は伴うことなく融合していてもよい。
更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体に対する結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含むＦｃドメインを含む。特に、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
特定の態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２４２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２４３の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２４４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号２４５の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２４２のポリペプチド配列、配列番号２４３のポリペプチド配列、配列番号２４４のポリペプチド配列及び配列番号２４５のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
更に具体的な態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２４６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２４７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２４８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号２４９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号２４６のポリペプチド配列、配列番号２４７のポリペプチド配列、配列番号２４８のポリペプチド配列及び配列番号２４９のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１に記載されている。
更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はまた、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））を含み得る。更なる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２００７／０７１４２６号又は国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載される二重特異性抗体である。別の態様において、二重特異性抗体はＭＥＤＩ５６５である。
別の態様では、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨｍｕＣＤ３）及び軽鎖可変領域（ＶＬｍｕＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨｍｕＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬｍｕＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインと、重鎖可変領域（ＶＨｍｕＣＥＡ）及び軽鎖可変領域（ＶＬｍｕＣＥＡ）を含む第３の抗原結合ドメインとを含む、マウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関する。
特定の態様では、マウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２５０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２５１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２５２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２５３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。更に特定の態様では、マウス抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２５０のポリペプチド配列、配列番号２５１のポリペプチド配列、配列番号２５２のポリペプチド配列及び配列番号２５３のポリペプチド配列を含む（ｍｕ ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
本発明で使用するためのＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤
本発明の一態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用するためのものである。別の態様では、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤をＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用するためのものである。これら全ての態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニストである。特に、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体である。
ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られている「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＰＤ－Ｌ１（特に、「ヒトＰＤ－Ｌ１」）を意味する。完全ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号２８６）に示されている。「ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナーのうちのいずれか１つ以上、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、遮断する、阻害する、消失させる、又は妨害する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１及び／又はＢ７－１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、及びＰＤ－Ｌ１とその結合パートナーのうちの１つ以上、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、遮断する、阻害する、消失させる、又は妨害する他の分子を含む。一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１を介するシグナル伝達を媒介したＴリンパ球上で発現された細胞表面タンパク質によって又はそれを介して媒介される負の共刺激シグナルを低減し、機能不全のＴ細胞の機能不全状態を軽減する（例えば、抗原認識へのエフェクター応答を増強する）。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体」、又は「アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様においては、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の標準的な結合アッセイを用いて測定される。
特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ－１１０５からなる群より選択される。具体的な一態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＭＤＸ－１１０５である。さらに別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。なお更なる態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。より詳しくは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号２８８の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号２８９の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号２９０の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号２９１の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ－１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＰＤ－Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１５１１６（配列番号２８７）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ－１を指す。「ＰＤ－１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方への結合を阻害する。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－１抗体」、又は「ヒトＰＤ－１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体」、又は「アンタゴニスト抗ＰＤ－１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を意味する。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の標準的な結合アッセイを用いて測定される。
一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ－０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群より、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号２９２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号２９３の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。別の態様において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号２９４の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号２９５の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書中に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子若しくはＴ細胞二重特異性抗体又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の二重特異性抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は同時発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分由来の別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。同時発現する場合、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る抗原結合分子全体をコードする。他の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する本発明に係る抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
組換え方法
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得られてもよい。組換え産生のために、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを、例えば上記のように単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用い、容易に単離され、配列決定されてもよい。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される手法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部であることができ、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節要素と作動可能に会合してクローニングされる発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であると考えられてもよいが、存在する場合、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、単一のベクター上に、存在していてもよく、又は別個のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に、存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。更に、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が、制御配列（複数可）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を試行する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことが可能な場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合していてもよい。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみに指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えば、エンハンサー、オペレーター、転写停止シグナルは、細胞特異的な転写に指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合してもよい。
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａと組み合わせる）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギａ－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。更なる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、及び誘発性プロモーター（例えばプロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は、当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、ウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）等の他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有しており、これらは、粗い小胞体を通って成長したタンパク質鎖が外に出始めると、成熟タンパク質からは開裂する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的に、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、ポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成するために、翻訳されたポリペプチドから開裂することを知っている。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの***を指向する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後での精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にする、又は、融合タンパク質の標識を補助するために使用可能な、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗体、又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの中に、又はその末端に含めることができる。
本発明の更なる態様において、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを単独で、又は組み合わせて組み込んでもよい。一態様において、宿主細胞は、本発明の本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクションされている）。本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製し、発現を補助するのに適した宿主細胞は、当該技術分野で周知である。かかる細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクトされるか、又は形質導入されてもよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等が挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要とされない場合には、細菌内で産生されてもよい。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドを産生する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児性腎株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載される２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ：ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；並びにＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えば、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞を組み換えて、他方の免疫グロブリン鎖を発現して、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンとなるようにすることができる。
一態様において、本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子又はそのポリペプチド断片を製造する方法であって、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を発現するのに適した条件下で、本明細書で提供されるように、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することと、を含む、方法を提供する。
特定の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメイン、又は抗原結合分子の一部を形成するＩＣＯＳ（例えば、Ｆａｂ断片、又はＶＨ及びＶＬ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインは、抗原への結合能を有する免疫グロブリン可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、それらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、組換えによって産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載されるように）、又は例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５，９６９，１０８号を参照されたい）。
免疫グロブリンの任意の動物種を本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するのに重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に接合すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフト接合すること、又は（ｃ）全非ヒト可変ドメインを翻訳するが、表面残基を置き換えることによって、これらとヒト様部分とを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）に更に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で知られている様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、一般的に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５、３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０、４５０－４５９（２００８）に記載される。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成し得て、そのヒトモノクローナル抗体に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリー（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８，１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８，５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，６２４－６２８（１９９１）を参照されたい）から選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによって作製され得る。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。
特定の態様において、抗原結合（ａｎｔｉｋｇｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメインは、例えば、ＰＣＴ国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示される方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。本発明の抗原結合分子が特定の抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者には知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施形態では、かかる競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子により結合されるのと同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイにおいて、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原に結合するために第１の抗原結合分子と競合する能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む、溶液中でインキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化された抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーションの後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化された抗原に関連する標識の量を測定する。固定化された抗原に関連する標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に低減される場合、それは、第２の抗原結合分子が抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示す。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載されるように調製される本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には、正味の電荷、疎水性、親水性等の因子に依存し、当業者には明らかである。親和性クロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧの親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例にて本質的に記載しているように、抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現する二重特異性抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切にアセンブルしたことが示された。
