CN115517142A - 一种天麻的替代种植方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天麻种植技术领域，具体涉及一种天麻的替代种植方法；包括替代菌材的制备步骤：S1培养蜜环菌菌种：使用栽培基质对蜜环菌种液进行培养；所述栽培基质的原料包括茶树枝和核桃青皮；S2菌材培养：在茶树枝上切出鱼鳞口，再经消毒和干燥后，在鱼鳞口中接种蜜环菌菌种以及促生基质，获得菌材；所述促生基质的原料包括核桃青皮。本方案利用茶树作为木材原料，探究了其对蜜环菌生长的影响以及相应的菌材，拓展了天麻种植的方式。本方案使用了多种原料混合使用的方式，克服了单用茶树枝作为菌材的问题，提升了蜜环菌对木质材料的侵染效率，蜜环菌快速且高效地在菌材上定值，是其为天麻提供充足营养的基础，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及天麻种植技术领域，具体涉及一种天麻的替代种植方法。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Bl.)属兰科(Orchidaceae)多年生草本植物，是我国传统中草药之一，多以块茎入药，具有极高的医疗和保健价值。天麻是一种无根无叶的植物，不能从土壤中吸收养分和进行光合作用，其必须与蜜环菌等共生，由共生菌提供营养。蜜环菌(Armillaria mellea)又名榛蘑、蜜蘑，由于其子实体菌盖表面呈蜜黄色，菌柄上端呈环状花纹，故名“蜜环菌”。而蜜环菌生长主要从木材中吸取营养，因此，现有技术中种植天麻必须使用到大量木材。据估算，种植一亩天麻需要消耗两万公斤5厘米粗的阔叶木材，相当于砍掉7亩至8亩山林。白栎(Quercus fabri Hance)、青冈树(Quercus glauca)和麻栎(Quercus acutissima)是常用于培养蜜环菌以及天麻的木材，蜜环菌这两种树木的枝条上菌索长势旺盛且性状优良。天麻栽培时大量砍伐这些壳斗科的植物,对生态影响严重。多地采用限制天麻栽种面积的方式来解决栽培过程中砍伐大量木材之间的矛盾,显然不能从根本上解决问题。因此，寻找能够替代上述两种木材的树种，选用替代菌材,以扩大天麻的种植范围以及种植量，进而满足市场对于高品质天麻的需求，对天麻产业发展具有重要意义。
发明内容
本发明意在提供一种天麻的替代种植方法，以解决现有技术中的用于天麻种植的木材的种类有限的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种天麻的替代种植方法，包括替代菌材的制备步骤：
S1培养蜜环菌菌种：使用栽培基质对蜜环菌种液进行培养；所述栽培基质的原料包括茶树枝和核桃青皮；
S2菌材培养：在茶树枝上切出鱼鳞口，再经消毒和干燥后，在鱼鳞口中接种蜜环菌菌种以及促生基质，获得菌材；所述促生基质的原料包括核桃青皮。
本方案的原理及优点是：
每年修剪及轮伐产生的茶树的废弃枝条数量巨大，一方面大量农林废弃物需要处理,另一方面天麻栽培需要大量木材,利用这些废弃的枝条作为天麻种植用木材,一举两得，可以满足市场对于高品质天麻的需求，对天麻产业发展具有重要意义。在本技术方案中，发明人利用茶树作为木材原料，探究了其对蜜环菌生长的影响以及制备了以茶树枝为基础的菌材，拓展了天麻种植的方式。
本领域普遍认为茶树作为天麻种植的替代菌材，其种植效果并不理想。近期，也有相关的文献报道，使用天麻作为替代菌材，对于蜜环菌的侵染木材的能力并没有产生较为理想的正向影响(王丹阳，天麻无伐栽培替代菌材的研究，中药材，第45卷第4期2022年4月)。因此，如何将茶树废弃枝条充分利用到天麻种植中，是本技术方案需要克服的关键技术问题。在本技术方案中，发明人使用了多种原料混合使用的方式，克服了单用茶树枝作为菌材的问题，提升了蜜环菌对木质材料的侵染效率，蜜环菌快速且高效地在菌材上定值，是其为天麻提供充足营养的基础。多种原料中包括了核桃青皮，核桃青皮通常为核桃收获时弃用的部分，一定程度上会造成环境污染。发明人通过对大量原料进行筛选，发现核桃青皮作为栽培基质以及促生基质的原料，有助于菌材中蜜环菌的漆酶活性的提升，进一步提升蜜环菌在木质材料上的侵染和生长活性，有利于后续天麻的栽培。
进一步，在S1中，所述栽培基质的原料包括质量比为3-5:3-4:2-3:2-3的茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯，还包括质量分别为茶树枝、核桃青皮、棉籽壳和玉米芯的总质量的3％和0.5％的土豆汁以及葡萄糖。采用上述配比的原材料，有助于培养出高活性的用于菌材制备的蜜环菌菌种。
