CN111686133A - 杜氏杆菌在预防和改善肥胖及其相关疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杜氏杆菌在预防和改善肥胖及其相关疾病中的应用，属于生物医药及微生物技术领域。本发明使用的杜氏杆菌属菌株(Dubosiellanewyorkensis)NYU‑BL‑A4能够改善高脂肪饮食诱导肥胖小鼠的各项指标异常，可使肥胖小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)降低25％和肝脏甘油三酯(TG)含量降低32％；同时还能够降低肥胖小鼠体重和血糖相关指标，提高体内对葡萄糖的消化和吸收能力；所述杜氏杆菌属菌株NYU‑BL‑A4能够提高肥胖小鼠体内有益微生物的丰度，改善由高脂饮食引发的小鼠肠道菌群结构紊乱，提高肠道代谢和免疫能力，减少细菌感染等疾病的发生。

Description

杜氏杆菌在预防和改善肥胖及其相关疾病中的应用

技术领域

本发明涉及杜氏杆菌在预防和改善肥胖及其相关疾病中的应用，属于生物医药及微生物技术领域。

背景技术

随着二代测序技术、宏基因组学、代谢组学技术的发展和应用，人们对肠道微生物的研究也不断深入。成人肠道内的微生物群大约有330万个基因，是整个人类基因组的150～200 倍，被认为是人体的第二基因组，而人体则被形容为“超级生物体”。肠道菌群参与了人体的营养和能量的代谢过程，不仅可通过影响机体的能量代谢吸收、肠壁通透性介导肥胖的发生、发展，也可以通过参与机体碳水化合物、胆汁酸、胆碱等的代谢过程，产生小分子化学物质，与人体的组织器官相互作用，形成肠道菌群-肠-靶器官轴，介导肥胖症的发生发展。

肠道菌群作为机体“隐形的内分泌器官”，其参与物质代谢产生的多种化学物质对宿主的多种作用需要更多的基础和临床试验去研究，以期为肥胖的预防和治疗提供更多的理论依据。随着技术的发展与成熟，可以更好地针对敏感菌群进行肠道干预，弥补临床研究空白，如益生菌、益生元特异性菌种的研发，敏感菌种的肠道移植，代谢物质作用的相关受体及配体激动剂或阻滞剂，以期更有效地发挥菌群的减重作用，这些针对肠道菌群的个体化干预将为肥胖症的预防和治疗提供新思路。

然而，由于微生物群-宿主相互作用的特异性，必须在纯培养物中获得有益的生物，以便始终如一地将其作为治疗剂提供。与胃肠道中的大量生物相比，当今市场上可用的益生菌中使用的属相对较少。对培养和表征新型细菌分类的成员的需求不断增加，要定期鉴定潜在微生物并研究其与宿主关联性。

发明内容

本发明为解决上述背景技术中提出的问题，本发明提供了杜氏杆菌(Dubosiellanewyorkensis)或含有杜氏杆菌的益生菌制剂在制备预防、缓解或改善肥胖及其并发症的产品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述杜氏杆菌为NYU-BL-A4，公布于公开号为US2018125900A1的专利中。

在本发明的一种实施方式中，所述肥胖及其并发症包括高血脂、脂肪肝、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受。

在本发明的一种实施方式中，

所述产品用于(a)～(c)至少一方面：

(a)降低体重；

(b)降低肝脏脂肪的堆积；

(c)降低血清低密度脂蛋白胆固醇、肝脏胆固醇、甘油三酯中至少一个指标的水平。

在本发明的一种实施方式中，所述产品用于提高肠道内有益微生物的丰度。

在本发明的一种实施方式中，所述有益微生物包括但不限于双歧杆菌、乳杆菌属。

在本发明的一种实施方式中，所述益生菌制剂中除杜氏杆菌外，含有其他辅料，所述辅料包括但不限于赋形剂或食品添加剂；所述杜氏杆菌在益生菌制剂中的含量不低于1.0×10⁸cfu/mL或1.0×10⁸cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括药物或药物组合物，杜氏杆菌在药物或药物组合物中的含量为不低于1.0×10⁸cfu/mL或1.0×10⁸cfu/g。