アッセイ
本明細書において提供する抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
１．親和性アッセイ
ＩＣＯＳ又は腫瘍関連抗原に対する本明細書で提供される抗体の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な機器を使用して、実施例に記載の方法に従って決定することができ、受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。標的細胞抗原に対する二重特異性抗原結合分子の親和性もまた、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な計装、及び、例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例及び例示的な実施形態は、実施例９に記載される。一態様によれば、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
２．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本明細書に記載の抗体を、例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー等の既知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。
３．活性アッセイ
腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の活性を評価するために、いくつかの細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを行った。アッセイは、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）媒介性Ｔ細胞活性化の存在下で抗ＩＣＯＳ二重特異性分子の更なるアゴニスト性／共刺激活性を示すように設計された。例えば、ＣＤ３／ＴＣＲとＩＣＯＳとの結合時に誘導されるルシフェラーゼのＮＦＡＴ制御発現を有するレポーター細胞株を用いたＪｕｒｋａｔアッセイであって、プレート結合対溶液中及び被覆ＣＤ３ ＩｇＧ刺激の非存在下対存在下でＩＣＯＳ ＩｇＧ分子を測定した、Ｊｕｒｋａｔアッセイを実施例７．２に更に詳細に記載する。
さらに、Ｔ細胞上のＣＤ３及び腫瘍細胞上のヒトＣＥＡに同時に結合することによって架橋されているＴＣＢ分子の存在下で、Ｔ細胞上のヒトＩＣＯＳ及び３Ｔ３－ｈＦＡＰ細胞（親細胞株ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ－９２、ヒトＦＡＰを安定に過剰発現するように改変されている）上に発現されたヒトＦＡＰに同時に結合することによって架橋されたＦＡＰタグ付ＩＣＯＳ分子を試験する、実施例７．１に記載される、初代ヒトＰＢＭＣ共培養アッセイ。
特定の態様では、本明細書に記載の抗体を、そのような生物学的活性について試験する。
医薬組成物、製剤及び投与経路
更なる態様では、本発明は、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。特定の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、がんの処置、より具体的には固形腫瘍の処置に使用するための医薬組成物が提供される。さらなる一態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニストＩＣＯＳ結合分子、及び腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が、単一の組成物で一緒に投与するためのもの、又は２つ以上の異なる組成物で別々に投与するためのものである、医薬組成物が提供される。別の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と同時、その前又はその後に投与される。
別の態様では、医薬組成物は、本明細書中に提供されるアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。別の態様において、医薬組成物は、本明細書中に提供されるアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、例えば、下記に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
更に別の態様では、本発明は、がんを処置するため又はがんの進行を遅延させるための方法において使用するための、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を含む医薬組成物であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が、腫瘍関連抗原に対して特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて使用するための、又はＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用するためのものである、医薬組成物を提供する。別の態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて、かつＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用するためのものである。特に、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より特定的には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペムブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブである。別の具体的な態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はペンブロリズマブ又はニボルマブである。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤に溶解又は分散した治療有効量の１つ以上の抗体を含む。「薬学的又は薬理学的に許容可能な」との句は、一般的に、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、すなわち、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。少なくとも１つの抗体と、場合により更なる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、本明細書に参考として組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されるように、本開示の観点で、当該技術分野で既知である。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組合せが挙げられる。
非経口組成物としては、注射による（例えば、皮下、皮内、病変内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射による）投与のために設計されたものが挙げられる。注射のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水緩衝液中で配合されてもよい。溶液は、配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤を含有していてもよい。或いは、融合タンパク質は、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための、粉末形態であってもよい。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の更なる所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の混入作用から保護されなければならない。内毒素の混入は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、脂肪族油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド）又はリポソームが挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定的な実施形態では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組合せ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。
本発明の例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤には、ヒスチジン－酢酸緩衝液が含まれる。
先に記載される組成物に加えて、本明細書中に記載されるアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子はまた、デポー調製物として製剤化される場合がある。このような長く作用する製剤は、植込み（例えば、皮下若しくは筋肉内）によって、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂、又は難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤化され得る。
本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムの水酸化物又は水酸化第二鉄等の無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
本発明の組成物は、処置される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌である。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成され得る。
治療方法及び組成物
一態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む有効量のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を被験体に投与する工程を含む、被験体においてがんを処置又は進行を遅延させる方法が提供される。
そのような一態様では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することを更に含む。更なる態様では、本明細書では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む有効量のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を被験体に投与する工程を含む、腫瘍縮小のための方法を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」又は「被験体」は、好ましくはヒトである。
更なる態様では、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む、がん免疫療法に使用するための組成物が提供される。特定の実施形態では、がん免疫療法の方法で使用するための、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む組成物を提供する。
更なる態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを含む組成物の使用が提供される。一実施形態では、医薬は、がんの処置のためのものである。さらなる態様では、医薬は、固形腫瘍を有する個体に、有効量の医薬を投与することを含む、腫瘍縮小の方法で使用するためのものである。そのような一態様では、上記方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することを更に含む。更なる実施形態では、医薬は固形腫瘍を処置するためのものである。いくつかの態様では、個体はＣＥＡ陽性がんを有する。いくつかの態様では、ＣＥＡ陽性がんは、結腸がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、子宮内膜がん、乳がん、腎臓がん、食道がん、又は前立腺がんである。いくつかの態様では、乳がんは乳癌腫又は乳腺癌である。いくつかの態様では、乳癌腫は浸潤性乳管癌腫である。いくつかの態様では、肺がんは肺腺癌である。いくつかの実施形態では、結腸がんは、結腸直腸腺癌である。上記の実施形態のいずれかによる「被験体」又は「個体」は、ヒトであってもよい。
別の態様において、被験体においてがんを処置するため又はその進行を遅延させるための方法であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメイン、及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む有効量のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を被験体に投与することを含み、被験体が、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子による処置前のＴ細胞上の低いＩＣＯＳベースライン発現を含む、方法が提供される。
上述の併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本明細書に報告される抗体の投与は、追加の治療剤（複数の場合がある）の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行われ得る。一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の投与、及び腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の投与、並びに任意に追加の治療剤の投与は、互いに約１ヶ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内に行われる。
本明細書に報告されるＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子（及び任意の追加の治療剤）の両方を、非経口、肺内及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与することができ、局所処置のために所望される場合、病巣内投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短時間であるか、又は慢性的であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路によるもの、例えば、静脈内注射又は皮下注射等の注射によるものであり得る。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本明細書に記載のＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、及び腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子はいずれも、優良医療実務と一致する様式で製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防又は処置するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類、及び上記の他の要因に依存する。これらは、一般に、ここに記載されている投与量と同じ投与量で、又はここに記載されている投与量の約１～９９％、又は経験的／臨床的に適切であると判断される任意の投与量で、及び任意の投与経路で使用される。
別の態様では、被験体においてがんを処置するための、又はその進行を遅延させるための方法であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む有効量のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を被験体に投与する工程を含む、方法が提供される。
他の薬剤及び処置
本発明の腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、処置において１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明のアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与することができる。「治療剤」という用語は、このような処置が必要な個体において、症状又は疾患を処置するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような更なる治療剤は、処置される特定の徴候に適した任意の有効成分を含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。特定の実施形態において、更なる治療剤は、別の抗がん剤である。一態様では、追加の治療剤は、化学療法剤、放射線及びがん免疫療法に使用するための他の薬剤からなる群より選択される。更なる態様では、がんの処置に使用するための本明細書中に先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が別の免疫調節剤と組み合わせて投与される、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。
「免疫調節剤」という用語は、免疫系に影響を与えるモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と見なすことができる。免疫調節剤は、がんの処置のための抗腫瘍剤として使用することができる。一態様では、免疫調節剤には、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ）、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ）、ＯＸ－４０抗体、ＬＡＧ３抗体、ＴＩＭ－３抗体、４－１ＢＢ抗体及びＧＩＴＲ抗体が挙げられる。
更なる態様では、がんの処置に使用するための本明細書中に先に記載される腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子であって、腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて投与される、アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子が提供される。一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ１抗体である。より特定的には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ペムブロリズマブ及びニボルマブからなる群より選択される。具体的な一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、アテゾリズマブである。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はペンブロリズマブ又はニボルマブである。このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量で組み合わされて存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用されるアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の量、障害又は処置の種類、及び上記で議論される他の要因に依存する。腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子は、一般に、本明細書中に記載される投与量及び同じ投与経路で、又は本明細書中に記載される投与量の約１～９９％で、又は任意の投与量で、経験的／臨床的に適切であると決定される任意の経路によって使用される。
上記のそのような併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ組成物又は別々の組成物に含まれる）及び別々投与を包含し、その場合、本発明の腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子の投与は、更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、それと同時及び／又はその後に行うことができる。
製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、組成物をそれ自身で、又は状態を処置し、予防し、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持しており、滅菌アクセス口を有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈用溶液袋又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子である。
ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される病態を処置するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）本発明の腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子を含む組成物が含有される第１の容器と、（ｂ）該組成物が含有される第２の容器であって、該組成物が更なる細胞傷害性薬剤又は他の治療剤を含む、第２の容器とを備え得る。製造物品は、本発明のこの実施形態において、その組成物を特定の状態を処置するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。
これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容可能なバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、ニードル及びシリンジを含め、商業的及びユーザの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。先に提供した一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２。
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生成されたか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，ドイツ）によって、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。正確な遺伝子配列が利用できない場合においては、最も近い相同体の配列に基づきオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織に由来するＲＮＡから、ＲＴ－ＰＣＲにより遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にするために、適切な制限部位を有する遺伝子セグメントを設計した。全ての構築物は、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
