CN115504835A - 一种生物源复合增效剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物及生物农药领域，具体涉及一种生物源复合增效剂及其制备方法和在小麦作物上的应用。生物源复合增效剂按重量百分比计，活性组分1所占比例30％～50％、活性组分2所占比例20～30％、微生物菌剂10～20％，过磷酸钙0‑20％；其中，活性组分1为褐黄孢子链霉菌发酵代谢产物，活性组分2为解淀粉芽孢杆菌发酵代谢产物，微生物菌剂为魏氏芽孢杆菌发酵产物。本发明的增效剂可对小麦茎基腐病防效75.42％；小麦白粉病防80.63％；小麦赤霉病防效69.69％。

Description

一种生物源复合增效剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物及生物农药领域，具体涉及一种生物源复合增效剂及其制备方法和在小麦作物上的应用。
背景技术
生物农药研究的一个重要方向是从微生物代谢产物中寻找控制有害生物的新物质。随着环境保护、绿色食品及农业可持续发展的需要，农用抗生素作为低毒低残留的生物农药日益受到人们的重视。我国早已经开展了针对生防菌的研究，已经登记了荧光假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆等用于防治土传病害。以往的研究中有些使用微生物代谢产物，有些使用微生物活菌体。利用代谢产物制备成生物农药需要纯化和剂型制备，成本较高，最终的药效不一定理想；直接使用微生物则大多数生防菌进入土壤后定殖情况不明确，对土壤病原菌防病谱较为狭窄，防治效果有限，而且微生物代谢产出活性成分需要一定的时间。微生物源的生防类产品或促生类产品在应用方面一直存在着很多问题。而目前广泛采用的防治手段还是化学方法，这些化学药剂杀死致病菌的同时也抑制了土壤中的大量有益微生物，严重影响了土壤生态结构。
发明内容
本发明提供了一种生物源复合增效剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为，
一种生物源复合增效剂，按重量百分比计，活性组分1所占比例30％～50％、活性组分2所占比例20～30％、微生物菌剂10～20％，过磷酸钙0-20％；其中，活性组分1为褐黄孢子链霉菌发酵代谢粗产物，活性组分2为解淀粉芽孢杆菌为发酵代谢粗产物，微生物菌剂为魏氏芽孢杆菌活菌体。
优选，按重量百分比计，活性组分1所占比例50％、活性组分2所占比例30％、微生物菌剂20％。
所述活性组份1为将褐黄孢子链霉菌接种于培养基中好氧发酵培养，离心收集菌体，加入甲醇超声破碎后收集甲醇组分，甲醇组分浓缩后加入大孔吸附树脂D101吸附纯化获得。
所述大孔吸附树脂D101吸附纯化过程为：褐黄孢子链霉菌菌体甲醇超声破碎的组分中加入50g/L的树脂D101在30℃、180转条件下吸附2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照5g/L的比例加入到40％甲醇溶液中30℃条件下180转洗脱2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照500g/L的比例加入到70％甲醇溶液中30℃条件下180转解析2-4h后抽滤收集液体并将液体干燥后析出活性组分。
所述活性组份2为将解淀粉芽孢杆菌接种于培养基中好氧发酵，离心去除菌体，将发酵液加入大孔吸附树脂AB-8吸附纯化获得。
所述大孔吸附树脂AB-8吸附纯化过程为：将收集到的发酵液按照50g/L的比例加入大孔吸附树脂AB-8。15℃条件下180转吸附2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照5g/L的比例加入到40％乙醇溶液中15℃条件下180转洗脱2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照500g/L的比例加入到70％乙醇溶液中15℃条件下180转解析2-4h后抽滤收集液体并将液体干燥后析出活性组分。
所述微生物菌剂为将魏氏芽孢杆菌接种于培养基中好氧发酵，离心收集菌体制备成菌悬液，向菌悬液中加入可溶性淀粉喷雾干燥成菌粉，一般根据喷雾干燥设备喷雾口大小按照决定，保证加入淀粉后成浆状态的液体，还不能堵住喷雾口，通常用量为20g/L。
一种生物源复合增效剂的应用，所述生物源复合增效剂在在作为小麦肥料中添加剂的应用。
本发明的有益效果是：