进一步，在S1中，所述栽培基质的制备方法如下：
SS1基质混合粉的制备：将茶树枝、棉籽壳、玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后烘干后混合，获得基质混合粉；
SS2青皮粉的制备：将新鲜核桃青皮切块并加入转化液中；经湿热灭菌之后，接入酿酒酵母菌种以及枯草芽孢杆菌菌种；培养后过滤取固相，再经烘干和粉碎获得青皮粉；
SS3土豆汁的制备：将新鲜马铃薯切块，经水煮后过滤取液相，获得土豆汁；
SS4栽培基质的制备：将基质混合粉和青皮粉混合，经过水浸泡之后过滤取固相，再加入土豆汁和葡萄糖混匀，获得栽培基质预混物；将栽培基质预混物加入培养瓶中，并补充水，再经过湿热灭菌，获得栽培基质。
采用上述技术方案，对核桃青皮进行高温处理以及生物转化，可以除去青皮中对蜜环菌生长产生抑制作用的物质，通过生物转化产生以及保留部分对蜜环菌侵染木材有利的成分，进一步促进蜜环菌在茶树木材上的生长活性。
进一步，在SS2中，核桃青皮与转化液的质量比为10g：50mL；转化液的配方为：酵母提取物2.00g/L、蛋白胨4.0g/L、柠檬酸氢二铵1.3g/L、硫酸镁0.40g/L；酿酒酵母菌种和枯草芽孢杆菌菌种的接种量均为2wt.％；培养条件为：在30℃、100rpm恒温摇床中培养36小时。采用上述生物转化条件，可以充分促进核桃青皮中的物质转化，获得最优的促进蜜环菌生长的效果，为最优参数选择。
进一步，在S1中，使用栽培基质对蜜环菌种液进行培养的条件为：培养温度20℃，且培养于黑暗环境中。上述培养条件为用于菌材制备的蜜环菌菌种的最佳培养条件。
进一步，在S2中，所述促生基质的原料包括质量比为3:2:2的核桃青皮、棉籽壳、玉米芯，还包括质量为核桃青皮、棉籽壳和玉米芯总质量的8％的土豆汁。在菌材中加入上述配比的促生基质，有助于促进蜜环菌对茶树木材的侵染和生长。
进一步，在S2中，所述促生基质由如下方法制备：棉籽壳和玉米芯分别粉碎，过8目筛，烘干后获得棉籽壳粉和玉米芯粉；将新鲜核桃青皮切块并加入转化液中；经湿热灭菌之后，接入酿酒酵母菌种以及枯草芽孢杆菌菌种；培养后过滤取固相，再经烘干和粉碎获得青皮粉；将新鲜马铃薯切块，经水煮后过滤取液相，获得土豆汁；将棉籽壳粉、玉米芯粉以及青皮粉混合，依次加入水和土豆汁混匀；再经灭菌后获得促生基质。对核桃青皮进行高温处理以及生物转化，可以除去青皮中对蜜环菌生长产生抑制作用的物质，通过生物转化产生以及保留部分对蜜环菌侵染木材有利的成分，进一步促进蜜环菌在茶树木材上的生长活性。通过加入土豆汁和水，将粉状材料大致粘合起来，便于将促生基质放置在木材鱼鳞口处。
进一步，在S2中，所述菌材的培养条件为：培养温度25℃、培养湿度60％。上述培养条件有助于蜜环菌在菌材上的生长，促进其快速长满菌材。
进一步，在S2中，蜜环菌菌种以及促生基质等体积使用，或者蜜环菌菌种和促生基质的质量比为1:1-4。在实际种植过程中，促生基质的用量可以稍微提升，以鱼鳞口的容纳空间能够放置为准。
进一步，在S2中，所述茶树枝的直径为5-10cm，长度为60-70cm；所述鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。在实际种植过程中，通常采用上述尺寸的木材。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1
(1)液体原种的获取
从来源于商业途径的蜜环菌A9的原种平板上挑取生长状态良好的约1cm3大小的菌索组织，接入常规的PDA培养基平板中，于培养箱中28℃恒温且遮光培养15天左右，获得含有蜜环菌母种的平板。然后将蜜环菌母种切碎为0.5×0.5cm的小块，在母种碎块中加入适量的无菌水，手动匀浆使得上述蜜环菌和水的混合物呈糊状。过滤除去多余水分之后，获得用于接种的母种。以3wt.％的接种量接种于200mL PDA液体培养基中，28℃恒温且遮光培养6天左右，并采用200rpm震荡培养的方式。经上述培养之后，过滤取菌丝球，以5wt.％的接种量接种于200mL PDA液体培养基中，28℃恒温且遮光培养5天左右，并采用200rpm震荡培养的方式。经上述培养之后，获得栽培用蜜环菌种液，用于后续的实验。
(2)栽培基质的准备