細胞培養技術
標準的な細胞培養技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように使用した。
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡単に記載すると、抗原結合分子をプロテインＡ親和性クロマトグラフィー（平衡化緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出緩衝液：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）に供した。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗原結合分子画分をプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０分子量カットオフ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、凍結させ、－２０℃又は－８０℃で保存することができる。試料の一部を、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析法によるその後のタンパク質分析及び分析による特性決定のために提供することができる。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％又は４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）又はＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準物質として供した。
質量分析法
この章は、その正しいアセンブリに重点をおいて、ＶＨ／ＶＬ置き換え（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂ）を有する多重特異性抗体の特性決定を記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化したインタクトなＣｒｏｓｓＭａｂｓ及び脱グリコシル化した／消化したプラスミン、又は脱グリコシル化した／制限されたＬｙｓＣ消化したＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した。
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓを、リン酸バッファー又はＴｒｉｓバッファー中、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで、３７℃で１７時間までの時間、Ｎ－グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は制限されたＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）消化を、１００μｇの脱グリコシル化したＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを用い、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中、それぞれ、室温で１２０時間、また、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、サンプルを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定された。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９－００５－０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合を、ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐｈ７．４）、２５℃（又は代替的に３７℃）中で測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒～３分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３～１０分間洗浄して解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを用いてＫＤ値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、サンプル曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサーグラムの分析及び親和性データの計算に使用する。
実施例１
ＩＣＯＳ抗体の生成
１．１ 免疫化による新規ＩＣＯＳバインダーの生成のための抗原及びスクリーニングツールの調製、精製及び特性評価
１．１．１ 単量体及び二量体ＩＣＯＳ抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の調製、精製及び特性評価
ヒト、カニクイザル若しくはマウス又は４－１ＢＢの外部ドメインをコードするＤＮＡ配列（表１）を、単量体のノブ並びに二量体ＩＣＯＳ抗原Ｆｃ融合分子のホール及びノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。抗原－ＦｃノブのＣ末端に、指示したビオチン化のためのＡｖｉタグを導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含有する抗原Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含有するＦｃホール鎖とを組み合わせることにより、単一コピーを含むＩＣＯＳヘテロ二量体又は２コピーのエクトドメイン含有鎖を含むホモ二量体の生成が可能になり、したがってＦｃ結合抗原の単量体又は二量体形態が作製される。表２は、抗原Ｆｃ融合構築物のアミノ酸配列を示す。
全てのＩＣＯＳ－Ｆｃ融合コード配列を、キメラＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含有するプラスミドベクターにクローニングした。さらに、ベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
ビオチン化抗原／Ｆｃ融合分子を調製するために、指数関数的に増殖する懸濁液のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、融合タンパク質の２つの成分（ノブ鎖及びホール鎖）並びにビオチン化反応に必要な酵素であるＢｉｒＡをコードする３つのベクターで同時トランスフェクトした。対応するベクターを１：１：０．０５の比（「Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
５００ｍｌ振盪フラスコにおけるタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、上清をあらかじめ温めておいたＣＤ ＣＨＯ培地で置き換えた。発現ベクターを、２００μｇのベクターＤＮＡを含有する２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加した後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合して、５００ｍＬ振蕩フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＬのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％の供給物を培養物に添加した。培養の７日後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルタ）、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるように補充し、４℃に保った。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡを使用する親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。親和性クロマトグラフィーのために、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。未結合タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有する少なくとも１０カラム容量の緩衝液で洗浄することによって除去した。２０カラム容量の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０に対して作製した塩化ナトリウム（０から５００ｍＭ）の線形ｐＨ勾配を使用して、結合タンパク質を溶出した。次いで、カラムを、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ３．０を含有する１０カラム容量の溶液で洗浄した。
回収した画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を添加することによって調整した。タンパク質を濃縮し、フィルタにかけた後、ｐＨ７．４の２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
１．１．２ 組換えＩＣＯＳを発現する安定な細胞株の生成及び特性評価
ヒト又はマウスＩＣＯＳをコードする全長ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングした。メーカーのプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５３３８１００）を使用してプラスミドをＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）細胞にトランスフェクションした。安定にトランスフェクトされたＩＣＯＳ陽性ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４００６３）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（ギブコ；＃３１３３１－０２８）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３２００３３）中で維持した。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；＃ａｎｔ－ｐｒ－１）を６μｇ／ｍＬに添加した。最初の選択後、ＩＣＯＳの最も高い細胞表面発現を有する細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別し、培養して安定な細胞クローンを確立した。発現レベル及び安定性を、４週間にわたってＰＥ抗ヒト／マウス／ラットＣＤ２７８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３１３５０８）を使用するＦＡＣＳ分析によって確認した。
１．１．３ ＤＮＡ免疫化のためのＩＣＯＳ発現ベクターの生成
ヒトＩＣＯＳをコードする全長ｃＤＮＡを標準的な哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
１．２ ウサギ及びマウス免疫化によるＩＣＯＳ特異的００９、１１６７、１１４３及び１１３８抗体の生成
１．２．１ 免疫化キャンペーン
免疫化のために、ＩＣＯＳ由来抗原による免疫化の際に、ヒト化抗体レパートリーを発現する、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から入手したＮＭＲＩマウス及びニュージーランド白ウサギ（ＮＺＷ）、並びにＲｏｃｈｅが所有権を有するトランスジェニックウサギを使用した。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックウサギは、国際公開第２０００／４６２５１号、国際公開第２００２／１２４３７号、国際公開第２００５／００７６９６号、国際公開第２００６／０４７３６７号、米国特許出願公開第２００７／００３３６６１号及び国際公開第２００８／０２７９８６号に報告されている。動物は、付録Ａ「動物の収容と世話に関するガイドライン」に従ってＡＡＡＬＡＣ認定の動物施設に収容された。全ての動物予防接種プロトコルと実験は、オーバーバイエルン政府（許可番号５５．２－１－５４－２５３２－６６－１６ ａｎｄ ５５．２－１－５４－２５３２－９０－１４）によって承認され、ドイツの動物福祉法と欧州議会及び理事会の指令２０１０／６３に従って実施された。
ＩＣＯＳ抗体００９の生成
６～８週齢のＮＭＲＩマウス（ｎ＝５）に、組換えＦｃ融合ヒトＩＣＯＳ ＥＣＤ分子（実施例１．１．１を参照されたい）を用いて１．５ヶ月間にわたって３回免疫化した。最初の免疫化のために、２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に溶解した１００μｇのタンパク質を、等容量の完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）と混合し、腹腔内投与した。不完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃ＤＩＦＣ ２６３９１０）を使用したことを除いて、同様の様式で追加免疫を２１及び４２日目に行った。最終免疫化の４～５週間後、マウスに約５０μｇの免疫原を滅菌ＰＢＳ中で腹腔内投与し、１日後に２５μｇの免疫原を滅菌ＰＢＳ中で静脈内投与した。４８時間後、脾臓を無菌的に採取し、ハイブリドーマ生成のために調製した。３回目の免疫後にＥＬＩＳＡによって組換えＦｃ融合ヒトＩＣＯＳ ＥＣＤ（実施例１．１．１参照）について血清を試験した。
ＩＣＯＳ抗体１１８３、１１４３（ＮＺＷウサギ）及び１１６７（ｔｇウサギ）の生成
１２～１６週齢のウサギ（ＮＺＷ：ｎ＝２、トランスジェニックウサギ：ｎ＝２）を、全長ヒトＩＣＯＳ（実施例１．１．３を参照されたい）及びヒトＩＣＯＳ発現細胞を交互レジームでコードするプラスミド発現ベクターで遺伝子免疫した。
全ての動物は、０、４及び１２週目に、同時のエレクトロポレーション（７５０Ｖ／ｃｍ、持続時間１０ｍｓ、間隔１ｓの５平方パルス）を伴う皮内適用によって４００μｇのベクターＤＮＡを受けた。さらに、３～５×１０７個のヒトＩＣＯＳ発現ＳＲ細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ－２２６２）又は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；ＢＤ Ｄｉｆｃｏ、＃２６３８１０）中で乳化された若しくはＴＬＲアゴニストの組合せと混合された活性化ヒト初代Ｔ細胞を、２週目に皮内、８週目に筋肉内及び１６週目に皮下注射した。ＣＦＡを細胞免疫化のためのアジュバントとして使用したことを除いて、同様の様式で２８（ＤＮＡ）、４２（Ｔ細胞）、５６（ＤＮＡ）及び７０（Ｔ細胞）日目にブースター免疫化を行った。
血液（推定全血液量の１０％）を、３回目の免疫から開始して、免疫後６日目～８日目に回収した。ＥＬＩＳＡによる抗原特異的力価測定に使用する血清を調製し、末梢単核細胞を単離し、これをＢ細胞クローニングプロセスにおける抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した（実施例１．２．２を参照されたい）。
１．２．２ ウサギからのＢ細胞クローニング
ヒトＩｇＧに対して遺伝子導入された免疫野生型ウサギ又はウサギの血液試料を採取した。ＥＤＴＡを含有する全血を、１×ＰＢＳで２倍に希釈した後、製造業者の仕様に従って、哺乳動物リンパ球（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、密度遠心分離を行った。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
ＥＬ－４ Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び０．０５ｍＭ ｂ－メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０培地を使用した。
プレートのコーティング
滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を抗原でのコーティングに使用した。
コーティング１、タンパク質：ヒトＩＣＯＳタンパク質抗原（ＩＤ １４８６）を炭酸塩コーティング緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、３４ｍＭ炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）で２μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。この溶液３ｍｌを６ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。使用前に、上清を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。
コーティング２、細胞：親ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（コーティング２ａ）又はマウスＩＣＯＳを発現するＣＨＯ細胞（コーティング２ｂ）を６ウェルプレートに播種し、コンフルエントな増殖が観察されるまでインキュベータ中３７℃でインキュベートした。
ＰＢＭＣからのマクロファージ／単球の除去
ＰＢＭＣを、純粋な滅菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）又はＣＨＯ細胞を含む細胞層を既に含む６ウェルプレートに播種して、非特異的接着を通してマクロファージ及び単球を枯渇させた。
各ウェルを、最大で４ｍｌの培地と、免疫付与したウサギ由来の６×１０ｅ６ ＰＢＭＣとで満たし、インキュベータ中、３７℃で１時間かけて結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニング工程に使用し、したがって８００×ｇで１０分間の遠心分離によって濃縮した。ペレットを培地に再懸濁した。
抗原特異的Ｂ細胞の濃縮
血液試料のＰＢＬを２×１０ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度に調整し、３ｍｌをコーティング１又は２のいずれかでコーティングした６ウェルプレートの各ウェル（培地３～４ｍｌ当たり最大６×１０６細胞）に添加する。プレートをインキュベータ中３７℃で６０～９０分間インキュベートした。上清を除去し、ウェルを１×ＰＢＳで１～４回慎重に洗浄することによって非接着細胞を除去した。粘着性抗原特異的Ｂ細胞の回収のために、１ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を６ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で５～１０分間インキュベートした。培地の添加によってインキュベーションを停止し、上清を遠心分離バイアルに移した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、上清を他の上清と合わせた。細胞を８００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化し、免疫蛍光染色まで氷上に保った。
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）及び抗ｈｕＣｋ ＰＥ（Ｄｉａｎｏｖａ）抗体を、単一細胞選別に使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中の抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ及び抗ｈｕＣｋ ＰＥ抗体と共に４℃の暗所で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷したＰＢＳに再懸濁させ、すぐにＦＡＣＳ分析を行った。死んだ細胞と生きている細胞とを区別するためのＦＡＣＳ分析の前に、濃度５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加えた。
コンピュータ及びＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を取り付けたＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａを、単一細胞選別のために使用した。
Ｂ細胞培養
ウサギＢ細胞の培養は、Ｓｅｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４，９（２），ｅ８６１８４によって記載される方法によって行われた。簡単に説明すると、単一細胞選別ウサギＢ細胞を、９６ウェルプレート中で、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５％ウサギ胸腺細胞上清（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ）及びガンマ線照射マウスＥＬ－４ Ｂ５胸腺腫細胞（５×１０ｅ５細胞／ウェル）を含有する２００μｌ／ウェルのＥＬ－４ Ｂ５培地を用いて、インキュベータ中３７℃で７日間インキュベートした。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために取り出し、残った細胞をすぐに集め、１００μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中、－８０℃で凍結させた。
１．２．３ ＶドメインのＰＣＲ増幅
全ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８／９６ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０７０９．４、７４０６９８）を用い、製造業者のプロトコルに従って、Ｂ細胞溶解物から調製した（ＲＬＴバッファー－Ｑｉａｇｅｎ－カタログ番号７９２１６に再懸濁させた）。ＲＮＡを、６０μｌのＲＮａｓｅを含まない水で溶出させた。６μｌのＲＮＡを使用し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１８０８０－４００）及びオリゴｄＴプライマーを用い、製造業者の説明書に従って、逆転写反応によってｃＤＮＡを作成した。全ての工程をＨａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒ Ｓｙｓｔｅｍで行った。国際公開第２０１５／１０１５８８号（表３参照）に記載されているように、重鎖についてはプライマーｒｂＨＣ．ｕｐ及びｒｂＨＣ．ｄｏ、野生型ウサギＢ細胞の軽鎖についてはプライマーｒｂＬＣ．ｕｐ及びｒｂＬＣ．ｄｏ、トランスジェニックウサギＢ細胞の軽鎖についてはプライマーＢｃＰＣＲ＿ＦＨＬＣ＿ｌｅａｄｅｒ．ｆｗ及びＢｃＰＣＲ＿ｈｕＣｋａｐｐａ．ｒｅｖを使用して、最終容量５０μｌでＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２３４４－０４０）を用いて免疫グロブリン重鎖可変領域及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅するために４μｌのｃＤＮＡを使用した。全ての順方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）シグナルペプチドに特異的であり、一方、逆方向プライマーは、（それぞれＶＨ及びＶＬの）定常領域に特異的であった。ＲｂＶＨ＋ＲｂＶＬのＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。９４℃で５分間で熱い状態で開始、９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒を３５サイクル、最後に６８℃で７分間伸長。ＨｕＶＬのＰＣＲ条件は、以下のとおりであった。９４℃で５分間で熱い状態で開始、９４℃で２０秒、５２℃で２０秒、６８℃で４５秒を４０サイクル、最後に６８℃で７分間伸長。８μｌの５０μｌ ＰＣＲ溶液を、４８Ｅ－Ｇｅｌ ２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇ８００８－０２）に充填した。陽性ＰＣＲ反応を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を用い、製造業者のプロトコルを用いて洗浄し、５０μｌ溶出バッファーで溶出させた。全ての洗浄工程をＨａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒｌｅｔ Ｓｙｓｔｅｍで行った。