本发明将微生物代谢粗产物和微生物菌剂结合使用，首次利用褐黄孢子链霉菌代谢产物中的强抑菌物质清除作物生长初期的数量较多的治病菌，解淀粉芽孢杆菌代谢产物中含有丰富的活性蛋白具有广谱的杀菌效果可以有效控制作物生长过程中出现的各类治病菌，加入大量抑菌活性物质导致土壤微生物总体数量下降肥力降低，魏氏芽孢杆菌可以吸附营养物质促进作物生长，这类芽孢杆菌不受到前两种抑菌物质的影响可与其共生，一定程度上弥补了抑菌物质造成微生物数量上的损失，有效抑制治病菌的同时保持土壤活力。以上成分混合使其作为肥料中的增效剂，将其再进一步应用至小麦中，进而实现小麦作物全程无病害生长，产量大幅度提高；其中：本发明增效剂中活性组份1具有极强的杀菌活性，其活性浓度最低可以达到2.5ppm，可以清除大部分致病菌，减小作物发病的概率。；活性组份2代谢产物中含有丰富的活性蛋白具有广谱的杀菌效果；同时魏氏芽孢杆菌在土壤中有效吸附营养类物质促进作物生长提高化肥利用率，为作物提供一个持续的增效作用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的活性组分1对水稻纹枯病抑制防效结果(2.5ppm)图；
图2为本发明实施例提供的活性组分1对黄瓜枯萎病抑制防效结果(2.5ppm)图；
图3为本发明实施例提供的活性组分1对花生白娟病抑制防效结果(2.5ppm)图；
图4为本发明实施例提供的活性组分1对苹果轮纹病抑制防效结果(2.5ppm)图；
图5为本发明实施例提供的活性组分1对小麦赤霉病抑制防效结果(2.5ppm)图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1：活性组份1制备
将褐黄孢子链霉菌(李宁,李海波,张会彦,崔文静,程书梅.褐黄孢链霉菌高产纳他霉素菌株的诱变选育[J].食品科技,2010,35(09):25-28.)接种于培养基中于30℃好氧发酵7-10天，1200转，常温离心收集菌体，将收集到的菌体按照湿重比1：1加入甲醇超声破碎后收集甲醇组分，剩下菌体继续按照湿重1：1加入甲醇如此重复3次，合并甲醇组分浓缩后加大孔吸附树脂D101的孔径为20-60目，甲醇组分按照50g/L的比例加入大孔吸附树脂D101。30℃条件下180转吸附3h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照5g/L的比例加入到40％甲醇溶液中30℃条件下180转洗脱3h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照500g/L的比例加入到70％甲醇溶液中30℃条件下180转解析2-4h后抽滤收集液体并将液体干燥后析出活性组分1。
其中，培养基为：葡萄糖40g/L、豆粕15g/L、氯化钠2g/L、无水硫酸镁3g/L、碳酸钙1.5g/L。
在土豆培养基中加入不同量的活性组分1，使培养基中活性组分1的终浓度分别为：400mg/L、100mg/L、50mg/L、2.5mg/L制成含药培养基，冷却后接种病原菌，在培养箱中培养3～7d后调查，调查时采用十字交叉法量取菌落直径(参见图1-5)，并计算抑菌率。
其中，土豆培养基为：:马铃薯200克、葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、硫酸镁1g/L、琼脂粉20g/L。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-原菌饼直径)-(处理菌落直径-原菌饼直径)]/(对照菌落直径-原菌饼直径)×100，抑菌数据如表1：
Figure BDA0003126155550000031
实施例2：活性组份2制备
将解淀粉芽孢杆菌接种于培养基(每升水中蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、氯化钠5g/L)中于30℃好氧发酵2天，好氧发酵2天后1200转常温离心去除菌体，将收集到的发酵液按照50g/L的比例加入大孔吸附树脂AB-8。15℃条件下180转吸附3h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照5g/L的比例加入到40％乙醇溶液中15℃条件下180转洗脱2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照500g/L的比例加入到70％乙醇溶液中15℃条件下180转解析3h后抽滤收集液体并将液体干燥后析出活性组分2。