栽培基质的配方为：茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯、土豆汁以及葡萄糖。茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯的质量比为3:3:2:2。土豆汁和葡萄糖分别占茶树枝、核桃青皮、棉籽壳和玉米芯(均以未加工前的原料质量计算)的总质量的3％和0.5％。其中，茶树(Camellia sinensis(L.)O.Ktze.)，是山茶科、山茶属小乔木或者灌木。此步骤可以选择灌木型的茶树，取修剪产生的大量细枝条制备栽培基质，本方案在此步骤选用的枝条的直径在0.7-1.2cm左右。核桃(Juglans regia L.)是胡桃科、胡桃属植物，核桃青皮是指核桃外部一层厚厚的果皮,待核桃成熟后,需要将青皮除去，再进行后续加工，核桃青皮一般作为就废弃物丢弃。
将配方量的茶树枝、棉籽壳、玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后60℃烘干至水分含量15wt.％以下，然后将上述粉料混合，获得基质混合粉。
取新鲜核桃青皮切成约2×2cm的小块，然后将核桃青皮加入转化液中，121℃、0.1MPa湿热灭菌20min，核桃青皮与转化液的质量比为10g：50mL。冷却后，将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，ATCC18824)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC6051)接种于转化液中，接种量分别为2wt.％和2wt.％。接种的酿酒酵母和枯草芽孢杆菌均为经过常规手段活化以及扩菌获得的湿菌体。转化液的成分以及含量为：酵母提取物2.00g/L、蛋白胨4.0g/L、柠檬酸氢二铵1.3g/L、硫酸镁0.40g/L。然后，30℃恒温摇床(100rpm)中培养36小时。培养结束之后，过滤取生物转化后的固体。60℃烘干发酵后的青皮至水分含量15wt.％以下，然后粉碎过8目筛，获得青皮粉。
土豆汁的制备方法如下：将新鲜马铃薯切块(约3cm×3cm)，然后加入马铃薯质量8倍的水，水煮40分钟，过滤取滤液，获得土豆汁。
将基质混合粉和青皮粉混合，再加入基质混合粉和青皮粉质量之和的两倍无菌水，浸泡24小时。过滤除去多余的水，在浸泡后的固体物质中加入配方量的土豆汁和葡萄糖。混合均匀后装入培养瓶(1L)中，装满至培养瓶体积的85％，并在培养瓶中加入无菌水，无菌水的用量为基质混合粉和青皮粉质量之和的50％。然后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用。
(3)蜜环菌接种以及培养
在灭菌后装有栽培基质的培养瓶中接种(1)中获得的栽培用蜜环菌种液，接种量为每瓶80ml，接种前需要注意将栽培用蜜环菌种液充分摇匀。完成接种之后，将培养瓶放置在室内，在黑暗环境中培养，培养温度控制在20℃左右。待蜜环菌生长满瓶(约50天左右)，获得用于制备菌材的蜜环菌菌种。
(4)菌材制作
将茶树枝去叶，并制备为直径为5-7cm，长度10cm左右的棒材。此步骤选用的茶树可为乔木型的茶树，从乔木型的茶树上可以获得更多可制备菌材的粗枝条。在棒材上砍出若干鱼鳞口。鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。然后将棒材置于沸水中浸泡30min，取出冷却并将棒材晾干，直至棒材的水分含量降为70％。然后使用小刀将鱼鳞口撬开，在每个鱼鳞口中放入小指头大小的蜜环菌菌种和等体积的促生基质(使用时沥干水分，取干物质)。完成接种之后，用力往鱼鳞口按压，菌材的制备完成。将菌材放入培养箱中，对培养箱及时适量的进行喷水，使培养箱内的水分含量控制在60％左右，培养箱的温度控制在25℃左右，直至蜜环菌长满茶树枝棒材表面。
促生基质由如下方法制备而成：青皮粉和土豆汁的制备参照“(2)栽培基质的准备”。促生基质的原料由核桃青皮、棉籽壳、玉米芯和土豆汁组成。核桃青皮、棉籽壳、玉米芯的质量比为3:2:2，土豆汁的用量为核桃青皮、棉籽壳和玉米芯(均以未加工前的原料质量计算)总质量的8％。棉籽壳和玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后60℃烘干至水分含量15wt.％以下。将棉籽壳粉、玉米芯粉以及青皮粉混合，并加入适量无菌水将上述粉料润湿，再加入土豆汁混匀。然后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用，即获得促生基质。