１．２．４ ハイブリドーマの生成
調製した脾臓を機械的に破壊した。細胞を洗浄し、遠心分離によって回収し、１０ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁した。４℃で５分間溶解した後、４０ｍｌの冷培地（ＲＰＭＩ １６４０）を添加し、細胞を洗浄し、５０ｍｌの冷ＲＰＭＩ １６４０に再懸濁した。リンパ球細胞数の決定後、Ｐ３ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した）を添加した。リンパ球対骨髄腫細胞の比を２：１として選択した。細胞を遠心分離によって回収し、培地を除去し、ＰＥＧ １５００（３７℃；１０８リンパ球あたり１．５ｍｌのＰＥＧ）の添加によって両方の細胞型の融合を開始した。１分間のインキュベーション後、ＲＰＭＩ １６４０培地を３つの連続工程（１、３及び１６ｍｌ）で添加した。細胞を遠心分離によって回収し、１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し、６ウェルプレート中の半固体培地に播種した。ＨＡＴ（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）の添加を使用して、融合ハイブリドーマ細胞を選択した。クローンを３７℃で９～１３日間のインキュベーション後に採取した。
単離したクローンを９６ウェルプレートに移し、７２時間インキュベートした。上清を、ＧＩＴＲ特異的抗体の一次スクリーニング及び同定のために使用する。二次スクリーニングのために、選択されたヒットからの細胞を２４ウェルプレートに移し、分割し、増殖させた。ＩｇＧのμ精製のために、更なる評価まで細胞を－１５０℃で保存しながら、上清を２ｍｌの９６ディープウェルプレートに移した。
１．２．５ ハイブリドーマ細胞からの抗体配列決定
ｍＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキットを使用してハイブリドーマ細胞ペレットから抽出及び精製した。次に、製造者の説明書に従ってＣＬＯＮＥＴＥＣＨ ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５´／３´キットを使用して、精製ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。縮重ＶＨ及びＶＬセンスプライマー並びに遺伝子特異的（ＣＨ／ＣＬ）アンチセンスプライマーを使用して、クローン００９の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸配列をＰＣＲによってｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてベクターにクローニングし、配列決定した。配列を、軽鎖又は重鎖の抗体可変領域を有するように分析した。陽性配列を抗体発現ベクターにクローニングし、抗原特異性についてスクリーニングした。
クローン００９、１１６７、１１４３及び１１３８を、上記の手順によってヒトＩＣＯＳ特異的バインダーとして同定した。それらの可変領域のアミノ酸配列を以下の表４に示す。
１．３ 抗ＩＣＯＳウサギＩｇＧ及びマウスハイブリドーマＩｇＧ抗体の調製、精製及び特性評価
１．３．１ 抗ＩＣＯＳウサギＩｇＧ抗体のクローニング及び発現
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のために、オーバーハング方法によって、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして発現ベクターへとクローン化した（ＲＳ Ｈａｕｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）１３、５１５－５１８；ＭＺ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）４、２５１－２５６）。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターと、３’ＢＧＨ ポリアデニル化配列とからなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加え、プラスミドは、ｐＵＣ１８由来の複製と、Ｅ．Ｃｏｌｉ中のプラスミド増幅について、アンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。塩基性プラスミドの３つのバリアントを使用し、１つのプラスミドはＶＨ領域を受容するように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含み、２つの追加のプラスミドは、ＶＬ領域を受容するためのウサギ又はヒトカッパＬＣ定常領域を含んだ。
カッパ定常領域又はガンマ定常領域及びＶＬ／ＶＨインサートをコードする線形化された発現プラスミドを、重複するプライマーを使用してＰＣＲによって増幅した。精製されたＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡ－ポリメラーゼと共にインキュベートし、一本鎖オーバーハングを作成した。ｄＣＴＰ添加によって反応を止めた。プラスミドと挿入物を合わせ、部位特異的な組換えを誘発するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ内で形質転換した。次の日、成長したコロニーを取り出し、プラスミド調製、制限分析及びＤＮＡシークエンシングによって、正しい組換えプラスミドについて試験した。抗ＩＣＯＳクローンのアミノ酸配列を表５に示す。
抗体発現のために、ＨＥＫ２９３Ｆ培養物を３Ｌの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１５Ｌ作業量、３７℃、８％ｖ／ｖ ＣＯ２、８０ｒｐｍ、５０ｍｍ振幅）中で１Ｌ（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び０．１％プルロニックを含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７）の容量に拡大した。培養物をトランスフェクションの１日前に希釈し、細胞数を１Ｌ培地中１０６細胞／ｍｌに調整した。
一過性発現を、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドの同時トランスフェクションによって行った。ＤＮＡ／ＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＦｅｃｔｏＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ）のＭａｓｔｅｒＭｉｘを純粋なＦ１７培地中で調製し、（ＰｏｌｙＰｌｕｓプロトコルに従って）１０分間インキュベートした。このトランスフェクションミックスを細胞懸濁液に滴下し、Ｂｏｏｓｔｅｒを直ちに添加した。トランスフェクションの１８時間後、培養物に３ｇ／Ｌグルコースを供給した。１週間後に上清を回収し、４０００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、１Ｍグリシン及び３００ｍＭ ＮａＣｌを清澄化された上清に添加し、親和性クロマトグラフィーによる精製に使用した。
ＡＫＴＡプライムシステムに接続した１×ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化した２５ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、０．７ｍＬ／分の流速で１Ｌの上清を充填することによって、初期捕捉工程を室温で行った。２８０ｎｍでのＵＶ吸収が安定したベースラインに達するまで、カラムを３ｍＬ／分の流速で１×ＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄した。結合したタンパク質を、１．２ｍＬの０．５Ｍヒスチジン／ＨＣｌ ｐＨ６を含むチューブ中で３ｍＬ画分として３ｍＬ／分の流速で５０ｍＭ酢酸塩／ＮａＯＨ ｐＨ３．２で溶出した。
プールした画分を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６０又はＳｕｐｅｒｄｅｘ １００ １０／３００増加カラムに適用し、２０ｍＭヒスチジン／ＨＣｌ ｐＨ６．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中でそれぞれ０．５又は１ｍＬ／分の流速で平衡化した。タンパク質凝集の分析を、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ １０μｍ ７．８×３００ｍｍカラムを備えたＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００シリーズＨＰＬＣシステムで、０．７５ｍＬ／分の流速でサイズ排除クロマトグラフィーによって行った。抗体の純度及び分子量を、ＤＴＴを含む又は含まない緩衝液を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はマイクロ流体チップキャピラリー電気泳動（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ）によって分析した。
１．３．２ ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の調製
ハイブリドーマ培養物からモノクローナル抗体を調製するために、細胞を２×１０５細胞／ｍＬで播種し、５００ｍＬの培養培地中で７日間培養した。ハイブリドーマ上清を滅菌濾過（ｓｔｅｒｉｌ ｆｉｌｔｅｒｅｄ）し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。サイズ排除クロマトグラフィーからの単量体Ｆｃ融合タンパク質を含有する画分をプールし、２８０ｎｍでの計算された吸光係数に基づいて、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｑＬａｂ ＮＤ－１０００）を使用してＵＶ法によってタンパク質濃度を決定した。タンパク質凝集の分析を、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ １０μｍ ７．８×３００ｍｍカラムを備えたＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００シリーズＨＰＬＣシステムで、０．７５ｍＬ／分の流速でサイズ排除クロマトグラフィーによって行った。抗体の純度及び分子量を、ＤＴＴを含む又は含まない緩衝液を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はマイクロ流体チップキャピラリー電気泳動（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ）によって分析した。
表６は、抗ＩＣＯＳ ＩｇＧ１抗体の収量及び最終含量を要約する。
実施例２
抗ＩＣＯＳ抗体の特性評価
２．１ ヒトＩＣＯＳへの結合
２．１．１ 表面プラズモン共鳴（結合活性＋親和性）
組換え単量体ＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）に対する免疫化由来ＩＣＯＳ特異的抗体の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。
数値積分によって１：１ラングミュア結合の速度方程式に適合させるために、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、ウプサラ／スウェーデン）を使用して速度定数を導出し、結合活性を定性的に推定するために使用した。
同じ実験において、免疫化由来ＩＣＯＳ特異的抗体分子８、分子１４、分子１８及び分子２０の間の相互作用の組換えヒトＩＣＯＳに対する親和性を決定した。この目的のために、ヒトＩＣＯＳの外部ドメインをａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）タグとインフレームでサブクローニングした（配列については表７を参照されたい）。
Ｆｃ融合タンパク質について上記のようにタンパク質の産生を行った。分泌されたタンパク質を、キレートクロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。
第１のクロマトグラフィー工程は、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４で平衡化したＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）で行った。溶出は、５％～４５％の溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｎＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を１２カラム容量に対して勾配を適用することによって行った。
タンパク質を濃縮し、フィルタにかけた後、ｐＨ７．４の２ｍＭ ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
親和性決定を、２つの設定を用いて行った。
設定１：抗ウサギＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ケンブリッジシャー／英国）を、標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、フライブルク／ドイツ）を使用してｐＨ４．５でＣＭ５チップ上に直接カップリングさせた。固定化レベルは約９０００ＲＵであった。ＩＣＯＳに対するウサギ免疫化由来抗体（分子８、分子１８、分子２０）を５．０ｎＭの濃度で３０秒間捕捉した。組換えヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）を７．５ｎＭ～６００ｎＭの濃度範囲でフローセルに６０μＬ／分の流量で１２０秒間にわたって通した。解離を７２０秒間監視した。バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。ここでは、抗原を、固定化された抗ウサギＦｃ抗体を有するが、抗体ではなくＨＢＳ－ＥＰが注入された表面上に流した。
設定２：抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ／米国）を、標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ、フライブルク／ドイツ）を使用してｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接カップリングさせた。固定化レベルは約５０００ＲＵであった。ＩＣＯＳに対するマウス免疫由来抗体（分子１４）を５．０ｎＭの濃度で３０秒間捕捉した。組換えヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）を７．５ｎＭ～６００ｎＭの濃度範囲でフローセルに６０μＬ／分の流量で１２０秒間にわたって通した。解離を７２０秒間監視した。バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。ここでは、抗原を、固定化された抗マウスＩｇＧ抗体を有するが、抗体ではなくＨＢＳ－ＥＰが注入された表面上に流した。
抗ＩＣＯＳ抗体とヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）との間の相互作用についての親和定数を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して１：１ラングミュア結合に適合させることによって決定した分子８、分子１４、分子１８及び分子２０がヒトＩＣＯＳに結合することが示された（表８）。
２．２ リガンド遮断特性
細胞ベースの受容体リガンド結合アッセイを実施して、ＩＣＯＳのそのリガンドＩＣＯＳＬＧへの結合を遮断する抗ＩＣＯＳ抗体の能力を決定した。
ビオチン化組換えヒトＩＣＯＳタンパク質を、実施例２．１における組換えヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）について記載されるように調製した。
ヒトＩＣＯＳリガンドをコードする全長ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）にトランスフェクトして、組換えＩＣＯＳリガンド発現細胞（ＣＨＯ－ＩＣＯＳＬＧ）を作製した。メーカーのプロトコルに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃１５３３８１００）を使用してプラスミドをトランスフェクションした。安定にトランスフェクトされたＩＣＯＳＬＧ陽性ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、＃１６１４００６３）及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（Ｇｉｂｃｏ；＃３１３３１－０２８）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、＃１１３２００３３）中で維持した。トランスフェクションの２日後、ピューロマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；＃ａｎｔ－ｐｒ－１）を６μｇ／ｍＬに添加した。最初の選択後、ＩＣＯＳＬＧの最も高い細胞表面発現を有する細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別し、培養して安定な細胞クローンを確立した。発現レベル及び安定性を、４週間にわたってＡＰＣ抗ヒトＣＤ２７５抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；＃３０９４０７）を使用するＦＡＣＳ分析によって確認した。
３８４ウェルポリ－Ｄ－リジンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５６６６２）を１ウェルあたり２５μｌ／１×１０４ＣＨＯ－ＩＣＯＳＬＧ細胞でコーティングし、密封し、３７℃で一晩インキュベートした。１５０ｎｇ／ｍｌの最終アッセイ濃度でのビオチン化ヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）をそれぞれの抗ＩＣＯＳ抗体（１４希釈段階１：２、アッセイでの開始濃度４μｇ／ｍｌ）とプレインキュベートし、室温で１時間インキュベートした。
細胞被覆プレートの遠心分離後、２５μｌ／ウェルのプレインキュベートした試料を細胞に添加し、４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液（ＤＰＢＳ、ＰＡＮ、Ｐ０４－３６５００＋０、１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で３×９０μｌ／ウェルを洗浄した後、各ウェルを１×ＰＢＳ（５０μｌ／ウェル、Ｓｉｇｍａ カタログ番号：Ｇ５８８２）中の０．０５％グルタルアルデヒドと共に室温で１０分間インキュベートして、細胞試料混合物を固定した。
ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェル洗浄した後、細胞表面でヒトＩＣＯＳ－Ｌと相互作用するヒトＩＣＯＳを、ストレプトアビジン－ＰＯＤコンジュゲート（Ｒｏｃｈｅ、＃１１０８９１５３００１、１：４０００）の添加及びＲＴでの１時間のインキュベーションによって検出した。ＰＢＳＴ緩衝液で３×９０μｌ／ウェルを更に洗浄した後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、＃１１８３５０３３００１）を５分間添加した。測定を３７０／４９２ｎｍで行った（表９）。
２．３ エピトープ特性評価
免疫化由来の抗ＩＣＯＳ抗体によって認識されるエピトープを、表面プラズモン共鳴によって特性評価した。
２．３．１ 競合結合（表面プラズモン共鳴）
抗ＩＣＯＳ抗体のヒト受容体に対する競合的結合を分析するために、ビオチン化ヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）をストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップの異なるフローセルに直接カップリングさせた。６００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルを使用した。免疫由来の抗ＩＣＯＳクローン分子８、分子１４、分子１８及び分子２０を、２ｎＭ～５００ｎＭの濃度範囲（３倍希釈）で、３０μＬ／分の流量で１２０秒間にわたってフローセルに通した。解離を省略し、第２の抗ＩＣＯＳ抗体を１００ｎＭの濃度で３０μＬ／分の流量で９０秒間にわたって通過させた。バルク屈折率差を、参照フローセルで得られた応答を差し引くことによって補正した。
ＳＰＲ実験を、ランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％界面活性剤Ｐ２０，Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃にて実施した。競合結合実験は、２つの抗体がヒトＩＣＯＳ Ｆｃ（ｋｉｈ）に同時に結合することができることから、免疫化由来の抗ＩＣＯＳクローン分子８、分子１４及び分子２０が分子１８として異なるエピトープビンを共有することを示した（表１０）。
実施例３
ＩＣＯＳ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性構築物の生成
３．１ ＩＣＯＳ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性一価抗原結合分子の生成（１＋１フォーマット）
２つの異なる重鎖の集合を可能にするためにノブ・イントゥ・ホール技術を適用することによって、ＩＣＯＳ及びＦＡＰに対する一価結合を有する二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体を調製した。ｃｒｏｓｓｍａｂ技術は、国際特許出願の国際公開第２０１０／１４５７９２号Ａ１に記載されているように、誤って対になった軽鎖の形成を減少させるために適用された。
ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
二重特異性構築物は、ＩＣＯＳ及びＦＡＰに一価で結合する（図１Ａ）。これは、抗ＩＣＯＳ ｈｕＩｇＧ１（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含有する）のホール重鎖に融合されたＦＡＰ抗原結合ドメインの交差Ｆａｂユニット（ＶＬＣＨ１）を含有する。Ｆｃノブ重鎖（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む）は、抗ＩＣＯＳ抗原結合ドメインを含むＦａｂに融合される。標的化された抗ＦＡＰ－Ｆｃホールを抗ＩＣＯＳ－Ｆｃノブ鎖と組み合わせることにより、ＦＡＰに特異的に結合するＦａｂ及びＩＣＯＳに特異的に結合するＦａｂを含むヘテロ二量体の生成が可能になる。
国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。
得られた二重特異性二価構築物は、図１Ａに示すものと類似している。成熟二重特異性一価抗ＩＣＯＳ（１１６７）／抗ＦＡＰ（４Ｂ９）ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｋｉｈ抗体（１＋１フォーマット）のアミノ酸配列を表１１に示す。
二重特異性の一価抗ＩＣＯＳ及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖２」）で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。
１Ｌ振盪フラスコでの産生のために、１０６個細胞／ｍＬのＨＥＫ２９３Ｆ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。目的の標的タンパク質をコードするプラスミドを用いて一過性トランスフェクションを行った。ＤＮＡ／ＦｅｃｔｏＰｒｏのＭａｓｔｅｒＭｉｘを純粋なＦ１７培地中で調製し、１０分間インキュベートした。このトランスフェクションミックスを細胞懸濁液に滴下し、Ｂｏｏｓｔｅｒを直ちに添加した。トランスフェクションの１８時間後、培養物に３ｇ／Ｌグルコースを供給した。
７日間培養した後、細胞上清を２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルタ）、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるように補充し、４℃に保った。