在本发明的一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于食品、保健品饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述食品、保健品饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂中还含有本领域技术人员根据剂型或者使用目的适当选择配料的本技术领域的常用成分，可与其他原料一同使用。

在本发明的一种实施方式中，所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。

有益效果：本发明杜氏杆菌属菌株(Dubosiella newyorkensis)NYU-BL-A4能够改善高脂肪饮食诱导肥胖小鼠的各项指标异常，可使肥胖小鼠血清和肝脏低密度脂蛋白胆固醇(LDL- C)降低15％、甘油三酯(TG)含量降低32％；同时还能够降低肥胖小鼠体重和血糖相关指标，提高体内对葡萄糖的消化和吸收能力；所述杜氏杆菌属菌株NYU-BL-A4能够提高肥胖小鼠体内双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus))的丰度，改善由高脂饮食引发的小鼠肠道菌群结构紊乱，提高肠道代谢和免疫能力，减少细菌感染等疾病的发生。本发明所述的菌株可用于制备缓解代谢综合征的保健食品或药物，具有非常广泛的应用前景。

附图说明

图1是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠肠道中相关有益菌属丰度的影响图。

图2是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠体重的影响图。

图3是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠空腹血糖水平图。

图4是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠葡萄糖耐量(GTT)的影响图。

图5是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠胰岛素敏感性(ITT)的影响图。

图6是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠的肝脏重量的影响图。

图7是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响图。

图8是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠肝脏甘油三酯(TG)的影响图。

图9是杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠肝脏脂质代谢基因的影响图。

具体实施方式

C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。

改良MTGE肉汤培养基：MTGE肉汤培养基+0.05％半胱氨酸盐酸盐。

实施例1：杜氏杆菌NYU-BL-A4对模拟胃肠液的耐受性

将保存于冷冻-80℃下的杜氏杆菌NYU-BL-A4接种于改良MTGE肉汤培养基中，于37℃厌氧条件下培养48h，再以2-4mL/100mL的接种量液体传代培养2次，充分活化菌株。调整菌株培养液活菌浓度为5×10⁸CFU/mL，并取出培养液1mL与9.0mL pH2.5的人工模拟胃液(含1g/100mL胃蛋白酶、pH＝2.5的MTGE肉汤培养基)混合，并在37℃厌氧条件下培养，分别在0h、0.5h、1h和2h时取样，涂布于布鲁氏菌固体培养基并培养、进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是取样时培养液中活菌数的对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表1所示。

表1杜氏杆菌NYU-BL-A4在人工模拟胃液中的耐受性

取混合培养液1mL加入9mL人工模拟肠液(含0.3％牛胆盐、1％胰蛋白酶、pH＝8.0的 MTGE肉汤培养基)中，在37℃厌氧环境下培养，分别在0h、0.5h、1h、2h、3h和4h时取样，涂布于布鲁氏菌固体培养基并培养、进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表示。实验结果如表2所示。

表2杜氏杆菌(Dubosiella newyorkensis)NYU-BL-A4在人工模拟肠液中的耐受性

实验结果如表1和表2所示，结果表明，杜氏杆菌(Dubosiella newyorkensis)NYU-BL- A4在酸性和碱性的人工胃肠液中均具有较高的存活，因而其对肠液具有较好的耐受性。

实施例2：杜氏杆菌NYU-BL-A4对C57BL/6J小鼠无毒副作用

将杜氏杆菌NYU-BL-A4菌体重悬于3g/100mL的蔗糖溶液中，制成浓度为 3.0×10⁸CFU/mL的菌悬液。取体重20-22g左右的健康雄性C57BL/6J小鼠8只，适应饲养环境一周后，每日给予浓度为3.0×10⁸CFU/mL的菌悬液灌胃一次，每次灌胃0.2mL，观察一周，记录实际死亡和体重情况。实验结果见表3。

表3小鼠体重的变化及死亡情况

时间(天)	1	2	3	4	5	6	7
								体重(g)	21..25±0.2	21.39±0.3	21.68±0.3	21.97±0.2	22.12±0.3	22.32±0.2	22.45±0.3
死亡情况	-	-	-	-	-	-	-