实施例2
本实施例基本同实施例1，不同点在于：
栽培基质的配方为：茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯、土豆汁以及葡萄糖。茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯的质量比为4:4:3:3。土豆汁和葡萄糖在栽培基质中的含量分别为4wt.％和1wt.％。
促生基质由如下方法制备而成：青皮粉和土豆汁的制备参照“(2)栽培基质的准备”。促生基质的原料由核桃青皮、棉籽壳、玉米芯和土豆汁组成。核桃青皮、棉籽壳、玉米芯的质量比为4:3:3，土豆汁为核桃青皮、棉籽壳、玉米芯的质量之和的10％。棉籽壳和玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后60℃烘干至水分含量15wt.％以下。将棉籽壳粉、玉米芯粉以及青皮粉混合，并使用少量水润湿，再加入土豆汁混匀。然后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用，即获得促生基质。
实施例3
本实施例基本同实施例1，不同点在于：
栽培基质的配方为：茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯、土豆汁以及葡萄糖。茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯的质量比为5:4:3:3。土豆汁和葡萄糖在栽培基质中的含量分别为4wt.％和1wt.％。
对比例1
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
“(2)栽培基质的准备”步骤中，栽培基质的配方为：茶树枝、棉籽壳、玉米芯、土豆汁以及葡萄糖。茶树枝、棉籽壳、玉米芯的质量比为3:2:2。土豆汁和葡萄糖分别占茶树枝、核桃青皮、棉籽壳和玉米芯的总质量的3％和0.5％。
对比例2
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
“(2)栽培基质的准备”步骤以及“(4)菌材制作”步骤中，青皮粉的制作方法为：取新鲜核桃青皮，60℃烘干至水分含量15wt.％以下，然后粉碎过8目筛，获得青皮粉。
对比例3
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
“(2)栽培基质的准备”步骤以及“(4)菌材制作”步骤中，青皮粉的制作方法为：取核桃青皮切成约2×2cm的小块，然后将核桃青皮加入转化液中，121℃、0.1MPa湿热灭菌20min，核桃青皮与转化液的质量比为10g：50mL。冷却后，将短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus Meyer and Gottheil，ATCC 7061)接种于转化液中，接种量为2wt.％。接种的短小芽孢杆菌为经过常规手段活化以及扩菌获得的湿菌体。转化液的成分以及含量为：酵母提取物2.00g/L、蛋白胨4.0g/L、柠檬酸氢二铵1.3g/L、硫酸镁0.40g/L。然后，30℃恒温摇床(100rpm)中培养36小时。培养结束之后，过滤取生物转化后的核桃青皮。60℃烘干发酵后的核桃青皮至水分含量15wt.％以下，然后粉碎过8目筛，获得青皮粉。
对比例4
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
“(2)栽培基质的准备”步骤以及“(4)菌材制作”步骤中，青皮粉的制作方法为：取新鲜核桃青皮切成约2×2cm的小片，然后将核桃青皮加入转化液中，121℃、0.1MPa湿热灭菌20min，核桃青皮与转化液的质量比为10g：50mL，过滤取固相部分。60℃烘干青皮至水分含量15wt.％以下，然后粉碎过8目筛，获得青皮粉。
对比例5
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
“(2)栽培基质的准备”步骤以及“(4)菌材制作”步骤中，青皮粉的制作方法为：取新鲜核桃青皮切成约2×2cm的小块，然后将核桃青皮加入水，核桃青皮与水的质量比为10g：50mL，80℃热浸处理4小时，然后过滤取青皮，60℃烘干青皮至水分含量15wt.％以下，然后粉碎过8目筛，获得青皮粉。