そこに含まれる組換え抗体を、プロテインＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除クロマトグラフィーを使用する親和性クロマトグラフィーによって２段階で上清から精製した。簡潔には、抗体含有の清澄化培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅプロテインＡ（５～５０ｍｌ）カラムに適用した。未結合タンパク質を平衡化緩衝液で洗い流した。抗体を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。タンパク質含有画分を２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ：３０ Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮して、ｐＨ６．０の２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）に充填した。様々な画分のタンパク質濃度を、Ｐａｃｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４（１９９５）２４１１－２４２３のアミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、バックグラウンド補正として３２０ｎｍでのＯＤを用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって決定した。等。単量体抗体画分をプールし、急速凍結し、－８０℃で保存した。試料の一部を、その後のタンパク質分析及び特性評価のために提供した。
精製されたタンパク質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量し、変性及び還元条件下（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及び分析ＳＥＣ（ＵＰ－ＳＷ３０００、Ｔｏｓｈｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。還元条件下で、見かけの分子サイズを分子量標準と比較することによって、ＩｇＧに関連するポリペプチド鎖をＬａｂ Ｃｈｉｐデバイスで同定した。分子同一性の決定は、超高速液体クロマトグラフィーシステム（ＵＰＬＣ）に連結された最先端のエレクトロスプレー四重極－飛行時間型（ＥＳＩ－Ｑ－ＴｏＦ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ）によって行った。
全ての構築物の発現レベルをプロテインＡによって分析した。平均タンパク質収量は、このような最適化されていない一過性発現実験では、細胞培養上清１リットル当たり２５ｍｇ～８６ｍｇの精製タンパク質であった（表１２、１４、１６、１８、２１、３１及び３３を参照されたい）。
３．２ ＩＣＯＳ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性一価抗原結合分子（１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ形式）の生成
ＩＣＯＳに対する一価結合及びＦＡＰに対する一価結合（１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌフォーマットとも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト性４－１ＢＢ抗体を、図１Ｂに示されるように調製した。
本実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１を、以下の構成要素で構成した。抗ＩＣＯＳバインダーのＶＨＣＨ１、続いてＦｃノブ（このＣ末端にて、抗ＦＡＰバインダーのＶＬを融合した）。第２の重鎖ＨＣ２は、Ｃ末端に抗ＦＡＰバインダーのＶＨが融合されたＦｃホールを含んでいた。ＦＡＰバインダー４Ｂ９の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＣＯＳ（１１６７）に対するバインダーを、実施例１に記載したように生成した。
国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。
二重特異性１＋１抗ＩＣＯＳ 抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載されるように構築物を作製し、精製した（実施例３．１を参照されたい）。
１＋１ ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ抗ＩＣＯＳ、抗ＦＡＰ構築物についてのアミノ酸配列を表１３に見出すことができる。
３．３ ＩＣＯＳについては二価であり、ＦＡＰについては一価である、ＩＣＯＳ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成（２＋１フォーマット）
ＩＣＯＳに対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体を、図１Ｃに示されるように調製した。
本実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１を、以下の構成要素で構成した。抗ＩＣＯＳバインダーのＶＨＣＨ１、続いてＦｃノブ（このＣ末端にて、抗ＦＡＰバインダーのＶＬを融合した）。第２の重鎖ＨＣ２は抗ＩＣＯＳのＶＨＣＨ１、続いてＦｃホールで構成され、このＣ末端にて、抗ＦＡＰバインダーのＶＨを融合した。ＩＣＯＳに対するバインダー（００９、１１３８、１１４３及び１１６７）を実施例１に記載のように生成した。
ウサギ抗体分子２０及び分子１８の相同性モデリングは、ＶＨ位置１９９及び２５１の２つのシステイン（Ｋａｂａｔ ３５Ａ及び５０）がＣＤＲ－Ｈ１とＣＤＲ－Ｈ２との間にジスルフィド架橋を形成する一方で、ＶＬフレームワーク位置７２６のシステイン（Ｋａｂａｔ ８０）は遊離しており、溶媒に曝露されていることを示唆した。両方の場合において、本発明者らは、全ての望ましくないシステインをセリン、すなわちＣ１９９Ｓ、Ｃ２５１Ｓ及びＣ７２６Ｓで置換するという最も控えめな選択肢を選んだ。本発明者らは、抗体分子２０をヒト化する必要があると予想したため、最も適合するヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ３－２３＊０１、すなわちＣ１９９Ｓ及びＣ２５１Ｖに従って置換を行う２つの追加のバリアントを加えた。それに応じて、位置２５２、２９６及び２９７（Ｋａｂａｔ ５１、６２及び６３）を変更して、結合親和性を失うことなくＣＤＲ－Ｈ２におけるこれらの置換が許容されるかどうかを評価し、ヒトらしさを高めるという付加的な利益を得た。明示的に述べられていない場合、残基インデックスはＷｏｌｆＧｕｙナンバリングで与えられる。表１５は、分子２０及び分子１８のアミノ酸配列の変異及びバリアント分子の数を要約する。
分子１４におけるフレームワーク変異の影響を検証するために、２＋１フォーマットの２つのバリアントを生成した（分子１５及び分子４０）。
ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
二重特異性２＋１抗ＩＣＯＳ 抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：２：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載されるように構築物を作製し、精製した（実施例３．１を参照されたい）。
２＋１抗ＩＣＯＳ、抗ＦＡＰ構築物についてのアミノ酸配列を表１６に見出すことができる。
３．４ ＩＣＯＳについては二価であり、ＦＡＰについては一価である、ＩＣＯＳ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成（２＋１ クロスｆａｂ－ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）
ＩＣＯＳに対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合（２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＦＡＰバインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換）とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体を、図１Ｄに示されるように調製した。
本実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１を、以下の構成要素で構成した。抗ＦＡＰ抗原結合ドメインのＶＬＣＨ１、続いて抗ＩＣＯＳ抗原結合ドメインのＶＨＣＨ１及びＦｃノブ。第２の重鎖ＨＣ２は、抗ＩＣＯＳのＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールとで構成した。ＩＣＯＳ（１１６７）に対する抗体を、実施例１に記載したように生成した。ＦＡＰ抗体（４Ｂ９）の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。
二重特異性２＋１抗ＩＣＯＳ 抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：２：１：１の比（「ベクター重鎖（ＶＬ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ １－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ １－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨＣＬ）」で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載されるように構築物を作製し、精製した（実施例３．１を参照されたい）。
これらの２＋１抗ＩＣＯＳ、抗ＦＡＰ Ｃｒｏｓｓｆａｂ－ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ構築物についてのアミノ酸配列を表１８に見出すことができる。
３．５ ＩＣＯＳについては二価であり、ＦＡＰについては一価である、ＩＣＯＳ及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成（２＋１ クロスｆａｂ－ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ逆位）
ＩＣＯＳに対する二価結合及びＦＡＰに対する一価結合（２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、逆位（ＦＡＰバインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換）とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体を、図１Ｅに示されるように調製した。
本実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１を、以下の構成要素で構成した。抗ＩＣＯＳバインダーのＶＨＣＨ１、続いて抗ＦＡＰバインダーのＶＬＣＨ１及びＦｃノブ。第２の重鎖ＨＣ２は、抗ＩＣＯＳのＶＨＣＨ１と、それに続くＦｃホールとで構成した。ＩＣＯＳ（１１６７）に対するバインダーを、実施例１に記載したように生成した。ＦＡＰバインダー（４Ｂ９）の生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号Ａ２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。
二重特異性２＋１抗ＩＣＯＳ 抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ逆位抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：２：１：１の比（「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）」：「ベクター重鎖（ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）」：「ベクター軽鎖（ＶＨ－ＣＬ）」で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載されるように構築物を作製し、精製した（実施例３．１を参照されたい）。
２＋１抗ＩＣＯＳ、抗ＦＡＰ Ｃｒｏｓｓｆａｂ－ＩｇＧ Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ逆位構築物についてのアミノ酸配列を表２０に見出すことができる。
実施例４
マウス及びウサギ抗ＩＣＯＳ抗体のヒト化
４．１ 方法
適切なヒトアクセプターフレームワークは、ヒトＶ及びＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータベースにマウス入力配列（可変部分に植え付けられた）を照会することによって特定された。ヒトアクセプターフレームワークを選択するための選択基準は、配列相同性、同じ又は類似のＣＤＲ長、及びヒト生殖細胞系列の推定頻度だったが、ＶＨ－ＶＬドメインインターフェースでの特定のアミノ酸の保存でもあった。生殖細胞系列の同定ステップに続いて、マウス入力配列のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク領域に移植した。これらの最初のＣＤＲ移植片と親抗体の間の各アミノ酸の違いは、それぞれの可変領域の構造的完全性への影響の可能性について評価され、親配列に対する「逆変異」が適切と思われる場合はいつでも導入された。構造評価は、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン１７Ｒ２を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングプロトコルにより作製し、親抗体とヒト化バリアントの両方のＦｖ領域相同性モデルに基づいた。いくつかのヒト化バリアントには、「順変異」、すなわち、親バインダーの所与のＣＤＲ位置で発生する元のアミノ酸をヒト受容体生殖細胞系列の同等の位置で見られるアミノ酸に変更するアミノ酸交換が含まれていた。目的は、免疫原性のリスクを更に低減するために、（フレームワーク領域を超えて）ヒト化バリアントの全体的な人間性を高めることである。
社内で開発されたｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して、対になったＶＨ及びＶＬヒト化バリアントのＶＨ－ＶＬドメイン配向を予測した（国際公開第２０１６／０６２７３４号）。結果を親バインダーの予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、元の抗体に形状が近いフレームワークの組合せを選択した。理論的根拠は、結合特性に悪影響を与える可能性がある２つのドメインの対合に破壊的な変化をもたらす可能性のあるＶＨ－ＶＬインターフェース領域でのアミノ酸交換の可能性を検出することである。
４．２ アクセプターフレームワークの選択及びその適合
００９のヒト化
ＣＤＲ３後フレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖細胞系列ＩＧＨＪ６＊０１／０２（ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ、配列番号１２０）及びヒトＩＧＫＪ生殖細胞系列ＩＧＫＪ２＊０１（ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ、配列番号１２１）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造的考察に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダー中のアミノ酸への復帰突然変異を、Ｈ４０（Ｐ＞Ｓ）、Ｈ４２（Ｇ＞Ｅ）、Ｈ４９（Ｇ＞Ａ）、Ｈ９４（Ｒ＞Ｗ）、Ｈ１０５（Ｋ＞Ａ）［ＶＨ１］、Ｈ４０（Ｐ＞Ｓ）、Ｈ４２（Ｇ＞Ｅ）、Ｈ９３（Ａ＞Ｔ）、Ｈ９４（Ｒ＞Ｗ）、Ｈ１０５（Ｋ＞Ａ）［ＶＨ２］、Ｌ３８（Ｑ＞Ｈ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｇ）、Ｌ４９（Ｙ＞Ｗ）、Ｌ１００（Ｑ＞Ｓ）［ＶＬ１］、及びＬ３８（Ｑ＞Ｈ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｇ）、Ｌ４９（Ｙ＞Ｗ）、Ｌ１００（Ｑ＞Ｓ）［ＶＬ２］の位置に導入した。
さらに、Ｈ６０（Ｓ＞Ａ）、Ｈ６１（Ｄ＞Ａ）［ＶＨ１］、Ｈ６０（Ｓ＞Ａ）［ＶＨ２］、Ｌ２４（Ｋ＞Ｑ）［ＶＬ１］、及びＬ２４（Ｋ＞Ｒ）［ＶＬ２］の位置を、正突然変異の有望な候補として同定した（Ｋａｂａｔナンバリング）。
１１３８のヒト化
ＣＤＲ３後フレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖細胞系列ＩＧＨＪ１＊０１（ＡＥＹＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ、配列番号１２２）及びヒトＩＧＫＪ生殖細胞系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ、配列番号１２２３）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造的考察に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダー中のアミノ酸への復帰突然変異を、Ｈ７１（Ｒ＞Ｋ）、Ｈ７２（Ｄ＞Ｔ）、Ｈ７３（Ｎ＞Ｓ）、Ｈ７６（Ｎ＞Ｔ）、Ｈ９１（Ｙ＞Ｆ）、Ｈ９４（Ｋ＞Ｒ）［ＶＨ１］、及びＬ１（Ｄ＞Ａ）、Ｌ４２（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｐ）［ＶＬ１］の位置に導入した。さらに、ＶＨの１つのバリアントでは、Ｎ末端が復帰突然変異され（Ｖ＞ＱからのＨ１の除去及びＨ２の変異）、ＶＨの１つのバリアントでは、ウサギフレームワークのＨ７５位のギャップが再導入された。
さらに、位置Ｈ６１（Ｓ＞Ｄ）、Ｈ６２（Ｗ＞Ｓ）、Ｈ６３（Ａ＞Ｖ）［ＶＨ１］及びＬ２４（Ｑ＞Ｒ）［ＶＬ１］が、正突然変異の有望な候補として同定された（Ｋａｂａｔナンバリング）。
１１４３のヒト化
ＣＤＲ３後フレームワーク領域を、ヒトＩＧＨＪ生殖細胞系列ＩＧＨＪ１＊０１（ＡＥＹＦＱＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ、配列番号１２２）及びヒトＩＧＫＪ生殖細胞系列ＩＧＫＪ４＊０１／０２（ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ、配列番号１２３）から適合させた。アクセプターフレームワークに関連する部分は太字で示されている。
構造的考察に基づいて、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダー中のアミノ酸への復帰突然変異を、Ｈ４８（Ｖ＞Ｉ）、Ｈ４９（Ｓ＞Ｇ）、Ｈ７１（Ｒ＞Ｋ）、Ｈ７２（Ｄ＞Ｔ）、Ｈ７３（Ｎ＞Ｓ）、Ｈ７６（Ｎ＞Ｔ）、Ｈ９１（Ｙ＞Ｆ）、Ｈ９４（Ｋ＞Ｒ）［ＶＨ１］、及びＬ４２（Ｋ＞Ｑ）、Ｌ４３（Ａ＞Ｐ）［ＶＬ１］の位置に導入した。さらに、ＶＨの２つのバリアントでは、Ｎ末端が復帰突然変異され（Ｖ＞ＱからのＨ１の除去及びＨ２の変異）、ＶＨの２つのバリアントでは、ウサギフレームワークのＨ７５位のギャップが再導入された。
さらに、位置Ｈ６１（Ｔ＞Ｄ）［ＶＨ１］及びＬ２４（Ｑ＞Ｒ）［ＶＬ１］が、正突然変異の有望な候補として同定された（Ｋａｂａｔナンバリング）。
４．３ ヒト化バリアント
逆変異の前にはｂが付いており、順変異にはｆが付いている。例えば、ｂＭ４８Ｉは、４８位（Ｋａｂａｔナンバリング）のメチオニンからイソロイシンへの逆変異（ヒト生殖細胞系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。
ヒト化バリアントのアミノ酸配列を、以下の表２８に見出すことができる。
４．４ ヒト化バリアントのクローニング及び発現
重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。タンパク質発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、合成ポリＡシグナル配列がＣＤＳの３’末端に存在する。選択された抗ＩＣＯＳヒト化バリアントのアミノ酸配列を表２９に示す。
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）細胞を哺乳動物発現ベクターと同時トランスフェクトすることによって、ヒトＩｇＧフォーマットのヒト化バリアントを作製した。対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）で細胞にトランスフェクトした。
４８ディープウェルプレートでの産生のために、２．５ｅ６細胞／ｍＬ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をトランスフェクションの日に播種した。目的の標的タンパク質をコードするプラスミドを用いて一過性トランスフェクションを行った。ＤＮＡ／ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３のＭａｓｔｅｒＭｉｘをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中で調製し、５分間インキュベートし、細胞懸濁液に添加した。トランスフェクションの２４時間後、各ウェルに１０μＬのエンハンサー１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び１００μＬのエンハンサー２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を供給した。
５日間培養した後、細胞上清を１２００×ｇで５０分間の遠心分離によって回収した。溶液を滅菌濾過（０．２μｍフィルタ）し、４℃に保った。
分泌されたタンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して９６ウェルフォーマットで液体処理プラットフォーム上の親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製する。親和性クロマトグラフィーのため、上清を、２９０μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で２回平衡化したＰｒｏＰｌｕｓ ＰｈｙＴｉｐ Ｃｏｌｕｍｎ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（ＣＶ＝４０μｌ；先端体積５００μｌのＰｈｙｎｅｘｕｓ）に充填する。未結合タンパク質を３００μｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で４回洗浄することによって除去し、標的タンパク質を１５０μｌの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で２回溶出する。タンパク質溶液を、３０μｌの０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を添加することによって中和する。
精製されたタンパク質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して定量し、変性及び還元条件下（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及び分析ＳＥＣ（ＵＰ－ＳＷ３０００、Ｔｏｓｈｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＣＥ－ＳＤＳによって分析した。還元条件下で、見かけの分子サイズを分子量標準と比較することによって、ＩｇＧに関連するポリペプチド鎖をＬａｂ Ｃｈｉｐデバイスで同定した。
実施例５
抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化バリアントの生成
５．１ 方法