在土豆培养基中加入定量(400ppm)的活性组分2制成含药培养基，冷却后接种病原菌在培养箱中培养3～7d后调查，调查时采用十字交叉法量取菌落直径，并计算抑菌率(参见表2)。
抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-原菌饼直径)-(处理菌落直径-原菌饼直径)]/(对照菌落直径-原菌饼直径)×100，抑菌谱数据如下表2：
Figure BDA0003126155550000041
活性组份2对植物致病菌均有广谱性的抑制作用，在400ppm浓度下对多种致病菌具有抑制作用。
实施例3：微生物菌剂的制备
将魏氏芽孢杆菌(参见201910343391.X申请案中记载的菌株)接种于100mL培养基(培养基成分为每升水中蛋白胨10g/L、酵母浸粉10g/L、氯化钠5g/L。)中30℃条件下好氧发酵48h后全部转接至10L上述培养基中继续好氧发酵48h后离心收集菌体制备成菌悬液，向菌悬液中加入可溶性淀粉喷雾干燥成菌粉。
实施例4：生物复合增效剂
将上述实施例获得微生物菌剂、活性组份1和活性组份2混合制备复合生物增效剂，按质量百分比计，活性组分1所占比例50％、活性组分2所占比例30％、微生物菌剂组分20％。
实施例5
将上述实施例获得微生物菌剂、活性组份1和活性组份2混合制备复合生物增效剂，按质量百分比计，活性组分1所占比例40％、活性组分2所占比例30％、微生物菌剂组分20％，剩余部分由过磷酸钙补全。
实施例6：小麦赤霉病防治效果盆栽试验
将上述实施例获得微生物菌剂、活性组份1和活性组份2混合制备复合生物增效剂，按质量百分比计，活性组分1所占比例30％、活性组分2所占比例30％、微生物菌剂组分20％，剩余部分由过磷酸钙补全。
应用例1
对小麦茎基腐病的的防效
将上述实施例4获得复合生物增效剂用灌溉水配置成悬浊液灌溉接种到处理组，每盆平均灌入含1.5g复合生物增效剂的悬浊液。将小麦种子先用无菌水冲洗两遍，用75％酒精清洗两分钟灭菌后重复用无菌水冲洗三遍，消毒后的小麦种子在培养皿中培养发芽播种至盆钵中，生长一周后接种含复合生物增效剂的悬浊液，同时以自来水作为对照。一周后接种病原菌(小麦茎基腐病)，7d后进行观察统计一个月。温室(T＝25℃)培养小麦苗每盆三株，每个处理重复十次计算防效(表3)。
小麦茎基腐病调查依据：0级：外层叶鞘无明显症状；1级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4；2级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4—1/2；3级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/2—3/4；4级：第一叶鞘全部脱绿腐烂；5级：第三叶鞘有明显褐枯或全株枯死。
病害严重程度(病情指数)＝Σ(病级数×该病级植株数)/(最高病级数×总植株数)×100％；生防效果＝(对照组病害严重度—处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％。
表3-小麦茎基腐病防效实验
Figure BDA0003126155550000061
“----”表示没有防效效果
应用例2
小麦白粉病防治效果盆栽试验
将上述实施例5获得增效剂用灌溉水配置成悬浊液灌溉接种到处理组，每盆平均灌入含1.5g复合生物增效剂的悬浊液。将小麦种子先用无菌水冲洗两遍，用75％酒精清洗两分钟灭菌后重复用无菌水冲洗三遍，消毒后的小麦种子在培养皿中培养发芽。播种至盆钵中，生长一周后接种含复合生物增效剂的悬浊液，同时以自来水作为对照。一周后接种病原菌，7d后进行观察统计一个月。温室(T＝25℃)培养小麦苗每盆三株，每个处理重复十次，计算防效(表4)。
小麦茎基腐病调查依据：0级：外层叶鞘无明显症状；1级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4；2级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4—1/2；3级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/2—3/4；4级：第一叶鞘全部脱绿腐烂；5级：第三叶鞘有明显褐枯或全株枯死。
病害严重程度(病情指数)＝Σ(病级数×该病级植株数)/(最高病级数×总植株数)×100％；生防效果＝(对照组病害严重度—处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％。
