CN115477658A - 一种有效降低安丝菌素p-3杂质的结晶方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效降低安丝菌素P‑3杂质的结晶方法，利用丁酮和异丙醚对AP‑3进行精制结晶，保证了精制后AP‑3的纯度且溶剂可以循环利用，对环境友好且能节约资源和成本，不仅提高了产品质量，而且在较大程度上减轻了工艺操作和对设备的要求，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，具体的说，尤其涉及一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法。
背景技术
1972年S.M.库普钱等从非洲收集的卵叶美登木中(含量为千万分之二)首先分离得到美登素，其母核为19-C的大环内酰胺或Ⅰ型多聚酮类，后来发现珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosum)也能产生与其类似的多种产物，将之称为美登素类抗生素，在限定的培养条件下，安丝菌素P-3(AP-3)是其主要成分。因它对各种肿瘤，如L-1210、P-388白血病、S-180、W-256、路易斯肺癌和体外鼻咽癌均有显著疗效，从而具有巨大的应用前景，例如目前AP-3作为免疫毒素结合剂的方式治疗恶性肿瘤的临床试验已进入最后阶段。因此，未来市场对AP-3的需求将是大量的，从而高效大规模生产AP-3已成为研究热点之一。
目前，关于安丝菌素的文献多为发酵工艺类报道，少数关于分离纯化的文献所述方法也较为模糊或工艺太过复杂，偏向于少量样品制备，不适于大规模生产。如CN102731526A、CN102732581A和US7432088所述方法需要用到正相硅胶层析或中压反向硅胶层析；而US6573074B2和US20020015984采用全发酵液萃取，消耗溶剂量太大，且萃取前需要将发酵液加热至75℃，会导致萃取溶剂大量挥发污染环境和增加操作风险。
因此，本领域急需找到一种提高产品的收率和纯度的同时，降低生产成本、操作步骤简单且对环境较为友好的纯化方法，以克服上述现有技术中存在的缺陷，满足工业化生产的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，包括如下步骤：
S1、取1质量份的由常规方法获得的纯度不达标的精制品AP-3；
S2、将S1取得的精制品AP-3用7-8质量份的丁酮溶解并加热升温至65℃；
S3、滴加7-9质量份的异丙醚，三小时滴完后保持65℃搅拌；
S4、将温度由65℃降至45℃并保持一段时间后再进行搅拌；
S5、将温度由45℃降至25℃并保持一段时间后再进行搅拌；
S6、将溶液进行过滤滤除结晶体，过滤所得的结晶体用1-2质量份的丁酮与1-3质量份的异丙醚混合液泡洗，再经过滤、干燥后得到纯度达标的AP-3制品。
优选的，所述S3中保持65℃搅拌60-70min。
优选的，所述S4中温度由65℃降至45℃后保持60min，最后保持45℃搅拌40-50min。
优选的，所述S5中温度由45℃降至25℃后保持60min，再保持25℃搅拌60-70min。
优选的，所述结晶方法获得的AP-3精制品纯度不小于98％。
有益效果：与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用丁酮和异丙醚对AP-3进行精制结晶，保证了精制后AP-3的纯度且溶剂可以循环利用，对环境友好且能节约资源和成本，不仅提高了产品质量，而且在较大程度上减轻了工艺操作和对设备的要求，适合工业化生产。
附图说明
图1为AP-3精制前色谱图；
图2为01批次AP-3精制后色谱图；
图3为02批次AP-3精制后色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
AP-3提取小试：
发酵小试培养至424h结束(发酵液体积约19L，含量0.636g/L)。
使用3M硫酸溶液调节发酵液pH值至4.5，调节过程中产生较大泡沫，补加少量消泡剂，加入珍珠岩760g，搅拌15min，pH值回升至5.5以上；加入甲醇16L，继续搅拌1h，加入甲醇1.8L，搅拌3h后放罐。
使用去离子水悬浮硅藻土(radiolite#500)740g填充压滤试验机，使用压滤机过滤，甲醇水冲洗滤饼；共得板框压滤滤液42L(滤液含量0.134g/L，体积42L，折合AP-35.628g，收率46.6％)。