抗ＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７は例えば、Ｍ．Ｊ．Ｂａｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９７，２９（２），１６１－１７１により開示されており、その構造は、タンパク質構造データベースＰＤＢ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ，Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，２８，２３５－２４２）においてＰＤＢ ＩＤ：１ＣＬＯとして見つけることができる。このエントリーは、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。抗ＣＥＡバインダーＡ５Ｂ７のヒト化の間に、好適なヒトアクセプターフレームワークを識別するために、高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、このフレームワークのＣＤＲをグラフトし、復帰突然変異が予想可能なものを評価することによる、古典的なアプローチを利用した。より明示的には、親抗体に対する、識別したフレームワークの各アミノ酸の違いの、バインダーに対する構造的完全性の影響を判断し、適切な場合はいつでも、親配列に対する逆変異を導入した。構造評価は、親抗体、及び、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，バージョン４．５を使用して実装した、社内で抗体構造相同性モデリングツールにより作製したそのヒト化版の両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
５．２ アクセプターフレームワークの選択及びその適合
アクセプターフレームワークを、下表３０に記載のとおりに選択した。
重鎖に関しては、ヒトＪエレメント生殖細胞系列ＩＧＪＨ６、及び、軽鎖に関しては、カッパＪエレメントＩＧＫＪ２に類似した配列から、ポストＣＤＲ３フレームワーク領域を適合させた。
構造の考察に基づき、親バインダーにおける、ヒトアクセプターフレームワークからアミノ酸への復帰突然変異を、重鎖の位置９３及び９４に導入した。
５．３ 得られるヒト化ＣＥＡ抗体のＶＨ及びＶＬ領域
ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＨドメインは、下表３１に見いだすことができ、ヒト化ＣＥＡ抗体の得られたＶＬドメインは、下表３２に列挙されている。
重鎖に関して、最初のバリアント３－２３Ａ５－１は、結合アッセイにおいて好適であることが発見され（しかし、親マウス抗体よりわずかに低い結合を示した）、更なる修飾のための起点として選択した。ＩＧＨＶ３－１５に基づくバリアントは、ヒト化バリアント３－２３Ａ５－１と比較して、低い結合活性を示した。
親キメラ抗体の完全な結合活性を復元するために、バリアント３－２３Ａ５－１Ａ、３－２３Ａ５－１Ｃ、及び３－２３Ａ５－１Ｄを作製した。ＣＤＲ－Ｈ２の長さがヒトアクセプター配列に適合可能であるか否か、バリアント３－２３Ａ５－１を試験したが、この構築物は完全に結合活性を失っていた。推定では、アミド分解ホットスポットはＣＤＲ－Ｈ２（Ａｓｎ５３－Ｇｌｙ５４）に存在したため、このモチーフをＡｓｎ５３－Ａｌａ５４に変更した。可能性のある別のホットスポットＡｓｎ７３－Ｓｅｒ７４を、Ｌｙｓ７３－Ｓｅｒ７４に復帰突然変異させた。このように、バリアント３－２３Ａ５－１Ｅを作製した。
ヒトＩＧＫＶ３－１１アクセプターフレームワークに基づき、軽鎖をヒト化した。連続したＡ５－Ｌ１からＡ５－Ｌ４において、バリアントＡ５－Ｌ１は良好な結合活性を示す（しかし、親抗体をわずかに下回る）ことが分かった。ＣＤＲ－Ｌ１（バリアントＡ５－Ｌ２；Ｋａｂａｔ位置３０及び３１）の部分的なヒト化により、結合が完全に失われる。同様に、ＣＤＲ－Ｈ２（バリアントＡ５－Ｌ３；Ｋａｂａｔ位置５０～５６）のヒト化によってもまた、結合が完全に失われる。位置９０（バリアントＡ５－Ｌ４）は、結合特性に対する著しい寄与を示す。この位置におけるヒスチジンは、結合に重要である。したがって、バリアントＡ５－Ｌ１を更なる修飾のために選択した。
連続したＡ５－Ｌ１Ａ～Ａ５－Ｌ１Ｄは、親キメラ抗体の完全な結合能力を復元するために、どの復帰突然変異が必要であるかの問いを解決した。Ｋａｂａｔ位置１、２、全体フレームワーク２、並びにＫａｂａｔ位置７１における復帰突然変異は、どのような更なる結合活性も添加しないことを、バリアントＡ５－Ｌ１Ａは示した。変異体Ａ５－Ｌ１Ｂ、及びＡ５－Ｌ１Ｃは、これらの位置のサブセットを解決し、そのサブセットは結合特性を変化させないことを確認する。Ｋａｂａｔ位置４６及び４７において復帰突然変異を有するバリアントＡ５－Ｌ１Ｄは、最良の結合活性を示した。
５．４ ヒト化Ａ５Ｂ７抗体の選択
ＶＨ及びＶＬの新規のヒト化変異体に基づき、国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、新規のＣＥＡ抗体を、エフェクターサイレントＦｃ（Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４、Ｌ２３５Ａ）を有するｈｕＩｇＧ１抗体として発現させてＦｃγ受容体への結合をなくし、ＭＫＮ４５細胞上で発現したＣＥＡへの結合を試験し、それぞれの親マウスＡ５Ｂ７抗体と比較した。
ＭＫＮ４５（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）は、ＣＥＡを発現するヒトの胃腺癌細胞株である。細胞を、高度ＲＰＭＩ＋２％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘで培養した。ＭＫＮ－４５細胞の生存能を確認し、細胞を再懸濁し、１Ｍｉｏ細胞／ｍＬの密度に調節した。１００μＬのこの細胞懸濁液（０．１Ｍｉｏ細胞を含有）を、９６ウェルの丸底フラスコに播種した。プレートを４分間４００×ｇで遠心分離し、上清を取り除いた。次に、４０μＬの希釈抗体又はＦＡＣＳ緩衝液を細胞に添加し、３０分間４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、２０μＬの希釈した二次ＰＥ抗ヒトＦｃ特異性二次抗体（１０９－１１６－１７０，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に加えた。細胞を更に３０分間、４℃にてインキュベートした。結合していない抗体を取り除いた後、細胞を再び、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を固定するために、１％ ＰＦＡを含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液をウェルに添加した。測定前に、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤフローサイトメーターを使用して蛍光を測定した。試験したバインダーは全て、ＭＫＮ４５細胞に結合することができたが、結合能力は、親Ａ５Ｂ７抗体と比較してわずかに低下した。クローンＰ１ＡＥ２１６７は、試験した全ての変異体に最良の結合を有したので、更なる開発のために選択した。
５．５表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用した、マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体のＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡに対する親和性の測定
マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体のＦａｂ断片の、ヒトＣＥＡに対する親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器を用いる表面プラズモン共鳴により評価した。ＣＭ５チップ上で、ヒトＣＥＡ（ｈｕ Ｎ（Ａ２－Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ Ｂ）を、フローセル２上での３０秒間の、約１００ＲＵに対する標準的なアミンカップリングにより、４０ｎＭの濃度で不動態化した。マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体のＦａｂ断片を、１２０秒の接触時間、２５０又は１０００秒の解離時間、及び３０μＬ／分の流速に対して、５００～０．６５６ｎＭの範囲の３倍希釈で、分析物としてその後注入した。ヒトＣＥＡ（ｈｕ Ｎ（Ａ２－Ｂ２）Ａ－ａｖｉ－Ｈｉｓ Ｂ）の濃度における再生は、２パルスの、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．０（６０秒間）により達成された。不動態化フローセル１、及び分析物のゼロ濃度に対して、データを二重参照した。分析物の前記を、単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。ヒトＣＥＡ（Ａ２ドメイン）に対する親和性定数［ＫＤ］を、下表３４に要約する。
マウスＣＥＡ抗体Ａ５Ｂ７のヒト化変異体は、親マウス抗体よりも低い親和性を有する。Ｐ１ＡＥ２１６７（ＶＨバリアント３－２３Ａ５－１Ａを有する重鎖、及びＶＬバリアントＡ５－Ｌ１Ｄを有するＣカッパ軽鎖）に由来するＦａｂ断片Ｐ１ＡＥ４１３８を、最終のヒト化バリアントとして選択した。更に、アミド分解部位を取り除くために、Ｋａｂａｔ位置５４における、グリシンからアラニンへの変異（Ｇ５４Ａ）をＶＨドメインに導入し、ＶＬバリアント３－２３Ａ５－１Ｅをもたらした。最終のヒト化抗体（ＶＨバリアント３－２３Ａ５－１Ｅを有する重鎖、及びＶＬバリアントＡ５－Ｌ１Ｄを有するＣカッパ軽鎖）の名前を、Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ又はｈｕＡ５Ｂ７とした。
実施例６
ＩＣＯＳ及び癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成
６．１ ＩＣＯＳ及び癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性一価抗原結合分子の生成（１＋１フォーマット）
２つの異なる重鎖の集合を可能にするためにノブ・イントゥ・ホール技術を適用することによって、ＩＣＯＳ及びＣＥＡに対する一価結合を有する二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体を調製した。ｃｒｏｓｓｍａｂ技術は、国際特許出願の国際公開第２０１０／１４５７９２号Ａ１に記載されているように、誤って対になった軽鎖の形成を減少させるために適用された。ＩＣＯＳに一価及びＣＥＡに一価で結合する二重特異性抗原結合分子の概略図を図１Ｆ～１Ｈに示す。
ＣＥＡ抗原結合ドメインについては、クローンＭＥＤＩ－５６５のＶＨ及びＶＬ配列を国際特許出願の国際公開第２０１４／０７９８８６号Ａ１から得た。ＣＥＡ抗体（Ａ５Ｈ１ＥＬ１Ｄ）の生成及び調製は、実施例５に記載されている。ＩＣＯＳ抗体ＪＭａｂ１３６については、クローンＪＭＡｂ１３６のＶＨ及びＶＬ配列を米国特許出願公開第２００８／０１９９４６６号Ａ１から入手した。
分子３７は、ｈｕＩｇＧ１のノブ重鎖に融合したＣＥＡ抗体の交差Ｆａｂユニット（ＶＬＣＨ１）を含む（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む）。Ｆｃホール重鎖（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む）を、ＩＣＯＳに結合するＦａｂ単位に融合する（図１Ｆ）。分子４１は、ｈｕＩｇＧ１（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む）のホール重鎖に融合したＣＥＡ抗体の交差Ｆａｂ単位（ＶＬＣＨ１）を含む。Ｆｃノブ重鎖（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む）を、ＩＣＯＳに結合するＦａｂ断片に融合する（図１Ｇ）。分子４２及び分子４３は、ｈｕＩｇＧ１（Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含む）のホール重鎖に融合したＩＣＯＳ抗体の交差Ｆａｂ単位（ＶＬＣＨ１）を含む。Ｆｃノブ重鎖（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含む）を、ＣＥＡに結合するＦａｂ断片に融合する（図１Ｈ）。
ＦｃホールをＦｃノブ鎖と組み合わせることにより、ＣＥＡに特異的に結合するＦａｂ断片及びＩＣＯＳに特異的に結合するＦａｂ断片を含むヘテロ二量体の生成が可能になる。
国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１号Ａ１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。
二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ及び抗ＣＥＡＣＡＭ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡを、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：１：１：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクターホール重鎖」：「ベクター軽鎖２」）で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載されるように構築物を作製し、精製した（実施例３．１を参照されたい）。
成熟二重特異性一価抗ＩＣＯＳ／抗ＣＥＡＣＡＭ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ ｋｉｈ抗体の配列のアミノ酸配列を表３５に示す。
６．２ ＩＣＯＳへの二価結合及びＣＥＡへの一価結合を有する、ＩＣＯＳ及び癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成（２＋１フォーマット）
ＩＣＯＳへの二価結合及びＣＥＡへの一価結合（２＋１とも呼ばれる）を有する二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ抗体を、図１Ｃに示されるようなＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ抗体と同様に調製した。
本実施例では、構築物の第１の重鎖ＨＣ１を、以下の構成要素で構成した。抗ＩＣＯＳ抗体のＶＨＣＨ１、続いてＦｃノブ（このＣ末端にて、ＣＥＡ抗体のＶＬを融合した）。第２の重鎖ＨＣ２は抗ＩＣＯＳ抗体のＶＨＣＨ１、続いてＦｃホールで構成され、このＣ末端にて、ＣＥＡ抗体のＶＨを融合した。ＣＥＡ抗原結合ドメインについては、クローンＭＥＤＩ－５６５のＶＨ及びＶＬ配列を国際特許出願の国際公開第２０１４／０７９８８６号Ａ１から得た。ＩＣＯＳ抗体ＪＭａｂ１３６については、クローンＪＭＡｂ１３６のＶＨ及びＶＬ配列を米国特許出願公開第２００８／０１９９４６６号Ａ１から入手した。
国際特許出願の国際公開第２０１２／１３０８３１Ａ１号に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を、ノブ及びホール重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合を消失させた。
二重特異性２＋１抗ＩＣＯＳ 抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＦｅｃｔｏＰｒｏ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、米国）を使用して哺乳動物発現ベクターと共トランスフェクションすることによって作製した。１：２：１の比（「ベクターノブ重鎖」：「ベクター軽鎖」：「ベクターホール重鎖」）で細胞に対応する発現ベクターをトランスフェクトした。二重特異性の一価の抗ＩＣＯＳ抗体及び抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ抗体について記載されるように構築物を作製し、精製した（実施例３．１を参照されたい）。
２＋１抗ＩＣＯＳ、抗ＣＥＡ構築物についてのアミノ酸配列を表３７に見出すことができる。
実施例７
分子のＩｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価
７．１ ＩＣＯＳ発現細胞への抗ＩＣＯＳ抗体の結合（フローサイトメトリー分析）
実施例１で調製したいくつかのＩＣＯＳ抗体の結合を、ＩＣＯＳ発現ＣＨＯ細胞（ヒトＩＣＯＳを安定に過剰発現するようにトランスフェクトされたＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。
簡潔には、懸濁細胞を回収し、計数し、生存率を確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に１ｍｌあたり１００万個の細胞で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（１０万個の細胞を含有する）を丸底９６ウェルプレートにおいて４℃で３０分間、漸増濃度の抗ＩＣＯＳ（Ｔ細胞へのＦＡＰ－ＩＣＯＳ構築物の結合のため７ｐＭ～１２０ ｎＭ）と共にインキュベートし、細胞を冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ＃７０９－１１６－１４９からのＰＥコンジュゲート化ロバ抗ヒトＨ＋Ｌ ＰＥを有する分子１、８；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ＃７１１－１１６－１５２からのロバ抗ウサギＨ＋Ｌ ＰＥを１：１００の希釈で含む分子１８及び２０、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ＃７１５－１１６－１５０からのロバ抗マウスＨ＋Ｌ ＰＥを含む分子１４）と共に４℃でさらに３０分間再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した。染色を、ウェルあたり７５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中１％ＰＦＡを使用して、暗所において４℃で２０分間固定した。
加えて、ヒトＳＲ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２６２）への上記分子の結合を、下記の改変とは別に上記で記載されるように行った：ＳＲ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ）中に１ｍｌあたり２００万個の細胞で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（２０万個の細胞を含有する）を９６ウェルＰＰプレート中で４℃にて１時間、漸増濃度の抗ＩＣＯＳ（７ｐＭ～５１０ｎＭ）と共にインキュベートし、細胞を冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、上記のように標識二次抗体と共に４℃にて更に３０分間再インキュベートした。
ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより蛍光を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７を用いて結合曲線及びＥＣ５０値を得た。
結果は、ＩＣＯＳ分子が濃度依存的様式でヒトＩＣＯＳに結合することができることを示す（図２Ａ及び２Ｂ）。ＥＣ５０値を表３９に要約する。分子２０及び８について最良の結合が観察された。
さらに、実施例４で調製したＩＣＯＳ抗体００９、１１４３ｖ２及び１１３８のヒト化変異体を、上記のようにヒトＩＣＯＳへのそれらの結合について（分子１５、２８及び３２の形態で）試験した。
結果は、分子が濃度依存的様式でヒトＩＣＯＳに結合することができることを示す（図３Ａ～３Ｃ）。ＥＣ５０値を表４０に要約する。抗体００９（分子１４）の場合、変化した結合特性を示した異なる参照分子（分子１５、ＦＡＰ標的２＋１ ＩＣＯＳ抗原結合分子）をアッセイに使用しなければならなかった。したがって、親分子との比較は困難である。これらの３つの変異体は、同等の結合プロファイル（図３Ａ）を示し、分子２６は、分子２５及び２７と比較してわずかに損なわれた結合を示した。
分子２８について、分子３１は親抗体（分子２８）と同等の結合を示し、分子２９及び３０と比較してより高い絶対結合を示すことが示された（図３Ｂ）。
分子３５は親抗体と比較して同様の結合挙動を示すが、分子３３及び分子３４は親抗体（分子３２）と比較してより高いＥＣ５０値及びより低い全体的な結合を示す。（図３Ｃ）
７．２ Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞の活性化（発光に基づく分析）
同時ＴＣＲ関与への依存性を、ＮＦＡＴ核移行に応答してルシフェラーゼを発現する操作されたＪｕｒｋａｔ細胞株を使用することによって評価した。
ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃ＣＳ１７６５０１）レポーター細胞株を、ＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ培養培地（１０％ＦＣＳ、１％ＧｌｕＭａｘ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＮＥＡＡ、１％ピルビン酸ナトリウム（ｏ－Ｐｙｒｕｖａｔｅ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地；選択：２００ｕｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ）の１．５μｇ／ｍｌのａＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３１７３０４）及び２μｇ／ｍｌのａＣＤ２８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２９１４）、又はＰＨＡ－Ｌ（Ｓｉｇｍａ＃、１μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ；２００Ｕ／ｍｌ）でをコーティングした細胞培養フラスコのいずれかを用いて、ＩＣＯＳ発現を誘導するためにあらかじめ活性化した。
アッセイ前に一晩、細胞を飢餓状態にした（刺激なしのＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ培養培地）。アッセイプレートＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ（透明、９６ウェル、Ｒｏｃｈｅ＃１１９８９６８５００１）を、Ｂｉ＜ｈｕＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２＞（ＪＩＲ、＃１０９－０６６－０９７）１μｇ／ｍｌ及びＢｉ＜ｍＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２＞（ＪＩＲ、＃１１５－０６６－０７２）１μｇ／ｍｌの混合物を１：１の比で同時にコーティングした（４℃で一晩）。翌日、プレートを洗浄し、０．２５μｇ／ｍｌのａＣＤ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３１７３１５）及び指定の濃度（２９ｐＭ～１２００００ｐＭの範囲）の抗ＩＣＯＳ分子のいずれかを添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートをＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０１３６）で１回洗浄し、０．１５ Ｍｉｏ刺激及び飢餓ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐを添加した。ＮＦＡＴ媒介性シグナル伝達を、３７℃、５％ＣＯ２での５時間のインキュベーション後に、Ｐｒｏｍｅｇａ ＯｎｅＧｌｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）を製造業者の説明書に従って使用してＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｄｉｎｇによって評価した。プレートを滅菌９６ウェル平底白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３９１７）に再フォーマットし、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ１０Ｍ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｄｉｎｇ、１０００ｍｓ積分時間、自動減衰設定）で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７を使用して曲線及びＥＣ５０値を得た。結果は、試験した全てのＩＣＯＳ抗体（野生型ＩｇＧフォーマット）がＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を濃度依存的に活性化できることを示す（図４）。ＥＣ５０値を表４１に要約する。分子２０について最も強力な活性化が観察された。