对比例6
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
“(2)栽培基质的准备”步骤以及“(4)菌材制作”步骤中，青皮粉的制作方法为：取新鲜核桃青皮切成约2×2cm的小块，然后将核桃青皮加入80％乙醇，核桃青皮与乙醇的质量比为10g：50mL，80℃热浸处理3小时，然后过滤取青皮，使用清水洗青皮除去附着的乙醇，然后60℃烘干青皮至水分含量15wt.％以下，并使得乙醇充分挥干，然后粉碎过8目筛，获得青皮粉。
对比例7
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
在“(4)菌材制作”步骤中，不使用促生基质。
对比例8
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
在“(4)菌材制作”步骤中，促生基质由如下方法制备而成：青皮粉和土豆汁的制备参照“(2)栽培基质的准备”。促生基质的原料由核桃青皮和土豆汁组成。土豆汁为核桃青皮的质量的8％。使用无菌水将青皮粉润湿，再加入土豆汁混匀。然后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用，即获得促生基质。
对比例9
本对比例基本同实施例1，不同点在于：
在“(4)菌材制作”步骤中，促生基质由如下方法制备而成：土豆汁的制备参照实施例1的“(2)栽培基质的准备”。促生基质的原料由棉籽壳、玉米芯和土豆汁组成。棉籽壳和玉米芯的质量比为1:1，土豆汁为棉籽壳和玉米芯质量之和的8％。棉籽壳和玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后60℃烘干至水分含量15wt.％以下。将棉籽壳粉和玉米芯粉混合，无菌水润湿，再加入土豆汁混匀。然后，121℃高温高压灭菌20分钟，灭菌冷却后待用，即获得促生基质。
实验例1
对长满茶树枝棒材表面的蜜环菌进行检测，以确定其生长活性，只有生长活性理想的蜜环菌，才能够在天麻种植的过程中为天麻提供足够的营养物质，所以我们将蜜环菌的生长活性作为评价菌材质量的指标之一。漆酶活力与蜜环菌的侵染木质的能力非常相关，漆酶活性越高，蜜环菌侵染茶树枝的能力就越强。检测原理以及方法参见现有文献(吴涓，蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定，厦门大学学报(自然科学版)，DOI：10.3321/j.issn:0438-0479.2001.04.012；曹春蕾,崔宝凯,秦问敏.桑木层孔菌液体培养过程中几种胞外酶活性的变化[J].菌物学报,2011,30(2):275-280.)。
大致的操作过程为：
取培养20天和50天的菌材中的菌索组织20g，使用酒精喷洒进行表面消毒，然后用无菌水洗去酒精。接下来将消毒后的菌索组织切碎，并加入20mL无菌水，冰浴条件下对菌索组织进行手动组织匀浆处理，然后将匀浆后的菌索组织全部加入50mL PDA液体培养基中，25℃恒温且遮光、200rpm培养24小时，然后离心取上清液(粗酶液)进行漆酶活性检测。检测采用分光光度法，底物为ABTS，缓冲液为pH为4.5的酒石酸钠。2.5mL酶活反应体系中，含1mL0.5mmol/L的ABTS，1mL pH4.5 0.1mol/L酒石酸钠缓冲液和0.5mL粗酶液。每隔3min记录420nm处OD值的变化，粗酶液中酶活计算公式：U/L＝A×V×106(εLtv)，A为吸光值的差值；V为反应体系总体积；ε＝3.6×104(mol/L)-1cm-1：L为比色皿直径：t为反应时间：v为样品体积。
表1：实施例1-3、对比例1-8的漆酶活性检测结果(mean±SD，每个实施例或者对比例分别对5根菌材上的蜜环菌的生长情况进行了检测，培养20天；*表示与实施例相比存在显著差异，t检验，p＜0.05)
表2：实施例1-3、对比例1-8的漆酶活性检测结果(mean±SD，每个实施例或者对比例分别对5根菌材上的蜜环菌的生长情况进行了检测，培养50天)
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 菌材1(U/L) | 72 | 72 | 61 | 55 | 42 | 61 |
| 菌材2(U/L) | 62 | 66 | 69 | 52 | 50 | 53 |