注：-表示无死亡。

表3中结果表明，喂食浓度3.0×10⁸CFU/m L的杜氏杆菌NYU-BL-A4未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象出现。小鼠体征正常外观无明显病理症状。

实施例3：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肠道菌群丰度的影响

实验动物采用SPF级雄性5-6周龄，体重20-22g的C57BL/6J小鼠36只，动物自由摄食、饮水，环境温度为22±2℃，湿度为55±5％，光照为12h光暗交替，适应环境7天后，开始实验。动物随机分为3组：空白对照组(ND)、高脂模型对照组(HFD)、杜氏杆菌NYU-BL- A4治疗组(NYU-BL-A4)，每组含小鼠8只。高脂饲料为南通特洛菲公司TP23300系列的60％高脂模型饲料，空白对照组采用南通特洛菲公司的10％的对照饲料(产品编号：D12450B)。治疗组小鼠经过高脂饲料喂养4周后灌胃菌悬液，剂量为1.0×10⁹CFU/mL，菌重悬于3g/100mL 的蔗糖溶液，灌胃6周。

实验动物分组及处理方法见表4：

表4实验各组小鼠只数、实验周期、饲料和处理方法说明

实验期间定期每周监测并记录小鼠体重，实验结束前收集小鼠新鲜粪便冻存于-80℃，提取粪便中细菌基因组进行16S rRNA测序，用来对肠道菌群特征结构进行后续分析。第10周实验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射100mg/kg bw的***麻醉后，眼眶静脉丛采血，颈椎脱臼处死。血液样本3000×g、4℃条件下离心15min分离血清，取上层，-80℃冻存用于后续相关血清生化指标的测定。肝脏组织和各部分脂肪组织(附睾脂肪和腹股沟脂肪) 精确称重后，相同部分肝脏收集后迅速置于预冷的生理盐水中漂洗去血，放入4％多聚甲醛中固定，用于石蜡病理切片制作。剩余部分肝脏、各种部位脂肪等组织取出后快速放于液氮速冻后转移至-80℃长期冻存，后续制成肝匀浆测定相关指标，具体制备方法如下：称取一定量肝脏组织，加入9倍体积生理盐水进行组织研磨，3000rpm离心10min，取上清冻存于-80℃待测，按照南京建成试剂盒说明书对肝脏甘油三酯(TG)、肝脏胆固醇(TC)进行测定。

肠道菌群分析实验结果如图1所示。高脂饲料诱导的模型组小鼠粪便中Dubosiella属的相对丰度显著降低，而灌胃杜氏杆菌NYU-BL-A4后可显著升高Dubosiella属的丰度，同时提高双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)增强机体肠道代谢和提高免疫力的菌属，这表明本发明选择的杜氏杆菌NYU-BL-A4具有调节基础代谢、增强免疫力和恢复肠道稳态等功能。

实施例4：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠体重的影响

C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。实验结果如图2所示。高脂模型对照组(HFD)小鼠与对照组相比，体重显著升高，灌胃杜氏杆菌NYU-BL-A4的小鼠体重明显下降并趋向于空白对照组。说明该菌株对于减肥有很好的效果。

实施例5：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗状态的影响

C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。在实验结束的前一周(第9周)进行各项血糖检测，使用血糖仪测定尾静脉血糖数值。

空腹血糖测定：小鼠过夜(12h)禁食不禁水后测定；

糖耐量测定：小鼠过夜(12h)禁食不禁水，检测初始血糖(0min)，然后腹腔注射2g/kg BW葡萄糖溶液，分别在30、60、90和120min时检测血糖值；

胰岛素敏感测定：小鼠禁食不禁水(6h)后，检测初始血糖(0min)，然后腹腔注射0.75U/kg BW葡萄糖溶液，分别在30、60、90和120min时检测血糖值。根据各点血糖值绘制血糖变化曲线，并计算出糖耐量和胰岛素敏感性曲线下面积(Area Under Cerve，AUC)用于各组之间比较。