さらに、実施例４で調製したＩＣＯＳ抗体００９、１１４３ｖ２及び１１３８のヒト化変異体を、上記のようにＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を活性化する能力について（分子１５、２８及び３２の形態で）試験した。
結果は、分子がＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を濃度依存的に活性化することができることを示す（図５Ａ～５Ｃ）。ＥＣ５０値を表４２に要約する。分子１４については、異なる参照分子をアッセイに使用しなければならず（分子１５）、これは変異体と比較してより低い全体的アゴニスト活性を示した。したがって、親分子との比較は困難である。これらの３つの変異体は、ヒトＩＣＯＳへの結合についての以前の事例のように、非常に同等のアゴニスト活性を示した。
分子２８及びその変異体は、同様に以前に記載されたようなヒトＩＣＯＳへの結合からの結果と一致して、分子２９＞分子３０＞分子２８＝分子３１というランク付けで、同等のＥＣ５０値を示し、最大アゴニスト活性にはわずかな差しかなかった。
また、分子３２及びそのヒト化変異体について、アゴニスト活性のわずかな違いしか観察されず、最大アゴニスト活性に関するランキングは、分子３５＞分子３３＞分子３４＞分子３２である。ＥＣ５０に関して、ランキングは分子３４＞分子３２＞分子３３＞分子３５である。
７．３ ＩＣＯＳ－リガンドとの競合（フローサイトメトリー分析）
実施例１で調製したいくつかの抗ＩＣＯＳ抗体とヒトＩＣＯＳリガンド（配列番号２１５、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｏ７５１４４）との競合を、ＩＣＯＳ＋ＣＨＯトランスフェクタント細胞（実施例２．２を参照されたい）で試験した。
簡潔には、細胞を回収し、計数し、生存率を確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に１ｍｌあたり１００万個の細胞で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（１０万個の細胞を含有する）を、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識した１２０ｎＭ ＩＣＯＳＬ（＝ＩＣＯＳＬ予め結合した）又はＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した抗ＩＣＯＳ分子（＝ＩＣＯＳ ＩｇＧ予め結合した）と共に４℃で３０分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、漸増濃度（７ｐＭ～１２０）の抗ＩＣＯＳ Ａ４８８分子（ＩＣＯＳＬが予め結合したウェルの場合）又はＩＣＯＳＬ－Ａ６４７（抗ＩＣＯＳ分子が予め結合したウェルの場合）と共にインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで再度２回洗浄し、次いで再インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液中１％ＰＦＡ ７５μｌ／ウェルを使用して、暗所で４℃で２０分間固定した。ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａを用いてＦＡＣＳにより蛍光を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７を用いてデータを分析した。
表４３は、異なる条件に対する抗ＩＣＯＳ分子の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）及び１２０ｎＭ濃度での相対結合％（ＭＦＩ（ＩＣＯＳＬ＋抗ＩＣＯＳ）／ＭＦＩ（抗ＩＣＯＳのみ）＊１００として計算し、細胞及び二次抗体のみをベースラインとして含むウェルからのシグナルを使用して、全てのＭＦＩをベースライン補正した）を示す。非競合対照分子を除く全ての抗ＩＣＯＳ抗体は、１２０ｎＭ ＩＣＯＳＬが添加された場合でさえ、ｈｕＩＣＯＳに結合したままであることが示されている。
７．４ ＩＣＯＳ過剰発現細胞、ＦＡＰ過剰発現細胞又はＣＥＡ過剰発現細胞への二重特異性腫瘍標的ＩＣＯＳ分子の結合（フローサイトメトリー分析）
実施例３又は６で調製したいくつかの二重特異性腫瘍標的ＩＣＯＳ抗原結合分子の結合を、ＩＣＯＳ発現ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１、ヒトＩＣＯＳを安定に過剰発現するようにトランスフェクトされている）を用いて試験した。
簡潔には、懸濁細胞を回収し、計数し、生存率を確認し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）に１ｍｌあたり１００万個の細胞で再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（１０万個の細胞を含有する）を丸底９６ウェルプレート中で、漸増濃度の抗ＩＣＯＳ（７ｐＭ～１２０ｎＭ）と共に４℃で３０分間インキュベートし、細胞を冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄し、標識二次抗体（Ｆａｂ Ｆｃｙ特異的ＡＦ６４７（１：１００）、１９０－６０６－００８ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に４℃で更に３０分間再インキュベートし、冷ＰＢＳ ０．１％ＢＳＡで２回洗浄した。染色を、ウェルあたり７５μｌのＦＡＣＳ緩衝液中１％ＰＦＡを使用して、暗所において４℃で２０分間固定した。
ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより蛍光を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７を用いて結合曲線及びＥＣ５０値を得た。
結果は、二重特異性ＩＣＯＳ抗原結合分子が濃度依存的様式でヒトＩＣＯＳに結合することができることを示す（図６Ａ）。ＥＣ５０値を表４４に要約する。分子１５について最良の結合が観察された。さらに、結果は、図１Ａ～１Ｃに示される３つの異なるフォーマットの結合のランキングを示し、ＩＣＯＳへの一価よりも二価の結合に起因して予想されるように、１＋１フォーマット（図６Ｂ）と比較して２＋１フォーマット（図１Ｃ）の優れた結合を示す。
表４４：ＩＣＯＳ＋ＣＨＯ細胞への種々の腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
また、ヒトＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（ヒトＦＡＰを安定的に過剰発現するように改変された親細胞株ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－９２）への同一分子の結合を、上記と同様に行った。
結果は、二重特異性腫瘍標的化ＩＣＯＳ抗原結合分子が濃度依存的様式でヒトＦＡＰに結合することができることを示す（図７Ａ）。ＥＣ５０値を表４５に要約する。分子９、１５、１９及び２２は、非常に類似した結合を示す。一方、結果は、２＋１（図１Ｃ）及び１＋１ ＨＴフォーマット（図１Ｂ）と比較して、１＋１分子フォーマット（図１Ａ）の優れた結合を示す（図７Ｂを参照されたい）。これは、ＶＨ－ＶＬ対Ｆａｂ融合としてのＦＡＰ標的化部分の異なる結合親和性によって駆動され得る。
表４５：ＦＡＰ＋ＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞に対する異なる腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
さらに、同じ分子のカニクイザルＩＣＯＳへの結合を予め活性化したカニクイザルＰＢＭＣで評価した。
簡潔には、カニクイザルＰＢＭＣを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ＃１１１３１Ｄ）を製造者の説明書に従って使用して４８時間活性化し、上記のように、次の結合実験が行われるまで加湿インキュベータ中、３７℃で１０％ＦＣＳ及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５００６１）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保存した。
結果は、腫瘍標的ＩＣＯＳ抗原結合分子がカニクイザルＩＣＯＳに濃度依存的に結合することができることを示す（図８Ａ及び８Ｂ）。ＥＣ５０値を表４６に要約する。ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方で分子１５について最良の結合が観察された。
表４６：カニクイザルＰＢＭＣに対する異なる二重特異性腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
カニクイザルＩＣＯＳに結合するそれらの能力に関して図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに記載されたフォーマットを比較すると、図１Ｃに記載されたフォーマットのＩＣＯＳへの二価結合は、図１Ａ及び図１Ｂに記載されたフォーマットの一価結合よりも優れていることが証明された（図８Ｃ及び８Ｄ、並びに表４７）。
表４７：カニクイザルＰＢＭＣに対する異なるフォーマットの二重特異性腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
さらに、マウスＩＣＯＳに対するマウス交差反応性分子９、１０及び１１の結合を、上記のプロトコルに対して以下の変更を行って、マウス脾細胞を用いて評価した：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス又はｈＣＥＡ（ＨＯ）ＴｇマウスのＢｒ脾臓をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に移し、ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）を各チューブに添加した。ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して脾臓を解離させ、チューブを短くスピンダウンし、細胞を１００μｍナイロン細胞ストレーナーに通した。その後、チューブを３ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｒ７３８８）ですすぎ、３５０×ｇで８分間遠心分離した。上清を捨て、細胞懸濁液を７０μｍナイロンセルストレーナーに通し、培地で洗浄した。別の遠心分離（３５０×ｇ、８分）後、上清を廃棄し、５ｍｌのＡＣＫ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。ＲＴでの５分間のインキュベーション後、細胞をＲＰＭＩ培地で洗浄した。その後、細胞を再懸濁し、細胞計数のために、ペレットをアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％ＦＢＳ、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ）にプールした（Ｖｉ－Ｃｅｌｌ－Ｓｅｔｔｉｎｇ白血球、１：１０希釈）。次いで、脾細胞をＰＨＡ－Ｌ（Ｓｉｇｍａ＃、２μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ；２００Ｕ／ｍｌ）で４８時間あらかじめ活性化させてマウスＩＣＯＳの発現を上方制御し、次いで、上記のように、その後の結合実験に使用した。
結果は、分子が濃度依存的にマウスＩＣＯＳに結合することができることを示している（図９Ａ）。ＥＣ５０値を表４８に要約する。この場合もやはり、２＋１フォーマットはマウスＩＣＯＳに対する優れた結合を示し、一方、１＋１フォーマットは、２＋１ ＨＴフォーマット及び１＋１ ＨＴフォーマットと比較して、マウスＦＡＰに対する優れた結合を示す（図９Ｂ）。
表４８：マウス脾細胞への種々の腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値
実施例３．４及び３．５において調製され、図１Ｄ及び１Ｅに示される二重特異性腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子のためのフォーマットの別のセットを、事前に活性化されたヒトＰＢＭＣをヒトＩＣＯＳへの結合のための標的細胞として使用した改変とは別に、上に記載されるようなヒトＩＣＯＳ及びヒトＦＡＰに対するそれらの結合特性について試験した。
簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｂｕｆｆｙ Ｃｏａｔ（「Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｚｕｒｉｃｈ」）から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１０７７１－５００ ＭＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７）密度遠心分離によって調製した。血液を、滅菌ＤＰＢＳで１：２に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）上で積層した。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分、室温）し、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程３５０×ｇ、１０分）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的に計数し（Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ）、１０％ＦＣＳ及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ３５０５００６１）に保存した。ＰＢＭＣをＰＨＡ－Ｌ（Ｓｉｇｍａ＃、２μｇ／ｍｌ）及びＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ；２００Ｕ／ｍｌ）で４８時間予備活性化して、加湿インキュベータ中、３７℃でヒトＩＣＯＳの発現を上方制御した。インキュベーション後、上記のように、ＰＢＭＣをその後の結合実験に使用した。
結果は、二重特異性ＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ分子が濃度依存的様式でヒトＩＣＯＳ及びヒトＦＡＰに結合することができることを示す（図１０Ａ～１０Ｃ）。ＥＣ５０値を表４９に要約する。分子１２及び１３は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット形式及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット形式の両方においてヒトＩＣＯＳに対する優れた結合性を示す（図１０Ａ及び１０Ｂ）。一方、分子１３はヒトＦＡＰよりも低い結合を示す（図１０Ｃ）。
表４９：ＦＡＰ＋ＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃｌ．１９細胞又はヒトＰＢＭＣのあらかじめ活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットに対する異なるＦＡＰ標的化抗ＩＣＯＳ分子の結合のＥＣ５０値。
さらに、ＦＡＰ標的化ＩＣＯＳ分子４０、１５、４４、２１及び２２の、ＳＲ細胞及びＦＡＰ＋ＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃｌ．１９細胞上のＩＣＯＳに対する結合を、更なる実験で試験した（図１２Ａ及び１２Ｂを参照されたい）。データを以下の表４９Ａに示す。
表４９Ａ：異なるＦＡＰ標的化抗ＩＣＯＳ分子の、ＳＲ細胞上のＩＣＯＳ及びＦＡＰ＋ＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰ ｃｌ．１９細胞への結合のＥＣ５０値。
ＦＡＰの代わりにＣＥＡを標的とする、実施例６で調製した別のセットの腫瘍標的化抗ＩＣＯＳ分子を、上記のようにヒトＩＣＯＳ及びヒトＣＥＡに対するそれらの結合特性について試験した。ヒトＩＣＯＳへの結合を、先に記載されたように事前に活性化されたヒトＰＢＭＣで試験した。ＣＥＡへの結合を、ＭＫＮ－４５細胞（ヒト胃腺癌細胞株、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）を使用して評価した。
結果は、ＣＥＡ標的二重特異性ＩＣＯＳ分子が濃度依存的にヒトＩＣＯＳ及びヒトＣＥＡに結合することができることを示している（図１１Ａ～１１Ｃ））。分子４２がヒトＩＣＯＳに対する優れた結合を示す（図１１Ａ及び図１１Ｂ）一方、３つの分子はいずれも、ヒトＣＥＡに対する同等の結合を示す（図１３Ｃ）。
７．５ 腫瘍標的ＩＣＯＳ抗原結合分子の存在下でのＴＣＢ媒介性Ｔ細胞活性化の増加（フローサイトメトリー分析）
ＦＡＰ又はＣＥＡ標的化二重特異性アゴニスト性ＩＣＯＳ分子のいずれかがＴ細胞のＣＥＡＣＡＭ ５－ＴＣＢ媒介性活性化を更にブーストする能力を、ＣＥＡ陽性ＭＫＮ－４５及びＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－９２、ヒトＦＡＰを安定的に過剰発現するようにトランスフェクトされている）並びにヒトＰＢＭＣの共培養アッセイで評価した。
簡潔には、接着性標的細胞を細胞解離緩衝液で回収し、実験の１日前に平底９６ウェルプレートに１００００個の細胞／ウェルの密度で播種した（Ｇｉｂｃｏ，１３１５１０１４）。これにより、ＮＩＨ／３Ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９細胞を、５０００ｒａｄ（フィルタなしの照射、レベル５）のＸ線照射装置ＲＳ ２０００（Ｒａｄ ｓｏｕｒｃｅ）を使用して、播種前に更に照射した。標的細胞を一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｂｕｆｆｙ Ｃｏａｔ（「Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｚｕｒｉｃｈ」）からの濃縮リンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１０７７１－５００ＭＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７）密度遠心分離によって調製し、血液を滅菌ＤＰＢＳで１：２に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ８８８９）上に重層した。遠心分離（４５０×ｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分、室温）し、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程３５０×ｇ、１０分）。得られたＰＢＭＣ集団を自動的に計数し（Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓ）、１０％ＦＣＳ及び１％Ｇｌｕｔａｍａｘを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ３５０５００６１）中、３７℃、加湿インキュベータ中でアッセイが開始されるまで保存した。
ＰＢＭＣを標的細胞及び線維芽細胞に添加して、固定濃度８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢ、及び漸増濃度のＦＡＰ又はＣＥＡ標的化ＩＣＯＳ分子（三連で０．１１ｐＭ～５０００ｐＭ）の存在下で５：１：１の最終Ｅ：Ｔ比を得た。Ｔ細胞活性化を、Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９（初期活性化マーカー）及びＣＤ２５（後期活性化マーカー）を認識する抗体を使用するフローサイトメトリー分析によって、３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後に評価した。
簡潔には、ＰＢＭＣを４００×ｇで４分間遠心分離し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）で２回洗浄した。ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３０１０３２）、ＣＤ４（ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３００５１８）、ＣＤ６９（ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ６９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３１０９３０）、ＣＤ２５（ＰＥ抗ヒトＣＤ２５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃３５６１０４）についての表面染色を供給業者の指示に従って実施した。次いで、細胞を、０．１％のＢＳＡを含有する１５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄し、１％のＰＦＡを含有する７５μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液を使用して４℃で１５～３０分間固定した。遠心分離後、試料を１５０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いてＦＡＣＳにより蛍光を分析した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ７を用いてグラフを得た。
実施例３において調製されるいくつかのＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のアゴニスト活性を、上記で記載されるような５名までのＰＢＭＣドナーにおいて比較した（図１２Ｃ）。結果は、分子４４、並びにその変異体分子２１及び２２について同等の活性、また分子１５の変異体である分子４０の活性のわずかな低下を示している。
別の例では、選択されたＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のアゴニスト活性を、次の改変を除いて、上記で記載されるように、３名のＰＢＭＣドナーにおいて比較した（図１３Ａ及び１３Ｂ）：８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢの代わりに、５ｐＭのＭＣＳＰ ＴＣＢを、５：１のエフェクター対標的比（１ウェルあたり５００００個のエフェクター及び１００００個の標的細胞）でのＭＣＳＰ＋細胞及びＦＡＰ＋ＭＶ－３細胞（受託番号ＣＶＣＬ＿Ｗ２８０）による細胞株の置き換えと併せて使用した。
全ての試験されたＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子が、ＴＣＢ媒介のＴ細胞活性化を高めることができた（図１３Ａ）。分子１９で最も強力な活性化が観察された。ＦＡＰ－ＩＣＯＳの３つの異なるフォーマットを比較したとき、図１Ｃに記載されるフォーマットは、最も強い活性化を誘導した（図１３Ｂ）。
別のアッセイでは、図１Ａ、１Ｄ及び１Ｅに記載のフォーマットを、２人の健康なＰＢＭＣドナーについて上記のように比較した（図１４Ａ～１４Ｃ）。
結果は、３つ全てのフォーマットが、ＴＣＢ処置単独と比較した場合、更なるＴ細胞活性化を誘導し得ることを示す。試験した３つのフォーマット間で最大アゴニスト活性の差を見出すことはできない（図１４Ｃ）。しかしながら、３つのフォーマットは、図１Ａ＞図１Ｅ＞図１Ｄの順位（より低い濃度からより高い濃度まで）で、異なる濃度でそれらの最大アゴニスト活性に達する。
ＴＣＢ及び腫瘍標的化ＩＣＯＳ分子を同じ標的細胞（「シス設定」）又は２つの異なる細胞（「トランス設定」）に標的化することの違いを評価するために、ＦＡＰ（トランス設定）又はＣＥＡ（シス設定）のいずれかを標的とする２つのＩＣＯＳ分子を、２人の健康なＰＢＭＣドナーについて上記のアッセイで試験した（図１５Ａ～１５Ｃ）。
結果は、ＣＥＡ標的化分子４１のより高い全体的アゴニスト活性を示す（図１５Ｃ）。しかしながら、ＦＡＰ標的化分子１０は、より低い濃度でその最大アゴニスト活性に達するようである（図１５Ａ～１５Ｂ）。