| 菌材3(U/L) | 73 | 69 | 59 | 37 | 41 | 34 |
| 菌材4(U/L) | 52 | 72 | 71 | 49 | 32 | 42 |
| 菌材5(U/L) | 69 | 57 | 73 | 61 | 55 | 41 |
| 平均活性(U/L) | 66±9 | 67±6 | 67±6 | 51±9 | 44±9 | 46±11 |
| 项目 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 | 对比例8 | 对比例9 |
| 菌材1(U/L) | 41 | 52 | 46 | 52 | 53 | 39 |
| 菌材2(U/L) | 32 | 41 | 41 | 47 | 57 | 46 |
| 菌材3(U/L) | 51 | 28 | 39 | 34 | 42 | 57 |
| 菌材4(U/L) | 53 | 33 | 33 | 51 | 46 | 43 |
| 菌材5(U/L) | 46 | 42 | 45 | 51 | 47 | 48 |
| 平均活性(U/L) | 45±8 | 39±9 | 41±5 | 47±8 | 49±6 | 47±7 |
在菌材培养至20天时(表1)，实施例1-3中的菌材中生长的蜜环菌均显示出了较为理想的漆酶活性，具有良好的侵染木材的能力，可以作为天麻生长的营养提供共生菌。
对比例1中，在用于接种菌材的蜜环菌菌种培养阶段，栽培基质的原料中未使用酿酒酵母和枯草芽孢杆菌生物转化过的核桃青皮，在菌材培养阶段，蜜环菌的漆酶活性有所下降。这说明蜜环菌菌种培养阶段的栽培基质的成分组成，对制备菌材时蜜环菌侵染茶树枝的能力有一定影响。将实施例1和对比例1相比较说明，酿酒酵母和枯草芽孢杆菌生物转化过的核桃青皮可提升蜜环菌侵染茶树枝的能力。
相对于实施例1，对比例2核桃青皮没有进行发酵处理，直接将青皮烘干粉碎之后混入栽培基质以及促生基质中。对比例2的菌材中的蜜环菌的漆酶活性非常不理想，发明人分析是由于核桃青皮中有一些对蜜环菌有毒性的物质，如果不通过生物转化的方式去除，会对蜜环菌菌种的培养产生负面影响，进而影响菌材的性能。
对比例3相对于实施例1在栽培基质的准备和菌材制作两个阶段，均使用了其他微生物来对核桃青皮进行生物转化，但是生物转化后的核桃青皮作为栽培基质的原料以及作为促生基质的原料，在促进漆酶活性的效果上并不理想。
对比例4在制备青皮粉的时候未使用发酵菌，所以栽培基质和促生基质中的核桃青皮原料未经过生物转化，其菌材中的蜜环菌的漆酶活性仍然不理想。这说明高温处理并不能很有效地去除核桃青皮中的部分对蜜环菌有负面影响的成分。
对比例5和对比例6使用水或者乙醇为溶剂通过热浸处理的方式处理核桃青皮，但是，菌材中的蜜环菌的漆酶活性不太理想，发明人分析原因在于热浸处理的方式难以除去核桃青皮中对蜜环菌有负面影响的物质。与实施例1相对比，说明了对核桃青皮进行适当的处理(高温处理+生物转化)，可以去除一些抑制性成分，核桃青皮处理之后剩下的部分可以提升蜜环菌对于茶树枝的木质部分的侵染能力。
与实施例1相比，对比例7在菌材制作阶段，没有使用促生基质，栽培过程中蜜环菌的漆酶活性减弱。对比例9的促生基质中不含有核桃青皮，对比例8中促生基质中不含有棉籽壳和玉米芯，栽培过程中蜜环菌的漆酶活性也不理想，这说明生物转化后的的核桃青皮需要在棉籽壳和玉米芯这些常规碳源的支持下，才能发挥理想效果。
菌材培养至50天时(表2)，各组的漆酶活性明显下降，这说明该时间段不是蜜环菌侵染木材的主要时机，因此，菌材培养早期是蜜环菌的侵染活性最高的时期，对蜜环菌的生长尤为关键，蜜环菌在木材上稳定定植之后才能够为天麻的种植提供充足营养。
应用例1
上述实验证明了茶树可以作为替代菌材，对蜜环菌的活性具有良好的促进作用，发明人进而将茶树应用于实际种植过程中，具体的菌材制作过程如下：
选用直径为5-10cm的茶树新鲜的枝条，并将枝条切断为长度60-70cm左右的棒材(实际应用中菌材的常规尺寸)。在棒材上砍出若干鱼鳞口。鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。然后将棒材置于沸水中浸泡5min，取出冷却并将棒材晾干，直至棒材的水分含量降为70％。然后使用小刀将鱼鳞口撬开，在每个鱼鳞口中放入小指头大小的蜜环菌菌种以及促生基质。蜜环菌菌种和促生基质的质量比为1:1-4。完成接种之后，用力往鱼鳞口按压，菌材的制备完成。获取的菌材可以根据现有技术的常规手段进行后续天麻的种植。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种天麻的替代种植方法，其特征在于，包括替代菌材的制备步骤：