实验结果如图3～5所示。由图3可见，高脂模型对照组(HFD)的空腹血糖值明显高于空白对照组(ND)，而杜氏杆菌NYU-BL-A4治疗组能显著降低肥胖导致的空腹血糖升高。如图 4和5所示，高脂模型对照组(HFD)在注射葡萄糖或胰岛素后，表现出对葡萄糖的耐受和消化吸收能力较差和对胰岛素不敏感的状态，血糖值受到葡萄糖刺激上升显著，并且下降趋势缓慢；注射胰岛素后血糖值下降不明显，但随后上升较快。灌胃杜氏杆菌NYU-BL-A4后明显降低了曲下面积AUC，并趋近于空白对照(ND)组。这说明，杜氏杆菌(Dubosiellanewyorkensis) NYU-BL-A4能够显著改善口服糖耐量和胰岛素抵抗状态，增强调节葡萄糖稳态和利用胰岛素的能力。

表5注射葡萄糖后小鼠血糖水平(mmol)

分组

0min

30min

60min

90min

120min

AUC

空白对照

6.07±0.15

16.7±1.19

12.3±0.94

11.05±1.43

7.97±0.75

1415±45.92

高脂模型对照组

8.07±0.06

21.15±2.26

17.56±0.88

16.62±0.77

12.97±0.95

1976±56.79

杜氏杆菌治疗组

7.55±0.71

17.87±0.85

14.25±1.01

12.55±1.03

10.25±0.53

1607±38

表6注射胰岛素后小鼠血糖水平(mmol)

分组

0min

30min

60min

90min

120min

AUC

空白对照

10.35±0.54

6.17±0.27

5.97±1.05

5.45±0.46

5.7±0.59

768±27.93

高脂模型对照组

12.15±0.44

10±0.79

8.3±0.64

9.55±0.75

10.12±0.50

1170±28.69

杜氏杆菌治疗组

10.8±0.57

7.2±0.54

6.78±0.37

7.47±0.45

7.58±0.39

926.6±26.89

实施例6：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠的肝脏重量的影响

实验结果如图5所示，与空白对照组(ND)组相比，HFD组肥胖小鼠体内的肝脏重量显著增加。杜氏杆菌干预组中与HFD组相比，肝脏重量显著下降，说明该菌株对于降低肥胖小鼠肝脏重量具有很明显的效果。

实施例7：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的影响

C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例3。按照南京建成低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)的检测方法测定血清中相应指标。实验结果如图7所示。

实验结果如附图7所示。由实验结果可以看出，与正常对照组相比，高脂饮食组小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量显著升高，灌胃杜氏杆菌NYU-BL-A4可降低血清中上述指标的含量。

实施例8：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠肝脏甘油三酯(TG)的影响

C57BL/6J小鼠分组、造模及处理方法同实施例2。分别称取各组小鼠一定量肝脏组织，按1:9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000rpm、离心10min，取上清，按照南京建成试剂盒的检测方法测定肝脏中甘油三酯(TG)的含量。

实验结果如附图8所示。与正常对照组相比，高脂饮食组小鼠肝脏甘油三酯(TG)含量显著升高，在灌胃菌株组可降低肝脏内上述三种指标的含量，说明该菌株可在一定程度上缓解肥胖导致的肝脏病理状态。

实施例9：杜氏杆菌NYU-BL-A4对肥胖小鼠肝脏脂质代谢基因的影响

肝脏组织总RNA的提取：取各组小鼠肝脏组织50mg放入无RNA酶的1.5ml EP管中，每管加入1ml Trizol，加入钢珠用高通量组织研磨器进行充分研磨，室温静置10min后加入200ul氯仿，颠倒混匀30s，室温静置5min。4℃离心，12000rpm离心15min。吸取上层含总 RNA的水相至一新无RNA酶EP管中。在新管中加入1倍体积4℃预冷的异丙醇，室温静置 15min。4℃离心，12000rpm离心15min，沉淀RNA，弃掉上清液。用1ml预冷的75％乙醇 (DEPC水配置)洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心10min，弃掉上清，重复洗涤步骤。室温自然干燥，挥发乙醇，RNA沉淀用DEPC水溶解，用于后续实验。