取板框过滤滤饼10g加甲醇定容至100ml，超声20min送检含量0.000086g/kg。
取板框过滤滤饼10g加丙酮定容至100ml，超声20min送检含量0.00012g/kg。
板框滤液复滤后使用HP20树脂吸附，梯度洗脱，收集液约300ml/瓶，检测结果如表1所述：
表1：各瓶AP-3的含量和纯度检测结果
| 瓶号 | 含量 | 纯度 | 瓶号 | 含量 | 纯度 |
| 10 | 0.232 | 37.87 | 16 | 3.01 | 85.24 |
| 11 | 0.561 | 54.14 | 17 | 2.68 | 84.86 |
| 12 | 0.928 | 73.28 | 18 | 2.11 | 87.07 |
| 13 | 0.911 | 74.37 | 19 | 1.54 | 81.64 |
| 14 | 1.36 | 78.73 | 20 | 0.687 | 70.96 |
| 15 | 1.91 | 84.59 | 21 | 0.196 | 44.24 |
合并15-19号瓶收集液(共约1.5L，折合AP-3约3.36g，单步收率59.7％)，加入活性炭(白鹭Z)6.5g，搅拌1h脱色，过滤得一次脱色滤液(约1.5L，含量1.775g/L，纯度91.34％，折合AP-3约2.663g，脱色步骤收率79.26％，总收率22.05％)。
将原料发酵液进行后处理，共得到脱色滤液2.9L，含量0.306g/L，纯度91.27％，收率21.76％(001发酵液约20L，含量0.0726g/L；002批发酵液约26L，含量0.101g/L，折合AP-3约4.078g)。
将两次脱色过滤后剩余活性炭使用约500ml70％丙酮水溶液搅拌20min后过滤得到约500ml洗涤液(含量1.197g/L，纯度90.57％，折合AP-3约0.599g)；再使用约500ml纯丙酮进行如上方法二次洗涤，并用丙酮200ml冲洗滤饼，共得约700ml洗涤液(含量1.188g/L，纯度88.12％，折合AP-3约0.832g)。
合并002批脱色滤液及两次活性炭洗涤滤液，35℃真空浓缩至浑浊，共得浓缩液约2000ml，加入乙酸乙酯2000ml，NaCl 40g搅拌10min，转入分液漏斗静置分层，分取有机相及萃取水相(含量0.0005g/L)；
有机相加入600ml0.05M NaOH溶液搅拌洗涤，静置分层，分取有机相及NaOH洗涤液(含量0.0121g/L，颜色淡黄，有机相近乎无色)；
有机相加入600ml去离子水搅拌洗涤，静置分层，分取有机相及洗涤水相(含量0.0073g/L)，共得萃取洗涤有机相约2L。
加入10g活性炭(白鹭Z)，搅拌30min，加入80g无水硫酸钠搅拌10min后过滤，因脱水不彻底，硫酸钠结块并在滤液底部有少量硫酸钠沉积，重新加入少量无水硫酸钠二次脱水并过滤，共得脱色脱水滤液约2.1L，含量1.045g/L，纯度92.21％。
38℃真空浓缩至约80ml，未见浑浊，加入甲醇2.3ml，补加乙酸乙酯23ml，40℃搅拌，滴加正庚烷46ml，见浑浊，后停止搅拌，浑浊消失，在底部出现少量淡黄色油状物，继续搅拌，未见变化。
将结晶液浓缩干，加乙酸乙酯30ml，未升温，溶清，加甲醇0.85ml，补加乙酸乙酯8.5ml，滴加正庚烷17ml，再次出现淡黄色油状物，取母液送检(含量7.002g/L)，冰柜保藏。
将结晶液浓缩干，加乙酸乙酯47ml，未升温，溶清，加甲醇1.0ml，滴加正庚烷21ml，未见固体析出，继续补加甲醇3.7ml(乙酸乙酯：甲醇＝10:1)，滴加正庚烷73ml(乙酸乙酯：甲醇：正庚烷＝10:1:20)，出现白色油状物挂壁，后变成白色固体，超声震荡后过滤，使用正庚烷洗涤滤饼，共得AP-3湿品1.64g(纯度93.732％)。
将1.64gAP-3结晶再次精制，加入乙酸乙酯17ml，甲醇1.7ml溶清，滴加正庚烷34ml，养晶后过滤得AP-3湿品1.41g(纯度95.156％)。
按上述方法进行结晶、精制得到1.41g样品(纯度＞95％)
除杂精制：两批次物料得到的精制品纯度不达标(98％)，主要是AP-4和AP-4’两个杂质较大，使用树脂精制，未见去除效果。故采用本发明提供的降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法去除相关杂质：使用丁酮和异丙醚进行精制结晶。
实施例1