S1培养蜜环菌菌种：使用栽培基质对蜜环菌种液进行培养；所述栽培基质的原料包括茶树枝和核桃青皮；
S2菌材培养：在茶树枝上切出鱼鳞口，再经消毒和干燥后，在鱼鳞口中接种蜜环菌菌种以及促生基质，获得菌材；所述促生基质的原料包括核桃青皮。
2.根据权利要求1所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S1中，所述栽培基质的原料包括质量比为3-5:3-4:2-3:2-3的茶树枝、核桃青皮、棉籽壳、玉米芯，还包括质量分别为茶树枝、核桃青皮、棉籽壳和玉米芯的总质量的3％和0.5％的土豆汁以及葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S1中，所述栽培基质的制备方法如下：
SS1基质混合粉的制备：将茶树枝、棉籽壳、玉米芯分别粉碎，过8目筛，然后烘干后混合，获得基质混合粉；
SS2青皮粉的制备：将新鲜核桃青皮切块并加入转化液中；经湿热灭菌之后，接入酿酒酵母菌种以及枯草芽孢杆菌菌种；培养后过滤取固相，再经烘干和粉碎获得青皮粉；
SS3土豆汁的制备：将新鲜马铃薯切块，经水煮后过滤取液相，获得土豆汁；
SS4栽培基质的制备：将基质混合粉和青皮粉混合，经过水浸泡之后过滤取固相，再加入土豆汁和葡萄糖混匀，获得栽培基质预混物；将栽培基质预混物加入培养瓶中，并补充水，再经过湿热灭菌，获得栽培基质。
4.根据权利要求3所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在SS2中，核桃青皮与转化液的质量比为10g：50mL；转化液的配方为：酵母提取物2.00g/L、蛋白胨4.0g/L、柠檬酸氢二铵1.3g/L、硫酸镁0.40g/L；酿酒酵母菌种和枯草芽孢杆菌菌种的接种量均为2wt.％；培养条件为：在30℃、100rpm恒温摇床中培养36小时。
5.根据权利要求4所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S1中，使用栽培基质对蜜环菌种液进行培养的条件为：培养温度20℃，且培养于黑暗环境中。
6.根据权利要求5所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S2中，所述促生基质的原料包括质量比为3-4:2-3:2-3的核桃青皮、棉籽壳、玉米芯，还包括质量为核桃青皮、棉籽壳和玉米芯总质量的8-10％的土豆汁。
7.根据权利要求6所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S2中，所述促生基质由如下方法制备：棉籽壳和玉米芯分别粉碎，过8目筛，烘干后获得棉籽壳粉和玉米芯粉；将新鲜核桃青皮切块并加入转化液中；经湿热灭菌之后，接入酿酒酵母菌种以及枯草芽孢杆菌菌种；培养后过滤取固相，再经烘干和粉碎获得青皮粉；将新鲜马铃薯切块，经水煮后过滤取液相，获得土豆汁；将棉籽壳粉、玉米芯粉以及青皮粉混合，依次加入水和土豆汁混匀；再经灭菌后获得促生基质。
8.根据权利要求7所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S2中，所述菌材的培养条件为：培养温度25℃、培养湿度60％。
9.根据权利要求8所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S2中，蜜环菌菌种以及促生基质等体积使用，或者蜜环菌菌种和促生基质的质量比为1:1-4。
10.根据权利要求9所述的一种天麻的替代种植方法，其特征在于，在S2中，所述茶树枝的直径为5-10cm，长度为60-70cm；所述鱼鳞口沿棒材长度方向排布，相邻鱼鳞口相距2-3cm。
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|---|---|---|---|
| CN202211010951.8A CN115517142A (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 一种天麻的替代种植方法 |
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