さらに、ＮＩＨ／３ｔ３－ｈｕＦＡＰクローン１９、標的としてＭＫＮ－４５細胞及び第１の刺激として８０ｐＭのＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢを使用して、先に記載したように、３人のＰＢＭＣドナーで一組のＣＥＡ－ＩＣＯＳ分子を試験した。
結果は、試験した３つ全ての分子が、ＴＣＢ刺激単独と比較してＴ細胞活性化を更に促進することができることを示している（図１６Ａ～１６Ｃ）。分子４２は、最も高い追加刺激を示す。
実施例８
Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製、精製及び特性評価
４．１ ヒト又はヒト化バインダーを用いたＴＣＢ抗体の調製
ＴＣＢ分子は、国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１又は国際公開第２０１６／０７９０７６号Ａ１に記載される方法に従って調製された。
この実験で使用される抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ又はＣＥＡ ＴＣＢ）の調製は、国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１の実施例３に記載される。ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ」抗体であり、２つの異なる重鎖と、２つの異なる軽鎖とで構成される。２つの異なる重鎖のアセンブリを促進するために、ＣＨ３ドメイン中の点変異（「ノブ・イントゥ・ホール」）を導入した。２つの異なる軽鎖の正しいアセンブリを促進するために、ＣＤ３結合ＦａｂにおけるＶＨドメインとＶＬドメインの交換を行った。２＋１は、その分子が、ＣＥＡに特異的な２つの抗原結合ドメインと、ＣＤ３に特異的な１つの抗原結合ドメインを有することを意味する。ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢは、同じフォーマットを有するが、別のＣＥＡバインダーを含み、軽鎖の正しい対合を補助するために、ＣＤ３バインダーのＣＨドメイン及びＣＬドメインに点変異を含む。
ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢは、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４及び配列番号２４５のアミノ酸配列を含む。ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ ＴＣＢは、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４９及び配列番号２４９のアミノ酸配列を含む。
４．２ ２＋１フォーマットの抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体（マウスＣＥＡでは二価、マウスＣＤ３では一価）の調製
抗ＣＥＡ（ＣＨ１Ａ１Ａ９８／９９ ２Ｆ１）／抗ＣＤ３（２Ｃ１１）Ｔ細胞二重特異性２＋１代用分子を、１つのＣＤ３－Ｆａｂ、並びに２つのＣＥＡ－Ｆａｂ及びＦｃドメインからなるように調製し、２つのＣＥＡ－ＦａｂはそれらのＣ末端を介して当該Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されており、ＣＤ３－ＦａｂはそのＣ末端と共に１つのＣＥＡ－ＦａｂのＮ末端に連結されている。ＣＤ３結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である。
マウス代用分子のＦｃドメインは、ｍｕ ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、特にＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０，１９６３７－１９６４６によって記載されるように、抗体Ｆｃヘテロ二量体形成を高めるため、ＤＤＫＫ変異が導入されている。第１の重鎖のＦｃ部分は変異Ｌｙｓ３９２Ａｓｐ及びＬｙｓ４０９Ａｓｐ（Ｆｃ－ＤＤと呼ばれる）を含み、第２の重鎖のＦｃ部分は変異Ｇｌｕ３５６Ｌｙｓ及びＡｓｐ３９９Ｌｙｓ（Ｆｃ－ＫＫと呼ばれる）を含む。ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う。さらに、例えば Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８），１８１，６６６４－６６６９、又は国際公開第２０１６／０３０３５０号Ａ１に記載されている方法に従ってＤＡＰＧ変異を重鎖の定常領域に導入し、マウスＦｃガンマ受容体への結合を消失させた。簡潔には、Ａｓｐ２６５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ変異をＦｃ－ＤＤ及びＦｃ－ＫＫ重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃガンマ受容体（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う；すなわち、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）への結合を消失させた。
したがって、抗ＣＥＡ（ＣＨ１Ａ１Ａ ９８／９９ ２Ｆ１）／抗ＣＤ３（２Ｃ１１）Ｔ細胞二重特異性２＋１代用分子は、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２及び配列番号２５３のアミノ酸配列を含む。
実施例９
ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと組み合わせた腫瘍標的ＩＣＯＳ抗原結合分子のＩｎ ｖｉｖｏでの機能的特性評価
９．１ ＮＳＧマウスにおける単回注射後の二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ（１１６７）二重特異性抗体の薬物動態学的プロファイル
２．５ｍｇ／ｋｇのＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の単回用量をＮＳＧマウスに注射した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内に注入した。２００μｌ当たり適切な量の化合物を得るために、原液（表５０）をヒスチジン緩衝液で希釈した。時点及び群あたり３匹のマウスを、１０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、６日間、８日間、１０日間及び１２日間で採血した。注入された化合物をＥＬＩＳＡによって血清試料中で分析した。分子の検出を、ｈｕＩＣＯＳ ＥＬＩＳＡ（ヒトＩＣＯＳ結合による検出）によって行った。各工程後にプレートを３回洗浄して未結合物質を除去した。最後に、ＡＢＴＳ基質溶液を添加して着色反応生成物を形成することによって、ペルオキシダーゼ結合複合体を可視化する。４０５ｎｍ（参照波長４９０ｎｍ）で測光的に決定される反応生成物強度は、血清試料中の分析物濃度に比例する。結果（図１７）は、全ての分子について安定したＰＫ挙動を示し、その後の有効性研究のための週に一回のスケジュールを示唆した。
表５０：試験した組成物の説明
９．２ ヒト化マウスにおけるＭＫＮ４５異種移植片におけるＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと組み合わせたＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗体のＩｎ ｖｉｖｏ有効性研究
ここに記載される有効性研究は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮及びＩｍｍｕｎｏ－ＰＤに関して、ＣＥＡＣＡＭ５－ＴＣＢと組み合わせたＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子のフォーマット依存的効力を理解することを目的とした。
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌腫）は、ＡＴＣＣから最初に得られ、増殖後、Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中、３７℃で１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養した。インビトロ継代１２を９７％の生存率で皮下注射に使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ－３Ｔ３をＡＴＣＣから最初に得て、ヒトＦＡＰを発現するようにＲｏｃｈｅ Ｎｕｔｌｅｙで操作し、１０％ウシ血清、１×ピルビン酸ナトリウム及び１．５ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。クローン３９を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ継代番号１８及び９８．２％の生存率で使用した。
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１ｘ１０６個のＭＫＮ４５細胞＋１×１０６個の３Ｔ３－ｈｕＦＡＰ）を、２２Ｇ～３０Ｇの針で麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。到着した後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために１週間維持した。継続的な健康モニタリングは、定期的に行われた。
雌性ＮＳＧマウスに、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、首尾良いヒト化のために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。その時点で、記載されるように、マウスに腫瘍細胞及び線維芽細胞を皮下注射し（図１８）、週に一度、腫瘍サイズがおよそ２５０ｍｍ３（２３日目）に達したときに化合物又はヒスチジン緩衝液（ビヒクル）で処置した。全てのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈内に注入した。２００μｌ当たり適切な量の化合物を得るために、原液（表５１）を必要に応じてヒスチジン緩衝液で希釈した。種々のＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子の用量をそれらの分子量（適合モル濃度、Ｃ、Ｄ、Ｆ群）に従って適合させた。１＋１フォーマットでは、３つの用量を使用した（グループＥ～Ｇ）。ＦＡＰ－ＩＣＯＳ及びＣＥＡＣＡＭ５との併用治療（Ｃ～Ｇ群、図１）については、ＴＣＢ構築物を同時に注射した。ノギスを用いて腫瘍増殖を週２回測定し（図１８）、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
終了時（５０日目）に、マウスを屠殺し、腫瘍及び脾臓を取り出し、秤量し、その後のＦＡＣＳ分析のためにコラゲナーゼＶ及びＤＮＡｓｅによる酵素消化によって単一細胞懸濁液を調製した。単一細胞を、ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１９及びＦｏｘＰ３（細胞内）について染色し、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。
腫瘍組織の小片（３０ｍｇ）を急速凍結し、全タンパク質を単離した。タンパク質懸濁液をマルチプレックス分析によってサイトカイン含有量について分析した。
図１９Ａ～１９Ｇは、モル濃度が一致した併用処置群における腫瘍成長速度論（平均、＋ＳＥＭ）、並びにマウスあたりの個々の腫瘍成長及び研究終了時の腫瘍重量を示す。本明細書に記載されるようにＣＥＡＣＡＭ５ ＴＣＢは、単剤として、初期腫瘍増殖阻害をほとんど誘導しなかった。しかしながら、全てのＦＡＰ－ＩＣＯＳ分子との組合せは、有意な改善された腫瘍成長阻害を示し、このことは、研究終了時の腫瘍重量によっても反映された（図１９Ｇ）。興味深いことに、試験終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータ（図２０Ａ～２０Ｆ）は、全ての併用群において腫瘍内Ｔ細胞及びＢ細胞の頻度の増加を明らかにした。腫瘍におけるＴ細胞浸潤の増加は、併用処置においてＣＤ８／Ｔｒｅｇ比をＣＤ８細胞にシフトさせた。終了時に脾臓において影響は検出されなかった。しかしながら、使用される二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗体の異なるタイプの間では、腫瘍成長及びＩｍｍｕｎｏＰＤに関して統計学的差異は認められなかった。
図２１Ａ～図２１Ｇは、１＋１ ＦＡＰ－ＩＣＯＳフォーマットの用量応答群についての腫瘍成長速度論（平均、＋ＳＥＭ）、また同様に、マウスあたりの個々の腫瘍成長及び研究終了時の腫瘍重量を示す。異なる用量についての腫瘍増殖データは、４ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量で最も強い効果が見られたが、試験した最高用量である１０ｍｇ／ｋｇはより弱い応答を示したことを明らかにした。興味深いことに、研究終了時に屠殺した動物由来の腫瘍のＩｍｍｕｎｏ－ＰＤデータ（図２２Ａ～２２Ｆ）は、ＦＡＰ－ＩＣＯＳ １＋１フォーマットの全ての用量が腫瘍内のＴ細胞及びＢ細胞の頻度を増加させたことを明らかにした。腫瘍におけるＴ細胞浸潤の増加は、併用処置においてＣＤ８／Ｔｒｅｇ比をＣＤ８細胞にシフトさせた。最も強いＩｍｍｕｎｏ－ＰＤ効果は、試験した最低用量（１ｍｇ／ｋｇ）で検出された。
さらには、図２３に示されるサイトカイン／ケモカイン分析により、全腫瘍タンパク質溶解物に対するサイトカイン／ケモカインの最も強いアップレギュレーションが明らかにされ、この場合、試験された他の全ての処置群とに対して最も低い用量の二重特異性ＦＡＰ－ＩＣＯＳ抗体が１＋１フォーマットで存在した。
表５１：試験した組成物の説明
参考文献：
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Claims (32)

  1. 腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインと、ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子であって、
    （ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、を含み、Ｆｃ受容体に対する抗原結合抗体分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを更に含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  2. アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインを含む、請求項１に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  3. 腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインである、請求項１又は２に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  4. 前記ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
    （ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は
    （ｂ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）、並びに（ｉｖ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  5. 前記ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）、又は配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  6. 前記ＣＥＡへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＥＡ）及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  7. 腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）への特異的結合能を有する抗原結合ドメインである、請求項１又は２のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  8. 前記ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
    （ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｂ）（ｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）、並びに（ｉｖ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、を含む、請求項１又は２又は７のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  9. 前記ＦＡＰへの特異的結合能を有する抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、又は
    （ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）、を含む、請求項１又は２又は７又は８のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  10. ＦＡＰへの特異的結合能を有する前記抗原結合ドメインが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＦＡＰ）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＦＡＰ）を含む、請求項１又は２又は７～９のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  11. ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する前記抗原結合ドメインが、
    配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  12. （ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、
    （ｂ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する１つのＦａｂ断片と、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  13. （ａ）腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する１つの抗原結合ドメインと、
    （ｂ）ＩＣＯＳへの特異的結合能を有する２つのＦａｂ断片と、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  14. 腫瘍関連抗原への特異的結合能を有する前記抗原結合ドメインがクロスＦａｂ断片である、請求項１２又は１３に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  15. アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子であって、
    （ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、並びに（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、を含む、アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  16. アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子であって、
    配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＩＣＯＳ）、及び配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＩＣＯＳ）、を含む、請求項１５に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子をコードする単離核酸。
  18. 請求項１７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  19. アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子を製造する方法であって、前記アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子の発現に適した条件下で、請求項１８に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  20. 前記抗原結合抗体分子を前記宿主細胞から回収することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
  22. がんの処置に使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 医薬として使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子又は請求項２１に記載の医薬組成物。
  24. がんの処置に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子又は請求項２１に記載の医薬組成物。
  25. 前記アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子が、化学療法剤、放射線療法、及び／又はがん免疫療法で使用するための他の薬剤と組み合わせて投与されるためのものである、がんの処置に使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  26. 前記アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与されるためのものである、がんの処置における使用のための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  27. 前記Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、請求項２６に記載の使用のための請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  28. 前記アゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤と組み合わせて使用するためのものである、がんの処置における使用のための請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  29. ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤がアテゾリズマブである、請求項２８に記載の使用のための請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子。
  30. がんの処置のための医薬の製造における、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子又は請求項２１に記載の医薬組成物の使用。
  31. 個体において腫瘍細胞の成長を阻害するための医薬であって、有効量の、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子又は請求項２１に記載の医薬組成物を含む、医薬。
  32. がんを処置するための医薬であって、治療有効量の、請求項１～１６のいずれか一項に記載のアゴニスト性ＩＣＯＳ抗原結合抗体分子又は請求項２１に記載の医薬組成物を含む、医薬。
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