表4-小麦白粉病防效实验
Figure BDA0003126155550000062
应用例3
小麦赤霉病防治效果盆栽试验
将上述实施例6获得增效剂用灌溉水配置成悬浊液灌溉接种到处理组，每盆平均灌入含1.5g复合生物增效剂的悬浊液。将小麦种子先用无菌水冲洗两遍，用75％酒精清洗两分钟灭菌后重复用无菌水冲洗三遍，消毒后的小麦种子在培养皿中培养发芽。播种至盆钵中，生长一周后接种含复合生物增效剂的悬浊液，同时以自来水作为对照。一周后接种病原菌，7d后进行观察统计一个月。温室(T＝25℃)培养小麦苗每盆三株，每个处理重复十次，计算防效(表5)。
小麦茎基腐病调查依据：0级：外层叶鞘无明显症状；1级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4；2级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/4—1/2；3级：第一叶鞘褐枯小于叶鞘长度的1/2—3/4；4级：第一叶鞘全部脱绿腐烂；5级：第三叶鞘有明显褐枯或全株枯死。
病害严重程度(病情指数)＝Σ(病级数×该病级植株数)/(最高病级数×总植株数)×100％；生防效果＝(对照组病害严重度—处理组病害严重度)/对照组病害严重度×100％。
表5-小麦赤霉病防效实验
Figure BDA0003126155550000071
本发明的增效剂可对小麦茎基腐病防效75.42％；小麦白粉病防80.63％；小麦赤霉病防效69.69％。
由上述各应用例可见：增效剂对小麦茎基腐病防效75.42％；小麦白粉病防80.63％；小麦赤霉病防效69.69％，有效抑制影响小麦产量的三种重要病害，防效基本均在70％以上，有望替代化学农药。

Claims (8)

1.一种生物源复合增效剂，其特征在于：按重量百分比计，活性组分1所占比例30％～50％、活性组分2所占比例20～30％、微生物菌剂10～20％，过磷酸钙0-20％；其中，活性组分1为褐黄孢子链霉菌发酵代谢粗产物，活性组分2为解淀粉芽孢杆菌为发酵代谢粗产物，微生物菌剂为魏氏芽孢杆菌活菌体。
2.按权利要求1所述的生物源复合增效剂，其特征在于：按重量百分比计，活性组分1所占比例50％、活性组分2所占比例30％、微生物菌剂20％。
3.按权利要求1所述的生物源复合增效剂，其特征在于：所述活性组份1为将褐黄孢子链霉菌接种于培养基中好氧发酵培养，离心收集菌体，加入甲醇超声破碎后收集甲醇组分，甲醇组分浓缩后加入大孔吸附树脂D101吸附纯化获得。
4.按权利要求3所述的生物源复合增效剂，其特征在于：所述大孔吸附树脂D101吸附纯化过程为：褐黄孢子链霉菌菌体甲醇超声破碎的组分中加入50g/L的树脂D101在30℃、180转条件下吸附2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照5g/L的比例加入到40％甲醇溶液中30℃条件下180转洗脱2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照500g/L的比例加入到70％甲醇溶液中30℃条件下180转解析2-4h后抽滤收集液体并将液体干燥后析出活性组分。
5.按权利要求1所述的生物源复合增效剂，其特征在于：
所述活性组份2为将解淀粉芽孢杆菌接种于培养基中好氧发酵，离心去除菌体，将发酵液加入大孔吸附树脂AB-8吸附纯化获得。
6.按权利要求5所述的生物源复合增效剂，其特征在于：所述大孔吸附树脂AB-8吸附纯化过程为：将收集到的发酵液按照50g/L的比例加入大孔吸附树脂AB-8；15℃条件下180转吸附2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照5g/L的比例加入到40％乙醇溶液中15℃条件下180转洗脱2-4h后抽滤风干树脂，将风干后的树脂按照500g/L的比例加入到70％乙醇溶液中15℃条件下180转解析2-4h后抽滤收集液体并将液体干燥后析出活性组分。
7.按权利要求1所述的生物源复合增效剂，其特征在于：所述微生物菌剂为将魏氏芽孢杆菌接种于培养基中好氧发酵，离心收集菌体制备成菌悬液，向菌悬液中加入可溶性淀粉喷雾干燥成菌粉。
8.一种权利要求1所述的生物源复合增效剂的应用，其特征在于：所述生物源复合增效剂在作为小麦肥料中添加剂的应用。
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