反转录cDNA合成：cDNA合成使用takara公司的反转录试剂盒(货号：RR036A)并按试剂盒说明书步骤相应进行操作。

SYBR Green法荧光实时定量PCR：

荧光定量PCR引物(上海生工生物工程有限公司合成)：

GAPDH-F：AGG TCG GTG TGAACG GATTTG(SEQ ID NO.1)，

GAPDH-R：TGTAGA CCA TGTAGT TGA GGT CA(SEQ ID NO.2)；

CD36-F：GCCTTGAAGCCGGGAGTTATT(SEQ ID NO.3)，

CD36-R：GTGGAGCGATCCATACAGGG(SEQ ID NO.4)；

FASN-F：ACAAGACAGACCTCTTCCCTC(SEQ ID NO.5)，

FASN-R：ATGGTTCGGAAATGTTGCACC(SEQ ID NO.6)；

pparγ-F：GATCCTACTGCTTGGGACATGG(SEQ ID NO.7)，

pparγ-R：GGAACACAAAGGCCAAGTG(SEQ ID NO.8)。

反应体系(10ul体系)：2×SYBR Green IMix 5ul，cDNA 0.5ul，上、下引物各0.5ul，无菌水4ul。将反应体系加入96孔实时定量专用反应板，每个样品设置4个复孔。将专用透明薄膜盖在96孔板上封紧，1500rpm离心2分钟离也后将反应板放入BIO RID荧光定量PCR 仪中。

反应程序：预变性：95℃ 10min；扩增：95℃10s，60℃20s，72℃30s。45个循环；熔解曲线：95℃5s，65℃1min。计算mRNA水平相对表达量：反应测得各样品荧光强度达到阈值时的Ct值，先用各样品Ct值减去对应处理组的内参基因(GAPDH)的Ct值，得到各样品的△ Ct值。对于同一个引物，用各处理组的△Ct值减去对照组的平均△Ct值，得到各样品的△△Ct值。

为了探究杜氏杆菌对肝脏脂质代谢基因水平影响，本实例选择检测CD36(脂肪酸转运蛋白36)、FASN(脂肪酸合成酶)、pparγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)这三个与脂质代谢密切联系基因的表达水平，结果如图9所示，与正常对照组相比，高脂饮食组小鼠肝脏 CD36、FASN和pparγ基因表达水平显著升高，说明长期高脂摄入会导致肝脏脂质代谢相关基因表达异常，而杜氏杆菌处理后，可降低肝脏CD36、FASN和pparγ基因表达水平，说明该菌株可以影响肝脏脂质代谢基因的表达，从而缓解肥胖导致的脂质代谢紊乱状态。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 杜氏杆菌在预防和改善肥胖及其相关疾病中的应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtagaccat gtagttgagg tca 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccttgaagc cgggagttat t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggagcgat ccatacaggg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acaagacaga cctcttccct c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggttcgga aatgttgcac c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatcctactg cttgggacat gg 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggaacacaaa ggccaagtg 19

Claims (10)

1.杜氏杆菌(Dubosiellanewyorkensis)或含有杜氏杆菌的益生菌制剂在制备预防、缓解或改善肥胖及其并发症的产品方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杜氏杆菌为NYU-BL-A4。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肥胖及其并发症包括高血脂、脂肪肝、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于(a)～(c)至少一方面：

(a)降低体重；

(b)降低肝脏脂肪的堆积；

(c)降低血清低密度脂蛋白胆固醇、肝脏胆固醇、甘油三酯中至少一个指标的水平。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于提高肠道内有益微生物的丰度。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述有益微生物包括但不限于双歧杆菌属和/或乳杆菌属的微生物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生菌制剂中除杜氏杆菌外，还含有辅料，所述辅料包括但不限于赋形剂或食品添加剂膳食补充剂；所述杜氏杆菌在益生菌制剂中的含量不低于1.0×10⁷cfu/mL或1.0×10⁷cfu/g。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物或药物组合物，杜氏杆菌在药物或药物组合物中的含量不低于1.0×10⁷cfu/mL或1.0×10⁷cfu/g。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于食品、保健品饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。

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