本实施例提供的一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，包括如下步骤：
S1、取1质量份的由常规方法获得的纯度不达标的精制品AP-3；
S2、将S1取得的精制品AP-3用7质量份的丁酮溶解并加热升温至65℃；
S3、滴加7质量份的异丙醚，三小时滴完后保持65℃搅拌60min；
S4、将温度由65℃降至45℃后保持60min，最后保持45℃搅拌40min；
S5、将温度由45℃降至25℃后保持60min，再保持25℃搅拌60min；
S6、将溶液进行过滤滤除结晶体，过滤所得的结晶体用1质量份的丁酮与1质量份的异丙醚混合液泡洗，再经过滤、干燥后得到纯度达标的AP-3制品。
实施例2
S1、取1质量份的由常规方法获得的纯度不达标的精制品AP-3；
S2、将S1取得的精制品AP-3用7.5质量份的丁酮溶解并加热升温至65℃；
S3、滴加8质量份的异丙醚，三小时滴完后保持65℃搅拌65min；
S4、将温度由65℃降至45℃后保持60min，最后保持45℃搅拌45min；
S5、将温度由45℃降至25℃后保持60min，再保持25℃搅拌65min；
S6、将溶液进行过滤滤除结晶体，过滤所得的结晶体用1.5质量份的丁酮与2质量份的异丙醚混合液泡洗，再经过滤、干燥后得到纯度达标的AP-3制品。
实施例3
S1、取1质量份的由常规方法获得的纯度不达标的精制品AP-3；
S2、将S1取得的精制品AP-3用8质量份的丁酮溶解并加热升温至65℃；
S3、滴加9质量份的异丙醚，三小时滴完后保持65℃搅拌70min；
S4、将温度由65℃降至45℃后保持60min，最后保持45℃搅拌50min；
S5、将温度由45℃降至25℃后保持60min，再保持25℃搅拌70min；
S6、将溶液进行过滤滤除结晶体，过滤所得的结晶体用2质量份的丁酮与3质量份的异丙醚混合液泡洗，再经过滤、干燥后得到纯度达标的AP-3制品。
以上实施例提供的降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法获得的AP-3精制品纯度不小于98％。
本发明提供的一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，利用丁酮和异丙醚对AP-3进行精制结晶，保证了精制后AP-3的纯度且溶剂可以循环利用，对环境友好且能节约资源和成本，不仅提高了产品质量，而且在较大程度上减轻了工艺操作和对设备的要求，适合工业化生产。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取1质量份的由常规方法获得的纯度不达标的精制品AP-3；
S2、将S1取得的精制品AP-3用7-8质量份的丁酮溶解并加热升温至65℃；
S3、滴加7-9质量份的异丙醚，三小时滴完后保持65℃搅拌；
S4、将温度由65℃降至45℃并保持一段时间后再进行搅拌；
S5、将温度由45℃降至25℃并保持一段时间后再进行搅拌；
S6、将溶液进行过滤滤除结晶体，过滤所得的结晶体用1-2质量份的丁酮与1-3质量份的异丙醚混合液泡洗，再经过滤、干燥后得到纯度达标的AP-3制品。
2.根据权利要求1所述的一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，其特征在于：所述S3中保持65℃搅拌60-70min。
3.根据权利要求1所述的一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，其特征在于：所述S4中温度由65℃降至45℃后保持60min，最后保持45℃搅拌40-50min。
4.根据权利要求1所述的一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，其特征在于：所述S5中温度由45℃降至25℃后保持60min，再保持25℃搅拌60-70min。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种有效降低安丝菌素P-3杂质的结晶方法，其特征在于：所述结晶方法获得的AP-3精制品纯度不小于98％。
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2022
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